專利名稱：水產(chǎn)養(yǎng)殖用殼聚糖溶液劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，特別涉及一種水產(chǎn)養(yǎng)殖用殼聚糖溶液劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
殼聚糖是由甲殼素經(jīng)脫乙?；玫降奶烊桓叻肿硬牧?，來源十分豐富，因為甲殼素是自然界中產(chǎn)量僅次于纖維素的天然產(chǎn)物且廣泛存在于蝦、蟹等甲殼動物外殼中。殼聚糖具有優(yōu)良的生物相容性，可被溶菌酶溶解，可生物降解，其代謝產(chǎn)物無毒，以及抗菌、抗病毒特性，近年來在醫(yī)藥保健、食品保鮮、農(nóng)業(yè)、化妝品、以及紡織品等領(lǐng)域得到廣泛研究且具有良好的應(yīng)用前景。通常的殼聚糖產(chǎn)品由于分子量高，其抗菌性能比較差，因此一般采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒎肿恿拷档鸵赃_(dá)到理想效果。低分子量殼聚糖還具有提高人體和動物免疫能力的功效。
在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，國內(nèi)外的相關(guān)研究表明殼聚糖以及某些經(jīng)過化學(xué)修飾的殼聚糖衍生物可以提高魚的免疫能力，甚至部分治愈某些細(xì)菌性魚病。在我國，甲殼素或殼聚糖作為一種極有潛力的飼料添加劑近年來被廣泛研究并得到部分實際應(yīng)用。劉興國等采用單因子濃度梯度法研究殼聚糖對羅非魚生長性能影響的試驗中發(fā)現(xiàn)0.5％殼聚糖劑量組的飼料系數(shù)比對照組的飼料系數(shù)下降11.63％[劉興國、宋理平.殼聚糖作為羅非魚飼料添加劑的效果研究.漁業(yè)現(xiàn)代化，2004，(1)，40-41]。曹丹等也采用單因子濃度梯度法研究了殼聚糖對異育銀鯽的生長、蛋白質(zhì)合成及肌肉營養(yǎng)的影響，結(jié)果表明，1.0％殼聚糖組的相對增重率比對照組提高51.44％，飼料系數(shù)比對照組下降20.51％[曹丹，周洪琪.殼聚糖對異育銀聊的生長、蛋白質(zhì)臺成及肌肉營養(yǎng)成分的影響。淡水漁業(yè)，2004，34(1)，6-9]。莊承紀(jì)等在研究殼聚糖對羅氏沼蝦、斑節(jié)對蝦苗生長和抗菌防病作用時發(fā)現(xiàn)濃度為100～200ppm殼聚糖對氣單胞菌有明顯抑制作用，100ppm殼聚糖也能明顯抑制弧菌的繁殖[莊承繼、劉勁科、楊清友等.殼多糖對羅氏沼蝦、斑節(jié)對蝦苗生長和抗菌防病作用研究。湛江海洋大學(xué)學(xué)報，1998，18(3)，29-34]。國內(nèi)現(xiàn)采用粉末殼聚糖作為飼料添加劑。魚類通過從餌料中攝取殼聚糖成份并吸收進(jìn)入體內(nèi)，固然能夠起到一定的作用，達(dá)到部分預(yù)防魚病的目的。
然而，在實際的水產(chǎn)養(yǎng)殖尤其是高密度養(yǎng)殖中，由于部分殘留飼料以及水產(chǎn)動物的排泄物在水中分解會產(chǎn)生有毒物質(zhì)，使水質(zhì)透明度降低、水中有害病菌繁殖速度加快，不利于魚、蝦、蟹等水產(chǎn)動物的生長，并且容易爆發(fā)魚病，因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖中水質(zhì)控制非常重要。為了控制魚病的發(fā)生，通常使用抗生素藥物抑制水體中病菌的繁殖。但是，抗生素藥物的廣泛使用容易使水產(chǎn)動物產(chǎn)生抗藥性，而且體內(nèi)殘留的藥物又會被人體吸收；甚至一些致癌藥物如孔雀石綠作為水體消毒劑也被部分養(yǎng)殖戶使用，嚴(yán)重威脅水產(chǎn)品的安全性。因此開發(fā)高效無毒的水產(chǎn)藥物或水處理劑已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖研究領(lǐng)域的重要課題。目前市場上銷售的較多的產(chǎn)品為雙鏈季銨鹽水溶液，雖然其殺菌效果比較好，但仍然不能生物降解，也不具有凈化水質(zhì)的功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的問題，提供一種兼具有抗菌及絮凝效果、且穩(wěn)定性好的水產(chǎn)養(yǎng)殖用殼聚糖溶液劑。
本發(fā)明的目的通過下列技術(shù)方案來實現(xiàn)一種水產(chǎn)養(yǎng)殖用殼聚糖溶液劑，其包括0.1～20％的活性成分殼聚糖，以及溶劑濃度為0.1～20％的酸溶液，該殼聚糖的分子量為2000～500000，脫乙酰度至少為70％；上述百分比均為占整個溶液劑的重量百分比。
常規(guī)殼聚糖的分子量很高，抗菌效果不明顯。只有當(dāng)分子量降低到一定程度時殼聚糖才具有理想的抗菌效果，但目前國際上對殼聚糖分子量大小對抗菌性能影響的報道有互相矛盾之處。降低殼聚糖分子量的方法可以采用化學(xué)降解(如H2O2)、射線輻照、酶分解等手段，目前市場上有此各種不同分子量的殼聚糖出售。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，對于水產(chǎn)養(yǎng)殖，選用殼聚糖的平均分子量范圍在2千～50萬之間才具有較佳的抗菌效果，如果平均分子量高于50萬，抗菌效果比較差，而且只能在較低pH的水溶液中溶解；反之，如果平均分子量低于2000，雖然水溶性好，但可能反而容易促進(jìn)細(xì)菌繁殖；更優(yōu)選的分子量為5千～10萬。本發(fā)明中的殼聚糖也可以由上述分子量范圍內(nèi)的兩種或兩種以上不同平均分子量的殼聚糖混合而成。另外，殼聚糖的脫乙酰度要求大于70％，如果脫乙酰度太低，水溶性差而且抗菌效果不理想。本發(fā)明殼聚糖溶液劑中殼聚糖的含量太低，如低于0.1％，則上述效果不明顯；反之，大于20％，則不能溶解充分，或長時間放置穩(wěn)定性差，可能會產(chǎn)生沉淀；本發(fā)明更優(yōu)選的含量為3～10％。
眾所周知，殼聚糖不溶于水，但可以溶解于較稀的酸性溶液，包括鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸、蟻酸、檸檬酸、丙酸、丁酸等無機(jī)酸和/或有機(jī)酸。由于殘留的無機(jī)酸可能對水體或環(huán)境造成負(fù)面影響，因此本發(fā)明從環(huán)保角度來說，更優(yōu)選有機(jī)酸；而酸的濃度太低，如低于0.1％，可能會影響殼聚糖的溶解，太高，如高于20％則大量游離酸和殼聚糖溶液一起噴灑于水面后可能引起水體的pH降低；該酸溶液的濃度更優(yōu)選0.5～5％。
更佳地，本發(fā)明水產(chǎn)養(yǎng)殖用殼聚糖溶液劑還包括竹和/或木醋液。
所說的竹或木醋液是竹材或木材炭化時通過對揮發(fā)性的煙塵冷卻所得到的液體再進(jìn)一步經(jīng)過提純，去掉有焦油等成分之后得到的棕黃色液體?，F(xiàn)市售產(chǎn)品中主要成分是水(占80％以上)，其次是醋酸、蟻酸(甲酸)，丁酸等酸類物質(zhì)，占6％左右；此外還含有甲醇，丙醇，丙酮，多酚等200多種成分。其混合液pH值2.2-3.01，比重約1.02左右。竹/木醋液中的許多成分對細(xì)菌和霉菌具有殺菌作用，利用竹(木)醋液的殺菌功能以及純天然、無毒、pH低等特點。在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)竹(木)醋液為殼聚糖溶液的抗菌增強(qiáng)劑，將其與殼聚糖溶液共混，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，使其全部或至少部分替代魚用抗生素藥物。
其中，該竹和/或木醋液在溶液劑中的重量含量一般不超過50％；優(yōu)選2～15％；更優(yōu)選2～11％。
本發(fā)明殼聚糖溶液劑可以直接噴灑于水產(chǎn)養(yǎng)殖場的水面，能抑制水中有害病菌的繁殖，并具有絮凝和凈化水產(chǎn)養(yǎng)殖用水環(huán)境的作用，提高了水的透明度，同時增強(qiáng)魚、蝦、蟹等水產(chǎn)動物的免疫力，預(yù)防或減少魚病發(fā)生，促進(jìn)其生長。因此，本發(fā)明的另一目的是提供上述水產(chǎn)養(yǎng)殖用殼聚糖溶液劑在制備水產(chǎn)藥物或水產(chǎn)養(yǎng)殖用水處理劑中的應(yīng)用。
由于殼聚糖不是合成的化學(xué)藥物，不會使水產(chǎn)動物產(chǎn)生耐藥性，而且殼聚糖沒有生物毒性，配置成水溶液后使用方面，應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可以提高水產(chǎn)品質(zhì)量，達(dá)到綠色環(huán)保目的。另外，本發(fā)明殼聚糖溶液劑可以在常溫下長期保存，即使長時間(6個月以上)放置也不產(chǎn)生沉淀，具有良好的物理化學(xué)穩(wěn)定性；且安全性佳。
具體實施例方式
下面通過實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，而本發(fā)明并不受其限制。
實施例1將平均分子量為8萬、脫乙酰度83％的殼聚糖5kg，醋酸2kg加入到90kg水中，攪拌溶解，待完全溶解后再加入3kg竹醋液，總共得到100kg含有殼聚糖和竹醋液的混合溶液。取該溶液按不同比例稀釋后進(jìn)行抗菌試驗，實驗對象為弧菌，培養(yǎng)條件為36℃，24小時，測得最低抑菌濃度(MIC)為300ppm(以殼聚糖計算)。
實施例2
將平均分子量為30萬、脫乙酰度95％的殼聚糖5kg，醋酸5kg加入到85kg水中，攪拌溶解，待完全溶解后再加入5kg木醋液，總共得到100kg含有殼聚糖和木醋液的混合溶液。取該溶液按不同比例稀釋后進(jìn)行抗菌試驗，實驗對象為弧菌，培養(yǎng)條件為36℃，24小時。測得最低抑菌濃度(MIC)為250ppm(以殼聚糖計算)。
實施例3將分子量2-6萬、脫乙酰度73％的殼聚糖5kg，醋酸2kg加入到93kg中溶解得到5wt％殼聚糖溶液。取該溶液100微克針對嗜水氣單胞菌進(jìn)行抑菌圈大小測定，測試條件為37℃，24小時，藥敏紙片直徑3.5cm。殼聚糖樣品的平均抑菌圈直徑為7.3mm，相同條件下抗生素藥物的平均抑菌圈直徑分別為氯霉素(30微克/片)，12.3mm；氟哌酸(10微克/片)，11.5mm；紅霉素(15微克/片)，8.0mm。表明100微克5％的殼聚糖溶液對嗜水氣單胞菌的抑菌能力與15微克/片的紅霉素相當(dāng)。
實施例4將分子量為40-50萬、脫乙酰度92％的殼聚糖8kg，醋酸15kg加入到64kg水中，攪拌溶解，待完全溶解后再加入11kg木醋液，總共得到100kg含有殼聚糖和木醋液的混合溶液。取該溶液按不同比例稀釋后進(jìn)行抗菌試驗，實驗對象為大腸桿菌、弧菌、嗜水氣單胞菌，培養(yǎng)條件為36℃，24小時，測得最低抑菌濃度(MIC)為分別為500ppm，350ppm和200ppm(以殼聚糖計算)。
實施例5將平均分子量分別為5000(脫乙酰度為70％)和10萬(脫乙酰度為87％)的殼聚糖各5kg，醋酸5kg、檸檬酸2kg加入到83kg水中，攪拌溶解，總共得到100kg含有殼聚糖的溶液。取該溶液按不同比例稀釋后進(jìn)行抗菌試驗，實驗對象為大腸桿菌、弧菌、嗜水氣單胞菌，培養(yǎng)條件為36℃，24小時，測得最低抑菌濃度(MIC)為分別為600ppm，400ppm和300ppm(以殼聚糖計算)。
實施例6將平均分子量4萬、脫乙酰度80％的殼聚糖3kg、醋酸1kg、竹醋液2kg與水94kg配成本發(fā)明殼聚糖水溶液劑。
實施例7將平均分子量為10萬、脫乙酰度80％的殼聚糖5kg、醋酸3kg、木醋液2kg加入到90kg水中，攪拌溶解，總共得到100kg含有殼聚糖的水溶液劑。
實施例8將平均分子量為8萬、脫乙酰度83％的殼聚糖0.1kg、竹醋液50kg加入到49.9kg鹽酸溶液中，攪拌溶解，使最終溶液中鹽酸濃度為0.1wt％，總共得到100kg含有殼聚糖的水溶液劑。
實施例9將平均分子量為2000、脫乙酰度70％的殼聚糖20kg、蟻酸20kg加入到60kg水中，攪拌溶解，總共得到100kg含有殼聚糖的水溶液劑。
上述實施例中各種平均分子量和脫乙酰度的殼聚糖、竹醋液和木醋液、以及各種酸均為常規(guī)市售產(chǎn)品。
應(yīng)用實施例1使用實施例3的殼聚糖溶液進(jìn)行了臨床急性毒性試驗。采用半靜態(tài)的魚類急性毒性試驗方法，pH值7.3-7.5，水溫20℃。對平均體長15.0cm，平均體重48.3克的草魚的96小時半數(shù)致死濃度——大于22000mg/kg體重(口服)；對平均體長4.8cm的南美白對蝦48小時半數(shù)致死濃度——大于18000mg/kg(浸泡)。參照我國農(nóng)藥急性毒性的分級標(biāo)準(zhǔn)以及七級毒性分級標(biāo)準(zhǔn)證明樣品實際無毒。
應(yīng)用實施例2選擇3口混合養(yǎng)殖的池塘(水面積4-6畝)進(jìn)行試驗。每隔10天分別向其中的兩個塘口潑灑0.3ppm和2.0ppm(按照水面估算塘口中水的重量)實施例6的殼聚糖溶液，另一個塘口作為對照。60天后分別從3個塘口捕撈體長25-30cm的草魚進(jìn)行血細(xì)胞測試。
從魚尾靜脈取血，肝素抗凝。然后沿試管壁緩慢加到已加入5ml淋巴細(xì)胞分離液試管中，離心10min(2000轉(zhuǎn)/min)，用吸管插到中間層即淋巴細(xì)胞懸液層吸出淋巴細(xì)胞懸液，離心10min(1500轉(zhuǎn)/min)后棄上層清液，用含10％FBS1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/L。然后用3H-Tdr、14C-Ur、3H-纈氨酸摻入法測定本發(fā)明殼聚糖溶液劑對魚血細(xì)中DNA、RNA、蛋白質(zhì)增值功能的影響。魚細(xì)胞懸液分裝12瓶，每瓶2ml，分為對照組A和殼聚糖潑灑組B1(0.3ppm)、B2(2.0ppm)。測定結(jié)果(表1，表2)表明池塘養(yǎng)殖的潑灑殼聚糖組的魚血細(xì)胞PHA和LPS刺激的DNA、RNA、蛋白質(zhì)增值明顯增強(qiáng)(P＜0.05和P＜0.01)。
表1.殼聚糖對魚血細(xì)胞DNA和RNA增值功能的影響

n＝6*P＜0.05(vs A) ▲＜0.05(vs A，B1，)表2.殼聚糖對魚血細(xì)胞蛋白質(zhì)增值功能的影響

n＝6*P＜0.05(vs A)▲＜0.05(vs A，B1，)
應(yīng)用實施例3選用實施例7，使用SC656型六聯(lián)混凝實驗儀在500mL燒杯中進(jìn)行該殼聚糖溶液的絮凝性能試驗。在不斷攪拌的高嶺土懸濁液中，加入同份量的殼聚糖溶液，先快速攪拌(200～240r/min)1min，再慢速攪拌(70～90r/min)5min，然后靜置20min，取上層清液測定濁度，并計算濁度除去率。測得殼聚糖濃度為1.0ppm，0.5ppm和0.1ppm時對應(yīng)的濁度除去率分別為60％，50％和45％。
應(yīng)用實施例4選擇河溝改建而成、面積為10畝的養(yǎng)殖試驗池，水深1.2-1.5m，淤泥深80cm，在池中高密度放養(yǎng)扣蟹，并套放V期幼蟹、以及鰱鳙、草鳊和蝦。5月上旬前保持淺水位，每7-10天加注一次新水，保持透明度在30cm左右，7月至8月保持最高水位并定期換水，保持透明度在30-40cm，9月份后逐步加大換水量及換水頻率；每15-20天施用一次生石灰；6月上旬全池潑灑一次實施例7的殼聚糖溶液，用量為0.3ppm(以殼聚糖重量計)，以后每隔15-20天潑灑一次，用量為0.1ppm，9月底停止?jié)姙ぞ厶侨芤?，?-9月間停止使用消毒劑。與對照組比較，河蟹顫抖病發(fā)病連續(xù)時間縮短3-5天，且發(fā)病期間河蟹日死量減少50％以上，混養(yǎng)的鰱鳙等魚類也未曾發(fā)生暴發(fā)性出血病及其它病害。與往年比較，定期潑灑殼聚糖溶液后，水質(zhì)有了明顯改善，換水次數(shù)減少4次以上，換水量大為30％以上。
權(quán)利要求
1.一種水產(chǎn)養(yǎng)殖用殼聚糖溶液劑，其包括0.1～20％的活性成分殼聚糖，以及溶劑濃度為0.1～20％的酸溶液，該殼聚糖的分子量為2000～500000，脫乙酰度至少為70％；上述百分比均為重量百分比。
2.如權(quán)利要求1所述的殼聚糖溶液劑，其特征在于所述酸溶液為無機(jī)酸和/或有機(jī)酸。
3.如權(quán)利要求2所述的殼聚糖溶液劑，其特征在于該無機(jī)酸選自鹽酸、磷酸和硫酸。
4.如權(quán)利要求2所述的殼聚糖溶液劑，其特征在于該有機(jī)酸選自蟻酸、醋酸和檸檬酸。
5.如權(quán)利要求1所述的殼聚糖溶液劑，其特征在于其包括3～10％的殼聚糖，該殼聚糖的分子量為5000～100000。
6.如權(quán)利要求1所述的殼聚糖溶液劑，其特征在于所述酸溶液的濃度為0.5～5％。
7.如權(quán)利要求1～6任一項所述的殼聚糖溶液劑，其特征在于其還包括竹和/或木醋液。
8.如權(quán)利要求7所述的殼聚糖溶液劑，其特征在于該竹和/或木醋液在溶液劑中的重量含量不超過50％。
9.如權(quán)利要求8所述的殼聚糖溶液劑，其特征在于該竹和/或木醋液在溶液劑中的重量含量為2～11％。
10.如權(quán)利要求1～6任一項所述的殼聚糖溶液劑在制備水產(chǎn)藥物或水產(chǎn)養(yǎng)殖用水處理劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水產(chǎn)養(yǎng)殖用殼聚糖溶液劑，其包括0.1～20％的活性成分殼聚糖，以及溶劑濃度為0.1～20％的酸溶液，該殼聚糖的分子量為2000～500000，脫乙酰度至少為70％。本發(fā)明殼聚糖溶液劑具有抗菌和促進(jìn)水產(chǎn)動物生長的作用，可替代抗生素藥物而避免產(chǎn)生抗藥性，且還具有絮凝和凈化水產(chǎn)養(yǎng)殖用水環(huán)境的作用；另外，本發(fā)明殼聚糖溶液劑穩(wěn)定性佳、安全性好且使用方便。
文檔編號C02F1/50GK1986438SQ20051011175
公開日2007年6月27日 申請日期2005年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月21日
發(fā)明者吳國忠, 龍德武 申請人:中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所