專利名稱：氨氧化細菌及其分離方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨氧化細菌及其分離方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氮在大氣中大量存在，同時，氮元素是大分子的組成元素之一，因此，是生物所必不可少的營養(yǎng)元素，在生物的生存、延續(xù)和發(fā)展作用中扮演著重要角色。良好的氮素循環(huán)使得氮的各種價態(tài)存在形式趨于平衡。但隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展與人民生活水平的提高，我國含氮有機物的排放量迅猛增加，氮循環(huán)的破壞導(dǎo)致其中一種或幾種價態(tài)形式存在的氮得以累計，其破壞性也秧及到大小水體，嚴(yán)重威脅到我們賴以生存的生態(tài)空間。如今水體富營養(yǎng)化已經(jīng)成為我國水環(huán)境面臨的重大問題，嚴(yán)重地阻礙著我國國民經(jīng)濟的發(fā)展。氮素污染是引起水體富營養(yǎng)化的重要原因之一，因此污水的脫氮處理在廢水處理過程中越來越顯示其重要地位。目前，與物理化學(xué)脫氮方法相比，生物脫氮工藝因具有處理效果好、處理成本低、操作管理方便等優(yōu)點而得到廣泛應(yīng)用，已經(jīng)成為廢水中去除氮素污染的最有效的方法之一。生物脫氮的理論基礎(chǔ)是微生物作用下的硝化作用和反硝化作用。在自然環(huán)境中， 硝化作用主要是依靠微生物的消化能力來完成的，目前所提到的硝化作用作為自然界氮循環(huán)的重要環(huán)節(jié)之一，是指NH4+或NH3被氧化為N02_至N03_的一系列生化反應(yīng)。其中分為兩個階段，首先是亞硝化作用，把NH4+或NH3到NO2-的反應(yīng)過程，是氮素循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，由氨氧化細菌來完成。然后由硝化細菌把亞硝酸鹽氮氧化為硝酸鹽氮。氨氧化細菌有自養(yǎng)型和異養(yǎng)型之分，一般將氨氧化細菌歸為硝化桿菌科。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對廢水生物脫氮工程實踐中揭示出的問題和現(xiàn)象進行了大量理論和試驗研究，力求進一步完善對氮素轉(zhuǎn)化過程的認知，并提出了一些突破傳統(tǒng)理論的新認識，其中就包括對氨氧化細菌的新認識。自養(yǎng)亞硝化細菌為硝化桿菌科的兩個生理亞群之一，在自然界氮循環(huán)鏈中起重要作用，能將氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽氮，并從該氧化過程中獲得能量，同化無機碳化合物如C032-、HCO3-和CO2，合成細胞物質(zhì)。在細菌系統(tǒng)發(fā)育圖譜中根據(jù)16SrRNA序列同源性分析，把亞硝化細菌生理亞群中的亞硝化單胞菌屬歸為紫色細菌群(Proteobacteria)的β亞群。其它基于16S rRNA序列同源性分析或氨單加氧酶 (Ammoniamonooxyg-enase, ΑΜ0)序列分析進行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究表明，除海洋亞硝化球菌(Nitroso-ococcus oceanus)禾口嗜鹽亞硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)為紫色細菌群的Y亞群(Gammasubdivision or gamma subclass)外，亞硝化細菌各屬構(gòu)成紫色細菌群β亞群。除了亞硝化單胞菌(Nitrosomonas)屬外，其它能把氨氧化成亞硝酸的細菌屬包括亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)、亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)、亞硝化弧菌屬 (Nitrosovibrio)、亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus)、亞硝化膠團菌屬(Nitrosogloea)、亞硝化囊菌屬(Nitrosocystis)。自養(yǎng)硝化作用在自然界生物硝化過程中占主導(dǎo)地位，但在某些環(huán)境中，真菌、放線菌、異養(yǎng)細菌等異養(yǎng)硝化微生物進行化能有機營養(yǎng)，能將氨、羥胺或有機氮化合物如肟等氧化成亞硝酸和硝酸。實際上，一個世紀(jì)以前就有關(guān)于異養(yǎng)硝化微生物及其異養(yǎng)硝化作用的報道，近幾十年研究者相繼從不同類型生境發(fā)現(xiàn)和分離了多種具有硝化活性的異養(yǎng)微生物(包括細菌、放線菌、真菌)。其中，異養(yǎng)硝化細菌有反硝化假單胞菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、產(chǎn)堿桿菌、節(jié)桿菌、糞產(chǎn)堿菌、PB16假單胞菌以及一些新發(fā)現(xiàn)的菌種(或?qū)?。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種氨氧化效果的氨氧化細菌及其分離方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的氨氧化細菌，命名為A.P-8(pseudomonas sp.)，已于2010年11 月01日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No.似87。氨氧化細菌A. P-8CGMCC No. 4287可將氨轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽。本發(fā)明所提供的的氨氧化細菌的分離方法，包括如下步驟將活性污泥進行馴化，打散，加入到富集培養(yǎng)基中，進行富集培養(yǎng)，取富集液涂布在硅膠平板上，30°C黑暗培養(yǎng)；長出菌落后，挑取單菌落到瓊脂平板上，進行平板分離純化， 對分離出的菌株進行鑒定，獲得氨氧化細菌；所述的富集培養(yǎng)基的成分為(NH4)2SO4O.5g/L，KH2PO4O. 2g/L，CaCl. 2H20 0. 04g/L, MgSO4. 7H20 0. 04g/L,甲酚紅 0. 5mg/L, Fe-EDTA 0. 5mg/L ；所述瓊脂平板的成分為(NH4)2S042g/L, K2HPO4O. 75g/L，NaH2PO4O. 25g/L， MnSO4. 4Η200· 01g/L, MgSO4. 7Η20 0. 03g/L, CaC035g/L,甲酚紅 0. 5mg/L。本發(fā)明的氨氧化細菌具有優(yōu)異的氨氧化效果，氨氧化效果可達90%以上，而現(xiàn)有的氨氧化細菌的氨氧化效果最高為80%。


圖1為NH4+-N和NO2--N值的變化。圖2為氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和總氮的變化。圖3為16S rDNA擴增產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析圖譜。圖4為重組子PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析圖譜。
具體實施例方式以下結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步描述。(一)培養(yǎng)基及試劑富集培養(yǎng)基的配制稱取(NH4)2SO4O.5g，KH2PO4O. 2g，CaCl. 2H20 0. 04g， MgSO4. 7H200. 04g,甲酚紅 0. 5mg, Fe-EDTA 0. 5mg，溶解于 IL 蒸餾水中，用 lmol/L 的 NaOH 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為7. 8 8. 0，經(jīng)121°C高溫高壓滅菌30min，靜置冷卻至室溫，得到富集培養(yǎng)基。富集培養(yǎng)基的成分(NH4)2SO4O. 5g/L，KH2PO4O. 2g/L，CaCl. 2H20 0. 04g/L，MgSO4. 7H20 0. 04g/L,甲酚紅 0. 5mg/L, Fe-EDTA 0. 5mg/L。液體分離培養(yǎng)基的配制稱取(NH4)2SOJg，K2HPO4O.75g，NaH2PO4O. 25g， MnSO4. 4Η200· Olg, MgSO4. 7H20 0. 03g, CaC035g，甲酚紅 0. 5mg，溶解于 IL 蒸餾水中，用 Imo 1/ L的NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為7. 8 8. 0，經(jīng)121 °C高溫高壓滅菌30min，靜置冷卻至室溫，得到液體分離培養(yǎng)基。液體分離培養(yǎng)基的成分(NH4) 2S042g/L, K2HPO4O. 75g/L，NaH2PO4O. 25g/ L, MnSO4. 4Η200· 01g/L, MgSO4. 7Η20 0. 03g/L, CaC035g/L,甲酚紅 0. 5mg/L。硅膠平板的配制取155ml蒸餾水加5. 5ml相對密度為1. 84的濃硫酸，取185ml蒸餾水加22. Oml相對密度為119的濃鹽酸，兩者混合即為稀酸液；取500ml蒸餾水加82. 59g 硅酸鈉(Na2SiO3 · 9H20)，攪拌溶解即為水玻璃；分別吸取12ml水玻璃和8ml稀酸液于小燒杯中，快速攪拌混勻，倒入培養(yǎng)皿中，靜置凝固。將凝固后的硅膠板放入水槽中，用自來水浸洗5 8次，每次15 25min。用1 %的AgNO3溶液檢查Cl_去除效果，如呈白色則繼續(xù)沖洗。當(dāng)Cl—除去之后，硅膠板再用冷卻開水浸洗1次，無菌水(或蒸餾水)清洗1次，倒置過夜晾干。在每一硅膠板表層加入氨氧化細菌分離培養(yǎng)液anl，然后放入烘箱中，35 45°C 維持1. 0 1.證至表層無營養(yǎng)液流動，然后與培養(yǎng)皿蓋子一同在紫外燈下照射30min，即為硅膠平板。瓊脂平板的配制稱取(NH4)2SOJg，K2HPO4O.75g，NaH2PO4O. 25g，MnSO4. 4H20 0. Olg，MgSO4. 7H20 0. 03g, CaC035g,甲酚紅 0. 5mg，溶解于 IL 蒸餾水中，用 lmol/L 的 NaOH 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為7. 8 8. 0。加入IOg瓊脂，加熱使其充分溶解，經(jīng)121°C高溫高壓滅菌 30min，靜置冷凝成平板，得到瓊脂平板。瓊脂平板的成分=(NH4) 2S042g/L，K2HPO4O. 75g/L， NaH2PO4O. 25g/L, MnSO4. 4H20 0. Olg/L, MgSO4. 7H20 0. 03g/L, CaC035g/L,甲酚紅 0. 5mg/L。格里斯試劑的配制格里斯試劑由甲乙兩種溶液混合而成。甲溶液稱取對氨基苯甲酸0. 5g，溶于150ml 10%的醋酸中，過濾，棕色瓶保存此試劑一個月內(nèi)可用；乙溶液稱取0. Iga -萘胺溶于150mll0%的醋酸和20ml蒸餾水的混合液中，過濾，棕色瓶保存，此試劑一個星期內(nèi)可用。使用前將甲液和乙液等體積混合。( 二)富集培養(yǎng)和分離純化將采自污水處理廠的活性污泥進行馴化之后，取200mL污泥至裝有玻璃珠的錐形瓶中，在30°C恒溫、ISOrpm的條件下，空氣浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱振蕩30min，使污泥充分打散， 污泥顆粒或菌膠團中的活菌釋放出來。打散后的污泥按質(zhì)量比1 10加入到盛有富集培養(yǎng)基的無菌的錐形瓶中，置于30°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。在富集培養(yǎng)過程中，用格里斯試劑檢測Ν02_-Ν的生成情況，與此同時，測定NH4+-N和Ν02_-Ν的值，結(jié)果如圖1，衡量富集培養(yǎng)的氨氧化效果。選取上述富集液中，在用格里斯試劑檢測Ν02_-Ν的生成情況時，呈現(xiàn)玫瑰紅色的富集液，吸取0. 01ml，采用涂布法均勻涂布在硅膠平板上，30°C恒溫黑暗培養(yǎng)1 2周，觀察菌落生長狀況。長出針尖大小的菌落后，挑取若干個單菌落到瓊脂平板上，采用 “十字交叉劃線法”進行平板分離培養(yǎng)。30°C恒溫黑暗培養(yǎng)10 14天，觀察菌落生長情況。 對分離得到的初步確定為氨氧化細菌的菌株進行氨氧化效果檢測。挑取菌株至液體分離培養(yǎng)基中，30°C恒溫、黑暗培養(yǎng)17d，測定氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和總氮的變化情況，結(jié)果如圖2。(三)菌株的鑒定通過肉眼和光學(xué)顯微鏡觀察瓊脂糖平板上生長的菌落形態(tài)特征，參照《伯杰細菌鑒定手冊(第八版)》進行表觀形態(tài)鑒定；通過透射電鏡(JEM1400)觀察菌株的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。菌落針尖大小，圓形，表面濕潤，顏色呈黃色，顯微鏡觀察菌體形態(tài)為桿狀，與假單孢菌屬特征基本一致。參照《微生物學(xué)實驗》對分離出的菌株進行革蘭氏染色實驗和相應(yīng)的生理生化實驗淀粉水解試驗、靛基質(zhì)和硫化氫試驗、糖發(fā)酵試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、接觸酶試驗、檸檬酸鹽利用試驗、伏-普試驗(V. P.試驗)、甲基紅試驗(M.R.試驗)、需氧性試驗對分離菌株進行初步鑒定，結(jié)果如表1所示。
表1.生理生化實驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種氨氧化細菌，其保藏編號為CGMCC No. 4287 ο
2.權(quán)利要求1所述的氨氧化細菌在將氨轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽中的應(yīng)用。
3.一種氨氧化細菌的分離方法，包括如下步驟將活性污泥進行馴化，打散，加入到富集培養(yǎng)基中，進行富集培養(yǎng)，取富集液用格里斯試劑檢測，呈陽性的富集液涂布在硅膠平板上，30°C黑暗培養(yǎng)；長出菌落后，挑取單菌落到瓊脂平板上，進行平板分離純化，對分離出的菌株進行鑒定，獲得氨氧化細菌；所述的富集培養(yǎng)基的成分為(NH4) 2S040. 5g/L，KH2PO4O. 2g/L，CaCl. 2H20 0. 04g/L, MgSO4. 7H20 0. 04g/L,甲酚紅 0. 5mg/L, Fe-EDTA 0. 5mg/L ；所述瓊脂平板的成分為(NH4) 2S042g/L, K2HPO4O. 75g/L, NaH2PO4O. 25g/L, MnSO4. 4Η200· 01g/L, MgSO4. 7Η20 0. 03g/L, CaC035g/L,甲酚紅 0. 5mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離方法，其特征在于所述活性污泥與所述富集培養(yǎng)基的質(zhì)量比1 10。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種氨氧化細菌及其分離方法與應(yīng)用。該氨氧化細菌，其保藏編號為CGMCC No.4287。所述的氨氧化細菌可將氨轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽。該氨氧化細菌的分離方法包括包括如下步驟將活性污泥進行馴化，打散，加入到富集培養(yǎng)基中，進行富集培養(yǎng)，取富集液涂布在硅膠平板上，30℃黑暗培養(yǎng)；長出菌落后，挑取單菌落到瓊脂平板上，進行平板分離純化，對分離出的菌株進行鑒定，獲得氨氧化細菌。本發(fā)明的氨氧化細菌具有優(yōu)異的氨氧化效果，氨氧化效果可達90％以上。
文檔編號C02F3/34GK102268386SQ20101056844
公開日2011年12月7日 申請日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月1日
發(fā)明者周岳溪, 竇立軍, 蔣進元 申請人:中國環(huán)境科學(xué)研究院