專利名稱：具有二氯甲烷降解能力的潘多拉菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株——潘多拉菌(Pandoraea pnomenusa strain) flx_l，及其在微生物降解二氯甲烷、氯苯、苯、甲苯或乙苯中的應用。
背景技術：
二氯甲烷(CH2Cl2, Dichloromethane，簡稱DCM)是一種使用非常廣泛的非水溶性有機溶劑，廣泛應用于金屬材料去油污、除漆行業(yè)和制藥工業(yè)。隨著工業(yè)化、城市化進程的加快，各國對DCM的需求量也日益增大。DCM不僅是大氣的主要污染物，還是城市廢水和工業(yè)污水的重要成分之一，90%以上的DCM來源于工業(yè)使用和廢棄物燃燒。由于其不易被降解，DCM在大氣和水環(huán)境中的半衰期分別為70天和700年。DCM在環(huán)境中具有累積性和持續(xù)性，對人類生活環(huán)境產(chǎn)生了重大的負面影響，已被美國環(huán)保署(EPA)列為1 種優(yōu)先控制的有毒污染物之一。因此研究DCM的凈化技術就顯得十分迫切和重要。生物凈化技術具有去除效率高、處理費用低、二次污染小等特點，逐漸被廣泛應用于有毒污染物的降解和凈化。采用生物技術處理DCM的關鍵之一便是獲得具有高效降解 DCM能力的菌株。目前，國內(nèi)外學者已對烷烴類化合物的生物降解進行了大量研究，但由于 DCM溶解度極低、結(jié)構(gòu)中含有氯原子，迄今分離到的DCM降解菌還比較有限，主要包括假單胞菌(Pseudomonas) >lif (Methylobacterium)、生絲微菌(Hyphomicrobium)、芽孢桿菌(Bacillaceae)、分枝桿菌(Mycobacterium)和梭桿菌(Fusobacterium)等,這些分離到的菌株其降解效率還有待進一步提高。大量研究表明從環(huán)境中分離篩選高效DCM降解菌， 仍然是消除環(huán)境中氯代有機污染物的重要方法之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一株高效、耐受能力強的具有DCM降解能力的潘多拉菌及其用途。本發(fā)明采用的技術方案是一株二氯甲燒降解菌-潘多拉菌(Pandoraea pnomenusa strain) flx_l，保藏
于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏編號CCTCC NO =M 2011242，保藏日期2011年7月8日。所述潘多拉菌flx-Ι菌落特征如下菌落呈白色，邊緣整齊，光滑濕潤；透射電鏡下觀察該菌體的形態(tài)為短桿菌，沒有鞭毛，革蘭氏染色陰性，氧化酶陽性，淀粉水解和吲哚試驗陽性，無法利用乳糖。該菌株flx-Ι能降解初始濃度O 1500mg/L的DCM，最終降解產(chǎn)物為C02、H2O和細胞生物量，平均礦化率74. 15%，平均產(chǎn)率系數(shù)0. 1269mgcells/mg DCM。該降解菌的發(fā)現(xiàn)對工業(yè)廢水廢氣中DCM的高效凈化具有重要意義。該菌株潘多拉菌flx-Ι還可降解其他工業(yè)常見有機污染物，尤其是氯苯、苯、甲苯、乙苯等。本發(fā)明還涉及所述的潘多拉菌flx-Ι在微生物降解二氯甲烷、苯、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、氯苯、四氫呋喃、甲醇或丙烯酸乙酯中的應用。廢水中這類物質(zhì)的初始濃度優(yōu)選為 0 1500mg/L。所述降解在25 35°C、pH 7 9，鹽度以NaCl計為0 (w/w)的條件下進行。優(yōu)選的，所述降解在33°C、pH 7. 3，鹽度以NaCl計為0. 66%的條件下進行。將潘多拉菌f Ix-I經(jīng)培養(yǎng)獲得的菌懸液，投入到分別含100mg/L苯(B)、甲苯(T)、 乙苯(E)、鄰二甲苯(X)、氯苯(CB)、四氫呋喃(THF)、甲醇(MeOH)，丙烯酸乙酯(EA)的模擬廢水中，在溫度33 °C，pH7. 3，鹽度(以NaCl計)0. 66 %的條件下振蕩培養(yǎng)，所述潘多拉菌 flx-Ι在92h內(nèi)能不同程度地降解這些污染物，降解率在57 100%。將潘多拉菌flx-Ι經(jīng)培養(yǎng)后獲得的菌懸液，投入到含100mg/L的二氯甲烷(DCM) 的去離子水中，分別以02、N02_、NO” SO42-和1 3+為唯一電子供體，靜置和振蕩培養(yǎng)，所述的潘多拉菌f Ix-I均能利用N02-、NO” SO42-和1 3+作為電子供體，在厭氧條件下實現(xiàn)對DCM 的脫氯。以狗3+為電子供體時，所述的潘多拉菌fIx-I能在較短的時間內(nèi)實現(xiàn)對DCM的脫氯，平均氯釋放率超過了相同條件下以化為電子供體時氯的釋放率，表明所述的潘多拉菌 flx-Ι是一類兼性好氧菌。本發(fā)明中的潘多拉菌是一種常見的短桿菌，經(jīng)檢索專利和其他相關文獻，尚未發(fā)現(xiàn)利用潘多拉菌降解DCM的報道。該降解菌的發(fā)現(xiàn)對于工業(yè)廢水廢氣中DCM等氯代烴類污染物和其他烴類污染物的高效凈化具有重要意義。優(yōu)選的，所述潘多拉菌flx-Ι用于降解初始濃度為50 1500mg/L的DCM廢水，所述的培養(yǎng)條件為溫度為33°C、pH7. 3，鹽濃度(以NaCl計)為0. 66%。所述潘多拉菌flx_l 對于此濃度范圍內(nèi)平均產(chǎn)率系數(shù)為0. 1269mg cells/mg DCM，DCM的平均礦化率為74. 15%, 平均氯離子的釋放率為96. 8%。本發(fā)明的潘多拉菌f Ix-I取自廢水處理單元，對于氯代烴類化合物，尤其是DCM具有較好地降解效果，可以較為完全地把DCM轉(zhuǎn)化為C02、H20、細胞生物量等無害物質(zhì)；同時， 該菌株也能不同程度地降解苯、甲苯等工業(yè)常見的污染物，因而在工業(yè)廢氣廢水的生物凈化中具有廣闊的應用前景。


圖1為本發(fā)明潘多拉菌flx-Ι的革蘭氏染色照片和透射電鏡照片；圖2為本發(fā)明潘多拉菌flx-Ι的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；圖3為本發(fā)明潘多拉菌flx-Ι對不同濃度DCM的降解曲線、降解過程中細胞生物量變化曲線及比降解速率擬合曲線；圖4為本發(fā)明潘多拉菌flx-Ι在降解DCM的過程中CO2生成量擬合曲線、氯離子釋放曲線及細胞生物量生成曲線；圖5為本發(fā)明潘多拉菌flx-Ι對工業(yè)常見有機污染物降解性能分析；圖6為本發(fā)明潘多拉菌flx-Ι分別在好氧和厭氧條件下對有機氯代烴類污染物的脫氯效果考察。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1 :Pandoraea pnomenusa flx-1的分離、純化及其鑒定1. Pandoraea pnomenusa flx-1 ^jjfmRitit潘多拉菌flx-1是從浙江寧波某煉化廠廢水處理站的活性污泥中馴化、分離得到的一株革蘭氏陰性菌。具體步驟如下取浙江寧波某煉化廠廢水處理站的活性污泥。自來水淘洗五次后，空曝48h，盡量去除殘留的有機物。配制無機鹽培養(yǎng)液(PH7)，以DCM為唯一碳源對活性污泥進行定向馴化，3d更換新鮮無機鹽培養(yǎng)液，每天測定培養(yǎng)液的pH，40d左右pH明顯下降。配制DCM初始濃度為50mg/L無機鹽培養(yǎng)基，配制方法如下=KH2PO4O. 376g， K2HPO4O. 456g, (NH4)2SO4O. 48g, NaNO3O. 68g, Mg(NO3)2O. 25g, CaCl2 · 2H20 0. Ollg,微量元素(MnCl2 · H2O 0. 06g, ZnCl2O. 088g, KI 0. Olg, NaMoO4 · 2H20 0. lg, H3BO3O. 05g)，蒸餾水， IOOOmL ；pH 7. 0-7. 2，分裝于250mL的密封鹽水瓶(50mL/個)，110°C滅菌40min。待培養(yǎng)基冷卻后，加入DCM作為唯一碳源，將馴化的污泥按體積分數(shù)為5 %的量加入到培養(yǎng)基中，于 30°C，160rpm的搖床振蕩培養(yǎng)。3d左右以10%的量轉(zhuǎn)接到新鮮滅菌后的無機鹽培養(yǎng)基中， 搖床振蕩培養(yǎng)。結(jié)合瓊脂無機鹽平板劃線分離，挑取單菌落接入無機鹽培養(yǎng)基搖床繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，直到獲得在上述培養(yǎng)基中生長快、菌落規(guī)則和性狀穩(wěn)定的可降解DCM的單菌。2. Pandoraea pnomenusa flx-1通過16S rDNA序列分析和生理生化實驗鑒定，確定菌株flx-1為Pandoraea pnomenusa。具體步驟如下采用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒(V2. 2，上海申能博彩生物科技有限公司)提取和純化菌株的DNA，4°C保存。選用細菌的通用引物BSF8/20和BSR1M1/20對純化的DNA進行PCR擴增，引物序列分別為BSF8/20 5' -AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3'BSR1541/20 5' -AAGGAGGTGATCCAG CCGCA-3‘PCR反應程序設定為94°C預變性^iin ；然后94°C變性lmin，59°C退火lmin，72°C 延伸1. 5min，循環(huán)35個周期；然后72°C延伸IOmin ；最后4°C保持lOmin。將PCR產(chǎn)物進行測序(上海英濰捷基)，測序結(jié)果見序列表。將菌株flx-1 的 16S rDNA 序列(SEQ ID NO. 1)上傳到 Genbank，獲得 Genbank 的登錄號JN021530，同時同Genbank中的基因序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)其屬于Pandoraea 屬，與Pandoraea pnomenusa(AY268168)同源性最高，達到100%。圖1為菌株flx_l的革蘭氏染色和透射電鏡照片，圖2為菌株flx-Ι的系統(tǒng)發(fā)育樹圖，表1為菌株flx-Ι的部分生理生化試驗結(jié)果。表1 菌株flx-Ι的生理生化性質(zhì)
權(quán)利要求
1.一株二氯甲烷降解菌-潘多拉菌(Pandoraea pnomenusa strain) flx_l，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏編號CCTCC NO =M 2011242，保藏日期2011年7月8日。
2.如權(quán)利要求1所述的潘多拉菌flx-1，其特征在于所述潘多拉菌flx-1菌落特征如下菌落呈白色，邊緣整齊，光滑濕潤；透射電鏡下觀察該菌體的形態(tài)為短桿菌，沒有鞭毛， 革蘭氏染色陰性，氧化酶陽性，淀粉水解和吲哚試驗陽性，無法利用乳糖。
3.如權(quán)利要求1所述的潘多拉菌flx-Ι在微生物降解二氯甲烷、苯、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、氯苯、四氫呋喃、甲醇或丙烯酸乙酯中的應用。
4.如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述降解在25 35°C、pH7 9，鹽度以NaCl 計為0 的條件下進行。
5.如權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于所述降解在33°C、pH7.3，鹽度以NaCl計為 0. 66%的條件下進行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株二氯甲烷降解菌——潘多拉菌(Pandoraeapnomenusa strain)flx-1及其應用。該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏編號CCTCC NOM 2011242，保藏日期2011年7月8日。本發(fā)明的潘多拉菌flx-1取自廢水處理單元，對于氯代烴類化合物，尤其是DCM具有較好地降解效果，可以較為完全地把DCM轉(zhuǎn)化為CO2、H2O、細胞生物量等無害物質(zhì)；同時，該菌株也能不同程度地降解苯、甲苯等工業(yè)常見的污染物，因而在工業(yè)廢氣廢水的生物凈化中具有廣闊的應用前景。
文檔編號C02F3/34GK102533586SQ201110370070
公開日2012年7月4日 申請日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者傅凌霄, 成卓韋, 於建明, 朱潤曄, 蔣軼鋒, 陳建孟 申請人:浙江工業(yè)大學