專利名稱：選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及固定與被檢物質(zhì)選擇性結(jié)合的物質(zhì)(本說(shuō)明書中稱為“選擇結(jié)合性物質(zhì)”)的載體。
背景技術(shù)：
已經(jīng)開始研究各種生物的遺傳信息解析，迅速確定了與以人類基因?yàn)榇淼亩鄶?shù)基因及其堿基序列、或基因序列所編碼的蛋白質(zhì)及由上述蛋白質(zhì)二次構(gòu)成的糖鏈有關(guān)的信息。可以采用各種方法研究已經(jīng)明確了序列的基因、蛋白質(zhì)、糖鏈等高分子的功能。作為主要方法，對(duì)于核酸，可以采用Northern雜交或Southern雜交等方法利用各種核酸/核酸間的互補(bǔ)性研究各種基因與其生物功能表達(dá)之間的關(guān)系。對(duì)于蛋白質(zhì)，可以采用以Western雜交為代表的方法利用蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)間的反應(yīng)研究蛋白質(zhì)的功能及表達(dá)。
近年來(lái)，作為一次性解析多個(gè)基因表達(dá)的方法，開發(fā)了稱為DNA微陣列法(DNA芯片法)的新型分析法以及方法論，而受到關(guān)注。上述方法均是基于核酸/核酸間雜交反應(yīng)的核酸檢測(cè)·定量法，在上述方面，原理與現(xiàn)有方法相同，在基于蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)間、糖鏈/糖鏈間、糖鏈/蛋白質(zhì)間的蛋白質(zhì)或糖鏈檢測(cè)·定量中也可以應(yīng)用。上述技術(shù)的最大特征為使用在稱為微陣列或芯片的玻璃平面基板片上高密度地整列固定了多條DNA片段或蛋白質(zhì)、糖鏈的試樣。作為微陣列法的具體使用法，例如，可以舉出以下方法使將研究對(duì)象細(xì)胞的表達(dá)基因等用熒光色素等標(biāo)記得到的樣品雜交在平面基板片上，使互補(bǔ)的核酸(DNA或RNA)結(jié)合，用高析像度解析裝置高速讀取該部位的方法，或檢測(cè)基于電化學(xué)反應(yīng)的電流值等應(yīng)答的方法。由此可以迅速地推定樣品中的各種基因量。
例如，特表平10-503841號(hào)公報(bào)(權(quán)利要求書)中，作為用于將核酸固定在基板上的技術(shù)，公開了下述方法等載玻片等平坦的基板上涂布聚-L-賴氨酸、氨基硅烷等，使用稱為測(cè)位儀(spotter)的點(diǎn)樣裝置，將各核酸固定。
另外，例如，特開2001-108683號(hào)公報(bào)(權(quán)利要求書及實(shí)施例)公開了以下方法作為DNA芯片中使用的核酸探針(固定在基板上的核酸)，從可以用現(xiàn)有的數(shù)百～數(shù)千堿基長(zhǎng)度的cDNA及其片段降低檢測(cè)時(shí)的出錯(cuò)率、且可以容易地采用合成機(jī)進(jìn)行合成的理由出發(fā)，使用低聚DNA(低聚DNA是指堿基數(shù)為10～100堿基的DNA)。此時(shí)，低聚DNA與玻璃基板以共價(jià)鍵鍵合。
除此之外，作為DNA芯片中使用的玻璃以外的基板的材料，提出了幾種關(guān)于樹脂制基板的方案。例如，特開2001-337089號(hào)公報(bào)(第17段)中公開了作為基板使用由聚甲基丙烯酸甲酯構(gòu)成的聚合物的內(nèi)容。但是，特開2001-337089號(hào)公報(bào)中并未描述具體的DNA固定化方法。另外，特開2003-130874號(hào)公報(bào)(第12段)中也給出了同樣的描述，但是并未說(shuō)明具體的DNA固定化方法。特開2002-71693號(hào)公報(bào)(第7段)中公開利用堿處理使丙烯酸纖維等具有腈基的纖維衍生成為具有羧基的纖維，使上述羧基和DNA等結(jié)合進(jìn)行固定的方法。但是，丙烯酸纖維以聚丙烯腈為主成分，因此存在材料本身的自身熒光強(qiáng)，不適合用作基板的問(wèn)題。而且，特開2002-71693號(hào)公報(bào)(第7段)中公開了使聚甲基丙烯酸酯與丙烯酸、甲基丙烯酸共聚而衍生成為具有羧基的纖維，使上述羧基與DNA結(jié)合的方法，上述方法因基板(載體)表面的羧基量少，能夠固定的DNA量變少，結(jié)果存在無(wú)法充分得到表示雜交的信號(hào)的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明想要解決的問(wèn)題如下所述。首先，在平坦的玻璃基板上固定低聚DNA時(shí)存在下述問(wèn)題。即，1)進(jìn)行雜交時(shí)，玻璃為親水性的，在固定了探針DNA的斑點(diǎn)以外的部分也容易非特異性地吸附檢體DNA，用稱為掃描儀的裝置進(jìn)行熒光檢測(cè)時(shí)，也檢測(cè)到上述非特異性地吸附的檢體，使噪聲變大；2)由于玻璃為剛體，因此基于妨礙了與其共價(jià)鍵合的低聚DNA空間自由度的推測(cè)理由，與檢體DNA的雜交效率低，因此信號(hào)強(qiáng)度弱，結(jié)果出現(xiàn)S/N比不充分的問(wèn)題。
本發(fā)明想要解決的問(wèn)題為提供一種能夠結(jié)實(shí)地且在雜交效率良好的狀態(tài)下將DNA固定在樹脂制基板上的載體。并且提供一種能夠防止上述S/N惡化、固定了檢測(cè)靈敏度高的選擇結(jié)合性物質(zhì)的載體。
即，本發(fā)明涉及一種選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，是固定了選擇結(jié)合性物質(zhì)的載體，其特征為，該載體的表面由低自身熒光樹脂構(gòu)成，用堿或酸處理上述聚合物的表面，生成羧基后固定選擇結(jié)合性物質(zhì)。
另外，本發(fā)明涉及一種選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，是在載體表面固定了選擇結(jié)合性物質(zhì)的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，載體表面具有包含下述通式(1)表示的結(jié)構(gòu)單元的聚合物，用堿或酸處理上述聚合物的表面后，固定選擇結(jié)合性物質(zhì)。
(通式(1)的R1、R2、R3表示烷基、芳基或氫原子。)根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種非特異性檢體的吸附少、且雜交效率良好、S/N比良好的固定了選擇結(jié)合物質(zhì)的載體。


圖1表示在PMMA表面固定選擇結(jié)合性物質(zhì)時(shí)的反應(yīng)流程。
圖2是本發(fā)明的載體的模式圖。
圖3是本發(fā)明的載體的剖面模式圖。
圖4表示微陣列定位用夾具的具體例。
圖5是載體凹凸部的剖面圖。
圖6是具有支持體層和選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化層的載體的概念圖。
圖7表示在玻璃表面固定選擇結(jié)合性物質(zhì)時(shí)的反應(yīng)流程。
具體實(shí)施例方式
下面，說(shuō)明本發(fā)明的選擇結(jié)合性物質(zhì)的固定化載體。
本發(fā)明的選擇結(jié)合性物質(zhì)的固定化載體為了固定選擇結(jié)合性物質(zhì)，具備以下特征載體表面由低自身熒光樹脂構(gòu)成。且用堿或酸處理表面，生成羧基。此處，低自身熒光樹脂是指使用Axon Instruments社的GenePix 4000B，在激發(fā)波長(zhǎng)為532nm、光電倍增管的增益設(shè)定為700、激光功率為33％的條件下對(duì)厚度為1mm的干凈平板進(jìn)行測(cè)定時(shí)，熒光強(qiáng)度為1000或1000以下的樹脂。不滿足上述條件的樹脂檢測(cè)時(shí)的S/N惡化，因此并不優(yōu)選。作為上述樹脂，例如可以舉出下述通式(1)表示的聚合物。
另外，本發(fā)明的選擇結(jié)合性物質(zhì)的固定化載體是在用于固定選擇結(jié)合性物質(zhì)的載體表面具有包含下述通式(1)表示的結(jié)構(gòu)單元的聚合物的固體。
(通式(1)的R1、R2、R3表示烷基、芳基或氫原子。)作為上述聚合物，可以使用均聚物或共聚物。上述聚合物使用至少一種類型的單體作為原料，上述單體以能夠參與聚合的雙鍵及能夠參與縮聚的官能團(tuán)、以及酮或羧酸、或上述物質(zhì)的衍生物的形態(tài)存在。另外，上述聚合物更優(yōu)選具有通式(1)的結(jié)構(gòu)。
另外，上述聚合物為共聚物時(shí)，通式(1)表示的結(jié)構(gòu)單元的含量?jī)?yōu)選為總單體單元的10％或10％以上。通式(1)表示的結(jié)構(gòu)單元的含量如果為10％或10％以上，則可以按照下述說(shuō)明的步驟在表面生成大量羧基，大量固定探針核酸，結(jié)果進(jìn)一步提高了S/N比。
本發(fā)明中，聚合物是指數(shù)均聚合度為50或50以上的物質(zhì)。上述聚合物的數(shù)均聚合度的優(yōu)選范圍為100～1萬(wàn)。特別優(yōu)選為200或200以上、5000或5000以下。需要說(shuō)明的是數(shù)均聚合度可以使用GPC(凝膠滲透色譜法)、按常規(guī)方法測(cè)定聚合物的分子量而容易地測(cè)定。
通式(1)中，R1及R2表示烷基、芳基或氫原子，可以分別相同，也可以不同。上述烷基可以為直鏈狀，也可以為支鏈狀，碳原子數(shù)優(yōu)選為1～20。上述芳基的碳原子數(shù)優(yōu)選為6～18、進(jìn)一步優(yōu)選為6～12。官能團(tuán)X為從O、NR3或CH2中任意選擇。R3為與上述R1及R2同樣地定義的官能團(tuán)。
作為包含上述各種官能團(tuán)的聚合物的優(yōu)選例，例如有聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸乙酯(PEMA)或聚甲基丙烯酸丙酯等聚甲基丙烯酸烷基酯(PAMA)等。上述物質(zhì)中，從容易采用注塑成形或熱壓成形(hot emboss)法成形、且玻璃化溫度較高方面考慮，最優(yōu)選聚甲基丙烯酸甲酯。而且，還可以使用聚乙酸乙烯酯、聚甲基丙烯酸環(huán)己酯或聚甲基丙烯酸苯酯等。另外，也可以使用組合了上述聚合物的構(gòu)成要素、或在上述聚合物的構(gòu)成要素中增加了其他的一種或多種聚合物的構(gòu)成要素的結(jié)構(gòu)的共聚物。作為上述其他的聚合物，有聚苯乙烯等。
在共聚物的情況下，作為各構(gòu)成要素之比的范圍，含有羰基的單體、例如甲基丙烯酸烷基酯的比例優(yōu)選為10摩爾％或10摩爾％以上。由此，可以在表面生成大量羧酸，固定大量探針核酸，結(jié)果進(jìn)一步提高了S/N比。在聚合物的結(jié)構(gòu)單元中，該單體的比例更優(yōu)選為50摩爾％或50摩爾％以上。
而且，本發(fā)明中，為了在含有至少具有1個(gè)通式(1)表示的結(jié)構(gòu)單元的聚合物的載體上固定選擇結(jié)合性物質(zhì)，必須用堿或酸對(duì)其實(shí)施前處理。由此，可以在載體表面形成羧基。作為在載體表面生成羧基的方法，不僅可以單獨(dú)采用以堿、酸等進(jìn)行處理的方法，而且也可以組合使用在加熱中進(jìn)行的超聲波處理、將載體暴露在氧等離子體、氬等離子體、放射線中的方法等。上述方法中，從載體的損傷少、容易實(shí)施方面考慮，優(yōu)選將載體浸漬在增高了溫度的堿或酸中，由此在表面生成羧基。作為具體例，可以將載體浸漬在氫氧化鈉或硫酸的水溶液(優(yōu)選濃度為1N～20N)中，優(yōu)選在30℃～80℃的溫度下保持1小時(shí)～100小時(shí)。
采用上述方法是否在載體表面生成羧基可以用XPS(X射線光電子分光法)加以確認(rèn)。具體而言，使用含氟的標(biāo)記化試劑(例如三氟乙醇)將羧基用氟標(biāo)記。然后，可以考慮相對(duì)于標(biāo)記后的試樣中的Cls、Fls峰面積強(qiáng)度的反應(yīng)率，推定官能團(tuán)量。而且，為了提高精度，可以用TOF-SIMS(飛行時(shí)間型二次離子質(zhì)量分析法)觀察經(jīng)三氟乙醇標(biāo)記的試樣表面的氟分布，由此確認(rèn)載體表面是否生成羧基。
如果由此在載體表面生成羧基，則以此為引物，對(duì)載體側(cè)進(jìn)行生物素或抗生物素蛋白修飾，對(duì)選擇結(jié)合性物質(zhì)進(jìn)行抗生物素蛋白或生物素修飾，利用抗生物素蛋白·生物素的相互作用將選擇結(jié)合性物質(zhì)固定在載體上的方法；或使載體側(cè)與乙二胺等連接體反應(yīng)，再使上述連接體與選擇結(jié)合性物質(zhì)反應(yīng)，進(jìn)行固定。但是，采用上述方法時(shí)，由于進(jìn)行2步反應(yīng)，因此因反應(yīng)收率的關(guān)系，容易使能夠固定在載體上的選擇結(jié)合性物質(zhì)減少。因此，優(yōu)選使載體的羧基與選擇結(jié)合性物質(zhì)的官能團(tuán)直接反應(yīng)，將選擇結(jié)合性物質(zhì)固定。即，使載體表面的羧基與選擇結(jié)合性物質(zhì)的氨基或羥基經(jīng)共價(jià)鍵固定。一般而言，為了促進(jìn)上述結(jié)合反應(yīng)，優(yōu)選使用二環(huán)己基碳二亞胺、N-乙基-5-苯基以異噁唑鎓(isooxazolium)-3’-磺酸酯等各種縮合劑。上述化合物中，從毒性小、比較容易從反應(yīng)體系中除去方面考慮，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)是用于選擇結(jié)合性物質(zhì)和載體表面的羧基的縮合反應(yīng)的最有效縮合劑之一。除此之外，作為有效的縮合劑，有4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基-嗎啉氯化物(DMT-MM)。上述EDC等縮合劑可以與選擇結(jié)合性物質(zhì)的溶液混合使用，也可以將表面生成了羧基的載體預(yù)先浸漬在EDC溶液中，將表面的羧基活化。
使用上述縮合劑，使載體表面的羧基和選擇結(jié)合性物質(zhì)的氨基反應(yīng)時(shí)，利用酰胺鍵將載體表面和選擇結(jié)合性物質(zhì)固定；使載體表面的羧基和選擇結(jié)合性物質(zhì)的羥基反應(yīng)時(shí)，利用酯鍵將載體表面和選擇結(jié)合性物質(zhì)固定。使包含選擇結(jié)合性物質(zhì)的試樣作用于載體時(shí)的溫度優(yōu)選為5℃～95℃、更優(yōu)選為15℃～65℃。處理時(shí)間通常為5分鐘～24小時(shí)、優(yōu)選為1小時(shí)或1小時(shí)以上。另外，用于固定選擇結(jié)合性物質(zhì)的流程如圖1所示。(圖1中的1表示PMMA基板，2表示選擇結(jié)合性物質(zhì)(DNA)。)利用上述方法，將選擇結(jié)合性物質(zhì)固定在聚合物表面，由于斑點(diǎn)部分以外存在負(fù)電荷的羧基，因此能夠抑制檢體(代表性的DNA)的非特異性吸附，而且，能夠利用共價(jià)鍵結(jié)實(shí)地、且高密度地固定選擇結(jié)合性物質(zhì)，而且，與玻璃相比，被固定的選擇結(jié)合性物質(zhì)的空間自由度高，基于上述推定理由，能夠獲得與檢體雜交效率高的載體?？臻g自由度高的優(yōu)點(diǎn)特別是在被固定的選擇結(jié)合性物質(zhì)以稱作低聚DNA的堿基長(zhǎng)度為10堿基～100堿基的DNA為目標(biāo)時(shí)，能夠賦予顯著提高與檢體的雜交效率的特性。
但是，用含有通式(1)表示的結(jié)構(gòu)單元的聚合物制作載體時(shí)，與玻璃、陶瓷、金屬等相比，可以通過(guò)使用注塑成形方法或熱壓成形法等而更簡(jiǎn)單地大量生產(chǎn)具備微細(xì)形狀的載體。此處，就固定選擇結(jié)合性物質(zhì)的載體的形狀進(jìn)行說(shuō)明。優(yōu)選方案為在本發(fā)明的固定選擇結(jié)合性物質(zhì)的載體上存在凹凸部，在凸部上表面固定選擇性結(jié)合物質(zhì)。通過(guò)采用上述構(gòu)造，在檢測(cè)時(shí)，不必如下所述地檢測(cè)非特異性地吸附的檢體，因此噪聲小，結(jié)果能夠提供一種S/N良好的固定選擇結(jié)合性物質(zhì)的載體。而且，對(duì)于凹凸部上多個(gè)凸部的高度，優(yōu)選使凸部上表面的高度大致相同。此處，高度大致相同是指滿足下述條件的高度在高度多少不同的凸部表面固定選擇結(jié)合性物質(zhì)，使其與熒光標(biāo)記后的被檢體反應(yīng)，然后，在用掃描儀掃描時(shí)，其信號(hào)水平的強(qiáng)度差不存在問(wèn)題。具體而言，高度大致相同是指高度差小于100μm。而且，優(yōu)選在本發(fā)明的載體上設(shè)置平坦部。具體例如圖2、圖3所示。11為平坦部，并且，在12表示的凹凸部的凸部上表面固定選擇結(jié)合性物質(zhì)(例如核酸)。因此，該凹凸部的凸部分的上表面優(yōu)選實(shí)質(zhì)上為平坦的。此處，凸部上表面實(shí)質(zhì)上為平坦是指不存在50μm以上的凹凸。而且，凹凸部的凸部的上表面高度和平坦部分的高度大致相同。此處，平坦部和凹凸部的高度大致相同是指在用掃描儀掃描時(shí)不產(chǎn)生信號(hào)水平降低等問(wèn)題的高度。具體而言，高度差大致相同是指凹凸部的凸部上表面的高度和平坦部的高度差小于100μm。
即，通常，微陣列使被熒光標(biāo)記的檢體與固定在載體上的選擇結(jié)合性物質(zhì)反應(yīng)，用稱為掃描儀的裝置讀取熒光。掃描儀構(gòu)成如下將作為激發(fā)光的激光光線通過(guò)物鏡，使激光光線會(huì)聚。會(huì)聚的光照射微陣列的表面，使激光光線的焦點(diǎn)定位在微陣列表面。在上述條件下直接掃描物鏡或微陣列本身，由此讀取微陣列發(fā)出的熒光。
使用上述掃描儀掃描本發(fā)明的在凸部上表面固定了選擇結(jié)合性物質(zhì)的載體時(shí)，能夠發(fā)揮不易檢測(cè)非特異性地吸附在凹凸部的凹部的檢體DNA的熒光(噪聲)的效果。其理由為激光光線的焦點(diǎn)會(huì)聚在凸部上表面，因此激光光線并未聚焦在凹部。反過(guò)來(lái)說(shuō)，固定了選擇結(jié)合性物質(zhì)的多個(gè)凸部?jī)?nèi)，最高的凸部上表面高度和最低的凸部上表面高度差優(yōu)選為50μm或50μm以下。其原因在于如果凸部上表面的高度存在上述范圍以外的不均，則可能因掃描儀的焦點(diǎn)深度的關(guān)系而無(wú)法測(cè)定正確的熒光強(qiáng)度。
另外，固定了選擇結(jié)合性物質(zhì)的多個(gè)凸部?jī)?nèi)，最高的凸部上表面的高度和最低的凸部上表面的高度差只要為50μm或50μm以下即可，更優(yōu)選為30μm或30μm以下，特別優(yōu)選高度相同。另外，本申請(qǐng)中的相同高度也包括生產(chǎn)等時(shí)出現(xiàn)的不均引起的誤差。
另外，固定了選擇結(jié)合性物質(zhì)的多個(gè)凸部是指固定了作為數(shù)據(jù)必需的選擇結(jié)合性物質(zhì)(例如核酸)的部分，排除僅固定了虛設(shè)(dummy)的選擇結(jié)合性物質(zhì)的部分。
另外，通常調(diào)整掃描儀焦點(diǎn)的方法如下所述。即，在掃描儀將激發(fā)光的焦點(diǎn)會(huì)聚在微陣列的表面時(shí)，使激發(fā)光的焦點(diǎn)會(huì)聚在微陣列的一角，或如圖4所示，將微陣列定位在夾具上，使激光光線的焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)微陣列表面。然后，在上述條件下直接掃描微陣列整體。(圖4中的13表示微陣列、14表示物鏡、15表示激發(fā)光、16表示用于將微陣列定位在夾具上的彈簧。)因此，特別優(yōu)選在本發(fā)明的載體上設(shè)置凹凸部和平坦部。具體例如圖2、圖3所示。11為平坦部，且、在12表示的凹凸部的凸部上表面固定選擇結(jié)合性物質(zhì)(例如核酸)。并且，凹凸部的凸部上表面的高度和平坦部分的高度差優(yōu)選為50μm或50μm以下。如果如上所述地進(jìn)行設(shè)定，則掃描固定了選擇結(jié)合性物質(zhì)的載體時(shí)，可以使激發(fā)光的焦點(diǎn)暫且對(duì)準(zhǔn)平坦部上表面，或?qū)⑵教共慷ㄎ辉趭A具上。即，掃描儀的焦點(diǎn)定位變得容易。由此，由于將激發(fā)光的焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)平坦部，因此優(yōu)選使固定了選擇結(jié)合性物質(zhì)的凸部的上表面平坦，且、凸部上表面的高度和平坦部的高度差為50μm或50μm以下。
凸部上表面的高度和平坦部的高度差如果大于50μm，則發(fā)生下述問(wèn)題。即，由于將激發(fā)光的焦點(diǎn)調(diào)整到平坦部的上表面，因此如果凸部上表面的高度不同，則凸部上表面的激發(fā)光焦點(diǎn)模糊，最差情況為完全檢測(cè)不到選擇結(jié)合性物質(zhì)與檢體反應(yīng)產(chǎn)生的熒光。同樣的情況在未設(shè)置高度與凸部上表面相同的平坦部時(shí)也能夠出現(xiàn)。
另外，凸部的上表面不平坦時(shí)，凸部上表面的激發(fā)光焦點(diǎn)大小出現(xiàn)不均，結(jié)果在1個(gè)凸部上表面內(nèi)檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)不均。如果出現(xiàn)上述情況，則難以進(jìn)行下述解析。本申請(qǐng)的情況下，不出現(xiàn)上述問(wèn)題，能夠獲得良好的信號(hào)(熒光)。
另外，凸部上表面的高度和平坦部分的高度差只要為50μm或50μm以下即可，更優(yōu)選為30μm或30μm以下，最優(yōu)選凸部上表面的高度與平坦部分的高度相同。另外，本申請(qǐng)中相同的高度也包括生產(chǎn)等產(chǎn)生的不均引起的誤差。
另外，本發(fā)明中，并非在平面狀的載體上點(diǎn)樣選擇結(jié)合性物質(zhì)，而是僅在凹凸部分的凸部上表面固定選擇結(jié)合性物質(zhì)。因此，凸部上表面以外的部分即使非特異性地吸附檢體試樣，由于在凸部上表面以外的部分激發(fā)光的焦點(diǎn)模糊，因此不會(huì)檢測(cè)到不希望的非特異性吸附的檢體試樣發(fā)出的熒光。因此，噪聲變小，結(jié)果發(fā)揮S/N變好的效果。
為了制作上述形狀的載體，鑒于生產(chǎn)率優(yōu)選采用注塑成形法。為了采用注塑成形法制作上述形狀的載體，必須有模型，作為上述模型的制作方法， 如果采用LIGA(Lithographie GalvanoformungAbformung)工序制作模型，則能夠制成成形后載體容易脫模的模型，因此是優(yōu)選的。
另外，凸部上表面的面積優(yōu)選大致相同。由此，可以使固定了多種選擇結(jié)合性物質(zhì)的部分的面積相同，因此有利于下述解析。此處，凸部上部的面積大致相同是指凸部中最大的上表面面積除以最小的上表面面積的值為1.2或1.2以下。
凸部上表面的面積沒(méi)有特別限定，從能夠減少選擇結(jié)合性物質(zhì)量和操作的容易性方面考慮優(yōu)選為4mm2或4mm2以下、10μm2或10μm2以上。
凹凸部的凸部高度優(yōu)選為0.01mm或0.01mm以上、1mm或1mm以下。如果凸部的高度低于0.01mm，則將檢測(cè)到斑點(diǎn)以外部分的非特異性地吸附的檢體試樣，結(jié)果S/N變差。另外，凸部的高度如果為1mm以上。則可能產(chǎn)生凸部容易折斷、破損等問(wèn)題。
另外，優(yōu)選至少在凸部的側(cè)面設(shè)置導(dǎo)電性材料。由此，例如，設(shè)置對(duì)置電極，在對(duì)置電極和上述導(dǎo)電性材料之間施加電流、電壓，由此，在核酸的情況下，能夠使雜交高速化。涂布導(dǎo)電性材料的優(yōu)選區(qū)域?yàn)榘疾康娜?、凸部的?cè)面全部。其具體例如圖5所示。(圖5中的21表示凸部上表面，22表示導(dǎo)電膜，23表示絕緣膜。)作為施加電壓的范圍，在電流流過(guò)的情況下，優(yōu)選在0.01V或0.01V以上、2V或2V以下的范圍內(nèi)。特別優(yōu)選的范圍是0.1V或0.1V以上、1.5V或1.5V以下。由此，在施加大電壓時(shí)，水發(fā)生電解，有時(shí)對(duì)表面的選擇結(jié)合性物質(zhì)產(chǎn)生不良影響。導(dǎo)電性材料的材質(zhì)沒(méi)有特別限定，可以舉出碳、鎂、鋁、硅、鈦、釩、鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銅、錫、鋯、鈮、鉬、鈀、銀、鉿、鉭、鎢、鉑、金、不銹鋼或上述物質(zhì)的混合物或?qū)щ娦跃酆衔?。其中，特別優(yōu)選使用鉑、金、鈦。作為上述導(dǎo)電性材料的膜的制作方法，可以舉出蒸鍍、濺鍍、CVD、電鍍等。
如上所述地在凸部涂布導(dǎo)電性材料時(shí)，在凸部的上表面之外，更優(yōu)選設(shè)置絕緣材料的層。如果存在絕緣材料的層，則電流流過(guò)時(shí)，可以使被檢體僅存在于凸部的上表面。作為絕緣材料的材料，可以舉出金屬的氧化物(例如、Al-O、SiO2、TiO2、VO、SnO、Cr-O、Zn-O、GeO2、Ta2O5、ZrO2、Nb-O、Y2O3等)、氮化物(Al-N、Si3N4、TiN、Ta-N、Ge-N、Zr-N、NbN等)、硫化物(ZnS、PbS、SnS、CuS)、絕緣性聚合物。
采用上述方法得到的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體可以在固定選擇結(jié)合性物質(zhì)后，進(jìn)行適當(dāng)處理。例如也可以通過(guò)進(jìn)行熱處理、堿處理、表面活性劑處理等，使被固定的選擇結(jié)合性物質(zhì)改性。
另外，通常選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體使被熒光標(biāo)記的檢體和固定在載體上的選擇結(jié)合性物質(zhì)發(fā)生雜交反應(yīng)，用稱為掃描儀的裝置讀取熒光。掃描儀將作為激發(fā)光的激光光線通過(guò)物鏡，使激光光線會(huì)聚。但是，載體表面產(chǎn)生自身熒光時(shí)，上述發(fā)光成為噪聲，導(dǎo)致檢測(cè)精度降低。為了防止上述情況的發(fā)生，優(yōu)選使具有通式(1)的結(jié)構(gòu)單元的聚合物呈黑色，或在其中含有激光照射時(shí)不發(fā)光的物質(zhì)，使表面呈黑色，由此能夠降低載體自身產(chǎn)生的自身熒光。通過(guò)使用上述載體，在檢測(cè)時(shí)，能夠降低載體發(fā)出的自身熒光，因此噪聲小，結(jié)果能夠提供一種S/N比良好的固定選擇結(jié)合性物質(zhì)的載體。
此處，載體為黑色是指在可見光(波長(zhǎng)為400nm～800nm)范圍內(nèi)，載體的黑色部分的光譜反射率不具有特定的光譜圖案(特定的峰等)，一律為較低值，并且，載體的黑色部分的光譜透射比也不具有特定的光譜圖案，一律為較低值。
作為上述光譜反射率、光譜透射比的值，優(yōu)選使可見光(波長(zhǎng)為400nm～800nm)范圍內(nèi)的光譜反射率為7％或7％以下，同波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光譜透射比為2％或2％以下。另外，此處所稱光譜反射率是指在符合JIS Z8722條件C的照明·受光光學(xué)體系中測(cè)定載體發(fā)出的正反射光時(shí)的光譜反射率。
作為處理成黑色的方法，可以通過(guò)使載體中包含黑色物質(zhì)而實(shí)現(xiàn)，作為上述黑色物質(zhì)的優(yōu)選例，可以使用炭黑、石墨、鈦黑、苯胺黑、Ru、Mn、Ni、Cr、Fe、CO及Cu的氧化物、Si、Ti、Ta、Zr及Cr的碳化物等黑色物質(zhì)。
除了單獨(dú)含有上述黑色物質(zhì)外，也可以混合含有2種或2種以上的物質(zhì)。在上述黑色物質(zhì)中，優(yōu)選含有炭黑、石墨、鈦黑，從容易均勻地分散在聚合物中方面考慮，特別優(yōu)選使用炭黑。
另外，作為載體的形狀，如果在由玻璃、金屬等不易發(fā)生熱變形的材料構(gòu)成的支持體層上設(shè)置由至少具有1個(gè)通式(1)表示的結(jié)構(gòu)單元的聚合物構(gòu)成的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化層，則可以防止熱或外力引起的載體形狀變化，因此是優(yōu)選的。作為其他支持體層，可以使用聚碳酸酯、聚酰亞胺、聚酰胺等能夠耐受較高溫度的樹脂等。其概念圖如圖6所示。(2表示選擇結(jié)合性物質(zhì)(DNA)，3表示支持體層(玻璃)，4表示選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化層(PMMA)。)作為支持體層，優(yōu)選玻璃，或鐵、鉻、鎳、鈦、不銹鋼等金屬。另外，為了改善上述支持體層和選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化層的密合性，優(yōu)選對(duì)支持體層表面實(shí)施在氬氣、氧氣、氮?dú)庵羞M(jìn)行的等離子體處理或采用硅烷偶合劑進(jìn)行的處理。作為上述硅烷偶合劑，可以舉出3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基二乙氧基甲基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基丙基)二甲氧基甲基硅烷、3-巰基丙基三甲氧基硅烷、二甲氧基-3-巰基丙基甲基硅烷等。作為在支持體層上設(shè)置選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化層的方法，可以將聚合物溶解在有機(jī)溶劑中，采用旋涂法或浸漬法等公知方法進(jìn)行設(shè)置。更簡(jiǎn)單的方法為用粘合劑貼合在支持體層上。
此處，“選擇結(jié)合性物質(zhì)”是指可以與被檢物質(zhì)直接或間接地選擇性結(jié)合的物質(zhì)，作為代表例，可以舉出核酸、蛋白質(zhì)、糖類及其他抗原性化合物。核酸可以為DNA或RNA，也可以為PNA。由于具有特定堿基序列的單鏈核酸能夠與具有與該堿基序列或其中的一部分互補(bǔ)的堿基序列的單鏈核酸選擇性雜交、結(jié)合，因此屬于本發(fā)明中所稱“選擇結(jié)合性物質(zhì)”。另外，作為蛋白質(zhì)，可以舉出抗體及Fab片段或F(ab’)2片段之類抗體的抗原結(jié)合性片段、及各種抗原。抗體或其抗原結(jié)合性片段與對(duì)應(yīng)的抗原選擇性結(jié)合，抗原與對(duì)應(yīng)的抗體選擇性結(jié)合，因此屬于“選擇結(jié)合性物質(zhì)”。作為糖類，優(yōu)選多糖類，可以舉出各種抗原。另外，也可以固定蛋白質(zhì)或糖類以外的具有抗原性的物質(zhì)。本發(fā)明中使用的選擇結(jié)合性物質(zhì)可以為市售品，也可以為從生物細(xì)胞等中取得的物質(zhì)。作為“選擇結(jié)合性物質(zhì)”，特別優(yōu)選核酸。上述核酸中，稱為低聚核酸的長(zhǎng)度為10堿基～100堿基的核酸可以用合成機(jī)容易地人工合成，另外，核酸末端的氨基修飾容易，因此容易固定在載體表面，是優(yōu)選使用的。從不足20堿基時(shí)雜交的穩(wěn)定性低方面考慮，更優(yōu)選20～100堿基。為了保持雜交的穩(wěn)定性，特別優(yōu)選在40～100堿基的范圍內(nèi)。
作為使用本發(fā)明載體的測(cè)定方法中采用的被檢物質(zhì)，可以舉出需要測(cè)定的核酸，例如病原菌或病毒等的基因、或遺傳疾病的病源基因等以及上述基因中的一部分、具有抗原性的各種生物體成分、病原菌或病毒等的抗體等，但是并不限定于上述物質(zhì)。另外，作為包含上述被檢物質(zhì)的檢體，可以舉出血液、血清、血漿、尿、糞便、骨髓液、唾液、各種組織液等體液、或各種飲食品及上述物質(zhì)的稀釋品等，但是并不限定于上述物質(zhì)。另外，作為被檢物質(zhì)的核酸可以將從血液或細(xì)胞中按常規(guī)方法提取的核酸進(jìn)行標(biāo)記，也可以以該核酸為模板，采用PCR等核酸擴(kuò)增法進(jìn)行擴(kuò)增。在后者的情況下，能夠大幅度提高測(cè)定靈敏度。以核酸擴(kuò)增產(chǎn)物為被檢物質(zhì)時(shí)，在被熒光物質(zhì)等標(biāo)記的核苷三磷酸的存在下進(jìn)行擴(kuò)增，由此可以標(biāo)記擴(kuò)增核酸。另外，在被檢物質(zhì)為抗原或抗體時(shí)，可以采用常規(guī)方法直接標(biāo)記作為被檢物質(zhì)的抗原或抗體，也可以在使作為被檢物質(zhì)的抗原或抗體與選擇結(jié)合性物質(zhì)結(jié)合后，洗滌載體，使與該抗原或抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的標(biāo)記后的抗體或抗原反應(yīng)，測(cè)定結(jié)合在載體上的標(biāo)記。
可以與現(xiàn)有方法完全相同地進(jìn)行使固定化物質(zhì)和被檢物質(zhì)相互作用的工序。根據(jù)雜交的核酸的鏈長(zhǎng)、或參與免疫反應(yīng)的抗原及/或抗體的種類等適當(dāng)選擇反應(yīng)溫度及時(shí)間，核酸雜交時(shí)，通常在50℃～70℃左右反應(yīng)1分鐘～十幾小時(shí)，進(jìn)行免疫反應(yīng)時(shí)，通常在室溫～40℃左右反應(yīng)1分鐘～數(shù)小時(shí)左右。
實(shí)施例利用下述實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。但是本發(fā)明不限定于下述參考例1將透明的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)板((株)KURARAY制；COMOGLASS擠壓板，厚度1mm，平均分子量15萬(wàn)，即，數(shù)均聚合度為1500)用乙醇和純水充分洗滌后，在10N的氫氧化鈉水溶液中，70℃下浸漬12小時(shí)。然后，按純水、0.1N HCl水溶液、純水的順序進(jìn)行洗滌。以實(shí)施了上述堿處理的板和未實(shí)施堿處理的板為試樣，使用含氟的標(biāo)記化試劑(三氟乙醇)，在氣相狀態(tài)下對(duì)試樣表面的羧基進(jìn)行標(biāo)記。然后，使用單色化的Al Kα1，2射線(1486.6eV)，在X射線徑為1mm、光電子逃逸角90°的條件下，進(jìn)行XPS測(cè)定，考慮相對(duì)于Cls、Fls峰面積強(qiáng)度的反應(yīng)率，推定羧基。結(jié)果，羧基量在未實(shí)施堿處理的試樣的情況下為0.0013(總碳量中羧基碳的比例)，進(jìn)行了堿處理的試樣的情況下為0.0015，確認(rèn)表面的羧基量增多。
另外，利用TOF-SIMS(飛行時(shí)間型二次離子質(zhì)量分析)測(cè)定上述2種用三氟乙醇標(biāo)記了表面的羧基的試樣表面的氟量和分布時(shí)，得到以下結(jié)果。即，比較2種試樣時(shí)確認(rèn)氫氧化鈉處理品的19F-或69CF3-強(qiáng)于未處理品，氫氧化鈉處理品的羧基多于未處理品。具體而言，未處理品中相當(dāng)于F-的質(zhì)量數(shù)19的離子的計(jì)數(shù)為8000，氫氧化鈉處理品為25000。另外，對(duì)應(yīng)于CF3-的質(zhì)量數(shù)69的離子的計(jì)數(shù)未處理品為1200，而氫氧化鈉處理品為7000。而且，利用TOF-SIMS對(duì)兩試樣表面的氟分布進(jìn)行二維測(cè)定時(shí)，對(duì)于氫氧化鈉處理品，在19F-的離子像中可見局部存在的分布(可見30μm～40μmφ的圓形或30μm～40μm寬的條紋狀離子強(qiáng)度較弱的區(qū)域)。由上述結(jié)果推測(cè)，對(duì)于進(jìn)行了堿處理的樣品，表面的羧基具有局部存在的分布。而在未處理品中，19F-的離子像中未確認(rèn)有特別局部存在的分布。另外，二種試樣中均未確認(rèn)在31CH3O-的離子像中有局部存在的分布，上述31CH3O-的離子像被認(rèn)為是甲氧基產(chǎn)生的。
實(shí)施例1(DNA固定化載體的制作)將透明的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)板((株)KURARAY制；COMOGLASS擠壓板，厚度1mm，平均分子量15萬(wàn)，即，數(shù)均聚合度為1500)在10N的氫氧化鈉水溶液中、65℃下浸漬12小時(shí)。然后，按純水、0.1N HCl水溶液、純水的順序進(jìn)行洗滌。由此，將板表面的PMMA的側(cè)鏈水解，生成羧基。另外，使用Axon Instruments社的GenePix 4000B，在激發(fā)波長(zhǎng)為532nm、光電倍增管的增益設(shè)定為700、激光功率為33％的條件下進(jìn)行測(cè)定時(shí)，該板(未進(jìn)行堿處理)的自身熒光強(qiáng)度為650。
(探針DNA的固定化)合成序列編號(hào)1(70堿基，5’末端氨基化)、序列編號(hào)2(60堿基，5’末端氨基化)、序列編號(hào)3(40堿基，5’末端氨基化)、序列編號(hào)4(20堿基，5’末端氨基化)的DNA。上述序列編號(hào)1～4的DNA的5’末端被氨基化。
將上述DNA溶解在純水中，使?jié)舛葹?.27nmol/μl，制成貯存液。在基板上點(diǎn)樣時(shí)，用PBS(將NaCl 8g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCl 0.2g、KH2PO40.2g溶解在純水中，加水至11后添加pH調(diào)節(jié)用鹽酸制成的溶液，pH5.5)，使探針最終濃度為0.027nmol/μl，并且為了使載體表面的羧基與探針DNA末端的氨基縮合，添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，使其最終濃度為50mg/ml。然后，取出上述混合溶液約200nl，將其點(diǎn)樣在基板上。即，在PMMA基板上將4種探針?lè)謩e點(diǎn)樣在1個(gè)部位。然后，將基板放入密閉的塑料容器中，在37℃、濕度100％的條件下培養(yǎng)20小時(shí)左右，用純水進(jìn)行洗滌。上述反應(yīng)流程如圖1所示。
(檢體DNA的調(diào)整)作為檢體DNA，使用具有能與上述DNA固定化基板雜交的堿基序列的序列編號(hào)8的DNA(968堿基)。調(diào)整方法如下合成序列編號(hào)5和序列編號(hào)6的DNA。將其溶解在純水中，使?jié)舛葹?00μM。然后，準(zhǔn)備pKF3質(zhì)粒DNA(TAKARA-BIO(株)產(chǎn)品編號(hào)3100)(序列編號(hào)72264堿基)，以其為模板，以序列編號(hào)5及序列編號(hào)6的DNA為引物，利用PCR反應(yīng)(Polymerase ChainReaction)進(jìn)行擴(kuò)增。
PCR的條件如下所述。即，加入ExTaq 2μl、10×ExBuffer 40μl、dNTP Mix 32μl(以上為TAKARA-BIO(株)制產(chǎn)品編號(hào)RR001A中的附屬產(chǎn)品)、序列編號(hào)5的溶液2μl、序列編號(hào)6的溶液2μl、模板(序列編號(hào)7)0.2μl，用純水加至總量為400μl。將上述混合液分在4個(gè)微管中，使用熱循環(huán)控制裝置進(jìn)行PCR反應(yīng)。利用乙醇沉淀對(duì)其進(jìn)行純化后，將其溶解在40μl的純水中。取出PCR反應(yīng)后的溶液的一部分，用電泳進(jìn)行確認(rèn)時(shí)，確認(rèn)擴(kuò)增后的DNA的堿基長(zhǎng)度約為960堿基，序列編號(hào)8(968堿基)被擴(kuò)增。
然后，溶解9堿基的隨機(jī)引物(TAKARA-BIO(株)制；產(chǎn)品編號(hào)3802)，使?jié)舛葹?mg/ml，在上述PCR反應(yīng)后進(jìn)行了純化的DNA溶液中加入2μl。將上述溶液加熱到100℃后，在冰上迅速冷卻。在上述溶液中添加Klenow Fragment(TAKARA-BIO(株)制；產(chǎn)品編號(hào)2140AK)附屬的緩沖液5μl、dNTP混合物(dATP、dTTP、dGTP的濃度分別為2.5mM，dCTP的濃度為400μM)2.5μl。再加入Cy3-dCTP(Amersham Pharmacia Biotic制；產(chǎn)品編號(hào)PA53021)2μl。在上述溶液中加入10U的Klenow Fragment，在37℃下培養(yǎng)20小時(shí)，得到被Cy3標(biāo)記的檢體DNA。需要說(shuō)明的是標(biāo)記時(shí)由于使用隨機(jī)引物，因此檢體DNA的長(zhǎng)度存在不均。最長(zhǎng)的檢體DNA成為序列編號(hào)8(968堿基)。另外，取出檢體DNA的溶液，用電泳進(jìn)行確認(rèn)時(shí)，在相當(dāng)于960堿基的附近出現(xiàn)最強(qiáng)帶，在對(duì)應(yīng)于堿基長(zhǎng)度比其短的區(qū)域內(nèi)呈現(xiàn)輕微拖尾的狀態(tài)。然后，利用乙醇沉淀對(duì)其進(jìn)行純化、干燥。
將上述被標(biāo)記的檢體DNA溶解在400μl的1重量體積％BSA(牛血清白蛋白)、5×SSC(5×SSC是指將NaCl 43.8g、檸檬酸三鈉水合物22.1g溶解在純水中，加至11制成的溶液。另外，將NaCl 43.8g、檸檬酸三鈉水合物22.1g溶解在純水中，加至51形成的溶液標(biāo)記為1×SSC，上述溶液的10倍濃縮液標(biāo)記為10×SSC，5倍稀釋液標(biāo)記為0.2×SSC。)、0.1重量體積％SDS(十二烷基硫酸鈉)、0.01重量體積％鮭精子DNA的溶液(各濃度均為最終濃度)中，制成雜交用溶液。
(雜交)在上述得到的固定了探針DNA的基板上，使上述檢體DNA雜交。具體而言，在預(yù)先準(zhǔn)備的固定了探針核酸的載體上滴加雜交用溶液10μl，在其上覆蓋蓋玻片。另外，將蓋玻片的周圍用紙帶密封，使雜交溶液不會(huì)干燥。將其放入塑料容器中，在65℃、濕度100％的條件下培養(yǎng)10小時(shí)。培養(yǎng)后，將蓋玻片剝離，然后進(jìn)行洗滌、干燥。
(測(cè)定)為了檢測(cè)是否進(jìn)行雜交，用熒光顯微鏡(奧林巴斯光學(xué))觀察雜交后的基板上的熒光。在全部的探針部分均觀察到表示雜交的熒光發(fā)光。另外，隨堿基數(shù)增至40、60、70，斑點(diǎn)上的熒光和背景之差變大。即，隨著探針的堿基數(shù)變長(zhǎng)，S/N比提高。
然后，為了進(jìn)行定量，將上述處理后的載體放置在DNA芯片用掃描儀(Axon Instruments社的GenePix 4000B)中，在激光輸出功率為33％、光電倍增管的增益為500的狀態(tài)下進(jìn)行測(cè)定。其結(jié)果如表1所示。此處，熒光強(qiáng)度是指斑點(diǎn)內(nèi)熒光強(qiáng)度的平均值，噪聲是指斑點(diǎn)周圍(未點(diǎn)樣DNA的部分)的熒光強(qiáng)度的平均值。
比較例1在實(shí)施例1的基板并非PMMA而是玻璃的情況下進(jìn)行試驗(yàn)。
將載玻片在10N NaOH水溶液中浸漬1小時(shí)后，用純水充分洗滌。然后，將APS(3-氨基丙基三乙氧基硅烷；信越化學(xué)工業(yè)(株)制)以2重量體積％的比例溶解在純水中后，將上述載玻片浸漬1小時(shí)，從上述溶液中取出后，在110℃下干燥10分鐘。由此，在玻璃表面導(dǎo)入氨基。
然后，將5.5g的琥珀酸酐溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮335ml中。在1M的50ml硼酸鈉(加入硼酸3.09g和pH調(diào)節(jié)用氫氧化鈉，用純水加至50ml得到的溶液，pH8.0)中添加上述琥珀酸溶液。將上述玻璃基板在上述混合液中浸漬20分鐘。浸漬后，用純水洗滌并干燥。由此，使玻璃基板表面的氨基和琥珀酸酐反應(yīng)，在玻璃表面導(dǎo)入羧基。將其用作DNA固定化用基板。再按與實(shí)施例1同樣的順序?qū)A基序列1～4的DNA固定在上述玻璃基板上。上述反應(yīng)流程如圖7所示(圖7中，2表示選擇結(jié)合性物質(zhì)(DNA)，5表示玻璃基板)。然后，按與實(shí)施例1同樣的順序進(jìn)行雜交。在與實(shí)施例1相同的條件下用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。
用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察時(shí)，玻璃基板中探針部分為40堿基或40堿基以上時(shí)也觀察到發(fā)光。但是，與基板為PMMA時(shí)相比，比較例的3個(gè)玻璃基板的熒光強(qiáng)度明顯微弱。而且，為了進(jìn)行定量，用掃描儀測(cè)定上述基板的熒光強(qiáng)度。其結(jié)果與實(shí)施例1一并示于表1。由表1的結(jié)果可知，玻璃基板的熒光微弱，且噪聲也較大，S/N比變差。
另外，使用市售的其他導(dǎo)入了氨基的載玻片，按與上述相同的流程進(jìn)行至DNA的固定、雜交。所使用的載玻片為DNA微陣列用涂布載玻片高密度氨基導(dǎo)入型(松浪硝子工業(yè)(株)制；產(chǎn)品編號(hào)SD00011)和MAS涂布載玻片(松浪硝子工業(yè)(株)制；產(chǎn)品編號(hào)S081110)。同樣地進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果為即使使用上述載玻片，S/N比也比以PMMA為基板時(shí)差。其結(jié)果如表1所示。
表1

比較例2(載玻片的調(diào)整)與比較例1同樣地使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在載玻片的表面導(dǎo)入氨基。然后，與比較例1同樣地使用琥珀酸酐，在載玻片的表面導(dǎo)入羧基后，用乙腈洗滌，減壓下干燥1小時(shí)。將干燥后的末端導(dǎo)入了羧基的玻璃基板在EDC(955mg)及N-羥基琥珀酰亞胺(575mg)的乙腈(50ml)溶液中浸漬2小時(shí)，用乙腈洗滌，減壓下干燥1小時(shí)，得到N-羥基琥珀酰亞胺經(jīng)酯鍵導(dǎo)入表面的玻璃基板。
(DNA的固定化)使用與實(shí)施例1同樣的5’末端進(jìn)行了氨基化的DNA，將其分散在0.1M碳酸緩沖液(pH9.3)中得到水性溶液(DNA的濃度為0.027nmol/μl)，將200nl上述水性溶液點(diǎn)樣在上述得到的玻璃基板上。隨后將固定化后的玻璃基板在25℃、濕度90％的環(huán)境中放置1小時(shí)后，將上述玻璃基板依次用0.1重量體積％SDS和2×SSC的混合溶液洗滌2次、用0.2×SSC水溶液洗滌1次。然后，將上述洗滌后的玻璃基板在0.1M甘氨酸水溶液(pH10)中浸漬1小時(shí)30分鐘后，用蒸餾水洗滌，在室溫下干燥，得到固定了DNA片段的玻璃基板。
(檢測(cè))采用與實(shí)施例1的雜交實(shí)驗(yàn)相同的順序及檢體DNA進(jìn)行雜交。結(jié)果如表2所示?？芍c實(shí)施例1的基板為PMMA時(shí)相比S/N比并不充分。
表2

實(shí)施例2(DNA固定化載體的制作)在平均分子量為15萬(wàn)的PMMA中按3重量％的比例混合炭黑，采用鑄塑法制造厚度為1mm的黑色基板。將上述黑色PMMA基板在10N的氫氧化鈉水溶液中于65℃下浸漬12小時(shí)。將其按純水、0.1N的HCl水溶液、純水的順序進(jìn)行洗滌。需要說(shuō)明的是使用Axon Instruments社的GenePix 4000B，在激發(fā)波長(zhǎng)為532nm、光電倍增管的設(shè)定增益為700、激光功率為33％的條件下進(jìn)行測(cè)定時(shí)，該板(未進(jìn)行堿處理)的自身熒光強(qiáng)度為250。使用4種與實(shí)施例1相同的探針DNA，按同樣的操作順序，制造黑色化的DNA固定化載體。
另外制作同樣的基板，測(cè)定上述黑色基板的光譜反射率和光譜透射比時(shí)，光譜反射率在可見光區(qū)域(波長(zhǎng)為400nm～800nm)的任一波長(zhǎng)下均為5％或5％以下。另外，在同范圍的波長(zhǎng)下，透射率為0.5％或0.5％以下。光譜反射率、光譜透射比在可見光區(qū)域中均不具有特定的光譜圖案(峰等)，光譜一律平坦。需要說(shuō)明的是光譜反射率使用搭載了符合JIS Z 8722的條件C的照明·受光光學(xué)體系的裝置(美能達(dá)照相機(jī)制、CM-2002)，測(cè)定測(cè)定載體發(fā)出的正反射光時(shí)的光譜反射率。
(檢體DNA的調(diào)整及雜交)采用與實(shí)施例1同樣的檢體DNA調(diào)整法及雜交法進(jìn)行。
(測(cè)定)在與實(shí)施例1相同的條件下，用掃描儀進(jìn)行熒光測(cè)定。表3給出用掃描儀進(jìn)行觀察得到的結(jié)果。與實(shí)施例1同樣地隨著堿基數(shù)增加，熒光強(qiáng)度增加。另外，與實(shí)施例1的結(jié)果相比背景減少。由此，確認(rèn)將基板制成黑色時(shí)，噪聲減低，進(jìn)一步提高了S/N比。
表3

實(shí)施例3采用比較例1的順序制作表面導(dǎo)入了3-氨基丙基三乙氧基硅烷的載玻片。在其上旋涂溶解在氯仿中的PMMA，在100℃下保持15分鐘、在115℃下保持1小時(shí)，制成由支持體層(玻璃)/選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化層(PMMA)構(gòu)成的載體。另外，旋涂后的PMMA的厚度約為20μm。
然后，將上述載體在10N的NaOH中浸漬10小時(shí)，在PMMA的表面生成羧基。與實(shí)施例1同樣地固定探針DNA、調(diào)整檢體DNA、雜交、測(cè)定熒光強(qiáng)度。此時(shí)，得到與實(shí)施例1相同的結(jié)果。另外，實(shí)施例1中，若干基板彎曲，本實(shí)施例的載體未見彎曲。
另外，即使同樣地旋涂實(shí)施例2中使用的分散了炭黑的PMMA，也能夠得到與實(shí)施例2相同的熒光強(qiáng)度和噪聲，在上述情況下也未見載體彎曲。
實(shí)施例4PMMA表面生成羧基時(shí)，代替10N的NaOH水溶液，使用10N的硫酸，除此之外進(jìn)行與實(shí)施例1相同的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果得到與實(shí)施例1同樣的結(jié)果。
實(shí)施例5制備苯乙烯和MMA(甲基丙烯酸甲酯)的共聚物。制成的聚合物組成為MMA 10mol％、苯乙烯90mol％。上述共聚物的具體制備方法為將MMA和苯乙烯按1∶9(摩爾比)的比例溶解在脫水甲苯中后，以MMA和苯乙烯總摩爾數(shù)的1/1000的比例加入AIBN(偶氮二異丁腈)，在氮?dú)鈿夥罩校?0℃下保持1小時(shí)、65℃下保持3小時(shí)、90℃下保持20小時(shí)。然后，利用乙醇沉淀、過(guò)濾進(jìn)行純化。
純化后的聚合物的組成用NMR(nuclear magnetic resonance)進(jìn)行確認(rèn)。另外，用GPC測(cè)定上述聚合物的分子量，計(jì)算數(shù)均聚合度的結(jié)果為1100。
然后，用鑄塑法將純化后的聚合物制成厚度為1mm左右的板狀。固定化的DNA僅為序列編號(hào)2的DNA，除此之外進(jìn)行與實(shí)施例1相同的實(shí)驗(yàn)。然后，在與實(shí)施例1相同的條件下，用掃描儀進(jìn)行熒光測(cè)定。結(jié)果，熒光強(qiáng)度為5200，噪聲為150，即使MMA的含量為10％，與比較例1、比較例2相比，S/N比也得以提高。另外，使用Axon Instruments社的GenePix 4000B，在激發(fā)波長(zhǎng)532nm、光電倍增管的設(shè)定增益為700、激光功率為33％的條件下，測(cè)定未實(shí)施堿處理的平板時(shí)，上述板的自身熒光強(qiáng)度為750。
比較例3制備聚苯乙烯的均聚物，采用鑄塑法制成厚度為1mm左右的板狀。使用該板，與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，完全未觀察到表示探針DNA與檢體DNA雜交的熒光。
實(shí)施例6(DNA固定化載體的制作)使用作為公知方法的LIGA(Lithographie GalvanoformungAbformung)工序，制造注塑成形用模型，利用注塑成形法得到具有下述形狀的PMMA制基板。另外，本實(shí)施例中使用的PMMA的平均分子量為15萬(wàn)，在PMMA中按1重量％的比例含有炭黑(三菱化學(xué)制#3050B)，基板為黑色。測(cè)定上述黑色基板的光譜反射率和光譜透射比時(shí)，光譜反射率在可見光區(qū)域(波長(zhǎng)為400nm～800nm)的任一波長(zhǎng)下均為5％或5％以下，另外，同范圍的波長(zhǎng)下，透射率為0.5％或0.5％以下。光譜反射率、光譜透射比在可見光區(qū)域中均不具有特定的光譜圖案(峰等)，光譜一律平坦。另外，光譜反射率使用搭載了符合JIS Z 8722的條件C的照明·受光光學(xué)體系的裝置(美能達(dá)照相機(jī)制，CM-2002)，測(cè)定載體發(fā)出的正反射光時(shí)的光譜反射率。
基板形狀的大小為縱76mm、橫26mm、厚度1mm，除了基板的中央部分外，表面平坦。在基板中央，設(shè)置直徑10mm、深度為0.2mm的凹陷部分，在凹陷之中，設(shè)置64(8×8)個(gè)最上部的直徑為0.2mm、高度為0.2mm的凸部。需要說(shuō)明的是凸部的最低部(凸部的基部)直徑為0.23mm，凸部制成錐形，以使注塑成形后的基板容易脫模。測(cè)定凹凸部分的凸部上表面的高度(64個(gè)凸部的高度的平均值)與平坦部分的高度差時(shí)，結(jié)果為3μm或3μm以下。另外，測(cè)定64個(gè)凸部上表面的高度不均(最高的凸部上表面的高度和最低的凸部上表面的高度差)、以及凸部上表面的高度的平均值和平坦部上表面的高度差時(shí)，結(jié)果分別為3μm或3μm以下。而且，凹凸部的凸部間距(從凸部中央部至相鄰的凸部中央部的距離)為0.6mm。
將上述PMMA基板在10N的氫氧化鈉水溶液中、65℃下浸漬12小時(shí)。將其依次用純水、0.1N的HCl水溶液、純水進(jìn)行洗滌，在基板表面生成羧基。另外，使用Axon Instruments社的GenePix 4000B，在激發(fā)波長(zhǎng)為532nm、光電倍增管的設(shè)定增益為700、激光功率為33％的條件下測(cè)定本實(shí)施例中使用的帶有炭黑的PMMA平板時(shí)，該板的自身熒光強(qiáng)度為250。
(探針DNA的固定化)然后，合成序列編號(hào)2(60堿基，5’末端氨基化)的DNA。上述DNA的5’末端被氨基化。將上述DNA溶解在純水中，使其濃度為0.27nmol/μl，制成貯存液。在基板上點(diǎn)樣時(shí)，用PBS(pH5.5)，使探針的最終濃度為0.027nmol/μl，并且為了使載體表面的羧基與探針DNA末端的氨基縮合，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，使最終濃度為50mg/ml。然后，用玻璃制移液管吸取上述混合溶液，在顯微鏡下，將上述探針DNA點(diǎn)樣在PMMA基板的凸部上的4部位。然后，將上述基板置于密閉的塑料容器中，在37℃、濕度100％的條件下培養(yǎng)20小時(shí)左右，然后用純水進(jìn)行洗滌。
(檢體DNA的調(diào)整)與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。
(雜交)取出10μl在上述“檢體DNA的調(diào)整”階段中調(diào)整后的DNA溶液，在其中添加30μl的1重量體積％BSA、5×SSC、0.1重量體積％SDS、0.01重量體積％鮭精子DNA溶液，使總量為40μl(即，與實(shí)施例1或2相比，檢體的濃度為1/4，檢體總量與實(shí)施例1相同)。然后，將其滴加在固定了上述DNA的載體的凹凸部分，謹(jǐn)慎地覆蓋蓋玻片。然后，用紙帶將蓋玻片的周圍密封，使雜交溶液不會(huì)干燥。即，使檢體DNA的分子量與實(shí)施例1或比較例1相同。將其放入塑料容器，在濕度100％、溫度65℃的狀態(tài)下培養(yǎng)10小時(shí)。培養(yǎng)后，剝離蓋玻片，進(jìn)行洗滌、干燥。
(測(cè)定)在與實(shí)施例1相同的條件下，用掃描儀進(jìn)行熒光測(cè)定。其結(jié)果如表4所示。
表4

由此可知，熒光強(qiáng)度與實(shí)施例2大致相同，噪聲遠(yuǎn)低于實(shí)施例2。
實(shí)施例7然后，在凸部的高度不均的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用砂紙研磨實(shí)施例6中使用的PMMA的注塑成形品的凸部，在凸部上表面設(shè)置高度差。即，分別制作存在比其他凸部上表面(作為基準(zhǔn)的凸部)低30μm的凸部(4個(gè)部位)的載體(載體A)、存在比其他凸部上表面低50μm的凸部(4個(gè)部位)的載體(載體B)。需要說(shuō)明的是上述載體的低部以外的凸部(作為基準(zhǔn)的凸部)上表面的高度與平坦部分的高度差為3μm或3μm以下。與實(shí)施例6同樣地調(diào)整點(diǎn)樣的探針DNA。然后，在作為基準(zhǔn)的凸部上表面的4個(gè)部位、在較低的凸部上表面的4個(gè)部位與實(shí)施例6同樣地點(diǎn)樣探針DNA溶液。再與實(shí)施例6同樣地調(diào)整雜交用DNA、進(jìn)行雜交，測(cè)定也與實(shí)施例6同樣地進(jìn)行。作為基準(zhǔn)的凸部上表面的熒光強(qiáng)度平均值及其周圍噪聲的平均值、高度低的凸部上表面的熒光強(qiáng)度平均值及其周圍噪聲的平均值如表5所示。
表5

由此可知，即使凸部的高度存在不均(50μm或50μm以下)，與比較例相比，也能夠獲得足夠大的S/N。
實(shí)施例8就對(duì)凸部上表面與平坦部存在差異的情況進(jìn)行進(jìn)一步研究。用砂紙研磨實(shí)施例6中使用的PMMA的注塑成形品的平坦部，制作平坦部上表面和凸部上表面的高度差為30μm(載體C)、50μm(載體D)的2種載體。即，載體C的凸部高度比平坦部的高度高30μm。與實(shí)施例6同樣地調(diào)整點(diǎn)樣的探針DNA、在凸部上表面點(diǎn)樣探針DNA溶液、調(diào)整雜交用DNA、進(jìn)行雜交，與實(shí)施例6同樣地進(jìn)行測(cè)定。需要說(shuō)明的是在上表面點(diǎn)樣DNA溶液的凸部在各基板上存在4個(gè)部位。然后，求出點(diǎn)樣DNA形成的斑點(diǎn)(4個(gè)部位)的熒光強(qiáng)度和其周圍的噪聲(4個(gè)部位)的平均值。其結(jié)果如表6所示。
表6

由此可知，即使平坦部上表面和凸部上表面的高度存在差異(50μm或50μm以下)，與比較例相比，能夠得到足夠大的S/N。
實(shí)施例9用鑄塑法制作聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸苯酯的平板，將其在10N的氫氧化鈉水溶液中、50℃下浸漬10小時(shí)。然后，按純水、0.1N HCl水溶液、純水的順序進(jìn)行洗滌。由此，將板表面的聚合物的側(cè)鏈水解，生成羧基。
與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行探針DNA的固定化(其中，固定化的探針DNA僅為60堿基長(zhǎng)度)、檢體DNA的調(diào)整、雜交、測(cè)定。其結(jié)果如表7所示。
表7

由此可知，與比較例相比能夠獲得足夠大的S/N。
實(shí)施例10(DNA固定化載體的制作)制作與實(shí)施例6相同的基板。然后，采用濺鍍法在上述基板上制作50nm的Ni-Cr(組成為Ni8Cr2)。另外，準(zhǔn)備在每10mL氯仿中按1g的比例溶解上述基板(未設(shè)置Ni-Cr膜)的粉碎物得到的溶液。然后，采用旋涂法涂布上述溶液，在Ni-Cr膜上制作由黑色的PMMA膜構(gòu)成的絕緣層。然后，用研磨機(jī)除去凸部上表面的絕緣層、Ni-Cr膜后，浸漬在65℃的10N NaOH溶液后，按純水、0.1N的HCl水溶液、純水的順序進(jìn)行洗滌。然后，與實(shí)施例6同樣地進(jìn)行探針DNA的固定化、檢體DNA的調(diào)整。
(雜交)在蓋玻片上蒸鍍鉻5nm、金100nm。用釬料在其上焊接金線。另外，在預(yù)先準(zhǔn)備的固定了核酸的載體的凹凸部分加入雜交用溶液50μl，使蓋玻片的金面朝向載體的凹凸部分，覆蓋上述蓋玻片。此時(shí)，為了不使載體的金與蓋玻片的金發(fā)生電短路，在其間插入高度為0.2mm的間隔物。用紙帶將蓋玻片的周圍密封，使雜交溶液不會(huì)干燥。
然后，使用金線及市售的銀糊料進(jìn)行連接，使載體的Ni-Cr膜與電源的陽(yáng)極電導(dǎo)通，將蓋玻片的金(金線)連接在電源的陰極上。將其放入65℃的烘箱中培養(yǎng)15分鐘。然后，由電源施加1V的電壓5分鐘后，從烘箱中取出，將蓋玻片剝離后進(jìn)行洗滌、干燥。
其結(jié)果為得到與實(shí)施例6相同的結(jié)果。由此可知，即使縮短雜交時(shí)間，也可以通過(guò)在凸部的側(cè)面設(shè)置電極、施加電場(chǎng)來(lái)縮短雜交的時(shí)間。
比較例4將以聚丙烯腈為主成分的厚度為1mm的板(三井化學(xué)(株)制ZEXLON)裁切成75mm×25mm的大小。將其浸漬在10N NaOH中，在70℃下放置12小時(shí)。將其洗滌后，與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行探針DNA的固定化(探針DNA的堿基長(zhǎng)度為60堿基)、與檢體DNA的雜交。與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果為自身熒光較強(qiáng)、無(wú)法檢測(cè)檢體與探針是否發(fā)生雜交。這是由于板本身帶有黃色，因此自身熒光非常強(qiáng)。另外，使用Axon Instruments社的GenePix 4000B，在激發(fā)波長(zhǎng)532nm、光電倍增管的設(shè)定增益為700、激光功率為33％的條件下測(cè)定堿處理前的平板時(shí)，該板的自身熒光強(qiáng)度為30000，非常大。
比較例5使甲基丙烯酸甲酯(MMA)99重量份與甲基丙烯酸1重量份共聚。將其純化后，溶于溶劑中，采用浸漬法在由PMMA構(gòu)成的板上制造由上述聚合物構(gòu)成的膜。省略在堿中浸漬的工序，除此之外，與實(shí)施例1同樣地在上述膜上固定探針DNA(60堿基長(zhǎng))、與檢體DNA雜交，與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行測(cè)定。其結(jié)果為信號(hào)6000、噪聲300。
實(shí)施例11使甲基丙烯酸甲酯(MMA)99重量份與甲基丙烯酸1重量份共聚。將其純化后，溶解在溶劑中，采用浸漬法在PMMA板上制作由上述共聚物構(gòu)成的膜。在50℃下將其在堿中浸漬10小時(shí)，除此之外，與實(shí)施例1同樣地在上述膜上固定探針DNA(60堿基長(zhǎng))、與檢體DNA雜交，與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行測(cè)定。其結(jié)果為信號(hào)15000、噪聲150。推測(cè)本實(shí)施例優(yōu)于比較例5的理由為通過(guò)進(jìn)行堿處理，使載體表面的羧基量增加。另外，采用鑄塑法制作由甲基丙烯酸甲酯(MMA)99重量份和甲基丙烯酸1重量份共聚而成的聚合物構(gòu)成的厚度為1mm的板，使用Axon Instruments社的GenePix 4000B，在激發(fā)波長(zhǎng)532nm、光電倍增管的設(shè)定增益為700、激光功率為33％的條件下測(cè)定未實(shí)施堿處理的平板時(shí)，上述板的自身熒光強(qiáng)度為850。
比較例6省略實(shí)施例1的堿處理(浸漬在氫氧化鈉中的處理)，除此之外，進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。此時(shí)，未觀察到表示雜交的熒光。這是因?yàn)槿绻挥脡A處理品或酸進(jìn)行表面處理，則未充分生成羧基，結(jié)果固定化的探針DNA非常少。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種非特異性檢體的吸附少、且雜交效率良好、S/N比良好的固定了選擇結(jié)合物質(zhì)的載體。
序列表<110>東麗株式會(huì)社<120>選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體<130>TD-04021-PCT<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>70<212>DNA<213>質(zhì)粒pKF3<400>1atcgtaaaga acattttgag gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg 60ttcatctgga70<210>2<211>60<212>DNA<213>質(zhì)粒pKF3<400>2acattttgag gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcatctgga 60<210>3<211>40<212>DNA<213>質(zhì)粒pKF3<400>3cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcatctgga 40<210>4<211>20<212>DNA<213>質(zhì)粒pKF3
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<211>968<212>DNA<213>質(zhì)粒pKF3<400>8gggcgaagaa gttgtccata ttagccacgt ttaaatcaaa actggtgaaa ctcacccagg 60gattggctga gacgaaaaac atattctcaa taaacccttt agggaaatag gccaggtttt 120caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata tgtgtagaaa ctgccggaaa tcgtcgtggt 180attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag tttgctcatg gaaaacggtg taacaagggt 240gaacactatc ccatatcacc agctcaccgt ctttcattgc catacgaaat tccgtatgag 300cattcatcag gcgggcaaga atgtgaataa aggccggata aaacttgtgc ttatttttct 360ttacggtctt taaaaaggcc gtaatatcca gatgaacggt ctggttatag gtacattgag 420caactgactg aaatgcctca aaatgttctt tacgatgcca ttgggatata tcaacggtgg 480tatatccagt gatttttttc tccattttag cttccttagc tcctgaaaat ctcgataact 540caaaaaatac gcccggtagt gatcttattt cattatggtg aaagttggaa cctcttacgt 600gccgatcaac gtctcatttt cgccaaaagt tggcccaggg cttcccggta tcaacaggga 660caccaggatt tatttattct gcgaagtgat cttccgttcg acggagttcc actgagcgtc 720agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 780ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 840accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 900tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 960cgctctgc 968
權(quán)利要求
1.一種選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，是固定了選擇結(jié)合性物質(zhì)的載體，其特征為，該載體的表面由低自身熒光樹脂構(gòu)成，用堿或酸對(duì)所述聚合物的表面進(jìn)行處理，生成羧基，然后固定選擇結(jié)合性物質(zhì)。
2.一種選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，是在載體表面固定了選擇結(jié)合性物質(zhì)的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，載體表面具有含有用下述通式(1)表示的結(jié)構(gòu)單元的聚合物，在用堿或酸對(duì)所述聚合物的表面進(jìn)行處理后，固定選擇結(jié)合性物質(zhì)， 通式(1)的R1、R2、R3表示烷基、芳基或氫原子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，用堿或酸處理載體表面的聚合物，使通式(1)構(gòu)成的結(jié)構(gòu)單元的側(cè)鏈為羧基，使所述羧基和選擇結(jié)合性物質(zhì)的官能團(tuán)結(jié)合，由此固定選擇結(jié)合性物質(zhì)。
4.如權(quán)利要求1或2所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，載體表面的聚合物中通式(1)的結(jié)構(gòu)單元含量占全部單體單元的10％或10％以上。
5.如權(quán)利要求1或2所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，利用選擇結(jié)合性物質(zhì)的氨基或羥基與載體表面的羧基形成的共價(jià)鍵，將選擇結(jié)合性物質(zhì)固定在載體上。
6.如權(quán)利要求1或2所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，選擇結(jié)合性物質(zhì)為核酸。
7.如權(quán)利要求1或2所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，具有通式(1)的結(jié)構(gòu)單元的聚合物為聚甲基丙烯酸甲酯。
8.如權(quán)利要求1或2所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，載體表面為黑色。
9.如權(quán)利要求8所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，具有通式(1)表示的結(jié)構(gòu)單元的聚合物含有炭黑。
10.如權(quán)利要求1或2所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，載體至少具有支持體層和選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化層，選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化層表面具有包含所述通式(1)表示的結(jié)構(gòu)單元的聚合物，且選擇結(jié)合性物質(zhì)與選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化層的表面結(jié)合。
11.如權(quán)利要求10所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，支持體層為玻璃或金屬。
12.如權(quán)利要求1或2所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，所述載體是固定擇結(jié)合性物質(zhì)的載體，在該載體上設(shè)置凹凸部，選擇結(jié)合性物質(zhì)被固定在凹凸部的多個(gè)凸部的上表面。
13.如權(quán)利要求12所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，該凹凸部的凸部上表面實(shí)質(zhì)上平坦，固定了選擇結(jié)合性物質(zhì)的凸部上表面的高度大致相同。
14.如權(quán)利要求12所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，該載體上設(shè)置平坦部。
15.如權(quán)利要求12所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，固定選擇性結(jié)合物質(zhì)的多個(gè)凸部?jī)?nèi)，最高的凸部的高度和最低的凸部的高度差為50μm或50μm以下。
16.如權(quán)利要求14所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，凹凸部的凸部上表面的高度與平坦部分的高度差為50μm或50μm以下。
17.如權(quán)利要求12所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，載體表面為黑色。
18.如權(quán)利要求17所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，具有通式(1)表示的結(jié)構(gòu)單元的聚合物含有炭黑。
19.如權(quán)利要求12所述的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，在凸部的側(cè)面設(shè)置導(dǎo)電性材料。
全文摘要
一種選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，是在載體表面固定了選擇結(jié)合性物質(zhì)的選擇結(jié)合性物質(zhì)固定化載體，其特征為，載體表面具有聚合物，該聚合物含有占總單體單元的 10％或10％以上的用所述通式(1)表示的結(jié)構(gòu)單元，利用與在載體表面生成的羧基形成的共價(jià)鍵固定選擇結(jié)合性物質(zhì)。通式(1)中的R
文檔編號(hào)B01J19/00GK1839317SQ200480005600
公開日2006年9月27日 申請(qǐng)日期2004年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月19日
發(fā)明者剃野邦久, 中村史夫, 信正均 申請(qǐng)人:東麗株式會(huì)社