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      反應(yīng)方法

      文檔序號(hào):5029979閱讀:831來源:國知局
      專利名稱:反應(yīng)方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種反應(yīng)方法,特別涉及一種反應(yīng)介質(zhì)為液體的反應(yīng)方法。
      背景技術(shù)
      在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)保、農(nóng)業(yè)、輕紡工業(yè)、化學(xué)工業(yè)等領(lǐng)域,進(jìn)行各種反應(yīng)的反應(yīng)方法往往借助于反應(yīng)器而實(shí)現(xiàn),其中所述的各種反應(yīng)大都需要催化劑進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)于在液態(tài)介質(zhì)中進(jìn)行的反應(yīng),為了提高反應(yīng)效率,反應(yīng)物和催化劑必須進(jìn)行有效的接觸。催化劑為固體時(shí)尤為如此。
      在生物、醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中,酶或含酶的細(xì)胞是眾多催化劑中比較引人注目的一類催化劑。而且,目前酶或含酶的細(xì)胞等多以固定化的形式使用,這是因?yàn)楣潭ɑ?固定化細(xì)胞通常比溶液酶穩(wěn)定且可從產(chǎn)品中分離回收、重復(fù)使用(生物催化工藝學(xué),孫志浩主編,化學(xué)工業(yè)出版社,北京,2005年),從而其成本可大幅降低。但大多數(shù)包括固定化酶和/或固定化細(xì)胞的固相催化劑的催化活力則較相應(yīng)的溶液酶低。
      目前,使用固相催化劑的反應(yīng)器主要有兩種即填充床反應(yīng)器和攪拌式反應(yīng)器,其中,攪拌式反應(yīng)器含有反應(yīng)罐,該反應(yīng)罐包括罐體、罐體內(nèi)的轉(zhuǎn)軸和諸如攪拌槳的攪拌器。一般而言,使用填充床反應(yīng)器的反應(yīng)方法較為簡單,具體過程為預(yù)先將顆粒狀或片狀固相催化劑填充到填充床反應(yīng)器中,反應(yīng)時(shí)底物溶液流經(jīng)填充床而使得固相催化劑與底物混合以使反應(yīng)物和催化劑進(jìn)行有效接觸。使用攪拌式反應(yīng)器的反應(yīng)方法具體過程為先將顆粒狀或塊狀的固相催化劑懸浮在反應(yīng)罐內(nèi)的底物溶液中,然后在反應(yīng)時(shí)通過攪拌槳進(jìn)行攪拌或借助于氣泡流動(dòng)而使固相催化劑與底物充分混合以使反應(yīng)物和催化劑進(jìn)行有效接觸。
      盡管上述兩種反應(yīng)方法均能實(shí)現(xiàn)將固相催化劑與底物的混合而使反應(yīng)物和催化劑進(jìn)行有效接觸,但在實(shí)際應(yīng)用中不可避免地存在下述問題就使用填充床反應(yīng)器的反應(yīng)方法而言,其存在的問題是[1]底物與固相催化劑之間的交換效率較低;[2]反應(yīng)過程不易補(bǔ)料和通氣體,也不易調(diào)節(jié)pH值及溫度等;[3]不適于粘性或不溶性底物;[4]使用顆粒較小的固相催化劑時(shí),床層壓降大,這導(dǎo)致容易出現(xiàn)阻塞。
      就使用攪拌式反應(yīng)器的反應(yīng)方法而言,盡管其可根據(jù)需要來調(diào)節(jié)各種反應(yīng)條件,但是在攪拌槳進(jìn)行攪拌的過程中,由于固相催化劑懸浮在反應(yīng)罐內(nèi)的底物溶液中,因此在固相催化劑顆粒之間、固相催化劑顆粒與攪拌槳之間以及固相催化劑顆粒與反應(yīng)罐罐壁之間均會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈碰撞(酶學(xué),陳石根和周潤琦編,復(fù)旦大學(xué)出版社,上海,2001年;生物反應(yīng)工程,戚以政和夏杰編著,化學(xué)工業(yè)出版社,北京,2004年),因而導(dǎo)致固相催化劑顆粒因碰撞而碎裂和磨損,從而使得固相催化劑活力下降、使用壽命變短,并且固相催化劑因碎裂和磨損會(huì)產(chǎn)生碎片或粉渣,而這些碎片或粉渣隨反應(yīng)的進(jìn)行會(huì)流失,這會(huì)妨礙反應(yīng)液的后續(xù)處理,如產(chǎn)品的過濾和純化等。而且,眾所周知,懸浮在溶液中的固相催化劑顆粒的密度越大、運(yùn)動(dòng)(轉(zhuǎn)速)越快,反應(yīng)的效率就越高;但與此同時(shí),顆粒受碰撞的強(qiáng)度也隨之增大,固相催化劑也就越容易碎裂,其活力的下降也越快。因而,使用攪拌式反應(yīng)器的反應(yīng)方法的應(yīng)用范圍受到局限,尤為不適用于本身就易碎的固相催化劑顆粒。

      發(fā)明內(nèi)容
      為克服現(xiàn)有反應(yīng)方法存在的上述缺陷,本發(fā)明提供了這樣一種反應(yīng)方法其能夠防止催化劑活力下降、延長催化劑的使用壽命,并具有交換效率高、反應(yīng)充分以及應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)。
      本發(fā)明提供的技術(shù)方案為提供一種適用于由固相催化劑催化的反應(yīng)方法,所述方法使用包括至少一個(gè)反應(yīng)罐的反應(yīng)器,所述反應(yīng)罐包括罐體以及可轉(zhuǎn)動(dòng)地安裝于罐體內(nèi)的轉(zhuǎn)軸,所述固相催化劑固定于所述的轉(zhuǎn)軸上,所述固相催化劑具有可通透反應(yīng)液和氣體的孔,該固相催化劑在隨著轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)還充當(dāng)攪拌器的作用,在反應(yīng)液中隨轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生離心力并同時(shí)在固相催化劑內(nèi)造成負(fù)壓,該離心力迫使反應(yīng)液沿離心方向貫穿固相催化劑后甩出,而被甩出的反應(yīng)液則再度循負(fù)壓流經(jīng)固相催化劑,如此形成循環(huán)回流,從而使所述反應(yīng)液和氣體貫穿所述固相催化劑并與之充分而有效地接觸。
      在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方式中,所述固相催化劑為柱體形式,該柱體可由整個(gè)的片材卷繞而成,該柱體也可是中空的柱體,例如一種在其軸線附近設(shè)有用于安裝轉(zhuǎn)軸的空腔的柱體。該中空柱體套在所述的轉(zhuǎn)軸上。
      可以采用捆綁方式將所述固相催化劑直接固定到所述的轉(zhuǎn)軸。根據(jù)反應(yīng)的需要,所述固相催化劑的體積與反應(yīng)罐的體積之比在1%至95%之間。該體積之比因不同的催化反應(yīng)和需要而定。一般而言,該體積之比越高,反應(yīng)進(jìn)行得越快,故適用于不穩(wěn)定或易降解的底物和/或產(chǎn)物。但該體積之比過高則會(huì)導(dǎo)致催化効率下降;另一方面,該體積之比過小(如少于5%)則降低攪拌効率,從而影響反應(yīng)速率。
      所述轉(zhuǎn)軸具有與罐體內(nèi)外相通的用于輸送液體和/或氣體的孔道。所述反應(yīng)罐可以以直立式或臥式或其它方式安置。
      在本發(fā)明的一個(gè)更為具體的實(shí)施方案中,所述固相催化劑是固定化酶/固定化細(xì)胞。優(yōu)選的是,所述固定化酶或細(xì)胞由酶或表達(dá)酶的細(xì)胞與作為固定化載體的開孔的多孔有機(jī)泡沫材料制成的,所述有機(jī)泡沫材料包括木漿海綿、聚乙烯醇海綿或三聚氰胺海綿。
      根據(jù)所用固相催化劑的性能及其所催化的反應(yīng)的要求,所述轉(zhuǎn)軸的轉(zhuǎn)速可以在很寬的范圍內(nèi)選擇,例如可以為20~20,000rpm。當(dāng)轉(zhuǎn)速低于20rpm,反應(yīng)液不能充分有效地和催化劑接觸,反應(yīng)效率不高,當(dāng)轉(zhuǎn)速高于20000rpm,消耗的能量比較大,對(duì)于節(jié)約成本不利。一般優(yōu)選的范圍為50~10,000rpm,更為優(yōu)選的范圍為100~1,000rpm,例如可為300~600rpm。
      相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù),本發(fā)明的有益效果是
      第一,在本發(fā)明的反應(yīng)方法中,所使用的反應(yīng)器無需采用單獨(dú)的攪拌器。在本發(fā)明方法中所使用的整塊/整片的固相催化劑具有離心攪拌功能,所謂離心攪拌是在離心作用下使反應(yīng)液或反應(yīng)液和氣體與固相催化劑接觸,就此而言,其效果類似于攪拌槳等攪拌器的攪拌動(dòng)作所產(chǎn)生的效果,因此本發(fā)明的反應(yīng)方法所使用的反應(yīng)器無需采用攪拌器。
      第二,利用本發(fā)明提供的反應(yīng)方法,不存在固相催化劑彼此之間、固相催化劑與攪拌器之間以及固相催化劑與反應(yīng)罐罐壁之間的碰撞,因而,可以避免固相催化劑因碰撞而碎裂和磨損,從而可以避免固相催化劑因碎裂和磨損而導(dǎo)致酶的活力下降、壽命降低。
      第三,本發(fā)明反應(yīng)方法的固相催化劑的分離、更換步驟更加簡單。由于采用的整體式的固相催化劑,在反應(yīng)完成后或更換催化劑只需要將該催化劑從轉(zhuǎn)軸上取下,進(jìn)而換上新的催化劑即可。
      第四,本發(fā)明提供的反應(yīng)方法的應(yīng)用范圍廣泛。根據(jù)不同的應(yīng)用場(chǎng)合,本發(fā)明提供的反應(yīng)方法所使用的反應(yīng)器以及其中整塊/整片的固相催化劑可以采取各種式樣,其外形可以是例如圓筒狀、球狀、棱柱狀、方塊狀等規(guī)則形狀,也可以是螺旋狀、階梯狀等不規(guī)則形狀。
      第五,本發(fā)明提供的反應(yīng)方法所使用的反應(yīng)器中,采用整塊/整片的固相催化劑,反應(yīng)罐內(nèi)固相催化劑的荷載量可遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過現(xiàn)有的攪拌式反應(yīng)器,達(dá)到罐體總?cè)萘康?5%或以上,反應(yīng)速度可因之提高,反應(yīng)時(shí)間則相應(yīng)縮短。這對(duì)容易降解的底物或產(chǎn)物尤為有利。而且,高密度的固相催化劑用量更可提高反應(yīng)時(shí)底物的濃度,進(jìn)而加快反應(yīng)速度,有助于產(chǎn)物的純化、結(jié)晶等以及提高產(chǎn)率。
      第六,利用本發(fā)明提供的反應(yīng)方法,在整塊/整片的固相催化劑隨轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)時(shí),進(jìn)入整塊/整片的固相催化劑內(nèi)的反應(yīng)液在離心作用下貫穿整塊/整片的固相催化劑并被甩出,同時(shí)在固相催化劑內(nèi)造成負(fù)壓,而被甩出的反應(yīng)液則循負(fù)壓再度流經(jīng)整塊/整片的固相催化劑,如此形成循環(huán)回流,從而提高了交換效率。而且,離心作用使得反應(yīng)液與固相催化劑表面之間的傳質(zhì)加快,因此相對(duì)于填充床反應(yīng)器,利用本發(fā)明提供的反應(yīng)方法,其反應(yīng)催化效率大大提升。更為重要的是,由于整塊/整片的固相催化劑具有孔,因而使反應(yīng)液可以直接經(jīng)由該孔貫穿整塊/整片的固相催化劑而與催化劑充分接觸,進(jìn)而也提高了交換效率。
      第七,利用本發(fā)明提供的反應(yīng)方法,便于在反應(yīng)過程中進(jìn)行補(bǔ)料、通氣、pH調(diào)節(jié)及溫度調(diào)節(jié)等操作,從而克服了使用填充床反應(yīng)器的反應(yīng)方法在此方面的缺陷及應(yīng)用障礙。


      下面結(jié)合附圖具體實(shí)施方式
      以及應(yīng)用實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
      圖1是本發(fā)明提供的反應(yīng)方法所采用的反應(yīng)器的一種結(jié)構(gòu)的示意圖;圖2是本發(fā)明提供的反應(yīng)方法所采用的反應(yīng)器的另一種結(jié)構(gòu)的示意圖;圖3是圖1所示反應(yīng)器的一個(gè)具體實(shí)施方式
      的結(jié)構(gòu)示意圖;以及圖4是表達(dá)D-氨基酸氧化酶的載體pHS-GHA的核苷酸序列。
      具體實(shí)施例方式
      下面結(jié)合圖1對(duì)本發(fā)明提供的反應(yīng)方法進(jìn)行詳細(xì)說明。
      首先描述本發(fā)明的反應(yīng)方法所使用的反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)。
      請(qǐng)參閱圖1,本發(fā)明的反應(yīng)方法所使用的反應(yīng)器包括至少一個(gè)反應(yīng)罐,該反應(yīng)罐包括罐體51、轉(zhuǎn)軸21和固相催化劑20。該固相催化劑20指的是整塊/整片的固相催化劑。轉(zhuǎn)軸21安裝于罐體51內(nèi),其在電機(jī)或其它傳動(dòng)裝置(未圖標(biāo))的帶動(dòng)下以一定的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)。固相催化劑20具有能夠通透反應(yīng)液、通透氣體的孔。如圖所示,固相催化劑20的中央位置處開設(shè)有通孔,用以將轉(zhuǎn)軸21穿插在此通孔內(nèi)(如必要還可以借助于固定裝置(未圖標(biāo))),將固相催化劑20固定在轉(zhuǎn)軸21上。
      下面具體說明各個(gè)組成部分。
      罐體51一般用不銹鋼材料制成,當(dāng)然也可用其它材料制成,其外形與罐內(nèi)轉(zhuǎn)軸21和固相催化劑20的塊數(shù)或片數(shù)以及排列有關(guān),例如,當(dāng)罐內(nèi)只有一根轉(zhuǎn)軸21時(shí),罐體51的外形可為圓柱形且兩端呈圓弧狀;當(dāng)罐內(nèi)有多根轉(zhuǎn)軸21時(shí),罐體51的外形可為扁的柱形、波浪柱形或其它形狀。并且,罐體51具有一個(gè)或多個(gè)輸液管口以及可拆卸的罐蓋和/或罐底。安裝完成的反應(yīng)罐可為直立式(即,轉(zhuǎn)軸21垂直于罐底),也可為臥式(即,轉(zhuǎn)軸21平行于罐底),當(dāng)然也可為傾斜形式等其它形式。至于罐體51的加熱、保溫以及溫度、pH、氣體等的探測(cè)與調(diào)節(jié)方式,可以與現(xiàn)有的反應(yīng)器相同。
      轉(zhuǎn)軸21可以具有與罐體51內(nèi)外相通的縱向孔道,因而兼具輸液功能。轉(zhuǎn)軸21縱穿罐體51,其一端與電機(jī)或其它傳動(dòng)裝置連接,另一端連接罐外的輸液管道。轉(zhuǎn)軸21的支點(diǎn)位于罐體51兩端罐壁上,當(dāng)罐內(nèi)僅有一根轉(zhuǎn)軸21時(shí),其支點(diǎn)位置優(yōu)選地位于兩端罐壁的中央位置處;當(dāng)罐內(nèi)有多根轉(zhuǎn)軸21時(shí),根據(jù)實(shí)際需要確定轉(zhuǎn)軸21的支點(diǎn)位置。轉(zhuǎn)軸21與罐壁的交聯(lián)處裝有軸承和防止漏液的裝置(如油封)。
      固相催化劑20與整個(gè)反應(yīng)罐的體積之比可達(dá)95%或更高。其外形可以為通常的規(guī)則形狀,例如圓柱狀、球狀、棱柱狀、方塊狀等,也可以為不規(guī)則形狀,例如螺旋狀、階梯狀等各種形狀。當(dāng)為柱體形狀時(shí),其可以是整個(gè)的實(shí)心柱體形式,也可以是由片材卷繞而成的柱體,或者是中空的柱體形式。為加強(qiáng)固相催化劑20的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度,可在其外周設(shè)置一個(gè)或多個(gè)緊固環(huán)。
      至于固定裝置,例如可以是帶螺栓的鋼環(huán),將鋼環(huán)套在固相催化劑20的外周,擰緊螺栓來實(shí)現(xiàn)固定;或者可以是繩索等,用其捆綁固相催化劑20的外周而將固相催化劑20固定到轉(zhuǎn)軸21上。當(dāng)然,也可以采用其它固定裝置或者其它固定方式將固相催化劑20固定到轉(zhuǎn)軸21上,例如在固相催化劑20和轉(zhuǎn)軸21之間添加物質(zhì),使得固相催化劑20借助于添加的物質(zhì)而緊緊擠壓轉(zhuǎn)軸21,由此產(chǎn)生摩擦力來將固相催化劑20與轉(zhuǎn)軸21緊緊固定在一起。
      需要指出的是,在如上所述的反應(yīng)器的一個(gè)反應(yīng)罐內(nèi),可根據(jù)需要配置一塊/片固相催化劑20或多塊/片固相催化劑20。多塊/片固相催化劑20可串聯(lián)在同一根轉(zhuǎn)軸21上,也可并聯(lián)在不同的轉(zhuǎn)軸21上,并且多塊/片串聯(lián)的固相催化劑20可并列安裝于同一反應(yīng)罐內(nèi)。而且,在如上所述的反應(yīng)器中,可以具有多個(gè)反應(yīng)罐。根據(jù)實(shí)際需要,這些反應(yīng)罐可以相互串聯(lián)或并聯(lián),并且,其中一部分反應(yīng)罐并不僅僅局限于用作反應(yīng)罐,也可用于其它用途,例如用作預(yù)熱罐等。
      下面說明本發(fā)明提供的反應(yīng)方法的原理和過程。
      本發(fā)明提供的反應(yīng)方法使用圖1所示的反應(yīng)器,罐體51中裝有反應(yīng)液等,反應(yīng)液可通過固相催化劑20的孔進(jìn)出固相催化劑20。當(dāng)固定到轉(zhuǎn)軸21上的固相催化劑20與轉(zhuǎn)軸21一同旋轉(zhuǎn)時(shí),進(jìn)入固相催化劑20的反應(yīng)液在離心作用下沿離心方向貫穿整塊/整片固相催化劑,從而使反應(yīng)液和氣體與固相催化劑20充分接觸,該方式的作用結(jié)果類似于攪拌槳等攪拌器的作用結(jié)果,因此,也可以將固相催化劑20視為攪拌槳或轉(zhuǎn)子。
      利用本發(fā)明提供的反應(yīng)方法進(jìn)行反應(yīng)時(shí),首先將預(yù)先制備的整塊/整片的固相催化劑20固定在反應(yīng)罐內(nèi)的轉(zhuǎn)軸21上,該固相催化劑20具有可通透反應(yīng)液和通透氣體的孔。將固相催化劑20裝入反應(yīng)罐后,關(guān)閉罐蓋,向罐體51內(nèi)注入適當(dāng)溫度和體積的反應(yīng)液,之后啟動(dòng)電機(jī)或其它傳動(dòng)裝置以帶動(dòng)轉(zhuǎn)軸21離心旋轉(zhuǎn),這樣,當(dāng)固相催化劑20隨轉(zhuǎn)軸21旋轉(zhuǎn)時(shí),進(jìn)入固相催化劑20內(nèi)的反應(yīng)液在離心作用下沿離心方向貫穿整塊/整片固相催化劑20,從而使反應(yīng)液和氣體與固相催化劑20充分接觸。逐步調(diào)整轉(zhuǎn)速至最佳反應(yīng)效率,一般而言,轉(zhuǎn)速越快,上述回流越快,底物與酶分子接觸越頻繁,而底物/產(chǎn)物與酶分子等的交換也就越快,反應(yīng)速度也隨之加快。
      上述反應(yīng)可批量、半批量半連續(xù)或連續(xù)進(jìn)行。所謂批量反應(yīng),指的是反應(yīng)完成后排放全部反應(yīng)液,然后注入新的底物溶液進(jìn)行下一輪反應(yīng);所謂半批量半連續(xù),指的是在反應(yīng)過程中底物連續(xù)或批量加入、而產(chǎn)物批量或一次性排出;所謂連續(xù)反應(yīng),指的是反應(yīng)進(jìn)行過程中反應(yīng)液不斷地輸入罐內(nèi),罐內(nèi)液體也以同樣的流速連續(xù)輸出,反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行。在實(shí)際使用中,也可將多個(gè)反應(yīng)罐串聯(lián)起來進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)以提高總體反應(yīng)效率。當(dāng)有氣體參與反應(yīng)時(shí),反應(yīng)罐處設(shè)有專門的氣體排出裝置,并可借此調(diào)節(jié)罐內(nèi)氣體的壓力。
      順便說明,上述整塊/整片固相催化劑20可以這樣制成即,采用開孔、多孔有機(jī)泡沫材料如木漿海綿、聚乙烯醇海綿和三聚氰胺海綿等作為固定化載體,先將開孔的多孔有機(jī)泡沫材料預(yù)制成片帶狀、蜂窩塊狀或其它整體結(jié)構(gòu)的載體,再用多元醛及蛋白質(zhì)凝絮劑將酶或細(xì)胞凝絮交聯(lián)于載體的三維網(wǎng)壁上,從而得到整塊/整片固相催化劑20。當(dāng)然,在實(shí)際應(yīng)用中也可以使用類似的方法來制造其它的固相催化劑。
      請(qǐng)參閱圖2,圖中所示結(jié)構(gòu)類似于圖1中的結(jié)構(gòu),其中各個(gè)部分的結(jié)構(gòu)、功能、以及彼此之間的連接作用關(guān)系類似于圖1所示反應(yīng)器,對(duì)此不再重復(fù)說明,并且與圖1相同的部分采用相同的參考標(biāo)號(hào)。
      可以看出,圖1和圖2所示結(jié)構(gòu)的不同之處僅在于圖1中,固相催化劑20固定在轉(zhuǎn)軸21的兩側(cè)或?qū)⑥D(zhuǎn)軸21包圍在其中;圖2中,固相催化劑20僅固定在轉(zhuǎn)軸21的側(cè)面。除了在固相催化劑20和轉(zhuǎn)軸21之間添加物質(zhì)并通過固相催化劑20與轉(zhuǎn)軸21擠壓而產(chǎn)生的摩擦力將固相催化劑20與轉(zhuǎn)軸21緊緊固定在一起這種方式之外,固相催化劑20和轉(zhuǎn)軸21之間的固定方式可以采用如前所述的各種固定裝置和固定方式。
      可以理解,在圖2所示的反應(yīng)器的一個(gè)反應(yīng)罐內(nèi),也可根據(jù)需要配置一個(gè)固相催化劑20或多個(gè)固相催化劑20。多個(gè)固相催化劑20可串聯(lián)或并聯(lián)在同一根轉(zhuǎn)軸21上,也可并聯(lián)在不同的轉(zhuǎn)軸21上,并且多個(gè)串聯(lián)的固相催化劑20可并列安裝于同一反應(yīng)罐內(nèi)。
      請(qǐng)參閱圖3,通過一個(gè)具體實(shí)施方式
      對(duì)本發(fā)明的反應(yīng)方法所使用的反應(yīng)器作進(jìn)一步的說明。
      在本實(shí)施方式中,本發(fā)明的反應(yīng)方法所使用反應(yīng)器包括一個(gè)反應(yīng)罐。該反應(yīng)罐的罐體51由不銹鋼材料制成,形狀為圓筒形,其內(nèi)徑為11cm,內(nèi)高為6.4cm;罐壁為雙層結(jié)構(gòu),兩層罐壁之間為循環(huán)水信道1,罐壁的外層開設(shè)有與該信道1相連的循環(huán)水輸入口2和循環(huán)水輸出口3,輸入口2和輸出口3連接恒溫水浴。
      罐體51底部開設(shè)有四個(gè)孔,分別通向放料口40、取樣口5、輸液口6及通氣口7。其中,放料口40處設(shè)置有放料閥4;通氣口7由外向內(nèi)通向嵌于罐底內(nèi)表的環(huán)形管道8。該環(huán)形管道8上有眾多的細(xì)孔通向罐內(nèi)。在罐體51底部的中央位置處設(shè)置有與轉(zhuǎn)軸21相匹配的油封9和下軸承10。
      罐體51頂部為圓形罐蓋11,罐蓋11的中央隆起形成隆起頂部12。隆起頂部12的內(nèi)表面設(shè)置有連接轉(zhuǎn)軸21的上軸承13。罐蓋11上開設(shè)有三個(gè)小孔,分別通向排液口14、補(bǔ)液口15及排氣口16。排氣口16位于隆起頂部12的中央位置處。罐蓋11上另有兩孔,分別用于安裝pH和溫度探測(cè)電極17以及進(jìn)料口螺旋蓋18。罐蓋11經(jīng)四個(gè)螺絲19與罐口吻合固定,罐口與罐蓋11的吻合面有一環(huán)形橡膠密封圈(未圖標(biāo))。
      罐內(nèi)有固相催化劑20和轉(zhuǎn)軸21。轉(zhuǎn)軸21直徑約為2cm。在固相催化劑20的中央位置處插入轉(zhuǎn)軸21,然后使用固定裝置將固相催化劑20固定到轉(zhuǎn)軸21上。轉(zhuǎn)軸21內(nèi)有縱向孔道22,此孔道22的頂部、上端23及中下端24分別通向排氣口16、罐蓋11隆起的內(nèi)腔及固相催化劑20的孔。
      調(diào)速直流電機(jī)(例如,DC直流電機(jī),200瓦,VEM MOTORS CO.,LTD.HK)位于罐體51底部中央,電機(jī)軸經(jīng)活動(dòng)關(guān)節(jié)與罐內(nèi)轉(zhuǎn)軸21連接。
      需要指出的是,本實(shí)施方式的反應(yīng)器可以利用本發(fā)明的反應(yīng)方法的基本原理對(duì)現(xiàn)行常規(guī)的攪拌式反應(yīng)器進(jìn)行改造而獲得。同現(xiàn)行常規(guī)的攪拌式反應(yīng)器相比,本實(shí)施方式中的固相催化劑既是催化劑,又是具離心攪拌功能的攪拌器(轉(zhuǎn)子);固相催化劑攪拌產(chǎn)生的離心力和負(fù)壓進(jìn)而強(qiáng)化其所具有催化作用。并且,在現(xiàn)行的攪拌式反應(yīng)器中的催化反應(yīng)中,固相催化劑與底物(反應(yīng)液)的旋轉(zhuǎn)方向和速度基本相同;而本發(fā)明的反應(yīng)方法所使用的反應(yīng)器中,反應(yīng)液與固相催化劑的旋轉(zhuǎn)方向和速度不同,并且固相催化劑攪拌產(chǎn)生的離心力和負(fù)壓形成有利于底物傳質(zhì)和產(chǎn)物傳質(zhì)的回流。此外,由于反應(yīng)是不斷循環(huán)的混勻體系,易施行補(bǔ)料、通氣、溫度調(diào)節(jié)、pH調(diào)節(jié)等操作。
      進(jìn)一步需要指出的是,本發(fā)明的反應(yīng)方法所使用的反應(yīng)器的具體操作過程及各個(gè)參數(shù)的設(shè)定將視具體應(yīng)用而定。
      下面,通過應(yīng)用實(shí)例來對(duì)本發(fā)明的反應(yīng)方法的原理、用途和有益效果作更為詳盡的說明。
      實(shí)例1.整塊開孔D-氨基酸氧化酶固定化酶直接作為攪拌槳批量攪拌反應(yīng)制備戊二酰-7-氨基頭孢霉烷酸(GL-7-ACA)首先按照下述方法制備蜂窩狀固定化D-氨基酸氧化酶塊。
      D-氨基酸氧化酶將頭孢菌素C轉(zhuǎn)化成戊二酰-7-氨基頭孢霉烷酸(GL-7-ACA)。按下列方法制備BL-HS-GHA[含有重組D-氨基酸氧化酶GHA的E.coli BL21(DE3)pLysS]大腸桿菌菌體。
      BL-HS-GHA的來源根據(jù)已知的Thermoanaerobacterium saccharolyticum glucoseisomerase DNA序列(GenBank L09699),設(shè)計(jì)PCR引物,具體為上游引物GI-NdeI5’-AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAATAAATATTTTGAGA下游引物GI-EcoRI5’-ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTATTCTGCAAACAAATAC以Thermoanaerobacterium saccharolyticum(購自ATCC,USA)DNA為模板,用上述引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增得到一1,376bp產(chǎn)物。PCR條件為50ng T.saccharolyticum DNA,0.4μM GI-NdeI,0.4μMGI-EcoRI,50μM dATP,50μM dTTP,50μM dCTP,50μM dGTP,20mM Tris-HCl(pH為8.8),10mM KCl,10mM(NH4)2SO4,2mMMgSO4,0.1%Triton X-100,2.5 U Platihum Taq High Fidelity DNA聚合酶(Invitrogen),用無菌水將反應(yīng)體積調(diào)至50μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃,5分鐘;94℃,1分鐘,50℃,1分鐘,72℃,3分鐘,循環(huán)35次;72℃,10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳提純,利用TA克隆方法,與pGEMT-Easy(Promega)連接,得pGEMT-Easy-GI。用NdeI和EcoRI酶切pGEMT-Easy-GI,經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳提純,與經(jīng)NdeI和EcoRI酶切的pRSET-lac-kan連接,得pRSET-lac-GI-kan。根據(jù)已知hok/sok基因片段序列(GenBank X05813)設(shè)計(jì)10條引物(見表1)。PCR基因構(gòu)造根據(jù)Kikuchi,M.et al.,1999,Gene236159-167所述,惟具體步驟有變更。PCR條件為20ng各個(gè)引物,50μM dATP,50μM dTTP,50μM dCTP,50μM dGTP,20mMTris-HCl(pH為8.8),10mM KCl,10mM(NH4)2SO4,2mM MgSO4,0.1%Triton X-100,2.5U Pfu DNA聚合酶(Promega),用無菌水將反應(yīng)體積調(diào)至50μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃,4分鐘;94℃,1.5分鐘,50℃,1.5分鐘,72℃,5分鐘,循環(huán)30次;72℃,10分鐘。取PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合物5μL作模板,引物1和10,依上述條件再次PCR擴(kuò)增,得PCR產(chǎn)物長為580 bp,在其5’和3’端分別含有AscI及EcoRI酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳提純,AscI及EcoRI酶切后,與經(jīng)AscI及EcoRI酶切的pRSET-lac-GI-kan連接,得pRSET-lac-GI-hok/sok-kan。
      表1


      用NdeI和BgllI酶切質(zhì)粒pRSET-kan-DAOGHA(公開號(hào)為CN1680558的中國專利申請(qǐng)),得一1,074bp基因片段(內(nèi)含D-氨基酸氧化酶突變體GHA基因),經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳提純,與經(jīng)NdeI和BglII酶切的pRSET-lac-GI-hok/sok-kan得到的長片斷連接,得pHS-GHA(其核苷酸序列列于圖4中)。將pHS-GHA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)pLysS(Novagen),得菌株BL-HS-GHA。
      制備BL-HS-GHA[含有重組D-氨基酸氧化酶GHA的E.coliBL21(DE3)pLysS]菌體的方法如下所述。
      從卡那霉素(50μg/mL)LB瓊脂平板上挑取單菌落大腸桿菌BL-HS-GHA,接種到2×5mL含卡那霉素(50μg/mL)的液體LB培養(yǎng)基,在37℃培養(yǎng)8小時(shí)(搖床轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘),再接種至2×50mL含卡那霉素(100g/mL)和氯霉素(40μg/mL)的種子培養(yǎng)基,在30℃培養(yǎng)16小時(shí)(搖床轉(zhuǎn)速為400轉(zhuǎn)/分鐘)。
      玉米漿1的制備將300g玉米漿(購自華北制藥康欣有限公司)溶于300mL的蒸餾水中,攪拌后離心(5,000g,8分鐘),上清液即為玉米漿1。沉淀物留用。
      玉米漿2的制備將上述沉淀物再溶于600mL的蒸餾水中,攪拌后離心(5,000g,8分鐘),上清液即為玉米漿2。
      50mL種子培養(yǎng)基中各成分重量如下玉米漿14mL玉米漿24mL
      酵母浸膏 0.2g硫酸銨0.075g磷酸氫二鈉0.25g磷酸二氫鉀0.04g氯化鈉0.075g將各成分溶于50mL的蒸餾水中,以10N氫氧化鈉將pH值調(diào)至7.15,高溫消毒。
      種子過夜發(fā)酵后,將全部100mL的種子接種至含卡那霉素(50μg/mL)的2L發(fā)酵罐(BIOENGINEERING,Benchtop Fermentor,KLF2000)。
      2L發(fā)酵培養(yǎng)基中各成分重量如下玉米漿1 160mL玉米漿2 160mL酵母浸膏 8g硫酸銨3g磷酸氫二鈉10g磷酸二氫鉀1g氯化鈉3g將各成分溶于1.9L的蒸餾水中,以10N氫氧化鈉將pH值調(diào)至7.15,于2L發(fā)酵罐(BIOENGINEERING,Benchtop Fermentor,KLF2000)高溫消毒。
      將12.5g葡萄糖溶于50mL的蒸餾水中,高溫消毒;將1.25g硫酸鎂溶于50mL的蒸餾水中,高溫消毒。
      發(fā)酵前把已消毒的葡萄糖和硫酸鎂放進(jìn)2L發(fā)酵罐中。
      補(bǔ)料的制備將250mL玉米漿1和250mL玉米漿2混合,以10N氫氧化鈉將pH值調(diào)至7.25,高溫消毒。
      將2.25g硫酸銨、7.56g磷酸氫二鈉、1.2g磷酸二氫鉀、2.25g氯化鈉溶于60mL的蒸餾水中,高溫消毒。
      將15g酵母浸膏溶于100mL的蒸餾水中,高溫消毒。
      將70g葡萄糖溶于140mL的蒸餾水中,高溫消毒。
      將30mL甘油混合10mL的蒸餾水中,高溫消毒。
      將20g硫酸鎂溶于30mL的蒸餾水中,高溫消毒。
      將所有溶液混合,加入卡那霉素直至濃度為50μg/mL,加入2mL的消泡劑。
      在35℃生長,在初始的6小時(shí),pH值由6.9自然上升至7.2,開始補(bǔ)料(50mL/小時(shí))。在平衡條件下(以5 N氫氧化鉀將pH值維持在7.2,溶氧水平pO2不大于0.5%),繼續(xù)生長26小時(shí)。
      在發(fā)酵罐發(fā)酵后,細(xì)菌在4℃經(jīng)離心機(jī)分離(5,000g,8分鐘),棄上清液,取沉淀,將沉淀重懸于600mL的磷酸鈉緩沖液(50mM,pH為7.5)中。用珠磨法裂解細(xì)菌,以50mL/分鐘的速度把細(xì)菌重懸液送進(jìn)珠磨機(jī)(DYNO-MILL TYP KDL,直徑為0.2mm的玻璃珠,WA Bachofen)內(nèi),最后再以800mL的磷酸鈉緩沖液(50mM,pH為7.5)把細(xì)菌殘留沖洗出來。將細(xì)菌裂解液在55℃水浴中浸泡30分鐘,以高速離心(10,000g,30分鐘),取上清液,即為粗純的重組D-氨基酸氧化酶GHA。D-氨基酸氧化酶的純化基本上按Alonso,J.,Barredo,J.L.,Diez,B.,Mellado,E.,Salto,F(xiàn).,Garcia,J.L.,Cortes,E.(1998,Microbiology 1441095-1101)所述。提取的粗純重組D-氨基酸氧化酶GHA,加入甘油至最終濃度為10%,用5N氫氧化鈉將pH值調(diào)至8,離心(13,000g,30分鐘),取上清液。按產(chǎn)品供貨商所述制備法制備DEAE-纖維素離子交換樹脂(Sigma,D-0909)。按每1mL粗純酶混合0.5mL DEAE-纖維素離子交換樹脂,在4℃攪拌5小時(shí)(100轉(zhuǎn)/分鐘),用濾斗(Buchner filter funnel,120mm P1)將酶液濾去。以3倍于DEAE-纖維素離子交換樹脂體積的40mM的磷酸二氫鈉緩沖液(含10%甘油)沖洗DEAE-纖維素離子交換樹脂,再用2倍于DEAE-纖維素離子交換樹脂體積的400mM的磷酸二氫鈉緩沖液將重組D-氨基酸氧化酶GHA洗脫出來。按每1L洗脫的重組D-氨基酸氧化酶GHA,加入262g硫酸銨,在室溫?cái)嚢?5分鐘(100轉(zhuǎn)/分鐘)。離心(13,000g,15分鐘),棄上清液,保留沉淀物。將沉淀物溶于20mM磷酸二氫鈉緩沖液(pH為7.5)后,以MilliporeYM30濾膜超濾除去剩余硫酸銨,將酶液濃縮至25mg/ml。用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)的純度。取酶液20ml,加牛血清白蛋白3g,蒸餾水90ml,攪拌均勻,得到稀釋酶液110ml。將三聚氰胺海綿(珠海天虹特種海綿廠)切割成5.5cm厚的板狀,再穿刺海綿使之具有均勻密布的穿透孔道(孔的密度為6個(gè)/cm2、孔徑為0.2cm,所有孔道平行且與海綿穿刺表面呈45度角);然后,將海綿切割成直徑為8.5cm、高為3cm的圓盤柱狀,并于圓盤中央留一直徑為2cm、穿透并垂直于圓盤面的空腔。之后,按以下順序操作a)在海綿載體上加32ml稀釋酶液,擠壓使酶液在海綿中均勻分布;b)向海綿加0.05%的聚乙烯亞胺(PEI,購自Sigma,St.Luis,USA)溶液(pH為7.0)260ml,反復(fù)擠壓海綿至擠出液由混變清,再次擠壓并除去未被吸附的液體;c)向海綿加入0.05%的戊二醛溶液(購自廣東汕頭市西隴化工廠)260ml,擠壓使戊二醛分布均勻并除去未被吸附的液體。d)重復(fù)步驟a)至c)5次。在流動(dòng)空氣中干燥24小時(shí)后,即可得到重9.2克的蜂窩狀固定化D-氨基酸氧化酶塊。
      本應(yīng)用實(shí)例采用如圖3所示的反應(yīng)罐并利用本發(fā)明的反應(yīng)方法來完成的。將含空腔的蜂窩狀固定化D-氨基酸氧化酶塊直接套入反應(yīng)罐內(nèi)的轉(zhuǎn)軸21,這樣固定到轉(zhuǎn)軸21上的蜂窩狀固定化D-氨基酸氧化酶塊即可作為隨轉(zhuǎn)軸21轉(zhuǎn)動(dòng)的攪拌槳;然后將固定到轉(zhuǎn)軸21上的蜂窩狀固定化D-氨基酸氧化酶塊插入罐內(nèi),合上帶有密封圈的罐蓋11,使兩端露出的轉(zhuǎn)軸21分別與罐底和罐蓋11的凹槽良好配合,然后擰緊固定螺絲19使罐蓋11與罐體51緊密接合;再后,將連接著可指示溫度的pH控制器(Biotech-2020,上海保興生物設(shè)備有限公司)的電極17旋進(jìn)罐蓋11,將pH控制器的蠕動(dòng)泵輸出端連接罐底的補(bǔ)液口15,將pH控制器的蠕動(dòng)泵吸液口插入15%的氨水溶液中,將罐體51上下所有的輸液/氣口套上硅膠管,用金屬夾夾封位于罐底的取樣口5、通氣口7及位于罐蓋11的排氣口16和補(bǔ)液口15,關(guān)閉放料閥4;將溫度設(shè)定為25℃的精密循環(huán)水浴(THD-0506型,寧波天恒儀器廠)的進(jìn)、出水管分別與罐體51循環(huán)水輸入口2和輸出口3連接并啟動(dòng)水循環(huán)。加料前,關(guān)閉取樣口5、輸液口6、排液口14及放料閥4,排氣口16保持開放;將氧氣從通氣孔7通入罐內(nèi),調(diào)節(jié)氣流量為2.17L/min;將300ml 75mM頭孢菌素C鈉水溶液(pH為7.5)從罐蓋進(jìn)料口加入罐內(nèi),然后蓋上并旋緊進(jìn)料口螺蓋18,啟動(dòng)電機(jī),并根據(jù)需要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速。啟動(dòng)pH控制器以15%的氨水維持反應(yīng)液pH為7.5±0.1;在不同時(shí)間(10、20、30、40、50分鐘)取樣,參照公布號(hào)為CN1680558的中國專利申請(qǐng)中實(shí)例5所述,以HPLC法(色譜柱DiamonsilTMC18,250×4.6mm;流動(dòng)相含50mMK2HPO4/KH2PO4及5%乙腈,pH為7.0;柱溫為30℃;流速為1ml/min;檢測(cè)波長為260nm)測(cè)定固定化D-氨基酸氧化酶轉(zhuǎn)化頭孢菌素C為戊二酰-7-氨基頭孢霉烷酸(GL-7-ACA)的活力和轉(zhuǎn)化率。一單位酶活力定義為在上述反應(yīng)條件每分鐘轉(zhuǎn)化一微摩爾頭孢菌素C為戊二酰-7-氨基頭孢霉烷酸的酶量。共進(jìn)行7次反應(yīng),99%頭孢菌素C均在50分鐘之內(nèi)被轉(zhuǎn)化完畢。本應(yīng)用實(shí)例中所用轉(zhuǎn)速、底物的體積、濃度以及測(cè)定的結(jié)果見表2。
      表2

      本專利申請(qǐng)中參照的各種文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容,無論是專利文獻(xiàn)還是非專利文獻(xiàn),全部以引用方式并入本文。另外,本發(fā)明不受上述具體實(shí)施方式
      和應(yīng)用實(shí)例的限制。本發(fā)明可在權(quán)利要求書所概括的范圍內(nèi)做各種改變,這些改變也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
      權(quán)利要求
      1.一種適用于由固相催化劑催化的反應(yīng)方法,所述方法使用包括至少一個(gè)反應(yīng)罐的反應(yīng)器,所述反應(yīng)罐包括罐體以及安裝于罐體內(nèi)可轉(zhuǎn)動(dòng)的轉(zhuǎn)軸,其特征在于所述固相催化劑固定于所述的轉(zhuǎn)軸上,所述固相催化劑具有可通透反應(yīng)液和氣體的孔,該固相催化劑在隨著轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)還充當(dāng)攪拌器的作用,在反應(yīng)液中隨轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生離心力并同時(shí)在固相催化劑內(nèi)造成負(fù)壓,該離心力迫使反應(yīng)液沿離心方向貫穿固相催化劑后甩出,而被甩出的反應(yīng)液隨之再循負(fù)壓流經(jīng)固相催化劑,如此形成循環(huán)回流,從而使所述反應(yīng)液和氣體貫穿所述固相催化劑并與之充分而有效地接觸。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)方法,其特征在于所述固相催化劑為柱體形式。
      3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的反應(yīng)方法,其特征在于所述的柱體是由片材卷繞而成的。
      4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的反應(yīng)方法,其特征在于所述的柱體是中空柱體,在該柱體的軸線附近設(shè)有用于安裝轉(zhuǎn)軸的空腔。
      5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的的反應(yīng)方法,其特征在于所述的中空柱體套在所述的轉(zhuǎn)軸上。
      6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)方法,其特征在于所述固相催化劑與轉(zhuǎn)軸之間采用捆綁方式固定。
      7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)方法,其特征在于所述固相催化劑的體積與反應(yīng)罐的體積之比在1%至95%之間。
      8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)方法,其特征在于所述轉(zhuǎn)軸具有與罐體內(nèi)外相通的用于輸送液體和/或氣體的孔道。
      9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)方法,其特征在于所述反應(yīng)罐為直立式。
      10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)方法,其特征在于所述固相催化劑是固定化酶/固定化細(xì)胞。
      11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的反應(yīng)方法,其特征在于所述固相催化劑是由酶或表達(dá)酶的細(xì)胞與開孔的多孔有機(jī)泡沫材料制成的。
      12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的反應(yīng)方法,其特征在于所述有機(jī)泡沫材料包括木漿海綿、聚乙烯醇海綿或三聚氰胺海綿。
      13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)所述的反應(yīng)方法,其特征在于所述轉(zhuǎn)軸的轉(zhuǎn)速為20~20,000rpm。
      14.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)所述的反應(yīng)方法,其特征在于所述轉(zhuǎn)軸的轉(zhuǎn)速為50~10,000rpm。
      15.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)所述的反應(yīng)方法,其特征在于所述轉(zhuǎn)軸的轉(zhuǎn)速為100~1,000rpm。
      16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的反應(yīng)方法,其特征在于所述固定化酶是D-氨基酸氧化酶,轉(zhuǎn)軸的轉(zhuǎn)速為300~600rpm。
      全文摘要
      本發(fā)明公開一種適用于由固相催化劑催化的反應(yīng)方法,所述方法使用包括至少一個(gè)反應(yīng)罐的反應(yīng)器,所述反應(yīng)罐包括罐體以及安裝于罐體內(nèi)可轉(zhuǎn)動(dòng)的轉(zhuǎn)軸,所述固相催化劑固定于所述的轉(zhuǎn)軸上,所述固相催化劑具有可通透反應(yīng)液和氣體的孔,該固相催化劑在隨著轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)還充當(dāng)攪拌器的作用,在反應(yīng)液中隨轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生離心力并同時(shí)在固相催化劑內(nèi)造成負(fù)壓,該離心力迫使反應(yīng)液沿離心方向貫穿固相催化劑后甩出,而被甩出的反應(yīng)液隨之再循負(fù)壓流經(jīng)固相催化劑,如此形成循環(huán)回流,從而使所述反應(yīng)液和氣體貫穿所述固相催化劑并與之充分而有效地接觸。本發(fā)明提供的反應(yīng)方法能夠防止催化劑活力下降、延長催化劑的使用壽命,并具有交換效率高、反應(yīng)充分以及應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)。
      文檔編號(hào)B01J8/10GK101007255SQ20061000221
      公開日2007年8月1日 申請(qǐng)日期2006年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月24日
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