專利名稱：色譜介質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備新型色譜介質(zhì)的方法及其在利用固定化緩沖配體來控制流動(dòng)的PH值的色譜技術(shù)(例如色譜聚焦技術(shù))中的用途。
背景技術(shù)：
通常用于生物分子色譜聚焦的色譜介質(zhì)被在珠中均勻取代的適當(dāng)?shù)木彌_和結(jié)合配體所取代，以完成PH梯度和分離。色譜聚焦(CF)將離子交換方法的優(yōu)點(diǎn)與等電聚焦的高分辨率相結(jié)合，形成單一的使用簡(jiǎn)單的“等度”色譜聚焦方法。在色譜聚焦時(shí)，具有合適的緩沖能力的弱離子交換柱被緩沖液平衡，所述緩沖液限定分離PH梯度遵循的上限pH值(在陰離子交換CF介質(zhì)情況下)。然后，施用另一種“聚焦”緩沖液來洗脫結(jié)合蛋白，大致上按照它們的等電(PD點(diǎn)順序。聚焦緩沖液的PH值被調(diào)節(jié)為限定pH梯度下限值的pH值。 當(dāng)使用單一的聚焦緩沖液進(jìn)行等度洗脫期間，在填充柱內(nèi)形成PH梯度；不需要外部梯度形 成裝置。當(dāng)洗脫緩沖液(例如聚焦緩沖液)滴加到離子交換劑上的緩沖弱離子交換基時(shí)，形成PH梯度。峰值寬度在O. 02-0. 05pH單位范圍內(nèi)并且可以在單一步驟中處理包含數(shù)百毫克蛋白質(zhì)的樣品。蛋白質(zhì)帶由于流動(dòng)相的速度高于在形成的PH梯度發(fā)展并沿著柱移動(dòng)時(shí)的速度而發(fā)生聚焦。被分析物(analytes)沿著柱到達(dá)具有促進(jìn)結(jié)合的pH值的區(qū)域的轉(zhuǎn)移比結(jié)合區(qū)域自身的移動(dòng)要快。色譜聚焦對(duì)于兩性物質(zhì)例如蛋白質(zhì)和大型蛋白聚集體如病毒的表征是一種強(qiáng)大的分析工具，也是高純度蛋白分離的有效制備技術(shù)。色譜聚焦中使用的珠通常是弱陰離子交換劑或帶有強(qiáng)和弱IEX配體兩者的離子交換劑(例如來自GE Healthcare BiosciencesAB的PBE94、Mono P和DEAE介質(zhì))，其中在全部珠中，不同的胺配體同時(shí)參與到分離過程和PH梯度的生成。即使在蛋白質(zhì)分離和提純技術(shù)方面具有顯著性，但該技術(shù)仍然大部分地保留了 Sluyterman 等人最初的工作不變(J. Chromatography 150(1978) 17-44)。與現(xiàn)有的色譜聚焦(CF)介質(zhì)相比，用于CF的新的色譜精制介質(zhì)具有顯著改進(jìn)的負(fù)載能力和改善的峰形，它們應(yīng)該在色譜領(lǐng)域受到歡迎。
發(fā)明概要本發(fā)明提供一種提高離子交換色譜(尤其是色譜聚焦)性能的殼珠(shellbead)。所述殼珠具有形成pH梯度的配體的內(nèi)核，而所述與樣品(蛋白質(zhì))相互作用的配體位于外殼。這種結(jié)構(gòu)的主要優(yōu)點(diǎn)在于，與傳統(tǒng)的色譜聚焦介質(zhì)相比容量得到提高，這是因?yàn)樵鰪?qiáng)了結(jié)合強(qiáng)度，特別是在高pH值對(duì)于陰離子交換配體和在低pH值對(duì)于陽離子交換配體。如果外殼配體通過延長(zhǎng)劑或間隔劑連接，則容量可以得到進(jìn)一步提高。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)內(nèi)核的孔隙率以排除蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明涉及一種制備色譜介質(zhì)的方法，所述介質(zhì)包括具有多孔內(nèi)核和外殼的殼珠，用于在內(nèi)核中使用固定化緩沖配體的生物分子色譜技術(shù)，所述方法包括在珠的內(nèi)核中提供緩沖配體，用于穩(wěn)定PH值(緩沖)和形成pH梯度，以及在珠的外殼中提供結(jié)合配體，用于結(jié)合生物分子，其中所述緩沖配體和結(jié)合配體彼此獨(dú)立地進(jìn)行調(diào)節(jié)。所述方法使得色譜介質(zhì)(優(yōu)選色譜聚焦介質(zhì))的結(jié)合性能和緩沖性能可以分別得到優(yōu)化。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，內(nèi)核的孔隙率防止超過一定尺寸的生物分子滲透到內(nèi)核中。本發(fā)明的色譜珠具有超過5 μ m的直徑，優(yōu)選直徑在5-400 μ m之間。優(yōu)選地,夕卜殼為O. 5-30 μ m厚。在一些實(shí)施方案中，夕卜殼為O. 5_5 μ m。這種薄的外層特別可用于其中需要快速動(dòng)力學(xué)的應(yīng)用，且適用于具有3-200 μ m直徑的珠。在其它實(shí)施方案中，外殼是10-30μπι。這種較厚的外層特別可用于其中需要具有待分離生物分子的高負(fù)載容量的應(yīng)用。這種較厚的層適合具有40-400 μ m直徑的珠。優(yōu)選地，緩沖配體是弱酸和/或堿，如三亞乙基四胺、雙(3-氨丙基)胺、聚乙烯亞胺、巰基乙酸、水楊酸、聚丙烯酸、聚膦酸和兩性離子緩沖劑。優(yōu)選地，結(jié)合配體是強(qiáng)陰離子交換配體和/或強(qiáng)陽離子交換配體，如季胺、磺酸鹽 配體和胍基配體。任何類型的用于結(jié)合的帶電配體都是合適的。重要的是，配體在用于分離的pH-區(qū)間(pH-interval)內(nèi)強(qiáng)烈結(jié)合。如果是離子交換劑，這意味著配體必須在所用的PH-區(qū)間內(nèi)帶電荷。例如，二乙基胺配體在pH值為9-8及更低時(shí)帶電荷。所述結(jié)合配體也可以是親和配體、疏水相互作用(HIC、RPC)配體、螯合配體等。在第二方面，本發(fā)明涉及按照上述方法制備的色譜介質(zhì)。在第三方面，本發(fā)明涉及上述色譜介質(zhì)的用途，該介質(zhì)包括在內(nèi)核中的固定化緩沖配體(作為緩沖劑)取代緩沖溶液。所述用途可以用于離子交換色譜，但是主要用于色譜聚焦。色譜聚焦可以是任何生物分子的色譜聚焦，所述生物分子例如選自細(xì)胞和/或其部分、病毒和/或其部分、蛋白質(zhì)、復(fù)合蛋白質(zhì)、融合蛋白質(zhì)、肽、核酸、兩性大分子和兩性顆粒。所述方法適用于Pl在2-13、優(yōu)選在3-11內(nèi)的所有的生物分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，在色譜聚焦結(jié)束后，可以通過使洗脫餾分流過限制珠柱(lidbead column)將洗脫緩沖液除去，其中使生物分子從柱中排出，而使緩沖組分吸附在限制珠中。這描述于下面的實(shí)驗(yàn)部分。這種色譜聚焦(利用這種類型的介質(zhì)運(yùn)行)與等電聚焦具有同樣高的分離能力，將在制備和分析領(lǐng)域兩者得到應(yīng)用。附圖簡(jiǎn)述圖I :用于新的色譜法和色譜聚焦介質(zhì)的珠設(shè)計(jì)的示意圖，所述珠具有用于主要涉及在外殼中結(jié)合和在內(nèi)核中緩沖官能團(tuán)的配體的分開區(qū)域。圖2.扁豆凝集素(lens lectine)在常規(guī) Mono P(珠直徑10ym)和 HFA 70ΒΑΡΑShell-Q(珠直徑90 μ m)上的分離。pH梯度(一 ··一)從9調(diào)節(jié)至6。圖3.肌紅蛋白在常規(guī)Mono P(珠直徑:10 μ m)和HFA 70 BAPA Shell_Q(珠直徑90 μ m)上的分離。pH梯度(_··一)從9調(diào)節(jié)至6。發(fā)明詳述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，其中形成pH梯度的配體連接在珠的內(nèi)核中且與蛋白質(zhì)相互作用的配體存在于外殼中的殼珠(

圖1)，相比于傳統(tǒng)的色譜聚焦介質(zhì)，是用于色譜聚焦的優(yōu)化得多的珠設(shè)計(jì)。通過利用層功能化，其可以具有高配體結(jié)合密度而不引入不必要的形成梯度的高緩沖能力。這個(gè)想法的主要優(yōu)勢(shì)在于，由于可以使用結(jié)合性能不被pH值改變的配體以及在珠的外層使用較高的配體密度，蛋白質(zhì)的容量得到提高。這可提高結(jié)合強(qiáng)度而不引入不必要的高緩沖能力，這是傳統(tǒng)的弱CF離子交換配體在配體密度提高時(shí)的情形。取決于弱離子交換劑配體的類型，它們?cè)诟呋虻蚉H下失去它們的電荷，因此失去結(jié)合能力。負(fù)載容量也可以通過改變外“殼”的厚度進(jìn)行調(diào)節(jié)。另外，如果“殼配體”通過延長(zhǎng)劑連接，則容量可以得到進(jìn)一步提高。此外，殼可以做得很薄(O. 5-5 μ m)，其由于更快的釋放動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生更尖銳的峰而可以提高效率。通過將珠中結(jié)合區(qū)域和緩沖區(qū)域分開，還可以降低由于次要相互作用例如氫鍵所引起的其它的峰變寬效應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，內(nèi)核的孔隙率被調(diào)節(jié)成只允許多緩沖劑(polybuffer)組分進(jìn)入珠的內(nèi)部。因此，蛋白質(zhì)(原則上)只與“殼配體”發(fā)生相互作用。所述殼配體可被設(shè)計(jì)成在關(guān)注的PH區(qū)域沒有或具有極低的緩沖能力。這就意味著最合適的殼配體是Q(季銨)_基團(tuán)或SP(磺丙基)_基團(tuán)。色譜聚焦在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域具有許多潛在的應(yīng)用，例如用于將主要樣品組分分離 及移除以促進(jìn)分析低豐度組分，以及用于在使用SDS-PAGE、窄pi范圍2D-PAGE、或者其它的色譜步驟的后續(xù)分離之前的樣品預(yù)分離(prefractionation)。然而,色譜聚焦技術(shù)最常與聚兩性電解質(zhì)洗脫緩沖液使用，所述緩沖液限制了色譜聚焦在實(shí)踐中的使用，這是由于(緩沖液成本考慮，以及)關(guān)于兩性電解質(zhì)(如Polybuffers )的除去的考慮。兩性緩沖液被設(shè)計(jì)成具有均衡(even)的緩沖能力，并且大量組分的等電點(diǎn)在它們?cè)O(shè)想使用的pH區(qū)間內(nèi)。因此這種類型的緩沖液將提高CF的分辨率，這是因?yàn)樵谙疵撨^程中位移和堆積效應(yīng)會(huì)引起結(jié)合蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生間距(spacing)。為了擴(kuò)展這種技術(shù)的應(yīng)用范圍，在最高可能的分辨率并不是優(yōu)先的情況下，開發(fā)替代緩沖液系統(tǒng)可以作為一種選擇。實(shí)驗(yàn)部分本文提供的本實(shí)施例只是出于說明性目的，并不應(yīng)被解釋為限制所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明。綜沭基質(zhì)的體積指的是固定床體積，基質(zhì)的重量按克給出，指的是吸入干重(suctiondry weight)。反應(yīng)攪拌使用電動(dòng)攪拌器，因?yàn)槭褂么帕嚢杵鲿?huì)促使破壞珠。用常規(guī)的方法來分析官能度和確定烯丙基化程度或珠上的胺含量程度。下述例示了根據(jù)本發(fā)明制備分離基質(zhì)的一種方法，其從交聯(lián)瓊脂糖凝膠(Sepharose HFA 70, GE Healthcare, Uppsala, Sweden)開始。Sepharose HFA 70 的珠官徑為約90 μ m?；赟epharose HFA 70-HFA 70 BAPA Shelll-Q的用于色譜聚焦的殼介質(zhì)的制備Sepharose HFA 70 的烯丙基活化在玻璃過濾器上用蒸餾水洗滌S^harose HFA 70。將凝膠(210g排干的凝膠)稱入三頸圓底燒瓶。加入NaOHaOOmLJO^溶液)并開始機(jī)械攪拌。向燒瓶中加入O. 5g硼氫化鈉和31g硫酸鈉，并在水浴上將漿料加熱到50°C。約一個(gè)小時(shí)后，加入20mL烯丙基縮水甘油醚(AGE)。隨后將漿料置于劇烈攪拌下過夜。約20個(gè)小時(shí)后，將漿料轉(zhuǎn)移到玻璃過濾器并用蒸餾水(x4)、乙醇(x4)和蒸餾水(x4)洗滌。
隨后通過滴定法確定烯丙基的含量；152 μ mol/mL。殼活化(部分滇化)將50mL烯丙基化的凝膠稱入燒瓶中，加入500mL蒸餾水和2. 5g乙酸鈉。將I. 05mL溴(3. 28g)溶解于197mL蒸餾水中，并將38. 5mL這種溶液加入到烯丙基化的凝膠漿料中。所述用量的溴設(shè)想提供(對(duì)應(yīng)于)約2μπι的殼厚度。溴溶液在劇烈攪拌下瞬時(shí)加入到烯丙基凝膠漿料中。約10分鐘后在玻璃過濾器上用蒸餾水洗滌凝膠。Q-基團(tuán)的殼偶聯(lián)將部分溴化的凝膠(見上文)轉(zhuǎn)移到燒瓶中，與20mL三甲基氯化銨溶液混合。用50% NaOH將pH值調(diào)到12，將漿料加熱到35°C，讓其攪拌過夜。約18個(gè)小時(shí)后在玻璃過濾器上用蒸餾水洗滌凝膠。
氯離子容量估計(jì)為50 μ mol/mL。剩余的90 μ mol/mL烯丙基含量對(duì)應(yīng)于約2 μ m的
理論殼厚度。BAPA(雙氨丙基胺)在珠內(nèi)核中的偶聯(lián)在帶有頂置式攪拌的燒杯中將50mL “Q-殼凝膠(見上文)與蒸餾水(50mL)和
O.5g乙酸鈉混合。加入溴，直到漿料具有殘余的深橙/黃色。攪拌3分鐘后，加入甲酸鈉直到漿料完全褪色。然后在玻璃過濾器上用蒸餾水洗滌凝膠。將40mL排干的內(nèi)核溴化凝膠轉(zhuǎn)移到燒杯中，與IOmL水、IOmL雙氨丙基胺和2g硫酸鈉混合。然后將該混合物在30°C下攪拌17小時(shí)，之后在玻璃過濾器上用蒸餾水洗滌。連接到凝膠內(nèi)核的雙氨丙基胺的量估計(jì)為80 μ mol/mL。新的CF-原型(HFA 70 BAPA Shell-Q)與Mono P相比的色譜評(píng)價(jià)簡(jiǎn)介為了測(cè)試殼CF介質(zhì)原型(HFA 70 BAPA Shell-Q)的性能，用扁豆凝集素和肌紅蛋白的色譜圖與就Mono P(見實(shí)驗(yàn)部分)獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。Mono P 是基于ΙΟμπιMonoBeads顆粒的已有的介質(zhì)，且被叔胺和季胺均勻取代。小珠尺寸顯著貢獻(xiàn)于可達(dá)到的高分辨率。HFA 70 BAPA Shell-Q基于90 μ m的瓊脂糖珠，按照已有的色譜理論，峰寬將遠(yuǎn)寬于Mono P。然而，殼原型與Mono P的比較說明了使用如圖I所示的珠與同樣大小的常規(guī)珠相比的優(yōu)勢(shì)。實(shí)驗(yàn)關(guān)于色譜性能，將待研究的殼介質(zhì)(HFA 70 BAPA Shell-Q)裝填到Tricorn 5/20柱內(nèi)，在用緩沖溶液(25mM 二乙醇胺，pH 9. 3)平衡后，將樣品溶液以0. 5mL/min的流速泵送通過柱子。通過施用緩沖液B (Polybuffer 96, pH6)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫。色譜方法如下所示(Unicorn方法)。樣品樣品是溶解在25mM 二乙醇胺中的扁豆凝集素和肌紅蛋白，(pH 9. 3)濃度調(diào)節(jié)為
5.Omg/mLo樣本體積是100 μ L。儀器LC 系統(tǒng)Akta Explore 10軟件Unicorn柱HR 5/20
Unicorn 方法主要方法O. O Base CV (5) {ml}任意O. 00 Block 開始 _ 條件O.00 Base SameAsMainO. 00 柱位置(位置 2) #colposO. 00 PumpAInlet AlO.00 AveragingTimeUV 2.56 {sec}
O. 00 波長(zhǎng) 280{nm}254{nm}215{nm}O. 00 緩沖閥 Al AllO. 00 梯度 O. 00 {% B} O. 00 {base}O. 00 PumpBInlet BIO. 00 流量(O. 50)# 流量{ml/min}O. 10 AutoZeroUVO. 10 End_blockO. 00 Block 柱 _ 平衡O.00 Base SameAsMainI. 00 AutoZeroUV2 AutoZeroUV2. 00 End_BlockO. 00 Block 等度 _ 洗脫(加載)O.00 Base SameAsMainO. 00 AutoZeroUVO. 00注射閥注射O. 10 #injvol 注射閥加載O. 20 梯度 100 {% B}0 {base}8. 00 梯度 1000 {% B}0 {base}9. 00 End_Block色譜聚焦后有效除去緩沖物質(zhì)的新方法和介質(zhì)Polybuffer由小分子(< 1000g/mol)組成，因此可容易地從裝填有限制珠的流通柱除去。這些限制珠被設(shè)計(jì)成具有凝膠過濾限制(即排除大于約5000-10000g/mol的分子)，而且在內(nèi)核中具有適合的配體(其選擇取決于使用的多緩沖液)，用來吸附多緩沖液組分。需要稍微改變樣品溶液的PH值，以為了吸附而改變兩性緩沖液的凈電荷，取決于限制珠內(nèi)核中用于吸附的配體為何種類型，凈電荷從零變?yōu)橐粋€(gè)適合的正值或負(fù)值。結(jié)果與討論為了改進(jìn)下游色譜純化平臺(tái)，致使較大提高工藝生產(chǎn)率和蛋白質(zhì)制造，非常重要的是提高基于大珠(珠直徑大于約40 μ m)的介質(zhì)的色譜性能。具有所需要的選擇性的基于小珠(如珠直徑為IOmm的Mono P)的介質(zhì),在其壓力規(guī)格內(nèi)不能在大規(guī)模柱中使用足夠高的流速和生產(chǎn)力。即使對(duì)于非常堅(jiān)硬的珠也是如此。根據(jù)本發(fā)明，通過使用殼官能化的大顆粒，效率(峰值寬度)可以保持在小顆粒的水平。為了證明具有大顆粒直徑(約90 μ m)的如圖I所示的殼珠的優(yōu)勢(shì)，將色譜結(jié)果與粒徑為ΙΟμπι的“均一”珠(Mono P)相比。根據(jù)圖2和3，峰寬/高度在扁豆凝集素的情況下尺寸相同，而在肌紅蛋白的情況下稍微變寬。結(jié)果清楚地表明，如圖I所示設(shè)計(jì)的較大殼珠與小得多的(小IOx)常規(guī)珠幾乎一樣好。大珠的好處在于，與用于分析應(yīng)用的小珠相t匕，它們更適合于較大規(guī)模的制備或工藝應(yīng)用。由于這種新的介質(zhì)設(shè)計(jì)，可以結(jié)合急需的較大規(guī)模色譜性能和高效分析性能。 ·
權(quán)利要求
1.一種制備包含具有多孔內(nèi)核和外殼的殼珠的色譜介質(zhì)的方法，用于在內(nèi)核中使用固定化緩沖配體的生物分子色譜技術(shù)，所述方法包括在所述珠的內(nèi)核中提供緩沖配體，以及在所述珠的外殼中提供結(jié)合配體，其中所述緩沖配體和結(jié)合配體彼此獨(dú)立地進(jìn)行調(diào)節(jié)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其用于制備色譜聚焦介質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的方法，其中所述內(nèi)核的孔隙率防止生物分子滲透進(jìn)入內(nèi)核。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述珠的直徑超過3μ m。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述珠的直徑在3到400μ m之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其中所述外殼為O.5-30 μ m厚。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法,其中所述外殼為O.5-5 μ m。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述外殼為10-30μ m。
9.根據(jù)上述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中所述緩沖配體是弱酸和/或堿。
10.根據(jù)上述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)合配體是強(qiáng)陰離子交換配體和/或強(qiáng)陽離子交換配體。
11.根據(jù)上述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)合配體是親和配體、疏水相互作用(HIC、RPC)配體、螯合配體等。
12.根據(jù)上述一項(xiàng)或多項(xiàng)權(quán)利要求所制備的色譜介質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的色譜介質(zhì)在任何色譜法中的用途，所述色譜法使用內(nèi)核中的固定化緩沖配體(作為緩沖劑)代替緩沖溶液。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，用于生物分子的色譜聚焦，所述生物分子選自細(xì)胞和/或其部分、病毒和/或其部分、蛋白質(zhì)、復(fù)合蛋白質(zhì)、融合蛋白質(zhì)、肽、核酸、兩性大分子和兩性顆粒。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的用途，其中在結(jié)束聚焦后，通過使洗脫餾分流過限制珠柱將洗脫緩沖液除去，其中將生物分子從所述柱中排出，并使緩沖組分吸附在限制珠的內(nèi)核中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備新的色譜介質(zhì)的方法及其在純化生物分子如蛋白質(zhì)中的用途。所述色譜介質(zhì)包括具有多孔內(nèi)核和外殼的殼珠。所述方法包括在珠的內(nèi)核中提供緩沖配體，以及在珠的外殼中提供旨在結(jié)合生物分子的結(jié)合配體。所述方法使得可以彼此獨(dú)立地優(yōu)化結(jié)合性能和緩沖性能，這對(duì)于色譜聚焦介質(zhì)的生產(chǎn)特別有利。
文檔編號(hào)B01D15/08GK102821843SQ201180010197
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2011年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月19日
發(fā)明者J·貝格斯特倫, B-L·約翰遜 申請(qǐng)人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司