專利名稱：高親和性化合物結(jié)合常數(shù)的測(cè)定方法
高親和性化合物結(jié)合常數(shù)的測(cè)定方法化合物作為藥物的成功不僅依賴于其功效，而且依賴于藥物規(guī)格、藥物相互作用、安全性、藥代動(dòng)力學(xué)與生產(chǎn)成本之間的最佳平衡。在化合物可以有對(duì)受體有效前，其釋放、吸收和分布具有相當(dāng)?shù)挠绊?。僅游離的藥物(未結(jié)合)可以對(duì)受體有效。如果藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合過(guò)強(qiáng)，則其藥理學(xué)響應(yīng)強(qiáng)度可能降低，且它還可以對(duì)藥物的分布體積、代謝和消除產(chǎn)生影響。通過(guò)高流通量-ADME篩選(A =吸收，D =分布，M =代謝，E =排泄)使體外數(shù)據(jù)集的生成最大化是必要的，以得到化學(xué)家對(duì)發(fā)現(xiàn)具有最佳生化性質(zhì)的物質(zhì)的反饋，并理解化學(xué)結(jié)構(gòu)與生化參數(shù)之間的相關(guān)性。已知用于測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)合的方法是，例如平衡透析。該方法的起點(diǎn)在于兩個(gè)室即樣品室和蛋白質(zhì)室，它們被半透膜隔離。選擇膜的MWC0，使得測(cè)試物質(zhì)能夠透過(guò)，但截留大 分子(例如蛋白質(zhì))。將已知濃度和體積的測(cè)試物質(zhì)置于樣品室內(nèi)。然后將已知濃度的蛋白質(zhì)以與樣品室內(nèi)的物質(zhì)之一等同的體積置于蛋白質(zhì)室內(nèi)。當(dāng)測(cè)試物質(zhì)擴(kuò)散透過(guò)膜時(shí)，一些結(jié)合蛋白質(zhì)，一些將保持在溶液中游離。相互作用的親和性越低，則測(cè)試物質(zhì)在任意時(shí)間保持未結(jié)合的濃度越高。測(cè)試物質(zhì)擴(kuò)散通過(guò)膜并且結(jié)合測(cè)試物質(zhì)持續(xù)至達(dá)到平衡為止。在平衡時(shí)，測(cè)試化合物在溶液中游離的濃度在兩個(gè)室內(nèi)相同。然而，在蛋白質(zhì)室內(nèi)，測(cè)試物質(zhì)的總濃度因結(jié)合測(cè)試物質(zhì)而較高(條件是測(cè)試化合物結(jié)合蛋白質(zhì))。樣品室內(nèi)游離測(cè)試物質(zhì)的濃度然后可以用于測(cè)定測(cè)試化合物的結(jié)合特性。另一種方法在于使用BIAcore技術(shù)，其中結(jié)合配偶體之一固定在傳感器芯片上。另一結(jié)合配偶體流過(guò)置于微量吸收池中的芯片。結(jié)合的檢測(cè)依賴于“表面等離激元”(SPR)現(xiàn)象，即當(dāng)芯片表面結(jié)合蛋白質(zhì)或其他分子時(shí)出現(xiàn)來(lái)自金屬芯片的單色光反射的小改變。然而，所有這些方法并不適合于在高流通量測(cè)定中測(cè)定高親和性物質(zhì)的蛋白質(zhì)結(jié)合能力，因?yàn)樗荒茉谑褂酶吡魍课镔|(zhì)的99% -99. 99%結(jié)合率之間區(qū)分。原因在于最終分析的游離測(cè)試物質(zhì)的濃度過(guò)低而不能被定量。使用高親和性藥物，結(jié)合物質(zhì)的量的小的改變可能對(duì)體內(nèi)的游離部分產(chǎn)生顯著影響(參見(jiàn)下表)，由此對(duì)效果和副作用產(chǎn)生影響。因此，在這種極寬范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定具有高度重要性。具有4%差異的實(shí)例99%—95%結(jié)合 1%游離一5%游離因子580%—76%結(jié)合 20%游離一24%游離因子I. 2因此，本發(fā)明提供了所關(guān)注的高親和性化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)的測(cè)定方法，包含下列步驟a)將高親和性化合物加入到兩-室系統(tǒng)中，其中兩室被可透過(guò)所關(guān)注的化合物的膜隔離開，和在達(dá)到分布平衡后測(cè)定所述室之一內(nèi)所關(guān)注的高親和性化合物的量；b)將浸入化合物加入到所述室之一(浸入室)中，其中浸入化合物不能透過(guò)膜，和在達(dá)到分布平衡后測(cè)定所關(guān)注的化合物與浸入化合物的分配系數(shù)；
c)將非特異性蛋白質(zhì)加入到另一室(蛋白質(zhì)室)中，其中非特異性蛋白質(zhì)不能透過(guò)膜，和在達(dá)到分布平衡后在浸入化合物的存在下測(cè)定所關(guān)注的化合物與非特異性蛋白質(zhì)的分配系數(shù)；和d)測(cè)定具有步驟b)和c)的分配系數(shù)的測(cè)試化合物的結(jié)合常數(shù)。步驟a)、b)和步驟c)可以連續(xù)進(jìn)行，或它們可以平行進(jìn)行(參見(jiàn)圖3)。因此，本發(fā)明還提供了所關(guān)注的高親和性化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)的測(cè)定方法，包含下列步驟a)提供平行性能的兩-室系統(tǒng)，其中每一系統(tǒng)的兩室被可透過(guò)所關(guān)注的化合物的膜隔離開，并且將高親和性化合物加入到兩-室系統(tǒng)中，和
在達(dá)到分布平衡后測(cè)定所述室之一內(nèi)所關(guān)注的高親和性化合物的量；b)將高親和性化合物和浸入化合物加入到第二個(gè)室系統(tǒng)的室之一(浸入室)中，其中浸入化合物不能透過(guò)膜，和在達(dá)到分布平衡后測(cè)定所關(guān)注的化合物與浸入化合物的分配系數(shù)；c)將高親和性化合物和浸入化合物加入到第三個(gè)室系統(tǒng)的室之一(浸入室)中，并且將非特異性蛋白質(zhì)加入到另一室(蛋白質(zhì)室)中，其中非特異性蛋白質(zhì)不能透過(guò)膜，和在達(dá)到分布平衡后在浸入化合物的存在下測(cè)定所關(guān)注的化合物與非特異性蛋白質(zhì)的分配系數(shù)，和d)測(cè)定具有步驟b)和c)分配系數(shù)的測(cè)試化合物的結(jié)合常數(shù)，其中步驟a)、b)和c)平行進(jìn)行。此外，本申請(qǐng)?zhí)峁┝私牖衔镌跍y(cè)定高親和性測(cè)試化合物的結(jié)合常數(shù)中的用途。浸入化合物是一種物質(zhì)，其顯著降低高親和性測(cè)試物質(zhì)與非特異性蛋白質(zhì)的親和性。顯著降低親和性指的是在浸入化合物的存在下和其不存在結(jié)合的測(cè)試物質(zhì)與非特異性蛋白質(zhì)的量之差具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P ( O. 05，優(yōu)選P < O. 01)。為了避免浸入化合物通過(guò)膜，而允許測(cè)試化合物通過(guò)它，浸入化合物的大小優(yōu)選大于測(cè)試化合物大小2倍。優(yōu)選浸入化合物是配位劑。更優(yōu)選浸入化合物是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，最優(yōu)選浸入化合物是聚乙烯吡咯烷酮K-25(PVP 25，PVP K-25)。就上述舉出的方法的目的而言，可以使用浸入化合物的組合，例如PVP和環(huán)糊精。本文所用的術(shù)語(yǔ)“高親和性化合物”是指在生理?xiàng)l件下和血漿蛋白(例如清蛋白)剩余物的存在下總量的至少95%結(jié)合所述血漿蛋白的化合物(=所述化合物總量的至多5%是游離形式)。優(yōu)選至少97%是結(jié)合的，更優(yōu)選至少98%且最優(yōu)選至少99%以結(jié)合形式存在。將生理?xiàng)l件定義為PH 7.0和371。就本發(fā)明而言，高親和性化合物或測(cè)試化合物優(yōu)選是藥物。本文所用的術(shù)語(yǔ)“測(cè)試物質(zhì)”或"測(cè)試化合物"是指高親和性化合物。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合常數(shù)”是指描述平衡狀態(tài)下兩種分子之間的結(jié)合親和性的常數(shù)。它描述游離與結(jié)合的測(cè)試物質(zhì)之間的平衡狀態(tài)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合的物質(zhì)”或“結(jié)合的化合物”是指結(jié)合蛋白質(zhì)(特別是非特異性蛋白質(zhì))或浸入化合物的物質(zhì)或化合物。術(shù)語(yǔ)“分?jǐn)?shù)占據(jù)率”是指結(jié)合的測(cè)試化合物的部分。換句話說(shuō)，它是平衡狀態(tài)下結(jié)合浸入化合物的測(cè)試化合物的量與測(cè)
試化合物總量(C總測(cè)試憧)之比。
權(quán)利要求
1.所關(guān)注的化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)的測(cè)定方法，其包括下列步驟 a)將高親和性化合物加入到兩-室系統(tǒng)中，其中兩室被可透過(guò)所關(guān)注的化合物的半透膜隔離開，和 在達(dá)到分布平衡后測(cè)定所述室之一內(nèi)所關(guān)注的高親和性化合物的量； b)將浸入化合物加入到所述室之一中，其中浸入化合物不能透過(guò)膜，和在達(dá)到分布平衡后測(cè)定所關(guān)注的化合物與浸入化合物的分配系數(shù)； c)將非特異性蛋白質(zhì)加入到另一室中，其中非特異性蛋白質(zhì)不能透過(guò)膜， 和 在達(dá)到分布平衡后在浸入化合物的存在下測(cè)定所關(guān)注的化合物與非特異性蛋白質(zhì)的分配系數(shù)；和 d)使用步驟b)和c)的分配系數(shù)測(cè)定測(cè)試化合物的結(jié)合常數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中濾膜是大小選擇性膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的方法，其中浸入化合物是PVP或環(huán)糊精。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任ー項(xiàng)的方法，其中浸入化合物是PVP25。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任ー項(xiàng)的方法，其中蛋白質(zhì)是血漿蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5任ー項(xiàng)的方法，其中血漿蛋白是血清清蛋白。
7.權(quán)利要求1-6任ー項(xiàng)的方法，其中步驟a)、b)和c)平行進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及所關(guān)注的化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)的測(cè)定方法，其包括下列步驟a)將高親和性化合物加入到雙室系統(tǒng)中，其中兩個(gè)室通過(guò)半透膜隔離開，所述的半透膜可滲透所關(guān)注的化合物；和測(cè)定在達(dá)到分布平衡后所關(guān)注的高親和性化合物在所述室之一中的量；b)將浸入化合物加入到所述室之一中，其中浸入化合物不能透過(guò)膜，和在達(dá)到分布平衡后測(cè)定所關(guān)注的高親和性化合物與浸入化合物的測(cè)定分配系數(shù)；c)將非特異性蛋白質(zhì)加入到另一室中，其中非特異性蛋白質(zhì)不能透過(guò)膜，和在達(dá)到分布平衡后在浸入化合物的存在下測(cè)定所關(guān)注的化合物與非特異性蛋白質(zhì)的分配系數(shù)；和d)使用步驟b)和c)的分配系數(shù)測(cè)定測(cè)試化合物的結(jié)合常數(shù)。
文檔編號(hào)B01D61/24GK102770195SQ201180010919
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2011年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月25日
發(fā)明者F·阿斯穆斯, H·菲舍爾 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司