制備用于核酸擴增的樣品的方法【專利摘要】本發(fā)明屬于樣品制備領域，特別是，它涉及在進行核酸擴增之前制備樣品的方法?！緦＠f明】制備用于核酸擴増的樣品的方法[0001]本申請要求2012年3月30日提交的GB1205769.1的優(yōu)先權，其完整內容通過引用并入。發(fā)明領域[0002]本發(fā)明屬于樣品制備領域。特別是，本發(fā)明涉及在進行核酸擴增之前制備樣品的方法?！?br>背景技術：
】[0003]核酸擴增摶術，"NAAT"[0004]NAAT允許以高敏感度和特異性檢測和定量樣品中的核酸。NAAT可用于確定樣品中的特定模板核酸的存在，如實施特定NAAT之后擴增產物的存在所指示的。相反，不存在任何擴增產物則指示樣品中不存在模板核酸。這樣的技術在臨床、工業(yè)和研宄應用中非常重要。NAAT的應用實例包括但不限于：確定樣品中是否存在病原體、定量樣品中病毒的量、比較樣品中兩種或更多種基因的相對水平或確定樣品中的具體標志物的表達水平。[0005]現(xiàn)有技術中已經(jīng)描述了用于擴增核酸的各種各樣的熱循環(huán)和等溫技術。熱循環(huán)技術，諸如聚合酶鏈式反應（PCR)，使用溫度循環(huán)來驅動DNA合成的重復循環(huán)，從而與模板DNA的初始量成比例地合成大量新DNA。也已經(jīng)開發(fā)許多等溫技術，其不依賴于熱循環(huán)來驅動擴增反應。等溫技術，其利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，已經(jīng)被開發(fā)用于不涉及RNA合成步驟的擴增反應。類似地，對于涉及RNA合成步驟的擴增反應，已經(jīng)開發(fā)了可以使用逆轉錄酶、核糖核酸酶H和/或DNA-依賴性RNA聚合酶的等溫技術（參見例如，NucleicAcidIsothermalAmplificationTechnologies-AReview.Nucleosides,NucleotidesandNucleicAcids，第27卷，第3期，2008年3月第224-243頁）。[0006]樣品制各是NAAT的常規(guī)要求[0007]當希望使用NAAT確定特定樣品中核酸的存在和/或水平時，通常需要在進行NAAT之前使樣品經(jīng)受某種程度的預處理（在本文中稱為"樣品制備"）以使得在允許基于NAAT的檢測有效地發(fā)揮作用的條件下樣品中存在的核酸可以為NAAT所用。[0008]在實踐中，樣品制備可能是費力的、多步驟的工藝，需要熟練的技術人員和基礎設施、昂貴的消耗品、一系列試劑和溶劑（通常是危險或有害的）以及各種不同設備諸如離心機和真空歧管。所述工藝的復雜性為操作失誤帶來多個機會（包括樣品污染），因此，在沒有昂貴的自動/半自動樣品制備裝置的幫助之下，在專業(yè)實驗室外進行樣品制備是具有挑戰(zhàn)性的。[0009]因此，可以簡化樣品制備并減少樣品制備成本的方法是非常需要的，并且在更具挑戰(zhàn)性的環(huán)境和經(jīng)濟背景下將使得基于NAAT的技術的應用能夠脫離專門實驗室。例如，如果有效樣品制備的成本低并且樣品制備方法簡單得足以在這樣的背景下由非專業(yè)人員可靠地進行，那么改進的樣品制備方法可使得NAAT能夠在非洲村莊中用于HIV檢測。[0010]樣品制各的原則[0011]有三個與樣品制備相關的一般原則：[0012]i)使得核酸物理上可用于NAAT(樣品溶解）[0013]ii)NAAT抑制劑的去除/減少[0014]iii)核酸的濃縮[0015]為了使得NAAT可以運行，樣品中的核酸必須與NAAT試劑直接物理接觸。因為核酸通常存在于細胞或病毒衣殼內，并且因為這些細胞/病毒通常會還會包埋在復雜的基質中，因此樣品制備工藝必須能夠充分地破壞細胞/病毒衣殼兩者以及任何相關聯(lián)的樣品基質，以使得核酸可用于NAAT。[0016]進一步地，感興趣的核酸所在的基質可能含有能夠抑制NAAT的物質，因此，去除或減少這樣的抑制劑以使NAAT充分發(fā)揮作用可能是必須的。[0017]更進一步，在許多情況下，每單位體積中，樣品中感興趣的核酸的豐度可能非常低。在這種情況下，能夠將核酸從大體積濃縮為較小體積的方法是有利的；核酸的這種濃縮常常，在其本身，可能有利于從抑制劑純化核酸。[0018]樣品溶解[0019]樣品溶解，以使得核酸可用，可以通過機械手段（綜述于J.Brent(1998).BreakingUpIsn'tHardToDo:Acacophonyofsonicators,cellbombsandgrinders〃TheScientist12(22):23)和非機械技術來實現(xiàn)。簡單的機械方式包括使用攪拌器以及通過強制細胞經(jīng)過限制性開口的均化。超聲處理基于將樣品暴露于高頻聲波，而珠法（beadapproach)基于在各種珠的存在下將細胞暴露于劇烈攪拌。[0020]樣品的化學破碎是機械破碎的可替代方案。去污劑是重要的化學溶解劑，其通過破壞脂質雙層以及使蛋白增溶/變性起作用。十二烷基硫酸鈉（SDS)，是離子型去污劑，部分由于其在細胞內使大分子增溶和使蛋白變性的能力而常用于法醫(yī)DNA提取程序(J.L.Hainesetal(2005)CurrentProtocolsinHumanGeneticsVol.2,(2005JohnWileyandSons,Inc.Pub·)。蛋白酶K通常與基于去污劑（例如SDS、Tween-20、TritonX-100)的溶解程序串聯(lián)使用，以有利于細胞溶解。去污劑溶解的另一種形式基于FTA紙（美國專利第6,958,392號）。這是用弱堿、陰離子去污劑、螯合劑和防腐劑浸漬的纖維素過濾器。[0021]離液劑諸如鹽酸胍也可以作為有效的樣品溶解劑起作用，方便地，這些也允許用于如下文進一步討論的純化核酸的手段。[0022]另一個溶解方法是使用高溫來破碎打開細胞/病毒。這一物理方法的好處是需要非常簡單的硬件（只是加熱塊或水?。８邷乜梢耘c其他化學溶解試劑相結合使用以提高難以溶解的細胞諸如某些革蘭氏陽性細菌和孢子的溶解效率?；瘜W溶解和高溫溶解方法的好處在于它們特別有效地使得可降解感興趣的核酸的核酸酶失活。此外，它們使得可損害NAAT中使用的酶的蛋白酶失活。[0023]NAAT抑制劑[0024]NAAT的開發(fā)與利用受到對NAAT的進行起到負面作用的各種各樣的物質的顯著并且有害的影響（參見，例如對各種抑制劑問題的綜述"CapacityofNineThermostableDNAPolymerasesToMediateDNAAmplificationinthePresenceofPCR-InhibitingSamples，Appl.Environ.Microbiol.October1998vol.64no.103748-3753"）。樣品抑制劑是來自血液的血紅素、植物和土壤中存在的腐殖酸、多酚類、某些二價金屬和膠原蛋白。因為幾乎所有的生物樣品均含有NAAT抑制劑，顯然，在進行NAAT之前處理樣品以便去除或減少抑制劑水平是必要的。這對于某些復雜并且非均質的基質諸如具有非常高的抑制性物質負載的排泄物來說尤其如此。[0025]抑制劑去除[0026]NAAT抑制劑的去除或減少可以通過以下來實現(xiàn)：i)分別使用核酸和/或抑制劑的某些特性主動從抑制劑分離核酸；ii)稀釋樣品以使得抑制劑的濃度在對所采用的NAAT有不利影響的濃度之下；或iii)添加中和抑制劑的抑制作用的液相添加劑。[0027]例如，Chelex-100(Bio-Rad,Hercules,CA)是有效結合可以抑制NAAT的多價金屬陽離子的改性樹脂（WalshP.S.etal·，ChelexIOOasamediumforsimpleextractionofDNAforPCR-basedtypingfromforensicmaterial.Biotechniques10(4):506-13)。[0028]聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP)是不溶的高度交聯(lián)的改性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，已用于在DNA提取過程中去除多酚類，諸如腐殖酸（HolbenW.E.，JanssonJ.K.,ChelmB.K.,TiedjeJ.M.(1988)DNAProbeMethodfortheDetectionofSpecificMicroorganismsintheSoilBacterialCommunity.Appl.Environ.Microbiol.54(3):703-711)。[0029]我們已經(jīng)鑒定了對于排泄物抑制劑去除有用的一系列離子交換樹脂。這些包括但不限于OptiporeSD-2(Dowex)，用于脫色的胺化的苯乙稀-二乙稀基苯樹脂和DiaionWA30(MitsubishiChemical)，一種弱堿性的高度多孔性的陰離子交換樹脂。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這些樹脂可在從排泄物溶解物去除NAAT抑制劑時替代PVPP?；钚蕴渴强捎糜谌コ齆AAT抑制劑的另一種材料。優(yōu)選地，活性炭應是不能穿過用于保持其的釉料或過濾器的形式，例如，活性炭可以是大顆粒或小珠的形式。通常，可以選擇樹脂和釉料或過濾器的組合，以使得釉料或過濾器不會逐漸被樹脂堵塞，同時保留所使用的樹脂或其它固相材料。[0030]一種可替代的方法是使用尺寸排阻層析從低分子量的NAAT抑制劑分離高分子量核酸。例如來自GEHeathcare的illustraMicroSpin?G_25旋轉柱可以用于這一作用。[0031]雖然也許對于NAAT抑制劑來說最簡單的方法是將樣品簡單地稀釋至抑制劑濃度過低而不能對特定NAAT的產生不利影響的點，但是這具有同時稀釋樣品中任意核酸的缺點。因此，當核酸可能受到限制時（諸如在病原體檢測中），稀釋方法可能會導致在基于NAAT的實驗中獲得的假陰性結果。在某種程度上，稀釋方法可以通過添加中和某些酶抑制劑的液相試劑來改進。例如，也可以將EDTA添加至樣品以結合某些抑制性的二價金屬（例如Ca2+)并使得其對于NAAT來說無效用，并且在這樣做的同時，減少允許NAAT使用而必需的樣品稀釋的量。事實上，對于有待通過NAAT檢測的生物體的量處于非常高水平的某些臨床應用來說，樣品可以使得如果抑制劑濃度太低而不能抑制擴增，而反應中存在的靶標的量足以可重復性檢測，則可以在含有EDTA的緩沖液中將樣品稀釋一倍。然而，在非常抑制性的樣品類型（例如人類排泄物）中，常常需要500倍數(shù)量級的稀釋系數(shù)，甚至與EDTA-起，以將降低抑制劑水平至可以使用NAAT的點；所以顯然這種做法是不理想的，因為這么大的稀釋肯定會影響基于NAAT的測試的靈敏度。另外，過量的EDTA如果帶入基于NAAT的檢測那么其本身對NAAT來說也可以是抑制性的，因為EDTA可螯合DNA/RNA聚合酶所需的作為輔因子的Mg2+。[0032]核酸純化[0033]當樣品制備涉及特別純化核酸時，這兩種都去除NAAT抑制劑，但也可以從樣品濃縮核酸。[0034]在這一方法中，核酸的獨特特性用于被將它們與樣品的其他組分（包括抑制劑）分開并使得核酸能夠被濃縮到所選擇的緩沖液中。這具有增加基于NAAT的測試的靈敏度的顯著優(yōu)點。例如，如果來自于Iml血液所含有的HIV的核酸可以被濃縮為僅20μ1，那么這可以在樣品制備之后提供HIV核酸濃度高達50倍的增加：這可能在檢測HIV的特定NAAT之間產生差別或者未產生差別。[0035]最早的核酸純化方法之一是使用苯酷/氯仿萃?。―.Μ.Wallace(1987)Largeandsmallscalephenolextractions.MethodsEnzymol.152:33-41;Maniatis,T等人，''PurificationofNucleicAcids〃inMolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEd.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY)。在這一方法中，大部分的蛋白質轉移到有機相中或者有機-水界面，而溶解的DNA留在水相中?？梢允购珼NA的相可以經(jīng)受乙醇沉淀，并在一系列離心和洗滌步驟后DNA分離。有機萃取法的優(yōu)點在于，它產生高質量的DNA制備物（具有相對低量的蛋白質和相對低的降解），并且至今仍然是最可靠的方法之一。主要的缺點在于，這一過程耗時耗力，使用危險的溶劑和試劑，需要笨重的設備并且相對難以適應高通量環(huán)境，并且當然不適合于病人近旁測試或供不熟練的操作人員使用。[0036]核酸純化的可替換方法是與離液劑相結合使用二氧化硅（Boom，R.etal.，（1990)''RapidandSimplemethodforpurificationofnucleicacids,〃JClinMicrobiol.28(3):495-503)。離液劑對溶解細胞/病毒均起作用但也起到導致核酸結合硅顆粒的作用。核酸隨后可以使用低離子強度緩沖液（或水）從二氧化硅洗脫。Boom方法廣泛形成了許多溶解/純化方法（例如DNAIQSystems,Promega,Madison,WI)的基礎。娃珠的可替換方案是使用娃膠膜（QIAamp,QiagenHilden,DE)。此外，娃珠自身可以被改性以進一步增強DNA結合。[0037]可替換的基于電荷的方法是使用離子交換樹脂。將含有DNA和其他大分子的溶液暴露于離子交換樹脂。在給定的鹽濃度或PH值，帶負電荷的DNA(由于其磷酸主鏈）相對強地結合到樹脂。蛋白質、碳水化合物和其它雜質相對弱地結合（如果有的話），并從珠清洗掉（例如，以柱的形式或通過離心）。然后純化的DNA可以在高離子強度緩沖液中洗脫。如今使用的商業(yè)上可獲得的陰離子交換樹脂基于DEAE-改性的娃珠（Genomic-tip,Qiagen)。[0038]與離子交換樹脂方法相關的方法是使用在給定的pH下具有凈正電荷并且能夠結合DNA的改性的固體基質（Baker，M.J.，美國專利第6,914,137號）。所述改性含有可電離基團，使得DNA結合在較高pH值時被逆轉（當可離子化基團是中性或帶負電時）。廣泛使用的這種類型的方法基于ChargeSwitch珠（LifeTechnologies,Inc.Carlsbad,CA)〇[0039]寡核苷酸捕獲[0040]靶核酸也可以通過使用捕獲寡核苷酸來分離。在該方法中，將樣品核酸和與靶標中互補靶序列雜交的捕獲寡核苷酸一起孵育。之后將雜交的靶標-捕獲寡核苷酸絡合物從溶液取出，并洗滌以去除雜質。這既可以通過配體-受體相互作用諸如生物素-鏈霉親和素來實現(xiàn)，其中捕獲寡聚物寡核苷酸是生物素化的并且可以多種形式使用，包括磁珠，包被的管等。之后，可以將捕獲的靶標直接加至擴增反應。使用寡核苷酸捕獲的實例是APTIMAHIV測定（Gen-Probe)。[0041]免痔磁件分離QMS)[0042]特定的細胞類型也可以使用與針對它們的特定表面抗原決定簇的順磁性顆粒結合的抗體來分離。靶細胞/病毒通過應用磁場從樣品中去除并添加至對生物體的檢測測定。利用IMS的實例是通過Pathatrix系統(tǒng)（MatrixMicroScienceLtd)檢測沙門氏菌（Salmonella)。（OdumeruJ.A.，&CarlosG.Le0n_VelardeC.G·(2012)SalmonellaDetectionMethodsforFoodandFoodIngredients.于Salmonella-ADangerousFoodbornePathogen中，BarakatS.M.Mahmoud編輯，InTech,Rijeka,Croatia.)[0043]磁珠[0044]本領域技術人員應認識到，磁珠或顆粒可用于ChargeSwitch、寡核苷酸捕獲和免疫磁性分離。Boom法也可以使用含有二氧化硅和磁性氧化鐵兩者的磁性顆?；虼胖閬韺嵤?BerensmeierS.(2006)Magneticparticlesfortheseparationandpurificationofnucleicacids.Appl.Microbiol.Biotechnol.73(3):495-504)。磁性顆粒Boom提取的實例是NucliSENS系統(tǒng)（bioM6rieux)。[0045]樣品制各稈序質疑[0046]所討論的核酸純化/濃縮的三個方面即樣品制備、提取、抑制劑去除，難免造成多步驟過程。所述過程中的每個步驟增加了時間和精力，并導致復雜性、成本和操作失差。即使對于擁有訓練有素的操作者的專業(yè)實驗室來說，現(xiàn)有樣品制備方法的復雜性意味著人工方實在太繁瑣而難用，并且因此需要某種形式的自動化。[0047]遠離專業(yè)實驗室，可能沒有基礎設施或熟練的操作人員進行樣品制備。為了滿足這一需求，已經(jīng)引入使樣品制備能夠離散自動化的技術，從而使NAAT檢測可以由非專業(yè)用戶來進行。然而，這些方法需要復雜且昂貴的耗材，所述耗材在對尋求昂貴的樣品制備方法有經(jīng)濟限制的某些環(huán)境中不能使用。[0048]已經(jīng)開發(fā)了各種實驗室機器人儀，用于核酸的部分自動化純化。例如，設計了Maxwell16儀器（Promega)、iPrep儀器（LifeTechnologies)、NucliSENSeasyMAG(bioM6rieux)和QiagenEZl，BioRobotM48和Qiacube系統(tǒng)（Qiagen)來從一系列臨床和法醫(yī)樣品類型純化核酸。這些系統(tǒng)中的一些在將樣品裝載到儀器上前需要一些人工預處理。Innuprep(analytikjena,Itzehoe,DE)、LabTurbo(Taigen,Taipei,TW)、Xiril150(XirilAG，Hombrechtikon，CH)和Quickgene(FujiFilmCorp.，Tokyo，JP)提取系統(tǒng)都需要比上述全機器人系統(tǒng)更多的人工操作。[0049]更完全自動化的系統(tǒng)已被用于臨床和法醫(yī)檢測兩者。最值得注意的是Cepheid(Sunnyvale,CA)GeneXpert系統(tǒng)，其用于對來源于排泄物拭子樣品的艱難梭菌(C.difficile)進行DNA提取和實時PCR。然而，設備和單次測試兩者的成本可能高得令許多組織望而卻步。[0050]伸用壓力制各樣品[0051]存在使用壓力或壓力差在隔間之間移動液體作為樣品制備工藝的一部分的許多方法。例如，下面的文獻描述了使用壓力作為樣品制備工藝的一部分的方法：[0052]·GB2337261討論了壓力下使用多孔膜過濾從全細胞純化核酸。[0053]·JP2005095003教導了用于通過由壓力差使樣品溶液通過來分離和純化核酸的套盒（cartridge)。[0054]·JP2005118020教導了含有具有至少兩個開口的核酸吸附多孔材料和在至少兩個開口之間產生壓力差的裝置的套盒。[0055]*US20070269829討論了包括加壓裝置并且包含經(jīng)由固相連接的第一和第二容器部分的核酸分離儀器。[0056]*US2009/0023904教導了包括容器的套盒，所述容器具有至少兩個開口并含有核酸吸附固相。將壓力差應用于固相兩側。[0057]·US5804684教導將生物樣品與核酸結合基質（懸浮液中的瓊脂糖顆粒）接觸，導致核酸沉淀；以及從基質洗脫。[0058]·US2008/0275228教導將液體噴射至用于分離和純化核酸的套盒并且通過壓力差使得液體通過核酸吸附固相。[0059]·US2009/0023201討論了核酸檢測盒和水溶性抗附聚有機化合物。[0060]這些方法的優(yōu)點在于它們能避免在樣品制備工藝中使用設備諸如離心機。例如，壓力可用于在裝置周圍移動液體以便促進樣品制備。然而，這些方法的缺點在于仍然需要復雜的消耗品或泵來處理樣品。[0061]歷[0062]樣品制備是基于NAAT的檢測的重要組成部分。取決于樣品類型、抑制劑的水平和對濃縮樣品中核酸的任何要求，樣品制備可能是進行基于NAAT的檢測的最繁瑣和昂貴的部分。[0063]為了那些沒有專業(yè)設備或人員的那些人或買不起昂貴的自動化系統(tǒng)的那些人能夠享受到基于NAAT的檢測的益處，有對不昂貴的、可以由非專業(yè)用戶進行并且無需精密硬件的更簡單的方法的需要。雖然存在消除了對設備諸如機器人，離心機或真空歧管的需要而通過使用壓力移動裝置內液體來制備樣品的方法，但這些方法仍然被復雜消耗品或產生壓力差的硬件拖累。此外，利用低成本的、容易獲得的物理方法產生樣品制備物（尤其是高溫）的方法還沒有被充分利用。由于中溫的產生極其容易，因此可以被熱驅動但是仍然聯(lián)合與樣品制備相關的更精密的化學物質的樣品制備方法可使得用于基于NAAT的檢測的樣品制備更容易地以較低的成本和簡單得多的硬件實現(xiàn)。這樣的樣品制備方法會使得基于NAAT的檢測在更具挑戰(zhàn)性的環(huán)境例如資源匱乏的小診所中能夠進行。[0064]優(yōu)選實施方案的詳細描述[0065]本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過將容器加熱至產生足以從容器洗脫液體的壓力的溫度來從密封容器洗脫液體是可能的。因此本發(fā)明提供使液體樣品穿過多孔固體基質的方法，包括以下步驟：將液體樣品密封在包含作為容器的至少一部分的多孔固體基質的容器中，并且升高溫度以增加容器內部的壓力，由此致使液體穿過所述多孔固體基質。通過使液體穿過多孔固體基質，至少部分液體可以從容器中去除。本發(fā)明的方法還允許將液體從容器轉移至第二容器或器皿。[0066]使用加熱使得液體樣品穿過多孔固體基質的工藝在本文中被稱為"熱洗脫"。[0067]有利地發(fā)現(xiàn)，在低于IKTC的溫度下，可以生成足夠的壓力以使得液體穿過來自容器的多孔固體基質，即使使用各種不同尺寸的容器。這可以使用標準的塑料消耗品來實現(xiàn)，盡管在室溫下容器中多孔固體基質的存在阻斷液體流出容器。這種溫和的溫度和壓力條件下都可以使用，意味著核酸在該工藝中不被損壞，也不存在取得足夠壓力的容器失效甚至爆炸的任何顯著危險，也未要求極其高溫的加熱裝置（>110°c)。因此，本發(fā)明提供了改進的樣品制備的方法，尤其是在進行基于NAAT的檢測之前。[0068]本發(fā)明的方法的另一優(yōu)點在于，與其它方法相比，進行樣品制備所需的步驟（特別是液體轉移步驟）的數(shù)目大大減少。例如，在使用可比結合核酸更牢固地結合NAAT抑制劑的多孔固體基質的實施方案中，操作者必須簡單地[0069]1)將樣品轉移到第一容器中，[0070]2)進行熱洗脫，并且[0071]3)在NAAT測定中使用洗脫的核酸。[0072]不需要額外的液體轉移。此外，這可以僅使用容器本身和加熱塊來實現(xiàn)。不需要額外的離心分離機、泵或真空系統(tǒng)。這大大減少了進行樣品制備所需的硬件基礎設施，并且減小了樣品制備工藝的復雜性，使得其可以容易地由非專業(yè)操作者進行。[0073]可以將溫度增加至高達IKTC的溫度。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將密封的容器加熱至IKTC產生足以使得液體樣品穿過多孔固體基質的壓力，無論容器的尺寸如何。也可以將溫度增加至低于110°C的溫度，例如低于100°C、低于90°C、低于80°C或低于70°C的溫度。使液體樣品穿過多孔固體基質的最低溫度在不同容器之間可能是不同的，并且可以是例如至少40°C、至少50°C或至少60°C。一般來說，會將溫度增加至高于室溫的溫度。精確的溫度可容易地通過使容器經(jīng)受增加的溫度并且確立液體樣品穿過多孔固體基質的溫度來容易地實驗確定。當所用的加熱也將被用于溶解細胞或病毒衣殼時，那么足以溶解所述細胞或病毒衣殼的溫度可以容易地實驗確定。然而，通常至少90°C的溫度是必要的。[0074]根據(jù)本發(fā)明，可以使被加至容器的所有的液體樣品穿過多孔固體基質。液體樣品的原始體積的至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%穿過多孔固體基質的方法也在本發(fā)明的范圍之內。與被加至容器的液體樣品的組成相比較，穿過多孔固體基質的液體樣品可具有不同的組成。例如，與被加至容器的液體樣品相比較，洗脫的樣品可具有較低的NAAT抑制劑含量。[0075]熱洗脫可以通過使容器暴露于具有容器有待被加熱至的溫度的加熱裝置來實施。可選地，逐步增加容器中的熱量直到已達到所需的溫度也是可能的。更進一步地，容器可以經(jīng)受輻射諸如微波或紅外線。[0076]當液體因由加熱容器產生的壓力而穿過多孔固體基質時，可以理解的是，根據(jù)本發(fā)明的熱洗脫可以在沒有另外的外力諸如離心或真空的應用（例如通過真空泵）的情況下進行。[0077]根據(jù)本發(fā)明，容器將被密封。密封容器的方法是現(xiàn)有技術已知的。例如，容器可以使用蓋子或塞子密封。可選地，通過熔融容器中開口的邊緣，例如通過加熱開口并將邊緣壓在一起，來密封容器也是可能的。當容器由塑料或其它的熱塑性材料制成時這是特別適合的，因為加熱開口并通過施加壓力熔融開口的邊緣將是非常容易做到的。這可以例如通過使用加熱的夾爪（jaw)來實現(xiàn)。由于本發(fā)明的熱洗脫的方法需要液體穿過多孔固體基質，因此可以理解的是，多孔固體基質的至少一部分或全部將不會被密封，否則液體將不能穿過。[0078]本發(fā)明的方法可包括將液體樣品加至容器的另外步驟。[0079]容器[0080]在本說明書的上下文中，"容器"是適用于熱洗脫的器皿。[0081]一般來說，容器包含作為容器的至少一部分的多孔固體基質。所述多孔固體基質可以布置成使得它與所述容器的內部和外部都是連通的。這使得當液體樣品穿過多孔固體基質時，液體樣品從容器的內部轉移到外部。[0082]所述多孔固體基質可以是容器的組成部分并且可以形成，例如，容器壁的至少一部分。多孔固體基質不形成所述容器的組成部分也是可能的。在這些實施方案中，容器將包括開口，而所述多孔固體基質將相對于所述開口定位，以使得多孔固體基質與所述容器的內部和外部都是連通的。[0083]容器可以包括適合于將液體樣品加至容器的一個或多個開口。根據(jù)本發(fā)明的方法，這些一個或多個開口需要被密封，以便密封容器內的液體樣品。[0084]"器皿"是適合于容納液體但不適合于熱洗脫的任何器皿。[0085]多孔固體基質[0086]容器應包含在室溫（例如在18_22°C)下能將液體保留在容器內但在容器中的壓力由于溫度的增加而增加時允許液體穿過的至少一種多孔固體基質。[0087]在一些實施方案中，容器包括僅一種類型的固體多孔基質。本發(fā)明的方法也可使用包含兩種或更多種不同的多孔固體基質的容器來實施。例如，所述容器可以包括第一多孔固體基質和第二多孔固體基質。第一多孔固體基質優(yōu)選在容器被加熱之前將液體保留在容器中。第一多孔固體基質可以是過濾器。第二多孔固體基質可以是與結合核酸相比更牢固地結合NAAT抑制劑或者與結合NAAT抑制劑相比更牢固地結合核酸的基質。第二多孔固體基質可以在加入液體之前加至容器和/或它可以與液體預先混合并與液體樣品一起加至容器。第二多孔固體基質可以是珠的形式，例如磁珠。[0088]多孔固體基質可以是過濾器。多孔固體基質（尤其是當使用多于一種類型的基質時的第二固體多孔基質）可以是與結合核酸相比更牢固地結合NAAT抑制劑或者與結合NAAT抑制劑相比更牢固地結合核酸的基質。這種多孔固體基質是優(yōu)選的，因為本發(fā)明的方法之后可起到從核酸除去核酸擴增抑制劑的作用，或者相反，它們可起到從樣品純化和/或濃縮核酸的作用。[0089]在這方面，多孔固體基質需要與結合核酸相比更牢固地結合至少一種核酸擴增抑制劑，或反之亦然，以便適于在本發(fā)明的方法中使用。多孔固體基質是否比結合核酸更牢固(或更少）地結合核酸擴增抑制劑，可以通過使包含核酸擴增抑制劑和核酸的樣品與基質接觸并從基質分離液體來確定。如果與所分離的液體中核酸的相對減少相比抑制劑相對減少更高，則基質更牢固地結合抑制劑。[0090]多孔固體基質可以是樹脂的形式或珠的形式，例如磁珠。[0091]去除NAAT抑制劑[0092]當多孔固體基質與結合核酸相比更牢固地結合核酸擴增抑制劑，所期望的核酸將被優(yōu)先從基質洗脫。本發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人可以更有效地去除NAAT抑制劑，只要[0093]i.所述多孔固體基質與液體樣品一起加熱而不是在室溫下單獨混合，和[0094]ii.液體樣品包含從多孔固體基質分離的未結合的核酸，盡管基質和液體仍然被加熱。[0095]提高去除NAAT抑制劑的能力僅需要如上文所述加熱，而不依賴于歸因于由加熱生成的壓力的洗脫。[0096]因此，本發(fā)明提供了從包含核酸和核酸擴增抑制劑的液體樣品純化核酸的方法，其中所述方法包括以下步驟：(a)將樣品與與結合核酸相比更牢固地結合核酸擴增抑制劑的多孔固體基質接觸，其中將加熱應用于多孔固體基質和液體樣品；和（b)從多孔固體基質分離包含未結合的核酸的液體樣品。[0097]在根據(jù)本發(fā)明的這一方面的方法中，可以理解的是，所述方法應在NAAT抑制劑中的至少一些結合多孔固體基質而核酸中的至少一些不會結合多孔固體基質的條件下進行。合適的條件是本領域技術人員已知的。[0098]加熱可應用于步驟（b)。[0099]本發(fā)明的這一方面的方法可以使用包括作為容器的至少一部分的多孔固體基質的容器，使用本發(fā)明的熱洗脫來實施。因此，所述方法可以包括將液體樣品密封在容器內并升高溫度以增加容器內壓力從而使液體穿過多孔固體基質的步驟。[0100]已經(jīng)顯示，與離心相比，由熱洗脫生成的溫和壓力意味著較少的抑制劑離開多孔固體基質相材料。事實上，如果用離心使液體穿過多孔固體基質，那么第二器皿中存在的核酸樣品將包含比使用熱洗脫時更多的核酸擴增抑制劑。此外，改進的抑制劑去除意味著樣品制備的總稀釋倍數(shù)可以被減少。因此，本發(fā)明的方法并不要求與未利用上文原理i)和ii)的方法一樣多的原始樣品稀釋。[0101]壓力洗脫的力未高至產生使用離心柱方法時見到的對基因組DNA的顯著剪切。因此，有關樣品DNA分子中靶區(qū)域將因剪切而中斷并因此損害檢測是不可能的。[0102]優(yōu)選地，液體樣品從多孔固體基質分離，而液體樣品的溫度仍然大于60°C，更優(yōu)選地大于70°C，甚至更優(yōu)選地大于80°C，最優(yōu)選地大于90°C?？梢詫⒉襟E（a)中的樣品和基質加熱1-10分鐘。[0103]幾種類型的多孔固體基質，包括離子交換樹脂，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)起到本發(fā)明的這一方面的多孔固體基質的作用。這些樹脂能夠遮蔽一種或多種NAAT抑制劑。這些多孔固體基質包括但不限于含有亞氨基二乙酸的苯乙烯二乙烯基苯共聚物（諸如Chelex100-Bio-Rad)，PVPP(聚乙稀卩比略燒酮），聚苯乙稀-堿二甲胺基樹脂（Polystyrene-BaseDimethylaminebasedresins)(DiaionWA30_MitsubishiChemical)，具有叔胺官能團的大孔苯乙稀二乙稀基苯共聚物（OptiporeSD2,Dowex)和由具有叔胺官能團的苯乙稀-二乙稀基苯基質組成的高度多孔的弱堿性陰離子交換樹脂（SDVB樹脂家族）。也可使用活性炭。這樣的基質可以單獨或相互組合使用。應當理解的是，本領域技術人員將能夠篩選使用本發(fā)明的方法將獲得從特定樣品基質中最好地去除NAAT抑制劑的基質或基質混合物。[0104]某些基質，諸Chelex100，已知螯合二價金屬離子，其他基質諸如PVPP已知結合抑制劑多酚化合物。應當理解的是，本領域技術人員會篩選與對核酸的親和性相比對NAAT抑制劑具有較高的親和性的基質，以使得熱洗脫之后核酸與NAAT抑制劑分離。例如，對于從人排泄物檢測艱難梭菌（Clostridiumdifficile)DNA，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，下列樹脂組合對去除MAT抑制劑而不結合艱難梭菌DNA特別有效，使得在熱洗脫之后方便地存在于第二器皿中，所述熱洗脫為1.9ml反應溶液中的10%v/vChelexl00、25%v/vOptiporeSD-2和25%v/vDiaionWA30。[0105]NAAT抑制劑是本領域已知的，并且包括，例如來自血液的血紅素、植物和土壤中存在的腐殖酸、多酚以及某些二價金屬諸如鈣，或膠原蛋白。[0106]根據(jù)本發(fā)明的這一方面純化的核酸可以直接加至NAAT試劑以進行NAAT分析。洗脫的核酸還可以在進行NAAT測定之前被進一步處理。例如，核酸隨后可濃縮和/或轉移到不同的緩沖液中。合適的濃縮方法是本領域中熟知的。[0107]核酸捕獲策略[0108]當多孔固體基質與結合NAAT抑制劑相比更牢固地結合核酸時，熱洗脫之后核酸優(yōu)先保留在容器中的基質上，而NAAT抑制劑優(yōu)先與液體樣品一起穿過多孔固體基質。因此，本發(fā)明提供了使用包括作為容器的至少一部分的多孔固體基質的容器從液體樣品純化核酸的方法，其中所述方法包括以下步驟：將液體樣品密封在容器中，并且升高溫度以增加容器內部的壓力，由此致使液體穿過所述多孔固體基質，其中所述多孔固體基質與結合核酸擴增抑制劑相比更牢固地結合核酸。[0109]應理解的是，使用這樣的多孔的固體基質，核酸中的至少一些將被多孔固體基質保留，而液相，包括NAAT抑制劑中的至少一些，將在很大程度上或完全地洗脫。隨后，進一步處理被多孔固體基質保留的核酸以使它們可用于NAAT可能是必需的。這可以通過以下方式進行，例如，打開容器，并加入會從所述多孔固體基質洗脫結合的核酸的緩沖液，并進行熱洗脫以將所結合的核酸中的至少一些或所有從所述多孔固體基質洗脫至器皿中。所述器皿含有可以在NAAT測定中使用的所洗脫的核酸。[0110]可用于本發(fā)明的這一方面的固相材料的實例包括二氧化硅（經(jīng)由基于Boom的提取工藝）、Charge-Switch珠、寡聚物捕獲珠和離子交換樹脂/珠。[0111]當多孔固體基質被用于捕獲和/或濃縮核酸時，本發(fā)明降低了樣品制備工藝的復雜度。熱洗脫之后，所有的液體樣品可以被轉移至第二個容器或器皿中，這一事實意味著核酸可以從容器洗脫或取出，同時來自原始液相的污染（含有抑制劑）最小，這使得樣品的進一步處理更容易。在某些情況下，可將洗脫緩沖液在初始熱洗脫步驟之后直接加至多孔固體基質，以便從基質洗脫結合的核酸，以使得核酸可以立即加至NAAT試劑。應理解的是，對于某些NAAT來說（特別是在使用生物發(fā)光性報告系統(tǒng)時，諸如W02004/062338中所描述的），當這些方法耐受這些固相材料時，可將具有所結合的核酸的多孔固體基質直接轉移至NAAT試劑中。[0112]可選地，進行第二熱洗脫步驟以從多孔固體基質洗脫至少一些核酸或全部核酸是可能的。這方便地允許方便使用相同原理對樣品進行進一步的處理。[0113]液體樣品[0114]根據(jù)本發(fā)明，穿過多孔固體基質的樣品是液體樣品。術語"液體樣品"不排除可以包括一些固體組分的樣品，但應該理解的是樣品的大部分體積（例如，至少70%、至少85%、至少95%或至少99%)是液體。[0115]液體樣品可以來源于本身是液體樣品的起始樣品，諸如例如血漿或尿?？稍谄渖线M行NAAT和液體樣品可能來源于其的起始樣品，還可以是固體或半固體樣品。例如，樣品可以是排泄物樣品、食品樣品或組織樣品。對于這樣的樣品，固體或半固體樣品可在引入到容器中之前與適合的緩沖液混合以提供液體樣品?？蛇x地，固體或半固體樣品可以加入到已經(jīng)預先裝載適合的緩沖液的容器，由此產生液體樣品。固體或半固體樣品也可以在引入容器之前與適合的緩沖液混合，并且隨后與容器中預先裝載的第二適合的緩沖液（或相同的緩沖液）混合。[0116]起始材料也可以是可被直接加至容器的液體樣品。液體樣品可以在引入根據(jù)本發(fā)明的方法的容器中之前與適合的緩沖液混合。可選地，液體樣品可以加至已經(jīng)預先裝載適合的緩沖液的容器中。液體樣品也可以在引入容器之前與適合的緩沖液混合，并且隨后與容器中預先裝載的第二適合的緩沖液（或相同的緩沖液）混合。[0117]在本發(fā)明的方法中，多孔固體基質可以預裝載在容器中，或與樣品本身一起或在樣品本身之后引入容器中。多孔固體基質可以是樹脂或珠的形式，諸如磁珠的形式。[0118]液體樣品可包含將樣品制備和/或核酸純化的有效性最大化的緩沖器。適合的緩沖液可以包含可以例如保護核酸不被降解，有利于樣品制備和/或使得樣品制備與隨后使用的NAAT試劑相容的組分。例如，緩沖液可包含為抑制性去除劑的EDTA或牛血清白蛋白。它也可以包含可有利于樣品溶解并且能夠使酶諸如核酸酶失活的一種或多種蛋白酶。它也可以含有有利于樣品制備和隨后的核酸擴增兩者的去污劑或鹽（諸如KC1)。緩沖液還可以配置為保持液體樣品的pH值在對樣品制備來說有用的pH值，例如4.5-9.5的pH值或約8的pH值。[0119]樣品溶解[0120]在本發(fā)明的方法中所用的加熱也可以起到溶解容器中樣品并以此制備可用于隨后基于NAAT的檢測的核酸的作用。因此，本發(fā)明的方法可以包括溶解樣品的步驟。當液體樣品包含細菌（諸如產芽孢細菌）和/或病毒時，溶解步驟是特別優(yōu)選的，因為細菌或病毒的溶解也可以使得所述細菌或病毒變?yōu)榉歉腥拘缘?，并因此成為本發(fā)明的方便的安全特征。加熱溶解樣品的有效性可以通過加入其它試劑和/或通過某些固相材料來顯著增加。例如，EDTA和Chelex已顯示因掩蔽穩(wěn)定脂質雙層的二價離子而有利于細胞膜溶解(Brown,T.A.(1995)Genecloning:anintroduction.第3版·Chapman&Hall)〇[0121]本發(fā)明的方法還可以與在液體樣品加入容器之前已經(jīng)被溶解的液體樣品一起使用。這對于僅加熱難以溶解的樣品特別有利。例如，對某些產芽孢細菌，首先用機械方法打破孢子可能是有利的。用于溶解樣品的手段是本領域已知的，并且包括例如超聲處理、機械均質化（例如，通過使用攪拌機，強制細胞通過限制性開口或在各種珠存在的情況下劇烈攪拌）和化學破碎，例如通過使用去污劑（諸如十二烷基硫酸鈉（SDS)，任選與蛋白酶諸如蛋白酶K組合）或離液劑（諸如鹽酸胍）。[0122]當將熱洗脫工藝的洗脫液直接加至NAAT試劑時，所洗脫的液體充分冷卻也以便不對NAAT試劑產生不利影響，可能是重要的。當使用其中所用的酶中的一些不能耐受較高溫度的等溫NAAT時，這是特別重要的。例如，對于一些NAAT而言，諸如基于核酸序列的擴增（NASBA)和滾環(huán)擴增（RCA)，樣品的溫度必須低于50°C或甚至低于40°C，以便使NAAT工作。使用鏈置換聚合酶諸如Bst聚合酶或相關聚合酶的NAAT而言，例如，環(huán)介導等溫擴增（LAMP)或鏈置換擴增（SDA)，樣品的溫度必須低于90°C、80°C、70°C或甚至60°C，以便使NAAT工作。因此，在本發(fā)明的一些方面中，將洗脫的樣品與NAAT試劑混合之前，將液體樣品冷卻到低于90°C、低于80°C、低于70°C、低于60°C、低于50°C或甚至低于40的。C溫度。[0123]熱洗脫之后，可以將液體樣品洗脫至第二容器或器皿中，其中所述容器或所述容器器皿處于與用于熱洗脫的容器大致相同的溫度，使得熱洗脫之后所洗脫的液體保持是熱的。第二容器或器皿也可以處于比所述第一容器低的溫度。例如，溫度可以相差高達100°c，例如其中器皿保持在4°C，以幫助防止所洗脫的核酸降解。[0124]容器或器皿也可以在熱洗脫之后主動冷卻。[0125]洗脫的棹制[0126]這些方法涉及溶解容器中樣品時，加熱樣品一段足夠長的時間至足夠的溫度，以便樣品溶解的物理過程發(fā)生，這是很重要的。同樣的，洗脫發(fā)生前，必須有足夠長的時間以便溶解的樣品與所提供的固相物質相互作用。[0127]因此，本發(fā)明人已經(jīng)意識到，必須控制液體樣品從容器的洗脫速度，以使得液體樣品在處于所需溫度下在容器中度過足夠量的時間。這可以通過限制來自容器的液體的流動來實現(xiàn)，它可以通過各種手段完成。因此，在本發(fā)明的一些方面中，容器將包含限流器，其配置為與沒有限流器的容器相比減少來自容器的液體穿過多孔固體基質的流動。特別是，與沒有限流器的容器相比，這樣的限流器可以減少在容器被加熱至高于室溫的溫度（例如40°C以上或50°C以上）時來自容器的液體穿過多孔固體基質的流動。限流器可以通過在對容器應用加熱時允許恒定的但有限的液體流動穿過多孔固體基質來起作用。這樣的限流器的合適的實例是過濾器和釉料。限流器可以可逆地密封多孔固體基質。在本發(fā)明的這一方面中，密封將在液體樣品可以從容器洗脫之前去除。這可以通過例如，可由機械、磁性或電力控制系統(tǒng)驅動實現(xiàn)。限流器也可以是在高于室溫但低于ll〇°C例如在45°C和IKTC之間，在55°C和110°C之間或65°C和110°C之間的溫度融化的材料層，適合的材料是熱塑性聚合物或蠟（即化在45°C以上熔化產生低粘度液體的化合物），例如固體石蠟。[0128]核酸擴增摶術[0129]本發(fā)明的方法可用于制備用于任何NAAT的樣品。因此，當已經(jīng)組合使用已知為環(huán)介導等溫擴增（LAMP;notomietal·，NucleicAcidResearch,2000,28;E63)與已知為BART的生物發(fā)光報告系統(tǒng)（Gandelmanetal·，PublicLibraryofScience,November2010,Volume5,Issue11，el4155)特別示例說明本發(fā)明時，可以理解的是所述方法不限于這一NAAT。例如，本發(fā)明人已經(jīng)證明，根據(jù)本發(fā)明制備的核酸樣品也可以用于眾所周知比LAMP對抑制劑更敏感的聚合酶鏈式反應（PCR)。本發(fā)明的方法也可用于制備用于其他NAAT諸如模板重引發(fā)擴增（TRA)、自擴張擴增（SEA)、基于核酸序列的擴增（NASBA)、鏈置換擴增(SDA)和智能擴增過程（SMP)的樣品。[0130]另外的熱洗脫步馬聚[0131]根據(jù)本發(fā)明的熱洗脫可以重復一次以上，例如兩次、三次、四次、五次等等。當熱洗脫進行一次以上時，這可以通過將液體應用于與第一熱洗脫步驟所用的相同的容器來完成。為了純化液體樣品中的所有核酸這可能是必要的，例如當液體樣品的總體積超過容器的體積時。當期望在核酸已經(jīng)結合至多孔固體基質后清洗所述多孔固體基質時，它也可能是必要的，或者應用洗脫緩沖液以便基質洗脫結合的核酸可能是必要的。在這些方法中，當需要收集的洗脫的液體時，可以使用另外的容器或器皿。[0132]當進行一次以上熱洗脫時，也可以使用一個以上的容器來實施。例如，可以將來自第一容器的液體洗脫至第二容器。之后可以密封第二容器，并且提高溫度以增加容器內部的壓力，從而致使液體穿過多孔固體基質。來自第二容器的洗脫液體之后可被丟棄、收集于器皿中或轉移到第三個容器中。當使用兩個、三個或多個容器時，它們可以被同時、先后或依次加熱以將液體樣品在容器間轉移，以便在單次消耗中將一些樣品制備工藝自動化。當容器被同時加熱時，使用具有壁厚不同的容器以使得容器中的樣品和基質在不同時間點達到所需要的溫度是可能的。[0133]在一些方面中，通過熱洗脫從容器中洗脫的液體樣品（無論這是具體樣品制備工藝中的第一、第二、第三還是更多次熱洗脫）可以直接與所提供的容器中的NAAT試劑組合而不需要額外的液體處理步驟（例如，移液步驟）來將處理過的樣品轉移至NAAT試劑。[0134]以這種方式，可以預期，單個設備包含兩個或更多個容器，從而操作者只需要將樣品引入一個容器來進行整個樣品制備工藝，包括將處理過的樣品與NAAT試劑混合。這樣的設備會具有不需要復雜的泵和離心機來將液體從一個容器移至另一個容器的顯著益處：可使用簡單的加熱系統(tǒng)。[0135]設各[0136]如上文所討論的，本發(fā)明特別適用于使用本發(fā)明的方法以自動設置純化核酸。因此，本發(fā)明提供了適于根據(jù)本發(fā)明的方法純化核酸的設備。例如，本發(fā)明提供了一種用于純化核酸的設備，包括（a)包含作為容器的至少一部分的多孔固體基質的容器和用于密封容器的工具，和（b)配置為將容器加熱至高達IKTC的溫度的加熱元件。所述設備可以進一步包括第二容器以接收穿過多孔固體基質的液體。此外，或可選地，它也可以包括包含用于核酸擴增的試劑的器皿。[0137]本發(fā)明的設備使得能夠從樣品自動純化核酸，這能夠大大促進樣品制備。特別是，在設備還包含含有用于核酸擴增的試劑的器皿的實施方案中，本發(fā)明的設備具有操作者僅需要將樣品加至所述設備的優(yōu)點，因為所有的后續(xù)步驟都可以自動進行。因此，樣品可以被處理并擴增，而在將樣品加至容器和記錄擴增本身的輸出之間沒有人工干預。[0138]設備中的容器可以包含與結合核酸擴增抑制劑相比更牢固地結合核酸或與結合核酸相比更牢固地結合核酸擴增抑制劑的多孔固體基質，如上文詳細討論的。[0139]設備可以包括兩個或更多個（例如兩個、三個、四個、五個、六個或更多個）容器。多孔固體基質在設備的所有容器中可以是相同的。它們也可以是不同的，這在基質捕獲NAAT抑制劑的實施方案中可能是有利的，因為之后具有以不同強度結合不同抑制劑的基質將是可能的，這可以改進抑制劑的去除。當不止一個容器存在于本發(fā)明的設備中時，優(yōu)選的是，可以將每一個容器通過加熱元件加熱至高達IKTC的溫度，因為之后這些另外的容器中的液體可僅通過加熱來轉移。設備可以包括一個加熱元件或不止一個加熱元件。設備中的兩個或更多個容器可以以不同的速率加熱和/或加熱至不同的溫度。[0140]當設備包含不止一個容器，或一個或多個容器和器皿時，容器可定位在設備內，使得從一個容器洗脫的液體直接滴入另外的容器或器皿的開口中。通過通路諸如管轉移液體也是可能的。如果另外的容器將被用于本發(fā)明的熱洗脫，則管可以包含，例如，使得容器能夠在其被加熱之前被密封的閥。[0141]根據(jù)本發(fā)明，來自容器的液體會通過加熱穿過一個或多個容器中的多孔固體基質。因此，優(yōu)選的是，本發(fā)明的設備將不包含使液體穿過容器的多孔固體基質所需的離心機或栗。[0142]優(yōu)選的是，本發(fā)明的設備包括包括NAAT所需的試劑中的至少一些或優(yōu)選地全部試劑的器皿。器皿可以使得從容器洗脫的液體直接加至包含NAAT的器皿的方式定位在設備內。本發(fā)明的設備適于與所有的NAAT-起使用，包括但不限于PCR和LAMP。NAAT所需的試劑是本領域已知的，并且包括例如一種或多種引物、緩沖液、聚合酶和核苷酸（諸如dNTP)〇[0143]通則[0144]與數(shù)值X相關的術語"約"是可選的并且意指，例如X±10%。[0145]術語"包含"涵蓋"包括"以及"由...組成"，例如"包含"X的組合物可以僅由X組成或可以包括其它物質例如X+Y。[0146]術語"一個/種（a)"或"一個/種（an)"意指"一個/種或多個/種"。[0147]除非特別說明，包括混合兩種或更多種組分的步驟的工藝不要求任何特定的混合順序。因而組分可以以任何順序混合。當有三種組分時，那么兩種組分可以相互組合，并且之后該組合可與第三組分組合，等等。[0148]BART是指用于確定樣品中存在的模板多聚核酸的量的方法，其中來源于擴增反應的無機磷酸鹽的存在被檢測到并指示樣品中模板多聚核酸的量。[0149]現(xiàn)在將通過實施例的方式更詳細地描述本發(fā)明的各個方面和實施方案。應當理解的是可以進行細節(jié)的修改而不脫離本發(fā)明的精神和范圍?！緦＠綀D】【附圖說明】[0150]圖1:圖Ia顯示將液體試樣加至包含另一個密封開口的容器的原理；密封引入了液體的容器的開口；打開抵制液體流出這一第一容器的某種過濾器另一側上的容器的出口；將第一容器放在能夠從所述容器收集洗脫液的收集器皿內；將所述容器和所述器皿放在加熱塊中并隨后將液體從容器轉移至所述器皿。[0151]圖lb，如同la，但容器有含有優(yōu)選結合NAAT抑制劑而不是核酸的固相材料。熱洗脫后核酸溶液存在于器皿中。[0152]圖lc，如同lb，但在加至容器之前，混合固相材料和樣品。[0153]圖ld，如同la，但容器具有含有優(yōu)選結合核酸而不是NAAT抑制劑的固相材料。第一器皿內進行熱洗脫之后，將核酸固定在固相材料上。[0154]圖le，如同ld，但在被加至第一器皿中前混合固相材料和樣品。[0155]圖lf，如同Ib或lc，但所洗脫的核酸隨后使用優(yōu)選結合核酸的不同的固相材料來濃縮。在這種情況下，固相材料由可以使用磁體從樣品沉降的順磁珠組成。核酸可以用適合的洗脫緩沖液從所述材料釋放，否則，可將珠直接加至基于NAAT的檢測。[0156]圖2顯示如實施例1中所述第一器皿中加上和減去固相材料的兩個器皿之間的熱洗脫的數(shù)據(jù)。[0157]圖3顯示用于稀釋系列靶核酸的典型的BART-LAMP法的輸出。使用BART技術，陽性樣品獲得隨時間增加但之后減小的光強度。到達光峰值的時間與擴增反應中存在的靶核酸的量成反比。[0158]圖4比較用于從ISO巧克力濃縮物去除抑制劑的加熱和未加熱頂-SDVB。[0159]圖5使用4°SDVB和3°SDVB從咖啡濃縮物去除NAAT抑制。與不使用樹脂或使用樹脂頂-SDVB(a)相比，樹脂4°SDVB(b)和3°SDVB(C)顯示在去除速溶咖啡所造成的抑制上極為有效。[0160]圖6在100°C的熱塊上隨著加熱時間的通過樹脂混合物的腐殖酸抑制去除（a);在100°c的熱塊上隨樹脂混合物的加熱時間的溫度概況（b)。[0161]圖7隨著來自設定在100°C下的熱塊的熱洗脫洗脫液的時間的溫度概況。[0162]圖8通過熱洗脫去除木聚糖抑制對比僅在緩沖液中稀釋。[0163]圖9通過使用不同的釉料以及使用蠟調節(jié)洗脫時間。[0164]圖10顯示通過以下方式提取的艱難梭菌（C.difficile)陽性排泄物樣品之間的比較的艱難梭菌LAMP-BART反應的擴增概況：A)排泄物頂SDVB緩沖液混合物經(jīng)由PVPP柱熱洗脫或，B)負載有沸騰的排泄物IMSDVB緩沖液混合物的PVPP柱的紡絲洗脫和C)沸騰的排泄物頂SDVB緩沖液混合物的水旋澄清。[0165]圖11顯示熱洗脫排泄物提取物和離心洗脫的排泄物提取物的UV可視插入劑染色的1%瓊脂糖的強度概況。[0166]圖12顯示使用Pierce8ml柱中專用樹脂混合物和收集管提取艱難梭菌陽性排泄物樣品和艱難梭菌陰性排泄物樣品后的艱難梭菌LAMP-BART反應的擴增曲概況。[0167]圖13:(a)對照稀釋方法，通過熱洗脫由艱難梭菌陽性臨床糞便樣品（stoolsample)進行艱難梭菌LAMPBART檢測；[0168](b)對照稀釋方法，通過熱洗脫，來自艱難梭菌陽性臨床糞便樣品的抑制劑對照LAMPBART概況[0169]圖14:使用簡化的ChargeSwitch?磁珠方法比較濃縮前后艱難梭菌基因組DNA檢測。[0170]圖15:使用熱洗脫的多器皿樣品制備和擴增的集成[0171]圖16:有和沒有使用合并至第一器皿的ChargeSwitch?磁珠進行熱洗脫的艱難梭菌基因組DNA檢測的比較。實施例[0172]實施例1:加熱足以使用標準塑料消耗品和固相基質抗阻力驅動來自容器的洗脫液，證實熱洗脫原理。[0173]樣品制備柱內的加熱使得壓力能夠建立，這使得樣品溶解物穿過柱基自我洗脫，并且不需要離心機或注射器的輔助來實現(xiàn)這些（圖1)。這一特征示例于（a)小的0.8ml柱規(guī)模以及（b)較大的8ml柱上。[0174](a)用反應緩沖液中的專用樹脂混合物填充0.8ml柱（Pierce#89688)至600μ1的終體積，此時緩沖液的已占體積為327.5μ1。緊閉蓋子并分離（breakoff)扭動片(twisttab)。將柱放在2ml收集管中并且將全部的柱和試管置于95°C的加熱塊上10分鐘。在此期間，壓力已經(jīng)在柱內建立，而逐漸驅動大部分的液體穿過柱基部進入收集管中。[0175](b)用反應緩沖液中的專用樹脂混合物填充8ml柱（Pierce#89897)至3.4ml的終體積，此時緩沖液的已占體積為I.96ml。緊閉蓋子并分離扭動片。將柱放在13.5mm內徑的收集管（Fisher#FB51579)中，并且將全部的柱和試管置于具有80mm插入深度的定制加熱塊上。將其于100°c加熱10分鐘。在此期間，壓力已經(jīng)在柱內建立，而逐漸驅動大部分的液體穿過柱基進入收集管中。[0176]為了確認，在產生抵抗洗脫的背壓的固相和固相過濾器存在的情況下，中度加熱可以經(jīng)由熱洗脫方法洗脫液相，在Chelex100(Bio-Rad公司）存在的情況下，洗脫溶液。具體而言，按如下制備分子級水中ChelexlOO的10%懸浮液：將I.096gChelex置于50ml燒杯中并加入10.96ml分子級水（Sigma)。其再加入小攪拌子之后于磁力攪拌器上攪拌。將800μ1加至已經(jīng)除去卡扣片（snaptab)的兩個預先稱重的Pierce89868柱。將這些柱置于2ml收集管中，并以8000rpm離心1分鐘以從柱中的Chelex樹脂除去水。將250μ1的分子級水加至這兩個柱和另兩個預稱重的柱。將這些置于預先稱重的2ml扣蓋管中并置于l〇〇°C熱塊上或在室溫下保持5分鐘。5分鐘結束時，將柱和洗脫液管稱重，以確定洗脫液的體積和留在柱上的水的體積。僅保持在室溫下的兩個柱均未洗脫任何水，然而，兩個加熱的柱已經(jīng)洗脫，從加熱的Chelex柱上洗脫198.5μ1而從只有水的柱洗脫226.4μ1(圖2)。[0177]實施例2:BART報告系統(tǒng)[0178]BART報告系統(tǒng)已經(jīng)在W02004/062338和W02006/010948中進行了詳細說明，其通過引用并入本文。BART是設計用于等溫NAAT的報告系統(tǒng)的實例，其產生來自樣品的單一類型的信號，一種生物發(fā)光信號。BART利用無機焦磷酸鹽的螢火蟲熒光素酶依賴性檢測。這是在使用NAAT檢測到"靶"序列時大量產生的。因此，分子診斷可以在均相測定中簡單地用BART通過測量封閉管所發(fā)射的光來實現(xiàn)（圖3)。BART由在50-63°C之間操作的多個不同的NAAT證明。BART報告是追蹤MAT的擴增速率的特別有效的手段，因為光輸出表示擴增的瞬時速率的測量值（而例如熒光輸出顯示信號的積累，并且因此必須區(qū)分測量結果以獲得擴增速率）。[0179]實施例3:去除NAAT抑制劑的固相材料在它們于更高的溫度被洗脫時（這隨著熱洗脫自然發(fā)生）表現(xiàn)更好。[0180]i)固相樹脂"3°SDVB"在不同溫度下去除NAAT抑制劑的能力[0181]將20μ1的187.5ng/μ1腐殖酸原液加至含有無3°SDVB樹脂的580μ1緩沖液和有20%的3。SDVB的580μ1緩沖液的兩組BART-LAMP反應緩沖液（190mMBicine，pH8.0)中。一組渦旋混合，然后在95°C加熱5分鐘，隨后第二次渦旋。對照組渦旋并在室溫下靜置這一時間，然后再次渦旋。[0182]20μ1的每種上清液用于重構含有固定數(shù)量（104)的特定靶DNA分子（在本文中稱作"抑制劑對照"）的冷凍干燥的BART-LAMP反應物。隨后比較重復反應的峰值時間。抑制劑的存在可減緩或廢止擴增，在這種情況下，峰值時間（BART報告系統(tǒng)產生特征光峰值所花費的時間）會分別共同增加或消失。這表明，在沒有加熱和沒有樹脂的情況下，具有腐殖酸的反應時間為59.7±0分鐘。這在樹脂存在時改善至57.0±0.5分鐘，并在采用加熱的樹脂時進一步顯著改善至38.4±2.1分鐘。[0183]ii)固相樹脂"頂-SDVB"在不同溫度下去除復雜NAAT抑制劑的能力。[0184]測試巧克力的食品病原體的工藝包括，在含有緩沖蛋白胨水以及奶粉和染料艷綠的250ml富集培養(yǎng)基中孵育25g巧克力。孵育后發(fā)現(xiàn)這種富集培養(yǎng)基對NAAT是高度抑制的；這一培養(yǎng)基在本文中稱為ISO巧克力富集物。抑制劑的特性是未知的。將兩組ISO巧克力富集物的20μ1樣品加至I.5ml的離心管中的580μ1的pH8.8的20mMTris緩沖液以及10%(w/v)M-SDVB(由具有亞氨基二乙酸官能團的苯乙烯二乙烯基苯共聚物組成的陽離子交換樹脂），所述緩沖液含有IOmM硫酸按、0.15%TritonX-100、0.4mg/ml聚乙稀[!比咯烷酮和0.09%疊氮鈉。將這些脈沖渦旋。將一組巧克力樣品管于110°C在加熱塊上加熱5分鐘。而將另一組在室溫下保持同樣的時間。5分鐘后，兩組管都被脈沖渦旋，使得能夠冷卻，并且來自每支管的20μ1被用于在200μ1的PCR條帶中一式三份重構冷凍干燥的抑制劑對照BART-LAMP反應物。圖4顯示加熱的巧克力富集物產生24.7±1.15分鐘的平均峰值時間，這比32.8±1.61分鐘的未加熱的平均峰值時間快8.1分鐘。同時運行的空白抑制劑對照產生18.9±1.00分鐘的峰值時間。因此，在頂-SDVB中加熱巧克力與未加熱相比導致BART-LAMP抑制的減少。[0185]iii)固相樹脂"PVPP"在不同溫度下去除NAAT抑制劑腐殖酸的能力。[0186]200μ1的PVPP懸浮液用移液管移至200μ1的管中，其旋轉沉淀以產生密實的PVPP床，并且除去100μ1的過量液體。將100μ1的1.25μg/μ1腐殖酸加至PVPP床的頂部。加入物被渦流混合遍布PVPP。將三支管在95°C加熱15分鐘而三支管在室溫下放置15分鐘。5分鐘后渦旋所有管被并放回至溫度。取20μ1至單獨的PCR管，并且顆粒被旋轉沉淀。PVPP上清液上的室溫腐殖酸中的一些也在95°C下加熱15分鐘。將來自每支管的5μ1加至15μ1抑制劑對照BART-LAMP反應物。在95°C下加熱的PVPP上腐殖酸、室溫下PVPP上腐殖酸以及來自后者的上清液的抑制劑對照峰值時間分別是32.85±7.20分鐘、47.63±8.17分鐘和59.16±14.92分鐘。這表明，加熱的PVPP比室溫PVPP去除更多的腐殖酸抑制劑，而加熱來自室溫PVPP提取物的腐殖酸上清液沒有產生額外的抑制減輕。在這項研宄中，具有水的未抑制的峰值在23.11±3.31分鐘。[0187]iv)在不同溫度下固相樹脂"4°SDVB"和"3°SDVB"去除復雜NAAT抑制劑的能力。[0188]速溶咖啡可被證明含有強效NAAT抑制劑，因此，速溶咖啡是有用的抑制劑模型的代表。將速溶咖啡（Ig)加至IOml緩沖的蛋白胨水并在37°C孵育18小時。將20μ1的富集物加至580μIBART-LAMP擴增緩沖液的管中，所述緩沖液不含有樹脂，含有10%的M-SDVBdOOyl的4°SDVB(由具有季胺官能化基團的苯乙烯二乙烯基苯基質組成的大孔強堿陰離子交換樹脂）或300μ1的3°SDVB(具有叔胺官能化基團的大孔苯乙烯二乙烯苯共聚物）。將所有的管渦旋并在ll〇°C下加熱5分鐘。加熱的管被脈沖渦旋并使之冷卻。對每個條件一式兩份加入20μ1溶液中以在200μ1的PCR條帶中一式三份重構冷凍干燥的抑制劑對照BART-LAMP反應物。無樹脂但具有頂-SDVB(圖5a)、4°SDVB(圖5b)和3°SDVB(圖5c)的緩沖液中的咖啡富集物分別產生了45.3±8·3分鐘、37.8±3·8分鐘、19.7±0.8分鐘和22.4±1.5分鐘的平均峰值時間。因此，4。SDVB和3°SDVB兩者都從咖啡富集物去除了抑制劑，從而與僅緩沖液中的咖啡富集物的28分鐘延遲相比，允許抑制劑對照峰值比17.1±0.0分鐘的水抑制劑對照峰值時間慢不超過6分鐘。[0189]V)抑制劑去除的溫度依賴性[0190]將九支2ml試管用溶于BART-LAMP反應緩沖液的特定樹脂混合物（I0%v/vChelex100、25%v/vOptiporeSD-2和25v/vDiaionWA30)填充，其中緩沖液已占體積是633.2μ1。向這些試管中的每一支中，加入21.8μ1的187.5ng/μ1腐殖酸原液并渦旋混合。將每支試管置于l〇〇°C的加熱塊上0、1、2、3、4、5、8和10分鐘的時間點，之后將它們每一支從加熱塊移走，然后立即渦旋并且從所述樹脂取出200μ1上清液。在整個10分鐘的加熱中，也用熱電偶每30秒監(jiān)測另一支試管中的溫度。另外兩個對照分別具有655μ1僅緩沖液（無抑制劑對照）和633.3μ1中21.8μ1腐植酸（抑制對照）的設置。將這些試管在熱塊上加熱10分鐘。來自每支的上清液被用于一式兩份重構冷凍干燥抑制劑對照LAMP-BART反應混合物。這些在60°C運行并且在將所述時間過程中反應的峰值時間相比較。圖6a中的數(shù)據(jù)表明，抑制劑去除有隨加熱時間的增加而增加的趨勢，而在圖6b中這與溫度增加相關。通過5分鐘的加熱，證實了當所記錄的樹脂制劑溫度達到93.4°C時，達到了最大的抑制減輕。抑制劑對照峰值時間從〇分鐘孵育的43.2±0.5分鐘縮短至10分鐘的加熱后的19.7±0.5分鐘。[0191]同樣制備了具有專用樹脂混合物和腐殖酸的一組試管，作為不加熱的對照，并在室溫下孵育。0、1、2、3、4、5、8和10分鐘的時間點之后，將它們每一個分別立即禍旋，并從樹脂取出200μ1上清液。來自每一個的上清液被一式兩份用于重構冷凍干燥的抑制劑對照LAMP-BART反應混合物。這些在60°C運行并且將所述時間過程中反應的峰值時間相比較。由熱電偶測得的樹脂溫度為22.7°C。在這些試管中，在0分鐘孵育時的抑制劑對照峰值時間為49.0±1.0分鐘。即使在10分鐘孵育之后，峰值時間為44.2±2.7分鐘，表明使用未加熱的樹脂時抑制上無顯著降低，并確認加熱的樹脂在抑制劑去除上是更有效的。[0192]vi)熱洗脫的溫度動力學[0193]將8ml柱（Pierce#89897)用溶于BART-LAMP反應緩沖液的特定的樹脂混合物((10%v/vChelex100、25%v/vOptiporeSD-2和25%v/vDiaionWA30)填充，其中緩沖液已占體積為I.965ml。分離扭動片而將熱電偶放入洗脫頭。之后將柱放入13.5mm內徑的收集管（Fisher#FB51579)并且將全部的柱和管置于具有80mm插入深度的定制加熱塊上。將其于l〇〇°C加熱，并且3分鐘后每30秒監(jiān)測洗脫液的溫度，從洗脫開始時進行10分鐘。與最大抑制劑去除相關聯(lián)的最佳的溫度（圖6a和6b)在加熱時間期限內很容易達到得到證實。圖7顯示8分鐘的加熱時間使得洗脫溫度能夠上升至>93°C。事實上，因為溫度是與抑制劑去除相關的，那么顯著的抑制劑去除會在76°C發(fā)生，這意味著以這種形式加熱至少3分鐘。[0194]vii)在加熱和混合研宄中，從熱樹脂去除樣品洗脫液表現(xiàn)出比從冷樹脂去除更好的抑制劑去除。[0195]在LAMP-BART反應緩沖液中制備已被表征為含有一定豐度的NAAT抑制劑的來自糞便樣品的提取物的1比5稀釋液。將50μI(IOmg)與僅655μ1緩沖液混合，作為"無樹脂"對照。將另一個50μ1的量加至含有專用樹脂混合物的六支試管中，其中緩存液的已占體積也是655μ1。將每支試管于95°C加熱10分鐘。試管（a)在加熱之前和之后都進行混合；(b)不混合；（c)在加熱前混合；（d)在加熱后混合；（e)加熱之前和之后進行混合并且熱的上清液在冷卻前被取出；（f)加熱之前混合并在加熱之后靜置冷卻，之后混合。將20μ1的每種上清液一式兩份用于重構冷凍干燥的抑制劑對照LAMP-BART反應混合物并在60°C運行。比較反應的峰值時間。無樹脂時，在120分鐘的運行時間內檢測是不可能的。在（b)和（c)中，同樣沒有檢測，這表明與冷樹脂的初始混合物沒有抑制劑結合作用。（a)、(d)和（e)的反應物都在22.4至28.8分鐘內顯示檢測，其中發(fā)生有效的抑制劑去除，這表明，加熱后立即與熱樹脂混合對于去除抑制劑來說是必不可少的。如果將樣品和樹脂冷卻至室溫并混合（f)，則在120分鐘內檢測同樣失敗了。[0196]實施例4:使用熱洗脫方法從樣品去除抑制劑[0197]i)熱洗脫可用于去除NAAT抑制劑木聚糖[0198]將27.3μ1的60yg/yl木聚糖原液加至655μ1的反應緩沖液并在100°C加熱塊上加熱6分鐘。將81.8μ1的60μg/μ1木聚糖原液加至含有專用樹脂混合物的具有1.965ml的已占體積的柱。緊閉蓋子，并分離扭動片。將柱置于13.5mm內徑的收集管(Fisher#FB51579)中，并且將柱和試管放入裝有沸水的錐形瓶中6分鐘。[0199]來自每一試管的洗脫液被一式兩份用于重構冷凍干燥的抑制劑對照BART-LAMP反應混合物。將這些在60°C運行并且將比較反應的峰值時間。圖8顯示，在木聚糖存在時，在沒有樹脂處理的情況下，檢測時間為39.5±2.16分鐘。然而，柱洗脫液產生18.7±0.66分鐘的檢測時間，這表明，在相同稀釋倍數(shù)，樹脂去除木聚糖抑制劑。[0200]實施例5:洗脫的控制[0201]i)小孔徑釉料和高融化溫度石蠟用于調節(jié)洗脫[0202]為了有效去除樣品抑制劑，必須在液相洗脫前將樣品暴露于加熱的樹脂一段足夠的時間。因此，必須通過一些手段控制洗脫的速率。[0203]通過在樹脂下使用小孔徑聚乙烯釉料和高融化溫度固體石蠟來調節(jié)洗脫速率，以限制從柱流出的洗脫液。加熱期間洗脫的開始被延遲了3分鐘，并且在10分鐘之前完成，以確保樣品充分暴露于加熱的樹脂（圖9)。[0204]實施例6:熱洗脫所洗脫的核酸的質量[0205]i)對于抑制劑去除來說，熱洗脫可能比離心更好：通過LAMP-BART比較排泄物提取物的紡絲洗脫和熱壓力洗脫[0206]將27mM二硫蘇糖醇中20%的頂-SDVB和13.3BICINEpH5加至250μ1艱難梭菌陽性的腹瀉樣品中，并且渦旋混合。將200μ1體積的這種渦旋的均質混合物加至含有壓實的PVPP床的800μ1離心柱或加入2支1.5ml的試管中。將含有排泄物-IMSDVB-DTT-BICINE混合物的PVPP柱蓋緊，移除柱底部的塑料片以打開柱的基部，放置在I.5ml收集管中，并在105°C的熱塊上加熱15分鐘（A)。這使得洗脫液被熱洗脫至收集管中。將含有樣品的I.5ml試管同時在105°C加熱15分鐘。當冷卻后，將試管在14,OOOrpm離心5分鐘，并將來自其中一支試管的上清液轉移至I.5ml收集管中底部打開的含有密實的PVPP床的800μ1旋轉柱中。這一PVPP柱通過在微型離心機上以8,OOOrpm離心2分鐘來洗脫（Β)。使用來自其他1.5ml試管的提取物，而不使用PVPP柱（C)。將來自每種提取物的5μ1體積一式兩份加至PCR板的試管中15μ1反應體積的艱難梭菌LAMP-BART試劑。這些用油覆蓋并放置在60°C的BART擴增檢測儀上。圖10顯示直接在PVPP柱中溶解的排泄物樣品的峰值時間為28.28±0.75分鐘，在管中熱溶解并且在PVPP柱上旋轉的為28.28±2.26分鐘，而在緩沖液中熱溶解排泄物樣品并旋降沉淀的為61.39±3.78分鐘。因此，對于這一特定的排泄物樣品，在PVPP柱內熱溶解樣品并熱壓力洗脫與在管中溶解樣品并且之后在PVPP柱上旋轉洗脫溶解物一樣好。所旋出的溶解物產生較慢的檢測，歸因于抑制劑依然存在于溶解物中。[0207]ii)熱洗脫促進了高分子量的DNA洗脫[0208]用專用樹脂填充0.8ml柱（Pierce#89688)至555μ1的對于在I.5ml試管中洗脫開放的最終無水體積。將333μ1排泄物樣品加至含有緩沖液中的20%頂-SDVB的另一個試管并且通過渦旋混合。將200μ1的這一混合物加至0.8ml柱，蓋緊并且之后于其I.5ml試管中在95°C熱塊上加熱15分鐘。洗脫之后，將試管冷卻，并將柱轉移至新試管并且以8,000Xg離心3分鐘。將15μ1的加熱和旋轉洗脫液在與3μ1加樣緩沖液混合后在包含嵌入性染料的1%瓊脂糖凝膠上運行，并且在投射儀上捕獲凝膠圖像（圖11)。熱洗脫液的強度概況顯示，染色的DNA基本上是殘留在凝膠孔中的高分子量。隨后同一柱的離心洗脫顯示另外的低分子量染色。已經(jīng)知道離心會導致對高分子量DNA的剪切，這產生低分子量片段并可以通過擴增靶位點內的破損影響低拷貝數(shù)檢測。沒有DNA剪切是熱壓提取洗脫的優(yōu)點。[0209]實施例7:熱洗脫原理的證明[0210]i)糞便樣品提取之后用于艱難梭菌檢測[0211]用反應緩沖液中的專用樹脂混合物填充8ml柱（Pierce#89897)至3.4ml的終體積，其中緩沖液已占體積為I.965ml。使用無菌微超細植絨取樣拭子（Puritan#25-33181PN50)對艱難梭菌陽性和陰性排泄物樣品各取一份樣品。拭子的末端在樹脂混合物中混合，將拭子的柄折斷并緊閉柱。使分離扭動片脫落，并且將柱放入13.5mm內徑的收集管(Fisher#FB51579)中，并且將全部的柱和試管置于具有80mm插入深度的定制加熱塊上。將其在100°C加熱10分鐘。在此期間壓力已經(jīng)在柱內建立，并且全部洗脫液被逐漸驅動穿過柱基部進入收集管中。來自每個的洗脫液被一式兩份用于重構冷凍干燥的抑制劑對照LAMP-BART反應混合物。這些在60°C運行并比較反應的峰值時間。這產生24.04±0.75的艱難梭菌陽性樣品檢測時間，而艱難梭菌陰性樣品沒有產生峰值（圖12)，因此這表明所述方法能夠成功從糞便檢測艱難梭菌。[0212]ii)熱洗脫除去排泄物抑制而因避免了對過度稀釋的需要而不影響檢測。[0213]用反應緩沖液中的專用樹脂混合物填充6X8ml柱（Pierce#89897)，其中緩沖液的已占體積為1.965ml。通過壓力柱洗脫法測試六個確認的艱難梭菌陽性臨床糞便樣品。將150μ1的每種臨床樣品在反應緩沖液中的1比5稀釋液（30mg)加至每個柱并混合。分離扭動片。然后將柱放入13.5mm內徑的收集管（Fisher#FB51579)并且將全部的柱和試管都置于具有SOmm插入深度的定制加熱塊上。這些在l〇(TC加熱10分鐘，并且將洗脫液冷卻至室溫。用20μ1洗脫液重構冷凍干燥的艱難梭菌和抑制劑對照LAMP-BART試劑。[0214]將六份糞便樣品也稀釋至其他可用的艱難梭菌測試中所用的那些的量級水平。這些在反應緩沖液中以最終600μ1體積制備至1比200、1比500和1比700,渦旋混合，并在2ml試管中于設定在100°C加熱塊上加熱10分鐘。將試管混合并且之后用20μ1的溶解物重構冷凍干燥的艱難梭菌和抑制劑對照LAMP-BART試劑。反應在BART檢測硬件上于60°C運行90分鐘。樣品AOOl和A004具有低艱難梭菌負載，由公共衛(wèi)生實驗室（PublicHealthLaboratory)所用的PCR方法中的高Ct值證實。壓力柱提取已經(jīng)檢測所有重復，包括這兩個具有挑戰(zhàn)性的樣品，其中200x倍和700x倍稀釋之間稀釋方法顯示檢測受損。在圖13a中比較了所述方法的艱難梭菌LAMP-BART峰值時間。熱洗脫法需要樹脂混合物中不超過70倍稀釋以充分去除排泄物抑制。[0215]樣品AOOl是所述組中具有高抑制劑負載并具有最低艱難梭菌水平的固體糞便。這一樣品成功通過熱洗脫法檢測，其中1比200時的檢測已受損，而1比500和1比700由于過度稀釋而完全失敗。圖13b顯示對于這一樣品，1比200的抑制劑對照顯示出比來自柱（70倍稀釋）更多的抑制。事實上，將樣品以1比500稀釋以減輕抑制是必要的。就抑制去除而言，如通過更高抑制性的樣品AOOl和A005的趨勢所觀察到的，具有樹脂的熱洗脫柱比200倍稀釋更有效。[0216]iii)熱壓提取之后對諾如病毒（Norovirus)的檢測[0217]將50μ1諾如病毒GII-4陽性的腹瀉樣品加至I.5ml螺旋蓋試管中150μ1的溶于20mMMES，40mMDTT的20%的頂-SDVB。將其混合、加蓋并置于95°C熱塊上10分鐘，之后被帶至冰上2分鐘，并且之后以17,OOOrpm離心5分鐘。將100μ1上清液加至800μ1試管中壓實的PVPP床并以8,000Xg旋轉洗脫2分鐘。將來自提取液的5μ1體積，以及之前使用Boom技術提取的1μ1相同的排泄物樣品，一式兩份加至PCR板的試管中15μ1反應體積的諾如病毒GII-4逆轉錄酶LAMP-BART試劑。將這些用油覆蓋并置于60°C的BART擴增檢測儀上。頂SDVB-MES-DTT熱溶解以及之后的PVPP柱純化提取的排泄物樣品的峰值時間為50.44±7.59分鐘。這可與1μ1來自之前Boom法提取的樣品的43.46±0.76相比較。這表明諾如病毒RNA可用可與熱洗脫相容的方法來提取。[0218]實施例8:熱洗脫后從第二器皿濃縮核酸[0219]i)熱洗脫后，核酸可以進一步濃縮[0220]對于低拷貝數(shù)的應用來說，已經(jīng)證明，基因組艱難梭菌DNA水平的濃縮在摻入反應緩沖液即與洗脫液相同的試劑組合物時是可能的。[0221]將艱難梭菌基因組DNA的稀釋液在反應緩沖液中制備為每20μ1，IO3UO2UO和0個拷貝。20μ1每種稀釋液被用來一式兩份重構冷凍干燥的艱難梭菌LAMP-BART反應混合物并在60°C運行。[0222]每種稀釋液也通過取800μ1的混合物并與5μ1的ChargeSwitch?磁珠和160μ1的試劑盒結合緩沖液（Invitrogen)混合1分鐘來濃縮。通過在磁架上沉降珠來除去上清液。將珠重懸浮于80μ1的反應緩沖液而20μ1的粗懸浮液，包括珠，被用來一式兩份重構冷凍干燥的艱難梭菌LAMP-BART反應混合物并在60°C運行。[0223]圖14顯示濃縮將IO3和102個拷貝/20μ1水平的檢測時間提高3.2至4.8分鐘，并允許在52.3分鐘之前可再現(xiàn)地檢測10個拷貝/20μ1水平的兩個重復，其中，當沒有濃縮時僅檢測到2個重復中的1個。[0224]ii)熱洗脫后用簡化的ChargeSwitch?磁珠法從陽性排泄物濃縮艱難梭菌[0225]將艱難梭菌陽性糞便（1比5溶于反應緩沖液）用陰性糞便（1比5溶于反應緩沖液所制備的）1比10稀釋。將150μI(30mg糞便）的稀釋液加在含有溶于BART-LAMP反應緩沖液的特定的樹脂混合物（10%v/vChelex100、25%v/vOptiporeSD-2和25%v/v01&丨〇11'^30)的81111柱（？丨61^6#89897)上并手動混合。緩沖液已占體積為1.9651111。緊閉蓋子并分離扭動片。將柱置于13.5mm內徑的收集管（Fisher#FB51579)中并且將全部的柱和試管置于定制加熱塊上。將其于l〇〇°C加熱10分鐘。將20μ1收集到的洗脫液一式兩份用于重構冷凍干燥的艱難梭菌LAMP-BART反應物。[0226]將800μ1的洗脫物通過與5μ1的ChargeSwitch'?磁珠和160μ1的試劑盒結合緩沖液（Invitrogen)混合1分鐘來濃縮。通過在磁架上沉降珠來除去上清液。將小珠重懸浮于80μ1的反應緩沖液，而20μ1的粗懸浮液，包括珠，被用來一式兩份重構冷凍干燥的艱難梭菌LAMP-BART反應混合物。[0227]LAMP-BART反應物于60°C在BART檢測儀上運行。洗脫液的濃縮將檢測時間從27.2±0.5分鐘（未濃縮的）改進至19.2±0分鐘（濃縮后）。[0228]iii)有和沒有進行使用包含在第一容器中ChargeSwitch'?磁珠進行熱洗脫的艱難梭菌基因組DNA檢測的比較[0229]將20μ1艱難梭菌基因組DNA(IO3個拷貝，每20μ1)原液加至L98ml的Bicine緩沖液。[0230]將200μ1的原液用于使用I.8mlBICINE緩沖液以IO2和101個拷貝每20μ1制得系列稀釋液。[0231]按如下處理gDNA稀釋液：[0232]第1組：無處理。20μ1被用于直接重構艱難梭菌LAMPBART測定。[0233]第2組：將400μ1艱難梭菌gDNA稀釋液加至具有2.7mm釉料以及另外的玻璃過濾器（G/FDFD#1823-025紙，Whatman)以及5μIChargeSwitch珠和80μ1結合緩沖液的I.5ml熱洗脫柱。將其通過移液混合。緊緊固定柱蓋并置于100°C的加熱塊（具有2ml收集管）上6分鐘。洗脫后，將具有捕獲的珠的GF/D材料直接轉移至40μ1的重構艱難梭菌LAMPBART測定。[0234]與沒有熱洗脫相比，使用熱洗脫和磁性小珠濃縮的條件有助于檢測稀釋系列中低于1個對數(shù)的，從而證明了熱洗脫可以與珠捕獲法結合使用來濃縮熱洗脫容器中的核酸(圖16)。[0235]實施例9:使用熱洗脫的多容器樣品制備和擴增的集成[0236]熱洗脫的原理可以被應用于諸如將各自執(zhí)行用于樣品制備的不同功能的兩個或更多個相關聯(lián)的容器。單個加熱塊可以用于容納容器的這樣的關聯(lián)，或者當加熱的時間和速度以及加熱快的最終溫度被設計為以連貫的方式驅動樣品穿過容器時，可使用許多加熱塊。[0237]此外，一個器皿可以包含NAAT試劑，使得容器和器皿的組合允許向NAAT試劑直接加入處理過的樣品。像這樣，但加熱塊被適當設計，一旦樣品被加至第一容器中，熱洗脫方法可以進行樣品制備的所有步驟，并允許將樣品加至NAAT試劑并進一步允許擴增進行（圖15)〇[0238]實施例10:熱洗脫可以為PCR提供樣品[0239]在PCR檢測中使用溶解物[0240]用溶于反應緩沖液的專用樹脂填充8ml柱（Pierce#89897)至3.4ml的終體積，緩沖液已占體積為1.965ml。使用無菌微超細植絨拭子（Puritan#25-33181PN50)對艱難梭菌排泄物樣品取樣。將拭子的末端在樹脂混合物中混合，將拭子的柄折斷并緊閉柱。將柱手動混合并置于具有80mm插入深度的定制加熱塊上。將其在KKTC加熱10分鐘。將柱靜置冷卻，之后從柱的頂部移出溶解物。使用IQSupermix(Bi〇-Rad#1708862)制備了艱難梭菌實時PCR反應混合物。將4.5μ1的溶解物一式兩份加至PCR反應，與艱難梭菌基因組DNA稀釋系列一起在ABI-PRISM7000上運行，并且在95°C3分鐘的初始變性步驟之后以94°C，57°C和72°C每個30秒的50個循環(huán)擴增。溶解物產生29的(^值，當從校準曲線計算時這相應于I.ISxlO4個拷貝數(shù)，這表明柱溶解物可用于實時PCR檢測?！緳嗬蟆?.一種使液體樣品穿過多孔固體基質的方法，包括以下步驟：將所述液體樣品密封在包含作為容器的至少一部分的多孔固體基質的所述容器中，并且升高溫度以增加所述容器內部的壓力，由此使所述液體穿過所述多孔固體基質。2.如權利要求1所述的方法，其中所述容器包含兩種或更多種不同的固體多孔基質。3.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述液體樣品包含核酸和核酸擴增抑制劑。4.如權利要求3所述的方法，其中所述容器包含比結合核酸擴增抑制劑更牢固地結合核酸的多孔固體基質。5.如權利要求3所述的方法，其中所述容器包含比結合核酸更牢固地結合核酸擴增抑制劑的多孔固體基質。6.-種從包含核酸和核酸擴增抑制劑的液體樣品純化核酸的方法，其中所述方法包括以下步驟：(a)將所述樣品與與結合核酸相比更牢固地結合核酸擴增抑制劑的多孔固體基質接觸，其中將加熱應用于所述多孔固體基質和所述液體樣品；和（b)從所述多孔固體基質分離包含未結合的核酸的所述液體樣品。7.如權利要求6所述的方法，其中步驟（b)中將加熱應用于所述樣品。8.如權利要求6或7所述的方法，其中使所述液體樣品通過包括以下步驟的方法穿過所述多孔固體基質：將所述液體樣品密封在包含作為容器的至少一部分的多孔固體基質的所述容器中，并且升高溫度以增加所述容器內部的壓力，由此致使所述液體穿過所述多孔固體基質。9.如權利要求1-5或8中任一項所述的方法，其中所述容器包含限流器，其配置為與沒有所述限流器的容器相比減少來自所述容器的液體穿過所述多孔固體基質的流動。10.如權利要求9所述的方法，其中所述限流器是過濾器、釉料或閥。11.如權利要求9所述的方法，其中所述限流器是在45°C和110°C之間的溫度融化的材料層。12.如權利要求11所述的方法，其中所述材料層是蠟。13.如任一前述權利要求所述的方法，還包括溶解所述樣品的步驟。14.一種用于純化核酸的設備，包括(a)包含作為容器的至少一部分的多孔固體基質的所述容器和用于密封所述容器的工具，和(b)配置為將所述容器加熱至高達110°C的溫度的加熱元件。15.如權利要求14所述的設備，其中所述設備還包括第二容器以接收穿過所述多孔固體基質的液體。16.如權利要求14或15所述的設備，其中所述設備還包括包含用于核酸擴增的試劑的器皿。【文檔編號】B01L3/00GK104487573SQ201380028534【公開日】2015年4月1日申請日期:2013年3月28日優(yōu)先權日:2012年3月30日【發(fā)明者】克林特·佩雷拉,卡瑟爾約瑟夫·邁凱爾甘恩,勞倫斯卡洛·媞希申請人:魯茂偌有限責任公司