本發(fā)明涉及一種微流控芯片及其制備方法，屬于芯片檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在正常人體內(nèi)，有三種血紅蛋白：hba、hbf、hba2，而成人紅細(xì)胞中主要含有hba。在用層析法分離血紅蛋白時(shí)，可洗脫出3種含糖成分即：hba1a、hba1b、hba1c，合稱為糖化血紅蛋白。hba1c是葡萄糖化血紅蛋白，另兩種是其他糖形成的糖化紅蛋白。其中hbalc的量最大，反映血糖水平時(shí)一般用hbalc表示，hbalc由hba在代謝過程中與葡萄糖結(jié)合形成，因而它可準(zhǔn)確地反映血中葡萄糖水平。

血糖和血紅蛋白的結(jié)合生成糖化血紅蛋白是不可逆反應(yīng)，并與血糖濃度成正比，且保持120天左右，所以可以觀測到120天之前的血糖濃度。糖化血紅蛋白測試通常可以反映患者近8～12周的血糖控制情況。

檢測糖化血紅蛋白的意義在于，其反映糖尿病患者血糖總體控制情況的指標(biāo)；糖化血紅蛋白正常值為4-6％，<6％控制偏低，易出現(xiàn)低血糖；6-7％控制理想；7-8％可以接受；8-9％為控制不好；>9％為控制差，是慢性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展的危險(xiǎn)因素，并可能發(fā)生酮癥酸中毒等急性合并癥，所以當(dāng)其>8％就應(yīng)該加強(qiáng)血糖的控制。

現(xiàn)有技術(shù)對(duì)糖化血紅蛋白的診斷方法具有靈敏度低、重復(fù)性差、受干擾明顯，以及現(xiàn)有糖化血紅蛋白檢測配套儀器昂貴、檢測流程復(fù)雜、檢測時(shí)間長的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種微流控芯片，該微流控芯片以透射比濁法為基礎(chǔ)，通過微流控芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)樣本中待測成分含量的快速定量檢測，具有容易操作、高靈敏度、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種上述微流控芯片的制備方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種微流控芯片，包括基板、取樣件和底蓋；底蓋蓋設(shè)在基板的下方；基板上設(shè)有進(jìn)樣腔、預(yù)處理區(qū)、檢測腔和反應(yīng)區(qū)；取樣件以可拆卸的方式嵌設(shè)在進(jìn)樣腔中；取樣件包括進(jìn)樣口、樣本容置腔和出樣口；進(jìn)樣口、出樣口分別和樣本容置腔連通；預(yù)處理區(qū)包括預(yù)處理試劑腔、預(yù)處理腔和氣腔；預(yù)處理試劑腔通過第一預(yù)處理區(qū)流道與進(jìn)樣腔連通，進(jìn)樣腔通過第二預(yù)處理區(qū)流道和預(yù)處理腔相對(duì)應(yīng)；取樣件嵌設(shè)在進(jìn)樣腔時(shí)，第一預(yù)處理區(qū)流道的出口與進(jìn)樣口相對(duì)應(yīng)，第二預(yù)處理區(qū)流道的入口與出樣口相對(duì)應(yīng)；預(yù)處理腔通過流道與檢測腔相連通；氣腔通過氣道與預(yù)處理腔連通；反應(yīng)區(qū)包括反應(yīng)試劑腔和反應(yīng)腔；檢測腔通過流道與反應(yīng)腔相連通；反應(yīng)試劑腔通過流道與反應(yīng)腔連通；預(yù)處理試劑腔、氣腔、反應(yīng)試劑腔和反應(yīng)腔上均設(shè)有彈性腔壁；檢測腔的上表面設(shè)有透光面板，下表面設(shè)有透光底板；透光面板和透光底板相對(duì)應(yīng)；底蓋的底面設(shè)有與透光底板相對(duì)應(yīng)的通孔。

進(jìn)一步地，預(yù)處理試劑腔包括第一預(yù)處理試劑腔和第二預(yù)處理試劑腔，第一預(yù)處理試劑腔通過第一預(yù)處理區(qū)流道與進(jìn)樣腔連通；第二預(yù)處理試劑腔通過流道與預(yù)處理腔連通。

進(jìn)一步地，第一預(yù)處理試劑腔中注有溶血?jiǎng)?；第二預(yù)處理試劑腔中注有膠乳粒子懸濁液。

進(jìn)一步地，膠乳粒子懸濁液通過以下步驟制備得到：

預(yù)處理：在甘氨酸緩沖液中加入粒徑200-400nm的聚苯乙烯微球和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，在20-25℃的條件下反應(yīng)2-3h，然后離心、混勻，反復(fù)離心和混勻操作，最后一次離心操作后棄上清，得到沉淀的聚苯乙烯微球；

制備懸濁液：將經(jīng)預(yù)處理的聚苯乙烯微球分散于含有血紅蛋白吸附劑的溶液中，用甘氨酸緩沖液調(diào)整溶液的ph＝8，然后在20-25℃的條件下避光封閉至少24h，得到聚苯乙烯微球懸濁液。

進(jìn)一步地，聚苯乙烯微球懸濁液中，聚苯乙烯微球的質(zhì)量百分比為3％。

進(jìn)一步地，反應(yīng)試劑腔包括第一反應(yīng)試劑腔和第二反應(yīng)試劑腔；第一反應(yīng)試劑腔和第二反應(yīng)試劑腔分別通過流道與反應(yīng)腔連通。

進(jìn)一步地，第一反應(yīng)試劑腔中注有第一反應(yīng)試劑；第一反應(yīng)試劑含有鼠抗hba1c單抗；第二反應(yīng)試劑腔中注有第二反應(yīng)試劑；第二反應(yīng)試劑含有羊抗鼠igg抗體。

進(jìn)一步地，底蓋和基板之間設(shè)有廢液腔；檢測腔通過流道與廢液腔連通。為了在檢測時(shí)，待測溶液充滿檢測腔，以使得入射光線能夠穿射待測溶液，準(zhǔn)確測出吸光度，則待測溶液充滿檢測腔時(shí)，可將多余的待測溶液壓進(jìn)廢液腔中，也可推出檢測腔中的氣泡。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第二個(gè)目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種如上所述的微流控芯片的制備方法，包括以下步驟：

制備試劑：分別制備預(yù)處理試劑和反應(yīng)試劑；

組裝芯片：將預(yù)處理試劑注入預(yù)處理試劑腔，反應(yīng)試劑注入反應(yīng)試劑腔，密封基板，安裝底板，完成組裝。

進(jìn)一步地，組裝芯片步驟中，使用膠帶密封基板。

本發(fā)明的配方設(shè)計(jì)原理如下：以透射比濁法為基礎(chǔ)，將樣本中的待測成分和能夠與之反應(yīng)而產(chǎn)生懸浮物的試劑進(jìn)行反應(yīng)，使得溶液混濁，混濁程度與形成的懸浮物數(shù)量成正比，也與待測成分含量成正比；測定其懸濁液的吸光度，可求出樣本中待測成分的含量。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明的微流控芯片以透射比濁法為基礎(chǔ)，通過微流控芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)樣本中待測成分的快速定量檢測，能夠針對(duì)性地設(shè)置能夠與待測成分產(chǎn)生懸浮顆粒的試劑，在檢測腔中設(shè)置透光面板和透光底板，可檢測入射光和出射光的強(qiáng)度，計(jì)算待測成分的含量，具有容易操作，自動(dòng)扣除了空白干擾，具有背景影響低、高靈敏度、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)；

2、本發(fā)明的微流控芯片技術(shù)，把樣本預(yù)處理、混合、反應(yīng)、分離和檢測集成在芯片上，并把反應(yīng)所需的所有試劑組分集成到芯片上；操作簡便，可完成整套檢測，檢測效率大大提高。

附圖說明

圖1為本發(fā)明微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖中，1、基板；11、進(jìn)樣腔；12、預(yù)處理區(qū)；121、第一預(yù)處理試劑腔；1211、第一預(yù)處理區(qū)流道；1212、第二預(yù)處理區(qū)流道；122、第二預(yù)處理試劑腔；123、預(yù)處理腔；124、氣腔；1241、氣道；13、檢測腔；131、透光面板；132、透光底板；14、反應(yīng)區(qū)；141、第一反應(yīng)試劑腔；142、第二反應(yīng)試劑腔；143、反應(yīng)腔；2、取樣件；21、進(jìn)樣口；22、樣本容置腔；23、出樣口；3、底蓋；31、通孔；4、彈性腔壁；5、廢液腔。

具體實(shí)施方式

下面，結(jié)合附圖以及具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：

實(shí)施例1：

微流控芯片的制備及用于測定hba1c。

一、芯片結(jié)構(gòu)：

參照?qǐng)D1，一種微流控芯片，包括基板1、取樣件2和底蓋3；底蓋3蓋設(shè)在基板1的下方；基板1上設(shè)有進(jìn)樣腔11、預(yù)處理區(qū)12、檢測腔13和反應(yīng)區(qū)14；取樣件2以可拆卸的方式嵌設(shè)在進(jìn)樣腔11中；取樣件2包括進(jìn)樣口21、樣本容置腔22和出樣口23；進(jìn)樣口21、出樣口23分別和樣本容置腔22連通；預(yù)處理區(qū)12包括第一預(yù)處理試劑腔121、第二預(yù)處理試劑腔122、預(yù)處理腔123和氣腔124；第一預(yù)處理試劑腔121通過第一預(yù)處理區(qū)流道1211與進(jìn)樣腔11連通，進(jìn)樣腔11通過第二預(yù)處理區(qū)流道1212和預(yù)處理腔123相對(duì)應(yīng)，第二預(yù)處理試劑腔122通過流道與預(yù)處理腔123連通；取樣件2嵌設(shè)在進(jìn)樣腔11時(shí)，第一預(yù)處理區(qū)流道1211的出口與進(jìn)樣口21相對(duì)應(yīng)，第二預(yù)處理區(qū)流道1212的入口與出樣口23相對(duì)應(yīng)；預(yù)處理腔123通過流道與檢測腔13相連通；氣腔124通過氣道1241與預(yù)處理腔123連通；反應(yīng)區(qū)14包括第一反應(yīng)試劑腔141、第二反應(yīng)試劑腔142和反應(yīng)腔143；檢測腔13通過流道與反應(yīng)腔143相連通；第一反應(yīng)試劑腔141和第二反應(yīng)試劑腔142分別通過流道與反應(yīng)腔143連通；第一預(yù)處理試劑腔121、第二預(yù)處理試劑腔122、氣腔124、第一反應(yīng)試劑腔141、第二反應(yīng)試劑腔142和反應(yīng)腔143上均設(shè)有彈性腔壁4；檢測腔13的上表面設(shè)有透光面板131，下表面設(shè)有透光底板132；透光面板131和透光底板132相對(duì)應(yīng)；底蓋3的底面設(shè)有與透光底板132相對(duì)應(yīng)的通孔31；底蓋3和基板1之間設(shè)有廢液腔5；檢測腔13通過流道與廢液腔5連通。

上述中的流道、第一預(yù)處理區(qū)流道和第二預(yù)處理區(qū)流道均為常規(guī)技術(shù)中的芯片流道，作用為連通兩個(gè)腔室，是試劑從一個(gè)腔室流至另一個(gè)腔室的通道；氣道為常規(guī)技術(shù)中供氣體通過的通道，連通氣腔和預(yù)處理腔。

二、注入試劑：

作為檢測糖化血紅蛋白，需要在第一預(yù)處理試劑腔、第二預(yù)處理試劑腔、第一反應(yīng)試劑腔、第二反應(yīng)試劑腔注入相應(yīng)的試劑：

第一預(yù)處理試劑腔中注有溶血?jiǎng)?；溶血?jiǎng)┌ǎ簄acl、十四烷基三甲基溴化銨(ttab)表面活性劑和穩(wěn)定劑；溶血?jiǎng)┯糜谄扑檠?xì)胞，釋放血細(xì)胞中的血紅蛋白和糖化血紅蛋白；

第二預(yù)處理試劑腔中注有膠乳粒子懸濁液；

膠乳粒子懸濁液為聚苯乙烯微球懸濁液，通過以下步驟制備得到：

預(yù)處理：在濃度為100mmol/l的甘氨酸緩沖液中加入粒徑200-400nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球的質(zhì)量百分比為3％，和濃度為0.5mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，在23℃的條件下反應(yīng)2.5h，然后轉(zhuǎn)速10000rmp的條件下離心15min、混勻，反復(fù)離心和混勻操作，最后一次在轉(zhuǎn)速15000rmp的條件下離心25min操作后棄上清，得到沉淀的聚苯乙烯微球；

制備懸濁液：將經(jīng)預(yù)處理的聚苯乙烯微球分散于含有血紅蛋白吸附劑的溶液中，溶液中聚苯乙烯微球的質(zhì)量百分比為3％，甘氨酸緩沖液調(diào)整溶液的ph＝8，然后在23℃的條件下避光封閉24h，得到聚苯乙烯微球懸濁液。

第一反應(yīng)試劑腔中注有第一反應(yīng)試劑；第一反應(yīng)試劑含有鼠抗hba1c單抗；

第一反應(yīng)試劑通過以下步驟制備得到：在濃度為50mmol/l的甘氨酸緩沖液中加入鼠抗hba1c單抗，配置鼠抗hba1c單抗試劑，試劑中抗體的終濃度大于0.5mg/ml；

第二反應(yīng)試劑腔中注有第二反應(yīng)試劑；第二反應(yīng)試劑含有羊抗鼠igg抗體；

第二反應(yīng)試劑通過以下步驟制備得到：在濃度為50mmol/l的甘氨酸緩沖液中加入羊抗鼠igg抗體，配置成試劑羊抗鼠igg抗體試劑，試劑中抗體的終濃度大于0.5mg/ml。

三、芯片的制備：

微流控芯片的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

制備試劑：分別溶血?jiǎng)⒕郾揭蚁┪⑶驊覞嵋?、鼠抗hba1c單抗試劑和羊抗鼠igg抗體試劑；

組裝芯片：將預(yù)處理試劑注入預(yù)處理試劑腔，反應(yīng)試劑注入反應(yīng)試劑腔，使用膠帶密封基板，安裝底板，完成組裝。

四、使用方法：

1、芯片的原理如下：以免疫透射比濁法為基礎(chǔ)，將樣本中hb和hba1c與有相同的非特異性吸附的膠乳粒子進(jìn)行固相化，然后加入hba1c的特異性單克隆抗體后形成：膠乳粒子-hba1c-鼠抗人hba1c單克隆抗體的復(fù)合物，此復(fù)合物和羊抗鼠igg抗體作用形成凝集，凝集量因乳膠表面固相化的hba1c量的不同而不同；通過測定其吸光度并與hba1c百分濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較后，可求出樣本中hba1c占總hb的百分含量。

2、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：

對(duì)樣本進(jìn)行檢測前，以純化水或生理鹽水為零點(diǎn)，制備不同濃度水平的校準(zhǔn)品溶液，利用芯片重復(fù)檢測過程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3、使用步驟包括：

加樣：取全血，以肝素或edta抗凝血，靜置3h以上或2000rpm經(jīng)2min離心，然后從紅細(xì)胞層中精確取10μl作為樣本，將取樣件取出，從取樣件的進(jìn)樣口加入至樣本容置腔中，然后將取樣件插入至基板的進(jìn)樣腔中；

預(yù)處理：擠壓第一預(yù)處理試劑腔的彈性腔壁，則溶血?jiǎng)牡谝活A(yù)處理區(qū)流道至進(jìn)樣口，并沖洗樣本容置腔，樣本與溶血?jiǎng)┗旌喜⑼ㄟ^第二預(yù)處理區(qū)流道流至預(yù)處理腔；擠壓第二預(yù)處理試劑腔的彈性腔壁，將聚苯乙烯微球懸濁液壓進(jìn)預(yù)處理腔與樣本混合，樣本中總hb和hba1c與聚苯乙烯微球產(chǎn)生非特異性吸附而固相化，得到預(yù)處理溶液；

空白檢測：擠壓氣腔的彈性腔壁，氣腔中的氣體將預(yù)處理溶液推進(jìn)檢測腔，溶液充滿檢測腔時(shí)進(jìn)行空白檢測，預(yù)處理溶液在氣體的作用下通過檢測腔，隨通道流至反應(yīng)腔；

反應(yīng)：擠壓第一反應(yīng)試劑腔和第二反應(yīng)試劑腔的彈性腔壁，將鼠抗hba1c單抗試劑和羊抗鼠igg抗體試劑壓進(jìn)反應(yīng)腔進(jìn)行反應(yīng)，形成聚苯乙烯微球-hba1c-鼠抗人hba1c單克隆抗體的復(fù)合物，此復(fù)合物和羊抗鼠igg抗體作用形成凝集，凝集量因聚苯乙烯微球表面固相化的hba1c量的不同而不同，得到待測溶液：

檢測：反應(yīng)后，擠壓反應(yīng)腔的腔壁，待測溶液回流至檢測腔中，待測溶液填充檢測腔，從透光面板射入入射光，透光底板檢測出射光，入射光采用660nm單色光作為主波長，800nm單色光作為副波長，實(shí)測出的吸光度值a與hba1c百分濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計(jì)算出樣本中的hba1c百分含量。

4、線性范圍測試

高低值標(biāo)本制備：高值樣本(1#)：樣本含有的待分析物濃度為16％，為高出微流控芯片檢測限值的14％。低值標(biāo)本(2#)：樣本含有的待分析物濃度為1.5％。

中間5個(gè)濃度標(biāo)本制備：將1#和2#樣本分別按5：1、4：2、3：3、2：4、1：5體積比混勻配置成3#、4#、5#、6#、7#線性樣本。

隨機(jī)順序?qū)?-7#樣本重復(fù)測試3次。

結(jié)果表明，其線性范圍為2-14％，r≥0.9900，且批內(nèi)重復(fù)性均較好，在樣本hba1c質(zhì)量百分比為4.8％處，其標(biāo)準(zhǔn)差為0.075％，變異系數(shù)為1.56％，在樣本hba1c％質(zhì)量百分比為10.6％處，其標(biāo)準(zhǔn)差為0.11％，變異系數(shù)為1.1％，結(jié)果符合臨床需求，可為糖尿病患者診斷提供參考。

本發(fā)明采用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，抗體(ab)與可溶性抗原(ag)反應(yīng)，形成一定結(jié)構(gòu)的免疫復(fù)合物，成為懸浮于反應(yīng)溶液中的微粒。在反應(yīng)中形成的復(fù)合物微粒具有特殊的光學(xué)性質(zhì)，可用儀器檢測，提高了檢測的速度、靈敏度和易操作性。

對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。