專利名稱：用于將溶液排列到固體支持物上的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微型制備技術(shù)如DNA-集成片制備技術(shù)，并且更具體地涉及用于將可控量的溶液轉(zhuǎn)移到固體支持物上特定且間距很近的位置的方法和裝置。
背景技術(shù)：
在分子生物學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域中，長(zhǎng)期以來經(jīng)常需要制備重復(fù)排列的生物試劑以利于平行測(cè)試多個(gè)樣品。例如，長(zhǎng)期以來使用無菌絲絨布和活塞環(huán)在各含有不同培養(yǎng)基的多個(gè)平板上復(fù)制細(xì)菌和酵母菌落的瓊脂平板作為快速篩選大量獨(dú)立菌落的不同生長(zhǎng)表型的方法(Lederberg和Lederberg，細(xì)菌學(xué)雜志63399，1952)。同樣，96孔微量滴定板已長(zhǎng)期用于以有組織并且容易應(yīng)用的方式保存大量細(xì)胞系和代表重組DNA文庫的病毒分離物或單克隆抗體細(xì)胞系。
對(duì)裝有克隆群的96孔微量滴定板的實(shí)驗(yàn)性篩選通常通過使用硬金屬或塑料96針裝置來完成，這種裝置設(shè)計(jì)成每根針相對(duì)于其它針互相間隔開使其準(zhǔn)確地與微量滴定板吻合。根據(jù)手邊的任務(wù)，將96針裝置小心地降低到營(yíng)養(yǎng)瓊脂板的表面(如果目的是重復(fù)培養(yǎng)生物樣品)、到另一微量滴定板中(為培養(yǎng)或稀釋這些樣品)、到尼龍膜上(用于通過DNA或RNA雜交的分子篩選以鑒定特定重組克隆)或被轉(zhuǎn)移以用于任何適于96孔微量滴定板形式的其它篩選或方法。
當(dāng)用一個(gè)浸入排列于主微量滴定板中的樣品的針進(jìn)行多次印跡時(shí)，在每次連續(xù)印跡過程中保存的樣品量下降?？刂茖⑷芤何接≯E針上的能力以及將溶液轉(zhuǎn)移到印跡表面的能力對(duì)于獲得達(dá)到基因組、分子生物學(xué)和分子診斷學(xué)領(lǐng)域微陣列制備技術(shù)要求的等分裝置是至關(guān)重要的。
開發(fā)成功的印跡方法的重要因素是控制針頭接觸待印跡表面時(shí)的移動(dòng)力和速度的能力。正如Drmanac和Drmanac(生物技術(shù)17328，335，1994)所觀察到的，用常規(guī)平圓柱體針的兩個(gè)問題是液滴可能粘附在針的側(cè)面從而導(dǎo)致不規(guī)則的印跡，并且當(dāng)印跡針頭從印跡表面太快取出時(shí)液滴可能濺射。太大的力可能導(dǎo)致對(duì)印跡表面的重大損傷從而對(duì)印跡陣列的應(yīng)用產(chǎn)生負(fù)面影響。太小的力也可能是不行的，因?yàn)榭赡苻D(zhuǎn)移不同量的樣品或者印跡總體上可能有缺陷。例如，當(dāng)將細(xì)菌或病毒樣品印跡到營(yíng)養(yǎng)瓊脂板表面上時(shí)，太大的壓力導(dǎo)致瓊脂表面的破壞，而太小的力可能導(dǎo)致樣品極少或沒有樣品轉(zhuǎn)移。此外，許多核酸雜交膜表面是脆性的并且容易在樣品印跡過程中被太大的針頭力損壞。
大規(guī)?；蚪M計(jì)劃的出現(xiàn)和分子診斷逐漸增加的醫(yī)學(xué)應(yīng)用促進(jìn)了大量處理方法的開發(fā)以篩選代表完整基因組的重組DNA文庫、進(jìn)行大規(guī)模DNA測(cè)序計(jì)劃以及進(jìn)行重復(fù)性免疫學(xué)分析、核酸雜交分析或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析。只是作為例證的以下公開文獻(xiàn)(以及本文引用的參考文獻(xiàn))提供依賴生物分子陣列的大量處理方法及制備這些排列的方法的總體和具體綜述Eggers，M.D.等，DNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)展卷SPIE 1891113-126，1993；Chetverin，A.B.等，生物/技術(shù)121093-1099，1994；Southern，E.M.核酸研究221368-1373，1994；Lipshutz，R.J.等，生物技術(shù)19442-447，1995；Schena，M.BioEssays 18427-431，1996；Blanchard，A.P.等，生物傳感器及生物電學(xué)11687-690，1996；O’Donnell-Maloney，M.J.等，遺傳分析生物分子工程13151-157，1996；Regalado，A.Start-Up 24-30，1996年10月和Stipp，D.財(cái)富30-41頁，1997年3月31日。
對(duì)大處理量方法學(xué)的需求在某些情況下已導(dǎo)致96孔微量滴定板形式向384孔(Maier等，生物技術(shù)雜志35191，1994)或864孔(Drmanac等，電泳13120，1992)形式的變化，這些形式也可與自動(dòng)裝置結(jié)合使用(參見例如Belgrader等，生物技術(shù)19426，1995；Wilke等，診斷微生物學(xué)及傳染病21181，1995)。然而，所有這些自動(dòng)化技術(shù)需要使用能可重復(fù)地從一種陣列形式(即96孔微量滴定板)向另一種陣列形式(雜交濾膜上的96點(diǎn)陣列)轉(zhuǎn)移等體積液體的自動(dòng)針附件裝置。
最近，已經(jīng)開發(fā)出合成大批與玻璃表面結(jié)合的代表所有或部分可能核苷酸序列的短寡聚核苷酸(ODN)的方法(Maskos和Southern，核酸研究.201675，1992)。一旦這樣的ODN陣列得到制備，就可用于通過雜交進(jìn)行DNA測(cè)序(Southern等，基因組131008，1992；Drmanac等，科學(xué)2601649，1993)。如果存在轉(zhuǎn)移和排列準(zhǔn)確量的、合成與可雜交表面結(jié)合的大量ODN所需的生化試劑的更好方法，那么這種DNA測(cè)序方法的效用將得到大大改善。這將確保陣列內(nèi)每個(gè)位置更加相同的ODN產(chǎn)量并且也增加可能合成的寡核苷酸鏈長(zhǎng)度。
已發(fā)現(xiàn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在許多不同生物學(xué)問題上的廣泛應(yīng)用。PCR商業(yè)利用的2個(gè)主要限制因素是試劑的高成本和不能自動(dòng)完成操作。如果可以降低每反應(yīng)的總體積，使DNA聚合酶和核苷酸也同時(shí)減少，就可降低試劑成本。用自動(dòng)控制的針附件排列小量試劑的準(zhǔn)確可靠方法可有助于解決這兩個(gè)PCR問題。
如上所述，移液裝置已在微生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中使用了一段時(shí)間。已經(jīng)使用的這類裝置大致可分為2個(gè)類別。由正/負(fù)壓驅(qū)動(dòng)的壓力裝置(例如泵和自動(dòng)移液器)，其通過移液頭將固定的等分液體樣品移到固體表面或微量滴定板加樣孔中。已經(jīng)建立對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)96孔微量滴定板形式的移液器陣列(Reek等，生物技術(shù)19282，1995)。這些裝置在5μl及以上體積范圍最準(zhǔn)確，但是一般不太適于更小體積的任務(wù)。
固體表面針式裝置依賴于針表面積和調(diào)節(jié)液體表面張力的因素而轉(zhuǎn)移液體，并且由于其簡(jiǎn)便性和轉(zhuǎn)移小量液體的能力而得到廣泛應(yīng)用。數(shù)年來已在自動(dòng)裝置中使用這些固定針式裝置以印跡核酸微點(diǎn)陣列的多個(gè)拷貝，然后將其用于雜交反應(yīng)以測(cè)定基因表達(dá)。
研究人員已修飾了傳統(tǒng)的固定微陣列印跡頭，使它含有微管道，微管道通過毛細(xì)作用發(fā)揮功能從而收集和容納用于隨后印跡到玻璃表面上的液體(Schena等，科學(xué)270467，1995；Schena，BioEssays 18427，1996；Shalon等，基因組研究.6639，1996)。這樣的印跡頭已通過自動(dòng)系統(tǒng)用于將PCR擴(kuò)增的cDNA插入片段印跡到微陣列中。使用此系統(tǒng)進(jìn)行小體積(每微點(diǎn)2μl)雜交反應(yīng)以借助同時(shí)發(fā)生的雙色熒光雜交測(cè)定45個(gè)基因的差異表達(dá)(Schena等，科學(xué)270467，1995)。
在本領(lǐng)域需要高效、價(jià)格合理的方法以將寡核苷酸和其它生物分子排列到平坦的固體支持物上。本發(fā)明提供在此詳細(xì)公開的這些及相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明概述在一方面，本發(fā)明提供一種彈性探頭，包括包住壓縮彈簧的管狀套殼，所述彈簧與活塞機(jī)械連接，所述活塞具有伸出所述套殼的第一個(gè)區(qū)域，所述第一個(gè)區(qū)域包括以平坦表面終止的錐形端部，所述表面與所述套殼的縱軸垂直，所述錐形端部在其剖面具有與上述表面相鄰接的外側(cè)邊，如果上述外側(cè)邊越過上述表面延伸，則相交于距上述表面約0.001-0.005英寸處的點(diǎn)。
在另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，包含基于組合物總體積約35體積％至80體積％濃度的增稠劑、0.001μg/mL到10μg/mL濃度的寡核苷酸以及水。
在另一方面，本發(fā)明提供一種將生物分子點(diǎn)樣到固體支持物上的方法。此方法包括以下步驟將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中；將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上；并且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉(zhuǎn)移到所述固體支持物上。
用于點(diǎn)樣的彈性探頭包括上述包住壓縮彈簧的管狀套殼。
在另一方面，本發(fā)明提供一種排列生物分子的方法。此方法包括以下步驟將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中；將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上；并且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉(zhuǎn)移到所述固體支持物上。
重復(fù)接觸步驟多次以使生物分子以陣列形式排列于固體支持物上。而且，帶有管狀套殼的彈性探頭如上所述。
參照附圖和下面詳細(xì)的描述，本發(fā)明的其它方面將變得顯而易見。
附圖描述

圖1A是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案所述的陣列的俯視平面示意圖。
圖1B是圖1A的陣列的剖面示意圖。
圖2A是用于制備本發(fā)明陣列的移液裝置的等軸視圖。
圖2B是根據(jù)本發(fā)明所述的移液頭的實(shí)施方案的放大正面立視圖。
圖3是帶有錐形設(shè)計(jì)的另一種移液頭的正面立視圖。
圖4A是根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施方案所述的帶有凹槽、錐形設(shè)計(jì)的移液頭的另一實(shí)施方案的正面立視圖。
圖4B是圖4A的移液頭的仰視平面圖。
圖5表示根據(jù)本發(fā)明制備并用Vector Blue(Vector Laboratories，Burlingame，California)顯色且用CCD相機(jī)和顯微鏡拍攝的微點(diǎn)陣列。
圖6表示同時(shí)存在于單一陣列單元中的兩種不同寡核苷酸如何根據(jù)本發(fā)明得到鑒定和部分定量測(cè)定。
圖7表示用本發(fā)明方法學(xué)由機(jī)器人制備的陣列的CCD相機(jī)圖像，其中點(diǎn)區(qū)域直徑約100-150微米，相鄰點(diǎn)與點(diǎn)之間中心到中心的間距為200微米。直徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差是約15％。
圖8是用熒光濾鏡在熒光下攝制的顯微照片，顯示從分析溶液轉(zhuǎn)移的非媒介物成分(在此情況下是熒光微球體)的可重復(fù)點(diǎn)樣(通過肉眼觀察測(cè)定)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種使用特殊設(shè)計(jì)的移液裝置和/或特殊制備的生物分子溶液和/或特殊涂敷的固體支持物將生物分子以高度可控制方式點(diǎn)樣到固體支持物上的方法。更具體地，本發(fā)明提供了一種將生物分子點(diǎn)樣到固體支持物上的方法，其中方法包括以下步驟將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中；將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上；并且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉(zhuǎn)移到所述固體支持物上。
自從在印刷電路板工業(yè)發(fā)展的初期被引進(jìn)以來，彈性探頭已變得眾所周知。它們是設(shè)計(jì)用于在裝配功能電路板時(shí)滿足準(zhǔn)確可靠構(gòu)建和測(cè)試各種電子元件及其連接要求的機(jī)械裝置。彈性探頭基本上是電子機(jī)械裝置，由包住壓縮彈簧、球體和活塞的管狀套殼組成。有些探針是特殊設(shè)計(jì)以攜帶電流，而其它一些用于鉆孔、彎曲和將元件固定到電路板上，還有一些設(shè)計(jì)用于進(jìn)行焊接。設(shè)計(jì)或銷售彈性探頭方面，還沒證明它們作為用于將溶液轉(zhuǎn)移和排列到固體支持物上以在微生物學(xué)、生物化學(xué)或分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的機(jī)械裝置的潛在用途。改進(jìn)的彈性探頭彈性探頭可從數(shù)家供應(yīng)商得到，包括Evertt Charles(Pomona CA)，Interconnect Devices Inc.(Kansas City，Kansas)和Test ConnectionsInc.，(Upland，CA)。
圖2A是表示用于選擇性地將分離的、可控量生物分子溶液轉(zhuǎn)移到陣列10的PEI層30上的優(yōu)選裝置和方法的等軸視圖。在一種實(shí)施方案中，裝置帶有與致動(dòng)器60可操作連接的彈性探頭50和與彈性探頭50相反端連接的移液頭70。彈性探頭50一般包括包住偏置部件54的套殼52和活塞56，活塞有與偏置部件54相鄰接的第一端57和從套殼52中伸出的第二端58。套殼52可以是管狀筒而偏置部件54可以是將活塞56的第二端58從套殼52推出的壓縮彈簧?；钊?6的第一端57因此帶有與從套殼52向內(nèi)放射狀伸出的止動(dòng)物59咬合的凸肩57a從而限制活塞56相對(duì)于套殼52的最大延伸量。適當(dāng)?shù)膹椥蕴筋^50可從Evertt Charles(Pomona，California)，Interconnect Devices Inc.(Kansas City，Kansas)、TestConnections，Inc.，(Upland，California)以及其它制造商得到。
致動(dòng)器60優(yōu)選地沿著與陣列10垂直的軸線(箭頭V所示)并在與PEI層30表面平行的平面(箭頭P所示)移動(dòng)彈性探頭50。因此，致動(dòng)器60控制彈性探頭50從而將移液頭70浸入含有生物分子流體90的容器80中，將彈性探頭50定位到PEI層30的所需位點(diǎn)上，并且將移液頭70壓至PEI層30的所需位點(diǎn)上。在另一實(shí)施方案中，致動(dòng)器60可能僅僅與至陣列10垂直地移動(dòng)彈性探頭50，而另一致動(dòng)器(未顯示)移動(dòng)陣列10和容器80以將移液頭70定位至容器80或PEI層30的所需位點(diǎn)。致動(dòng)器60優(yōu)選地是自動(dòng)將生物分子溶液移至PEI層30上的機(jī)器人或其它計(jì)算機(jī)控制的操作裝置。此外，可將多個(gè)彈性探頭50與一個(gè)致動(dòng)器連接以同時(shí)將多個(gè)生物分子物質(zhì)移至PEI層30上。
移液頭70優(yōu)選地吸取足夠量的生物分子流體90至其表面上以將多個(gè)的生物分子物質(zhì)移至PEI層30上并形成相應(yīng)的多個(gè)點(diǎn)樣區(qū)域32(圖1A中所示)。圖2B是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案所述的移液頭70的放大正面立視圖。移液頭70優(yōu)選地具有截短的圓錐形狀，帶有端面72和多個(gè)凹槽或溝道74。端面72可以是從假想的交點(diǎn)73凹進(jìn)的平面，凹進(jìn)的距離“R”約在0.00001英寸和0.010英寸之間。并且更優(yōu)選地約在0.001英寸和0.005英寸之間。此外，凹槽74具有以約15°到120°、并且更優(yōu)選地以約60°到90°的角α向端面72聚集的翼或脊76。
彈性探頭50、致動(dòng)器60和移液頭70一起運(yùn)行從而在每次致動(dòng)器60將移液頭70壓至PEI層30上時(shí)，將可控量的生物分子流體移至PEI層30上。致動(dòng)器60開始將移液頭70浸入生物分子流體90的容器80中以通過毛細(xì)作用汲取和容納較大體積的生物分子流體92(圖2B)到移液頭70上。然后致動(dòng)器60將彈性探頭50定位至PEI層30上。在容器80中取出移液頭70后，一部分移液頭70上的生物分子流體92在移液頭的端面72形成懸掛物94。然后致動(dòng)器將移液頭70壓至PEI層上以從移液頭70上的生物分子流體部分形成陣列10的單個(gè)分開離的點(diǎn)樣區(qū)域32(圖1A和1B中所示)。致動(dòng)器60優(yōu)選地將移液頭70壓至PEI層30上以使移液頭70以指定量的壓力接觸PEI層30。然而，用相同壓力將移液頭70連續(xù)壓至PEI層30上是困難的，因?yàn)橹聞?dòng)器60不能總是以相同高度定位移液頭70并且PEI層70表面可能不一樣平。偏置部件54因此儲(chǔ)存把移液頭70壓到PEI層30上產(chǎn)生的能量，從而允許彈性探頭50在每次移液時(shí)以基本上恒定的壓力接觸PEI層30而不論致動(dòng)器60的行程或PEI層30表面狀態(tài)的微小不規(guī)則性。
因此上述移液系統(tǒng)提供在每次移液頭70與PEI層30接觸時(shí)可移送恒定點(diǎn)樣體積的生物分子流體的裝置。應(yīng)當(dāng)理解應(yīng)將精確、恒定體積的生物分子流體移至每個(gè)點(diǎn)樣區(qū)域的PEI層30上以在PEI層30中維持間隔區(qū)34。點(diǎn)樣至點(diǎn)樣區(qū)域32上的PEI層30中的生物分子流體的量一般憑經(jīng)驗(yàn)確定，并且它是移液頭70與PEI層30接觸的時(shí)間、生物分子流體90的粘度、移液頭70的構(gòu)造以及移液頭70與PEI層30之間的壓力的函數(shù)。因?yàn)槠貌考?4在移液頭70與PEI層30之間提供了基本上恒定的壓力，所以影響移至PEI層30的生物分子流體量的首要因素是移液頭70與PEI層30之間接觸的時(shí)間。
圖3是根據(jù)本發(fā)明所述的移液頭170的另一個(gè)實(shí)施方案的正面立視圖。在此實(shí)施方案中，移液頭170具有無凹槽或翼片的截短的錐形狀。因此，移液頭170在其錐形部分的表面容納生物分子流體。雖然移液頭170可用于將生物分子流體移到PEI層30上，但是一般地使用帶凹槽的移液頭是更理想的，因?yàn)檫@樣的移液頭容納更多的生物分子流體。
圖4A是帶有多個(gè)凹槽274和翼片276的移液頭270的另一實(shí)施方案的正面立視圖，圖4B是其仰視平面圖。移液頭270基本上以與上述移液頭70相同的方式操作，并且因此也提供基本上相同的優(yōu)點(diǎn)。
上述的移液頭70、170和270代表一些可用于將生物分子流體點(diǎn)樣到PEI層30上的移液頭實(shí)例。應(yīng)當(dāng)理解可對(duì)這些移液頭進(jìn)行多種改進(jìn)，包括使用不同形狀的端面設(shè)計(jì)。例如，根據(jù)具體應(yīng)用，這些移液頭可以具有角錐形、圓柱形、立方形或其它適當(dāng)形狀。此外，這些凹槽可以具有除了本發(fā)明附圖中所示的構(gòu)造之外的其它構(gòu)造。因此，移液頭不一定局限于圖2B-4B中說明的那些種類。生物分子溶液本發(fā)明提供可用于將生物分子點(diǎn)樣到平坦表面上的組合物。這些組合物特別適于用上述改進(jìn)的彈性探頭轉(zhuǎn)移到平坦表面上。當(dāng)本發(fā)明的組合物與改進(jìn)的彈性探頭一起使用時(shí)，在僅一次汲取液體后可重復(fù)將多個(gè)微滴(例如10以上并且優(yōu)選地100個(gè)以上微滴)點(diǎn)樣到平坦表面上。
本發(fā)明提供一種也稱為“布列溶液”的組合物，包含基于組合物總體積約35體積％到約80體積％濃度的增稠劑、生物分子(優(yōu)選地是0.001μg/mL到10μg/mL濃度范圍的寡核苷酸)和水。令人吃驚地發(fā)現(xiàn)在水性寡核苷酸組合物中含有增稠劑時(shí)，增稠劑賦予組合物所需的流變學(xué)特性，因此使組合物能與此處公開的改進(jìn)的彈性探頭一起使用，在僅一次從組合物池汲取組合物的情況下將多個(gè)均勻的微滴移至有PEI涂層的平坦表面上。
對(duì)于液體增稠劑如甘油，濃度為35％V/V到80％V/V。組合物中優(yōu)選的增稠劑濃度在一定程度上取決于進(jìn)行排列時(shí)的溫度。排列溫度越低，需要使用的增稠劑濃度越低。溫度和粘度控制的組合使得可以在大多數(shù)固體支持物(例如玻璃、硅片、尼龍6/6、尼龍膜等)上進(jìn)行排列。
增稠劑的存在還有其它好處，即允許各種其它低濃度物質(zhì)與生物分子同時(shí)存在。例如，0.001％V/V到1％V/V的去污劑可存在于布列溶液中。這是有用的，因?yàn)镻CR緩沖液含有少量的Tween-20或NP-40，并且直接從PCR排列核酸樣品而無須事先純化擴(kuò)增子通常是有利的。使用增稠劑允許在布列溶液中含有鹽(例如NaCl，KCl或MgCl2)、緩沖液(例如Tris)和/或螯合劑(例如EDTA)。使用增稠劑還有其它好處，即允許交聯(lián)劑和/或有機(jī)溶劑存在于布列溶液中。正如商業(yè)上得到的，交聯(lián)劑通常溶解于有機(jī)溶劑如DMSO、DMF、NMP、甲醇、乙醇等溶劑中。當(dāng)使用增稠劑時(shí)，常用的有機(jī)溶劑可以0.05％到20％(V/V)的水平用于本發(fā)明的布列溶液中。
一般來說，增稠劑賦予布列溶液增加的粘度。當(dāng)布列溶液中達(dá)到適當(dāng)粘度時(shí)，點(diǎn)樣的第一滴基本上與例如第100滴大小相同。當(dāng)布列溶液中使用不適當(dāng)粘度時(shí)，點(diǎn)樣的頭幾滴顯著大于后來點(diǎn)樣的液滴。所需的粘度在純水與純甘油的粘度之間。
本發(fā)明的布列溶液可用于將微滴點(diǎn)樣到幾乎任何表面上。因?yàn)楣腆w支持物的表面特性對(duì)微滴的點(diǎn)樣幾乎沒有影響或沒有影響，所以生物樣品可排列到幾乎任何類型的有涂層表面或有聚合物涂層的固體支持物上。例如，一般的水溶液在用親水性聚合物如聚賴氨酸或聚乙烯亞胺涂敷的固體支持物上傾向于迅速擴(kuò)散而這些相同溶液不容易點(diǎn)樣在疏水性表面如硅片上。然而，含有根據(jù)本發(fā)明所述的增稠劑的布列溶液可用于將均勻的微滴點(diǎn)樣于任何這些基質(zhì)上。
在排列過程中包括增稠劑如甘油的另一重要好處是質(zhì)量控制。例如當(dāng)將甘油用于本文所述的排列方法時(shí)，將一小滴液體點(diǎn)樣于固體支持物上。以此處所述的方法中常用的濃度時(shí)，此甘油濃度足以防止微滴的蒸發(fā)。因此，在化學(xué)處理陣列之前可檢查每個(gè)排列針頭的每個(gè)印跡。觀察微滴的能力實(shí)質(zhì)上增強(qiáng)了對(duì)排列過程進(jìn)行質(zhì)量控制的能力。這導(dǎo)致排列方法學(xué)價(jià)值的重要增加。
生物分子可以是核酸多聚物或其類似物如PNA、硫代磷酸酯和膦酸甲酯。核酸指核糖核酸和脫氧核糖核酸。生物分子可包括非天然和/或合成的堿基。生物分子可以是單鏈或雙鏈核酸多聚物。
優(yōu)選的生物分子是包括寡核苷酸(多達(dá)約100個(gè)核苷酸堿基)和多核苷酸(超過約100個(gè)堿基)的核酸多聚物。優(yōu)選的核酸多聚物由15到50個(gè)核苷酸堿基形成。另一優(yōu)選的核酸多聚物有50到1,000個(gè)核苷酸堿基。核酸多聚物可以是PCR產(chǎn)物、PCR引物或核酸雙鏈，在此列出幾個(gè)實(shí)施例。然而，如下文所述，當(dāng)核酸含有伯胺時(shí)，基本上所有核酸類型可與PEI涂敷的表面共價(jià)結(jié)合。布列溶液中核酸多聚物的一般濃度為0.001-10μg/mL、優(yōu)選地0.01-1μg/mL、更優(yōu)選地0.05-0.5μg/mL。
優(yōu)選的核酸多聚物為“胺修飾的”，因?yàn)樗鼈兘?jīng)修飾在核酸多聚物的5’末端含有伯胺基，優(yōu)選地在核酸多聚物的伯胺與核酸部分之間有一個(gè)或多個(gè)亞甲基。6是亞甲基的優(yōu)選數(shù)目。胺修飾的核酸多聚物是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兛赏ㄟ^5’-胺基與固體支持物共價(jià)連接?？墒褂?’-己胺修飾的PCR引物排列PCR產(chǎn)物。可在使用胺烯丙基-dUTP(Sigma，St.Louis，MO)通過切口移位導(dǎo)入胺之后排列核酸雙鏈。用氨基烯丙基-dUTP通過聚合酶如末端轉(zhuǎn)移酶或用連接酶通過將含胺的短核酸多聚物連接到核酸上可將胺導(dǎo)入核酸中。
優(yōu)選地，在與PEI涂層接觸之前活化核酸多聚物。通過使胺功能化的核酸多聚物與多功能胺-反應(yīng)性化學(xué)物如三氯三嗪(Trichlorotriazine)混合可方便地實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。當(dāng)核酸多聚物含有5’-胺基時(shí)，5’-胺可與也稱為氰尿酰氯的三氯三嗪反應(yīng)(Van Ness等，核酸研究.19(2)3345-3350，1991)。優(yōu)選地，將過量的氰尿酰氯加入核酸多聚物溶液中，其中超過布列溶液中核酸多聚物胺數(shù)10-到100-倍摩爾數(shù)過量的氰尿酰氯是優(yōu)選的。在此方法中，大多數(shù)以胺終止的核酸多聚物與一分子三氯三嗪反應(yīng)，因此核酸多聚物變成以二氯三嗪終止。
本發(fā)明的有利特征是含有生物分子的布列溶液即使含有大量的三氯三嗪也可點(diǎn)樣到PEI涂層上。這提供了優(yōu)于在進(jìn)行排列之前需要從布列溶液去除偶聯(lián)劑的方法的顯著優(yōu)勢(shì)。
當(dāng)核酸多聚物是雙鏈時(shí)，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案提供兩條鏈或其中一條鏈含有末端氨基。雙鏈核酸多聚物可通過一個(gè)末端氨基結(jié)合到PEI涂層上，由此固定此雙鏈多聚物。然而，因?yàn)閮蓷l鏈中僅有一條鏈與PEI涂層共價(jià)結(jié)合，所以另一鏈可在變性和洗滌條件下去除。此方法提供根據(jù)本發(fā)明實(shí)施單鏈核酸多聚物的排列的一種方便方法。雙鏈核酸多聚物可例如作為PCR反應(yīng)產(chǎn)物得到。
優(yōu)選地，用常用緩沖液如磷酸鈉、硼酸鈉、碳酸鈉或Tris HCl緩沖布列溶液。布列溶液的優(yōu)選pH范圍是7到9，其中優(yōu)選的緩沖液是新鮮制備的pH8.3到pH8.5的硼酸鈉溶液。
為了制備一般的布列溶液，將己胺修飾的核酸多聚物以0.1μg/ml置于0.2M硼酸鈉pH8.3中至50μl總體積。然后加入10μl 15mg/mL的氰尿酰氯溶液，并且讓反應(yīng)于25℃持續(xù)攪拌下進(jìn)行1小時(shí)。加入甘油(GibcoBrl，Grand Island，NY)至56％終濃度。固體支持物本發(fā)明提供一種將生物分子點(diǎn)樣固體支持物上的方法，此方法包括以下步驟將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中；將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上；并且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉(zhuǎn)移到所述固體支持物上。固體支持物優(yōu)選地具有點(diǎn)樣生物分子的平坦表面。
用于此目的的固體支持物實(shí)例是一般用于電子工業(yè)中構(gòu)建半導(dǎo)體的硅片。這些硅片在一側(cè)是高度磨光和反光的并且可容易地使用硅烷化學(xué)法用聚乙烯亞胺涂敷。這些硅片在商業(yè)上可從諸如WaferNet(San Jose，CA)的公司得到。用聚合物如聚乙烯亞胺對(duì)硅片和玻片的涂敷可通過公司如Cel Associates(Houston，Texas)在合同下進(jìn)行。具有反光性涂層的玻片也可容易地使用硅烷化學(xué)法用聚乙烯亞胺涂敷。
聚乙烯亞胺多聚物涂層允許使用商業(yè)上可得到的交聯(lián)劑(Pierce，Rockford，IL)將寡核苷酸、PCR片段或擴(kuò)增子、DNA分子或片段或其它含有胺基的生物分子共價(jià)結(jié)合到固體支持物上。聚乙烯亞胺(PEI)涂敷的載片也具有長(zhǎng)保存期穩(wěn)定性的額外好處。
另一理想的固體支持物是金屬如不銹鋼。這樣的金屬固體支持物可用作MALDI-TOF分析中的基質(zhì)，其中待通過MALDI-TOF分析的成分用此處公開的印跡方法點(diǎn)樣。排列條件和排列后的處理如上所述的布列溶液可直接用于排列過程。也就是說，在排列核酸多聚物的優(yōu)選實(shí)施方案中，在印跡步驟前沒有從未反應(yīng)的氰尿酰氯中純化活化的核酸多聚物。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)在排列方法的印跡步驟前不必去除過量的交聯(lián)劑。也就是說，在反應(yīng)混合物中過量的氰尿酰氯不影響或競(jìng)爭(zhēng)核酸多聚物與有PEI涂層的固體支持物的共價(jià)結(jié)合。這是因?yàn)楣腆w支持物上的胺多于將以任何給定體積(納升到皮升)排列的氰尿酰氯分子的數(shù)目。
一般讓活化核酸結(jié)合到固體支持物上的反應(yīng)在20到50℃進(jìn)行1到20小時(shí)。優(yōu)選地，反應(yīng)時(shí)間是于25℃1小時(shí)。
本發(fā)明的陣列在進(jìn)行雜交分析中特別有用。然而，為了進(jìn)行這種分析，在進(jìn)行雜交步驟前必須對(duì)固體支持物上的胺加帽。這可通過使固體支持物與0.1-2.0M琥珀酸酐反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的反應(yīng)條件是70％m-pyrol和0.1M硼酸鈉中的1.0M琥珀酸酐。一般使反應(yīng)進(jìn)行15分鐘到4小時(shí)，其中優(yōu)選的反應(yīng)時(shí)間是于25℃30分鐘。殘余的琥珀酸酐用3X水洗加以去除。
然后將固體支持物與在pH7-9的0.1-10.0M硼酸鈉中含有0.1-5M甘油的溶液一起溫育。該步驟對(duì)任何可以共價(jià)結(jié)合到PEI表面上的二氯三嗪“加帽”。優(yōu)選的條件是在pH8.3的0.1M硼酸鈉中的0.2M甘油。
然后可以用含有去污劑的溶液洗固體支持物以去除未結(jié)合的物質(zhì)，例如微量的m-pyrol。
優(yōu)選地，將固體支持物在0.01M NaCl、0.05M EDTA和0.1M Tris(pH8.0)中加熱至95℃5分鐘。此加熱步驟去除未共價(jià)結(jié)合的核酸多聚物如PCR產(chǎn)物。在排列雙鏈核酸的情況中，此步驟也具有將雙鏈變成單鏈形式(變性)的效應(yīng)。
排列可通過生物素化的探針(例如寡核苷酸、核酸片段、PCR產(chǎn)物等)加以檢測(cè)。使核酸生物素化的方法在本領(lǐng)域眾所周知并且由Pierce進(jìn)行了充分描述(抗生物素蛋白-生物素化學(xué)手冊(cè)，Pierce化學(xué)公司，1992，Rockford Illinois)。探針一般以0.1ng/mL到10μg/ML在包括GuSCN、GuHCl、甲醛等的標(biāo)準(zhǔn)雜交液中使用(參見Van Ness和Chen，核酸研究195143-5151，1991)。
為檢測(cè)雜交事件(即生物素的存在)，將固體支持物與鏈霉抗生物素蛋白/辣根過氧化物酶偶聯(lián)物一起溫育。這樣的酶偶聯(lián)物在商業(yè)上可獲自例如Vector Laboratories(Burlingham，CA)。鏈霉抗生物素蛋白以高親和性結(jié)合生物素分子從而使辣根過氧化物酶與雜交探針靠近。未結(jié)合的鏈霉抗生物素蛋白/辣根過氧化物酶偶聯(lián)物用簡(jiǎn)單洗滌步驟洗去。然后在過氧化物和適當(dāng)緩沖液存在的情況下利用沉淀底物檢測(cè)過氧化物酶的存在。
對(duì)于比色分析基質(zhì)，點(diǎn)樣于反光性表面如硅片上的藍(lán)色酶產(chǎn)物具有與預(yù)期相比低許多倍水平的檢測(cè)(LLD)。此外，LLD對(duì)于不同的有色酶產(chǎn)物有很大不同。如實(shí)施例5中所示，每50μM直徑點(diǎn)4-甲氧基-napthol(產(chǎn)生沉淀的藍(lán)色產(chǎn)物)的LLD是約1000個(gè)分子，而紅色沉淀的物質(zhì)每50μM直徑點(diǎn)給出約1000倍更高1,000,000個(gè)分子的LLD。通過用裝有可見光源和CCD相機(jī)(Princeton Instruments，Princeton，NJ)的顯微鏡(如可從Zeiss商業(yè)上得到的Axiotech顯微鏡)檢測(cè)表面來測(cè)定LLD。一次可掃描約10,000μM×10,000μM的圖象。
為了用藍(lán)色比色測(cè)定方案，表面在酶反應(yīng)后必須很干凈并且硅片或載片必須在干燥狀態(tài)下掃描。此外，酸反應(yīng)必須在對(duì)照點(diǎn)飽和之前終止。對(duì)于辣根過氧化物酶，這大約是2-5分鐘。
也可以使用堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶(HRP)的化學(xué)發(fā)光底物或HPP或堿性磷酸酶的熒光底物。實(shí)例包括可獲自Perkin Elmer的堿性磷酸酶diox底物或可獲自JBL Scientific(Scan Luis Obispo，CA)的AttophosHRP底物。生物分子溶液的自動(dòng)轉(zhuǎn)移本發(fā)明提供一種將生物分子點(diǎn)樣到固體支持物上的方法，此方法包括以下步驟將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中；將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上；并且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉(zhuǎn)移到所述固體支持物上。在優(yōu)選實(shí)施方案中，接觸步驟自動(dòng)進(jìn)行，換句話說，是可在x，y和z軸上加以控制的精密自動(dòng)系統(tǒng)。精密Cartesian自動(dòng)系統(tǒng)將由與適當(dāng)馬達(dá)、放大器、移動(dòng)控制器、個(gè)人計(jì)算機(jī)和軟件連接以驅(qū)動(dòng)工作臺(tái)的精密線性定位工作臺(tái)組成。精密線性定位工作臺(tái)可獲自Parker Hannifin公司(Daedel Division，Harrison City，PA)或THK有限公司(日本東京)。馬達(dá)、放大器和移動(dòng)控制器可獲自Parker Hannifin公司(DaedelDivision，Harrison City，PA)或Galil Motion Control有限公司(Mountain View，CA)。軟件將最可能是自定義的并且可用語言如BorlandC++4.5(Borland International Inc.，Scotts Valley，CA)或VisualBasic 4.0(微軟公司，Redmond，WA)編寫。個(gè)人計(jì)算機(jī)可獲自眾多生產(chǎn)商如Dell計(jì)算機(jī)公司(Austin，TX)。
如上所述的彈性探頭制備成裝在任何類型的接受器中，本發(fā)明中有用的機(jī)器人含有適當(dāng)大小的接受器以容納彈性探頭。優(yōu)選的接受器由鎳-銀或青銅制成，然后在堅(jiān)硬的鎳上鍍金。優(yōu)選的接受器設(shè)計(jì)是直徑0.5mm到2.0mm、更優(yōu)選地1.68毫米的金屬管。將0.5mm到1mm厚、更優(yōu)選地0.64mm厚的方線彎入金屬管的一端并封閉。每個(gè)套殼制備有凹痕和壓環(huán)以安全地容納彈性探頭。將探頭插入接受器中，因此探頭管與接受器末端平齊。
為了排列液體的目的，將安裝頭部安裝到機(jī)器人上。該頭部具有可在不同印跡應(yīng)用時(shí)拆卸的扣栓。例如，通過取下2個(gè)螺絲并用一個(gè)設(shè)計(jì)以容納從384孔板點(diǎn)樣的彈性探頭的扣栓代替一個(gè)設(shè)計(jì)以容納從96孔板點(diǎn)樣的彈性探頭的扣栓可容易地改變扣栓。用精密鉆出的、雙水平的孔與接受器的繞線和彎曲區(qū)域適當(dāng)匹配借助摩擦力將接受器固定在扣栓上。這種設(shè)計(jì)使得可以容易地更換損傷或操作不靈的接受器和/或彈性探頭。一旦插入，接受器/彈性探頭組件從扣栓向下伸出25mm，從而允許探針到達(dá)裝有待排列樣品液的微量滴定板底部。
印跡方法和溶液以及將生物分子點(diǎn)樣的方法可用于制備陣列。這些陣列可用于各種分析，其中那些分析可包括作為探針的標(biāo)記生物分子(例如標(biāo)記的寡核苷酸)。標(biāo)記的生物分子的實(shí)例和使用其的分析法描述于美國(guó)專利申請(qǐng)Nos.08/786,835；08/786,834和08/787,521(各于1997年1月22日提交)，以及具有申請(qǐng)Nos.08/898,180；08/898,564和08/898,501的三個(gè)美國(guó)部分繼續(xù)專利申請(qǐng)(各于1997年7月22日提交)，以及PCT國(guó)際公開Nos.97/27331；97/27325和97/27327中。在此完全引用這6個(gè)美國(guó)專利申請(qǐng)和3個(gè)PCT國(guó)際公開的全文作為參考。
此外，本發(fā)明的裝置和方法可用于制備在單元中含有一個(gè)以上寡核苷酸序列的陣列。在成分中含有一個(gè)以上寡核苷酸序列的生物分子陣列及其使用描述于1997年7月22日提交的題為“排列單元內(nèi)的多功能性及其用途”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No.60/053,436和與其同時(shí)提交的類似題目的美國(guó)非臨時(shí)專利申請(qǐng)No.＿＿中，在此完全引用二者的全文作為參考。
本發(fā)明的裝置和方法也可用于制備在進(jìn)行擴(kuò)增和其它酶反應(yīng)中有用的陣列，如在我們1997年7月22日提交的題為“對(duì)核酸陣列進(jìn)行的擴(kuò)增和其它酶反應(yīng)”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No.60/053,428和與其同時(shí)提交的類似題目的美國(guó)非臨時(shí)專利申請(qǐng)No.＿＿中所述，在此完全引用二者的全文作為參考。
本發(fā)明的裝置和方法可用于制備生物分子陣列，如于1997年7月22日提交的題為“基于聚乙烯亞胺的生物分子陣列”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No.60/053,352和與其同時(shí)提交的類似題目的美國(guó)非臨時(shí)專利申請(qǐng)No.＿＿中所述，在此完全引用二者的全文作為參考。
如1997年7月22日提交的題為“使數(shù)據(jù)相關(guān)的計(jì)算機(jī)方法和系統(tǒng)”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No.60/053,429和與其同時(shí)提交的類似題目的美國(guó)非臨時(shí)專利申請(qǐng)No.＿＿(在此充分引用二者的全文作為參考)中所述的使數(shù)據(jù)相關(guān)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和方法、更具體地使標(biāo)記的數(shù)據(jù)與和標(biāo)記數(shù)據(jù)有關(guān)的信息相關(guān)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和方法可與本文公開的方法和裝置結(jié)合使用。
對(duì)于許多生物技術(shù)應(yīng)用，本發(fā)明有很大的用途，特別是那些涉及利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，核酸雜交，通過雜交的核酸測(cè)序，病毒、細(xì)菌或細(xì)胞文庫的復(fù)制開發(fā)大規(guī)模診斷篩選方法的方法以及任何其它涉及反復(fù)將溶液排列到固體表面上的方法。
提供以下實(shí)施例作為舉例說明而不是限制。實(shí)施例實(shí)施例1一步法制備有PEI涂層的玻片用0.1N乙酸洗玻片，然后用水沖洗直到從玻片上洗出的水的pH與用于沖洗玻片的水的pH相同。然后使玻片干燥。
向95∶5的乙醇∶水溶液中加入足夠量的溶于2-丙醇(Gelest，Inc.，Tullytown，PA，目錄號(hào)SSP060)中的50％w/w三甲氧基甲硅烷基丙基-聚乙烯亞胺(600MW)以達(dá)到2％w/w終濃度。攪拌此2％溶液5分鐘后，將玻片浸入溶液中，輕輕攪拌2分鐘，然后取出。為了洗去過多的甲硅烷基化試劑，將玻片浸入乙醇中。然后使玻片空氣干燥。實(shí)施例2一步法制備有PEI涂層的硅片用0.1N乙酸洗硅片(WaferNet，San Jose，CA)，然后用水沖洗直到從硅片上洗出的水的pH與用于沖洗硅片的水的pH相同。然后使硅片干燥。
向95∶5的乙醇∶水溶液中加入足夠量的溶于2-丙醇(Gelest，Inc.，Tullytown，PA，目錄號(hào)SSP060)中的50％w/w三甲氧基甲硅烷基丙基-聚乙烯亞胺(600MW)以達(dá)到2％w/w終濃度。攪拌此2％溶液5分鐘后，將硅片浸入溶液中，輕輕攪拌2分鐘，然后取出。為了洗去過多的甲硅烷基化試劑，將硅片浸入乙醇中。然后使硅片空氣干燥。實(shí)施例3一步法制備有PEI涂層的玻片用0.1N乙酸洗玻片，然后用水沖洗直到從玻片上洗出的水的pH與用于沖洗玻片的水的pH相同。然后使玻片干燥。
向95∶5的乙醇∶水溶液中加入足夠量的親電子甲硅烷基化試劑，同時(shí)攪拌以達(dá)到2％w/w終濃度。親電子甲硅烷基化試劑是2-(3，4-環(huán)氧環(huán)己基)乙基三甲氧硅烷(Gelest，Inc.，Catalog No.SIE4670.0)，3，4-環(huán)氧丁基三甲氧硅烷(Gelest，Inc.，Catalog No.SIE4665.0)或3-異氰酸根丙基三乙氧硅烷(Gelest，Inc.，Catalog No.SII6454.0)之一。攪拌此2％溶液5分鐘后，將玻片浸入溶液中，輕輕攪拌2分鐘，然后取出。為了洗去過多的甲硅烷基化試劑，將玻片浸入乙醇中。
通過用1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)稀釋30％聚乙烯亞胺(Polysciences，Warrington，PA)水溶液來制備70,000分子量聚乙烯亞胺的3％(w/v)溶液。將處理的玻片浸入3％溶液中并輕輕攪拌24小時(shí)。為了去除玻片上過多的PEI，將玻片浸入NMP中(2X)，然后浸入同時(shí)含有0.09M NaCl、50mM TrispH 7.6和25mM DETA的0.1％十二烷基磺酸鈉水溶液中(2X)，然后浸入水中(2X)，并且最后浸入乙醇中(1X)。然后使玻片空氣干燥。實(shí)施例4一步法制備有PEI涂層的硅片按照實(shí)施例3中所述用0.1N乙酸洗硅片(WaferNet，San Jose，CA)，然后也按照實(shí)施例3中所述用甲硅烷基化試劑和PEI處理。實(shí)施例5從商業(yè)彈性探頭制備點(diǎn)樣頭XP54P彈性探頭購(gòu)自O(shè)sby-Barton〔Everett Charles(Pomona，CA)的分公司〕。將探頭“端部向下”對(duì)著超細(xì)的金剛磨石(DMT Inc.，Miami Lattes，F(xiàn)L)并以輕輕的壓力在磨石上橫移約0.5cm距離。通過顯微鏡觀察到由此從點(diǎn)樣頭的末端去掉約0.005英寸(0.001到0.01英寸)的金屬。然后通過在皮帶上摩擦端部將點(diǎn)樣頭末端磨光。然后用水洗端部。在開始使用前或使用之間，將點(diǎn)樣頭干燥保存或于-20℃保存在50％甘油中。實(shí)施例6用改進(jìn)的彈性探頭裝配排列裝置將實(shí)施例5中制備的端部安裝到布列頭部中，布列頭部裝在可在x，y和z軸上控制的精密自動(dòng)系統(tǒng)上。精密Cartesian自動(dòng)系統(tǒng)將由與適當(dāng)馬達(dá)、放大器、移動(dòng)控制器、個(gè)人計(jì)算機(jī)和軟件連接以驅(qū)動(dòng)工作臺(tái)的線性定位工作臺(tái)組成。精密線性定位工作臺(tái)可獲自Parker Hannifin公司(Daedel Division，Harrison City，PA)或THK有限公司(日本東京)。馬達(dá)、放大器和移動(dòng)控制器可獲自Parker Hannifin公司(Daedel Division，Harrison City，PA)或Galil Motion Control有限公司(Mountain View，CA)。實(shí)施例7用親水性表面促進(jìn)液體汲取、液體轉(zhuǎn)移和微滴點(diǎn)樣按照實(shí)施例5將彈性探頭端部浸于100mM 1，4-二硫蘇糖醇和0.1M的硼酸鈉溶液中60分鐘。二硫蘇糖醇將通過硫醇-金配位與金表面反應(yīng)以制備金親水性表面(表面基本上羥化)。實(shí)施例8反應(yīng)性寡核苷酸的制備將75μl 5’-己胺-GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3’(0.5μg/μl)溶液與5μl 20mg/ml的氰尿酰氯和20μl 1M的硼酸鈉在室溫反應(yīng)30分鐘。實(shí)施例9寡核苷酸的布列溶液制備由12.5μL pH8.3的1M硼酸鈉(新鮮制備或從-20℃儲(chǔ)液凍融)、50μl 0.1μg/μL的5’己胺寡核苷酸(5’己胺-GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3’)、7.5μL乙腈中的15mg/mL氰尿酰氯組成的布列溶液。將此混合物在室溫下溫育30到60分鐘。然后向溶液加入155μL 80％甘油并將所得溶液充分混合。在某些情況下，向溶液加入15μL 10％的NP-40或10％的Tween 20或10％的Triton X-100(Rohm和Hass，費(fèi)城)。當(dāng)排列基質(zhì)由尼龍或硝酸纖維素膜組成時(shí)，向布列溶液加入25μL 5M的NaCl。實(shí)施例10 PCR擴(kuò)增子的布列溶液當(dāng)排列PCR擴(kuò)增子時(shí)，在完成熱循環(huán)步驟后將2.5μL pH8.3的1M硼酸鈉(新鮮制備或從-20℃儲(chǔ)液凍融)、50μl 0.1μg/μL的5’己胺寡核苷酸(5’己胺-GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3’)、7.5μL乙腈中的15mg/mL氰尿酰氯加入含有PCR內(nèi)容物的PCR管中。將此混合物在室溫下溫育30到60分鐘。然后向溶液加入155μL 80％甘油并將得到的溶液充分混合。在某些情況下，向溶液加入15μL 10％的NP-40或10％的Tween 20或10％的Triton X-100。當(dāng)排列基質(zhì)由尼龍或硝酸纖維素膜組成時(shí)，向布列溶液加入25μL 5M的NaCl。實(shí)施例11排列寡核苷酸的制備按照實(shí)施例6將實(shí)施例5的改進(jìn)的彈性探頭安裝在自動(dòng)移液裝置中，并且按照實(shí)施例7處理彈性探頭端部。將端部浸入實(shí)施例9的布列溶液中5毫米2秒種。然后機(jī)器人用帶有溶液的端部以12×6網(wǎng)格在有聚乙烯亞胺(PEI)涂層的硅片上印跡72個(gè)微點(diǎn)，硅片根據(jù)實(shí)施例2、4中的任一項(xiàng)制備或由將會(huì)根據(jù)合同制備有PEI涂層的基質(zhì)的Cell Associates(Houston，Texas)等提供。產(chǎn)生的點(diǎn)直徑約100-150微米，相鄰點(diǎn)之間中心到中心的間距是200微米。實(shí)施例12活性PEI位點(diǎn)的封閉為了封閉排列上未反應(yīng)的PEI位點(diǎn)，用100mg/mL 100％ NMP中的琥珀酸酐處理實(shí)施例11的陣列15分鐘。實(shí)施例13未反應(yīng)的氰尿酰氯位點(diǎn)的封閉為了封閉排列上未反應(yīng)的氰尿酰氯位點(diǎn)，用0.1M 0.01M Tris中的甘油處理實(shí)施例12的陣列15分鐘，然后用Tens(0.1M NaCl，0.1％SDS，0.01MTris，5mM EDTA)洗4次。實(shí)施例14雜交方法使實(shí)施例13的陣列中的固定寡核苷酸與其生物素化的互補(bǔ)產(chǎn)物(5’-生物素-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’)在37℃雜交20分鐘，用6XTens、2XOHS
洗。
雜交后，將硅片浸入0.5μg/ml堿性磷酸酶鏈霉抗生物素蛋白中15分鐘，用2XTens、4XTWS(0.1M NaCl，0.1％Tween20，0.05M Tris)洗。然后用Vector Blue(Vector Laboratories，Burlingame，Califor-nia)(按照試劑盒方法)使微點(diǎn)顯色并用CCD相機(jī)和顯微鏡照相。圖5顯示產(chǎn)生的圖象。實(shí)施例15單一陣列單元內(nèi)的多個(gè)寡核苷酸濃度均為0.5μg/μl的2種模板寡核苷酸(寡核苷酸#1＝5’己胺-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’，寡核苷酸#2＝5’己胺-ACTACTGATCAGGCGCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)分別與20μl 1M硼酸鈉中的5μl 20mg/ml氰尿酰氯于室溫反應(yīng)30分鐘(總反應(yīng)體積＝100μl)。從這兩個(gè)反應(yīng)制備由56％甘油和這兩種寡核苷酸的稀釋組合組成的布列溶液(見表1)。將8個(gè)點(diǎn)樣頭各浸入8種布列溶液中5毫米2秒鐘。然后機(jī)器人在聚乙烯亞胺(PEI)涂敷的硅片上用帶有溶液的端部印跡2套8個(gè)各含有72個(gè)微點(diǎn)的12×6網(wǎng)格。每個(gè)網(wǎng)格代表單一的布列溶液。產(chǎn)生的點(diǎn)直徑約100-150微米，相鄰點(diǎn)之間中心到中心的間距是200微米。
排列后，硅片上未反應(yīng)的PEI位點(diǎn)用100mg/mL 100％N-甲基吡咯烷酮中的琥珀酸酐封閉15分鐘，水洗3X。未反應(yīng)的氰尿酰氯位點(diǎn)用0.01M Tris中的0.1M甘油封閉15分鐘，Tens(0.1M NaCl，0.1％SDS，0.01M Tris，5mM EDTA)洗4X。然后進(jìn)行兩種雜交。
在第一種雜交中，將一套8種排列的寡核苷酸組合與互補(bǔ)于寡核苷酸#1的生物素化寡核苷酸(5’-生物素-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’)雜交。在第二種雜交中，將另一套8種排列的寡核苷酸組合與互補(bǔ)于寡核苷酸#2的生物素化寡核苷酸(5’-生物素-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCGCGCCTGATCAGTAGT-3’)雜交。雜交于37℃在Hybriwell SealingCovers(Research Products Internat ional Corporation，Mount Prospect，Illinois)下同時(shí)進(jìn)行20分鐘，用6XTens、2X CHS(0.06M Tris，2mMEDTA)、5XDenhardt’s溶液、6XSSC(3M NaCl，0.3M檸檬酸鈉，pH7.0)、3.68mM N-月桂酰肌氨酸、0.005％NP-40洗。
雜交后，將硅片浸入0.5μg/ml辣根過氧化物酶鏈霉抗生物素蛋白中15分鐘，用2XTens、4XTWS(0.1M NaCl，0.1％Tween 20，0.05M Tris)洗。然后用0.4mg/ml的4-甲氧基-1-napthol(0.02％過氧化氫，12％甲醇，PBS)使微點(diǎn)顯色，最后水洗3X。
與寡核苷酸#1的互補(bǔ)產(chǎn)物雜交的混合寡核苷酸系列對(duì)于含有最高濃度寡核苷酸#1的網(wǎng)格表現(xiàn)最強(qiáng)的顏色強(qiáng)度而對(duì)于含有最低濃度寡核苷酸#1的網(wǎng)格表現(xiàn)最低的顏色強(qiáng)度。而且，與寡核苷酸#2的互補(bǔ)產(chǎn)物雜交的混合寡核苷酸系列對(duì)于含有最高濃度寡核苷酸#2的網(wǎng)格表現(xiàn)最強(qiáng)的顏色強(qiáng)度而對(duì)于含有最低濃度寡核苷酸#2的網(wǎng)格表現(xiàn)最低的顏色強(qiáng)度(見圖6)。
表1<

>實(shí)施例16測(cè)定單元大小的一致性制備由56％甘油和44％用藍(lán)色食物染料染色的水組成的布列溶液。將點(diǎn)樣頭浸入布列溶液中5毫米2秒鐘。然后機(jī)器人用帶有甘油的端部以12×6網(wǎng)格在硅片上印跡72個(gè)微點(diǎn)。產(chǎn)生的點(diǎn)直徑約100-150微米，相鄰點(diǎn)之間中心到中心的間距是200微米。圖7顯示機(jī)器人產(chǎn)生的網(wǎng)格的CCD相機(jī)相片。點(diǎn)直徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差約為15％。實(shí)施例17測(cè)定排列方法內(nèi)的可重復(fù)性制備由56％甘油、0.01M Tris pH 7.2、5mm EDTA、0.01％肌氨酰和1％V/V Fluoresbrite Plain 0.5μM微球體(2.5％Solids-latex)(Polysciences，Warrington，PA)組成的布列溶液。將點(diǎn)樣針頭浸入溶液中5毫米5秒鐘并且然后用于在玻片上印跡多個(gè)微點(diǎn)。然后用熒光濾鏡在熒光下進(jìn)行顯微攝影。圖8顯示每個(gè)微點(diǎn)(陣列單元)熒光微球體的高度重復(fù)性點(diǎn)樣(通過肉眼觀察測(cè)定)。實(shí)施例18測(cè)定每單元核酸多聚物的濃度將與點(diǎn)樣的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸(5’-德克薩斯紅-CAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATGAC)與3M硫氰酸胍(GcSCN)、0.01M TrispH 7.5、5mM EDTA和0.1％肌氨酰中的陣列雜交。體積足以覆蓋固體支持物〔對(duì)于玻片(1×3英寸)為1mL〕。德克薩斯紅寡核苷酸的濃度為5μg/ml，并且反應(yīng)在室溫進(jìn)行。使雜交進(jìn)行30分鐘。然后用Tens洗玻片(5X)。然后用1mL洗脫緩沖液(0.005M Tris pH7.6，0.0005M EDTA，0.01％肌氨酰)覆蓋玻片并加熱到95℃2分鐘。從玻片上汲取溶液并將其置于黑色微量滴定板中。在黑色微量滴定板中測(cè)定熒光。從溫育管汲取溶液(200μL)并將其置于黑色微量滴定板中(Dynatek Laboratories，Chantilly，VA)。然后用Fluoroskan II熒光計(jì)(Flow Laboratories，McLean，VA)直接對(duì)平板讀數(shù)，對(duì)于熒光素用495nm的激發(fā)波長(zhǎng)并且在520nm處監(jiān)測(cè)發(fā)射光，對(duì)于德克薩斯紅用591nm的激發(fā)波長(zhǎng)并且在612nm處監(jiān)測(cè)發(fā)射光，并且麗絲胺或TAMRA用570nm的激發(fā)波長(zhǎng)并且在590nm處監(jiān)測(cè)發(fā)射光。洗脫的寡核苷酸的量通過用測(cè)得的熒光量〔3.84個(gè)相對(duì)熒光單位(rfu)〕除以德克薩斯紅寡核苷酸的比活(每μg寡核苷酸6.9rfu)加以測(cè)定。因此測(cè)得陣列中的每單元中存在108個(gè)寡核苷酸。
從前述應(yīng)當(dāng)理解，雖然在此為了舉例說明的目的描述了本發(fā)明的具體實(shí)施例，但在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下可進(jìn)行各種修飾。因此，除了所附的權(quán)利要求外，本發(fā)明不受其它限制。
權(quán)利要求
1.一種彈性探頭，包括包住壓縮彈簧的管狀套殼，所述彈簧與活塞機(jī)械連接，所述活塞具有伸出所述套殼的第一個(gè)區(qū)域，所述第一個(gè)區(qū)域包括以平坦表面終止的錐形端部，所述表面與所述套殼的縱軸垂直，所述錐形端部在其剖面具有與上述表面相鄰接的外側(cè)邊，如果上述外側(cè)邊越過上述表面延伸，則相交于距上述表面約0.001-0.005英寸處的點(diǎn)。
2.權(quán)利要求1所述的彈性探頭，其中錐形端部選自角錐形、輻射形、圓錐形、針形和凹槽形設(shè)計(jì)。
3.權(quán)利要求1所述的彈性探頭，其中錐形端部為凹槽形。
4.權(quán)利要求1所述的彈性探頭，其中錐形端部包括金制表面。
5.一種組合物，包含基于組合物總體積約35體積％至80體積％濃度的增稠劑、0.001μg/mL到10μg/mL濃度的寡核苷酸以及水。
6.權(quán)利要求5所述的組合物，其中增稠劑是具有至少三個(gè)羥基的多元醇。
7.權(quán)利要求6所述的組合物，其中多羥基醇選自甘油、三羥甲基丙烷、三羥甲基乙烷、季戊四醇和糖類。
8.權(quán)利要求7所述的組合物，其中糖類選自甘露醇、蔗糖、果糖、乳糖、纖維素和谷物糖漿。
9.權(quán)利要求5所述的組合物，其中增稠劑是以40體積％到60體積％濃度存在的甘油。
10.權(quán)利要求5所述的組合物，其中寡核苷酸濃度為0.01μg/mL到1μg/mL。
11.權(quán)利要求5所述的組合物，其中寡核苷酸濃度為0.05μg/mL到0.5μg/mL。
12.權(quán)利要求5所述的組合物，其中寡核苷酸包含15到50個(gè)核苷酸。
13.權(quán)利要求5所述的組合物，其中寡核苷酸包含50到1,000個(gè)核苷酸。
14.權(quán)利要求5所述的組合物，其中寡核苷酸是單鏈。
15.權(quán)利要求5所述的組合物，其中寡核苷酸是雙鏈。
16.權(quán)利要求5所述的組合物，其中寡核苷酸在其5’末端帶有氨基(-NH2)。
17.權(quán)利要求16所述的組合物，其中寡核苷酸在其5’末端帶有己胺(-(CH2)6-NH2)基團(tuán)。
18.權(quán)利要求16所述的組合物，進(jìn)一步包含三氯三嗪。
19.權(quán)利要求5所述的組合物，具有7到9的pH并且進(jìn)一步包含緩沖劑。
20.權(quán)利要求19所述的組合物，其中緩沖劑選自磷酸鈉、硼酸鈉、碳酸鈉和Tris HCl。
21.權(quán)利要求5所述的組合物，具有18-25℃的溫度。
22.權(quán)利要求5所述的組合物，具有20℃時(shí)約6厘泊到25℃時(shí)約80厘泊的粘度。
23.一種將生物分子點(diǎn)樣到固體支持物上的方法，此方法包括以下步驟將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中；將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上；并且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉(zhuǎn)移到所述固體支持物上；其中所述彈性探頭包括包住壓縮彈簧的管狀套殼，所述彈簧與活塞機(jī)械連接，所述活塞具有伸出所述套殼的第一個(gè)區(qū)域，所述第一個(gè)區(qū)域包括以平坦表面終止的錐形端部，所述表面與所述套殼的縱軸垂直，所述錐形端部在其剖面具有與上述表面相鄰接的外側(cè)邊，如果上述外側(cè)邊越過上述表面延伸，則相交于距上述表面約0.001-0.005英寸處的點(diǎn)。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的生物分子是寡核苷酸并且所述的溶液包含基于組合物總體積約35體積％至80體積％濃度的增稠劑、0.001μg/mL到10μg/mL濃度的寡核苷酸以及水。
25.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的固體基質(zhì)包括平面，并且所述平面至少部分覆蓋有一層與生物分子接觸的聚乙烯亞胺(PEI)。
26.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的接觸步驟重復(fù)至少10次且其中不插入浸入步驟。
27.一種排列生物分子的方法，包括以下步驟將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中；將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上；并且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉(zhuǎn)移到所述固體支持物上；并且重復(fù)所述接觸步驟多次以使生物分子以陣列形式排列于固體支持物上；其中所述彈性探頭包括包住壓縮彈簧的管狀套殼，所述彈簧與活塞機(jī)械連接，所述活塞具有伸出所述套殼的第一個(gè)區(qū)域，所述第一個(gè)區(qū)域包括以平坦表面終止的錐形端部，所述表面與所述套殼的縱軸垂直，所述錐形端部在其剖面具有與上述表面相鄰接的外側(cè)邊，如果上述外側(cè)邊越過上述表面延伸，則相交于距上述表面約0.001-0.005英寸處的點(diǎn)。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中陣列包括包含平面的固體基質(zhì)；所述平面至少部分覆蓋有一層聚乙烯亞胺(PEI)；所述涂層包括多個(gè)由第二區(qū)環(huán)繞并與其鄰接的分開的第一區(qū)；所述第一區(qū)有生物分子和PEI；并且所述第二區(qū)有PEI并且基本上沒有生物分子。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中雙功能偶聯(lián)劑的反應(yīng)產(chǎn)物置于所述平面與所述PEI涂層之間，所述反應(yīng)產(chǎn)物與所述平面和所述PEI涂層共價(jià)結(jié)合。
30.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述陣列有多個(gè)第一區(qū)，選自10到50個(gè)第一區(qū)，50到400個(gè)第一區(qū)和400個(gè)以上第一區(qū)。
31.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的固體支持物包括其上具有包括聚乙烯亞胺(PEI)的涂層的平面，所述生物分子溶液與所述PEI接觸。
32.權(quán)利要求31所述的方法，在所述重復(fù)步驟后進(jìn)一步包括用琥珀酸酐處理所述涂層的步驟。
33.權(quán)利要求32所述的方法，在所述處理步驟后進(jìn)一步包括將所述涂層與甘油一起溫育的步驟。
34.權(quán)利要求33所述的方法，在所述溫育步驟后進(jìn)一步包括用水性去污劑溶液清洗所述涂層的步驟。
35.權(quán)利要求32所述的方法，在所述處理步驟后進(jìn)一步包括在80-95℃加熱所述涂層的步驟。
全文摘要
一種用于將生物分子點(diǎn)樣到固體支持物上的方法,此方法包括以下步驟:將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中;將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上;并且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉(zhuǎn)移到所述固體支持物上。彈性探頭雖然具有平坦的端部,但在其它方面與商業(yè)彈性探頭相同。生物分子溶液除了含有生物分子之外還含有增稠劑,其中寡核苷酸分子是優(yōu)選的生物分子。
文檔編號(hào)B01L3/00GK1264319SQ98807432
公開日2000年8月23日 申請(qǐng)日期1998年7月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月22日
發(fā)明者K·莫伊尼漢, J·范尼斯, J·C·泰伯恩 申請(qǐng)人:拉普吉恩公司