細(xì)胞培養(yǎng)的制作方法
【專利說明】細(xì)胞培養(yǎng)
[0001] 介紹
[0002] 本公開內(nèi)容涉及包含一個(gè)或更多個(gè)功能化表面的三維[3-D]細(xì)胞培養(yǎng)膜的制造， 所述功能化表面適于提供適用于分析細(xì)胞之增殖、分化或功能的細(xì)胞培養(yǎng)條件，所述細(xì)胞 通常為真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。所述細(xì)胞培養(yǎng)膜適用于在現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)塑料器皿中安裝并使 用以用于培養(yǎng)細(xì)胞，并且還適用于高分辨率顯微技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)膜的多細(xì)胞陣列形式還提 供了高效且成本有效的裝置來可重復(fù)地提供培養(yǎng)物中的細(xì)胞，其可用于藥物篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 真核細(xì)胞（例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞）的培養(yǎng)已成為一種常規(guī)方法并且明確限定了使細(xì) 胞能夠增殖、分化和發(fā)揮功能的細(xì)胞培養(yǎng)條件。通常，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)需要通常由 塑料（典型為聚苯乙烯）制造的無菌容器，限定生長培養(yǎng)基以及在一些實(shí)例中的飼養(yǎng)細(xì)胞 和血清。飼養(yǎng)細(xì)胞的作用在于提供刺激細(xì)胞增殖和/或維持細(xì)胞處于未分化狀態(tài)并且可影 響細(xì)胞功能的信號(hào)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)具有多種應(yīng)用并且存在使用細(xì)胞培養(yǎng)來進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 和研宄的多種體外測定和模型；例如細(xì)胞在組織工程中的用途；哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)用于產(chǎn) 生重組蛋白的用途以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞在初步藥物篩選中的用途。
[0004] 在初步藥物篩選中使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞以確定先導(dǎo)治療劑（lead therapeutic)(例 如，小分子激動(dòng)劑或拮抗劑、單克隆抗體、肽治療劑、核酸適配體、小抑制性RNA)是否具有 效力，然后進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。需要提供改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，可在所述改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中 培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞以提供技術(shù)上盡可能接近其天然狀態(tài)的細(xì)胞群體，從而能夠以可靠的方 式分析細(xì)胞增殖、分化和功能。
[0005] 細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)在本領(lǐng)域是已知的并且技術(shù)人員已使用多年。例如，W02010/005995 公開了作為傳染病分析平臺(tái)的微圖案（micro-patterned)共培養(yǎng)系統(tǒng)。W02003/014334 公開了體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，其提供了使得前列腺上皮細(xì)胞能夠形成與在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的前列 腺腺泡非常類似的3D前列腺樣腺泡的培養(yǎng)方案。此外，W000/34454中描述了包含微孔 (microcellular)聚合物材料的細(xì)胞培養(yǎng)基材（substrate)。這些聚合物形成孔彼此相互 連接的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而提供細(xì)胞可附著至其并增殖的基材。
[0006] 細(xì)胞培養(yǎng)通常包括使細(xì)胞在封閉的細(xì)胞培養(yǎng)容器中于無菌條件下在單層培養(yǎng)物 中生長。一種方法是使用2D蛋白質(zhì)圖案或3D微孔（micro-well)。2D蛋白質(zhì)圖案已成功 并廣泛地用于控制細(xì)胞行為。此外，使用硅蝕刻Si晶片[1、2]、玻璃[3]、聚二甲基硅氧烷 [PDMS] [4]、彈性印章（elastomeric stamp) [5]、水凝膠（如瓊脂糖或PEG) [6、7]、膠原蛋白 [8]或Parylen膜[9]和纖維[10]進(jìn)行的微孔制造已被用于在受限環(huán)境中培養(yǎng)單細(xì)胞或有 限數(shù)目的細(xì)胞。然而，該技術(shù)通常相當(dāng)于使用微孔作為小型化培養(yǎng)皿而沒有利用細(xì)胞在孔 中的限制以及產(chǎn)生3D蛋白質(zhì)涂覆的凹穴（nich)的可能性。這主要是因?yàn)檫@樣的事實(shí)：至 少對(duì)單細(xì)胞培養(yǎng)而言，化學(xué)涂層在孔的側(cè)面、頂部和底部不可能不同，并因此僅可為細(xì)胞提 供單一化學(xué)信號(hào)，很少觀察到優(yōu)于2D圖案化表面的優(yōu)點(diǎn)。此外，單細(xì)胞微孔技術(shù)不太適合 于高分辨率成像，原因是其經(jīng)受由細(xì)胞和用于形成微孔的材料之間的率變化（例如硅聚合 物的折射率為約I. 45)所造成的圖像失真[11]。
[0007] 例如而非限制性地，使用原代肝細(xì)胞來舉例說明本公開內(nèi)容。我們的3D差異性表 面涂層允許培養(yǎng)原代肝細(xì)胞作為具有可用于藥物代謝分析的受控膽小管[BC]形態(tài)的細(xì)胞 雙聯(lián)體（doublet)。我們的技術(shù)使得功能原代肝細(xì)胞能夠在雙聯(lián)體水平培養(yǎng)至少96小時(shí)。 此外，我們的技術(shù)提供可包括在任意標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)裝置中的通用獨(dú)立膜。本文公開的細(xì)胞 培養(yǎng)系統(tǒng)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞以提供用于產(chǎn)生更接近地反映體內(nèi)條件的細(xì)胞培養(yǎng)物的設(shè) 備，從而提供應(yīng)用于例如組織工程、重組蛋白生產(chǎn)和藥物篩選的更可靠的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
[0008] 發(fā)明陳述
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了三維細(xì)胞培養(yǎng)基材，其包含：包含適于細(xì)胞培養(yǎng)之 經(jīng)固化聚合物的穿孔膜，其特征在于所述膜具有至少兩個(gè)經(jīng)改性細(xì)胞培養(yǎng)表面，其中第一 表面包含至少一種細(xì)胞培養(yǎng)劑并且第二表面包含第二種不同的細(xì)胞培養(yǎng)劑，其中所述膜增 強(qiáng)與所述膜相締合之細(xì)胞的增殖和/或分化或功能。
[0010] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述膜包含多個(gè)穿孔，其中所述穿孔的直徑為 至少5 y m至1000 y m ;優(yōu)選直徑為約20 y m至300 y m。
[0011] 縱橫比（aspect ratio)通常被認(rèn)為是外形（feature)的高度與特征性橫向尺寸 之間的比例關(guān)系。在本公開內(nèi)容的上下文中，關(guān)于穿孔尺寸，縱橫比通常不大于2。
[0012] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述穿孔的高度為10 y m至50 y m ;優(yōu)選高度為 40 y m〇
[0013] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述可固化聚合物是可UV固化的。優(yōu)選地，所 述可固化聚合物是基于丙烯酸的聚合物。
[0014] 基于丙烯酸的聚合物在本領(lǐng)域是公知的并且包括例如聚（甲基丙烯酸甲酯）
[PMMA]--Norland粘合劑系列的光學(xué)粘合劑[N0A系列；參見http ://www. norlandprod. com)。另一些實(shí)例包括具有期望光學(xué)性能的可固化聚合物，其可獲自My Polymer http ：// www. mypolymers. com,例如折射率不同的 My 132、133、136、145、147。
[0015] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)劑和/或所述膜通過包含交聯(lián)劑 而進(jìn)行進(jìn)一步改性，所述交聯(lián)劑有助于所述細(xì)胞培養(yǎng)劑與所述膜交聯(lián)，從而提供經(jīng)改性細(xì) 胞培養(yǎng)表面。
[0016] 提供經(jīng)改性細(xì)胞培養(yǎng)表面將有助于施加至膜之細(xì)胞的生長和分化。根據(jù)本發(fā)明的 細(xì)胞培養(yǎng)劑通常是蛋白質(zhì)或糖蛋白。涉及維持細(xì)胞之增殖和/或分化的蛋白質(zhì)是公知的。 例如，典型的蛋白質(zhì)因子包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，例如纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白、鈣粘 附蛋白和成纖維細(xì)胞生長因子，并且（根據(jù)細(xì)胞類型）維持細(xì)胞增殖和/或分化所需的單 核因子和細(xì)胞因子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，公知的是，碳水化合物劑（例如凝集 素）參與促進(jìn)細(xì)胞分化并在類似和不同細(xì)胞類型之間形成細(xì)胞與細(xì)胞的接觸。
[0017] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述膜的折射率為約1. 30至約1. 50 ;優(yōu)選約 1. 33 至約 1. 45。
[0018] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞基材包含相互連接的細(xì)胞培養(yǎng)微孔的 網(wǎng)絡(luò)。
[0019] 在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述網(wǎng)絡(luò)含多個(gè)長形的細(xì)胞培養(yǎng)微孔，其適 于提供至少所述第一經(jīng)改性細(xì)胞培養(yǎng)表面和第二經(jīng)改性細(xì)胞培養(yǎng)表面。
[0020] 優(yōu)選地，所述長形微孔的長度為至少300 y m。
[0021 ] 優(yōu)選地，所述長形微孔為至少30 y m寬。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于微制造包含至少一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)微孔的細(xì)胞 培養(yǎng)膜的方法，其中所述微孔調(diào)整為有至少兩個(gè)功能化細(xì)胞培養(yǎng)表面，所述方法包括以下 步驟：
[0023] i)使支持物的表面與通過提供一個(gè)或更多個(gè)凸起的突出部分進(jìn)行調(diào)整的基材相 接觸，其中所述突出部分中的一個(gè)或更多個(gè)接觸所述支持物的表面；
[0024] ii)將細(xì)胞培養(yǎng)兼容性聚合物溶液施加于所述基材，其中所述聚合物是可固化 的；
[0025] iii)固化所施加的聚合物以形成細(xì)胞培養(yǎng)膜；
[0026] iv)從所述基材中移除所述膜并使第一膜表面與一種或更多種細(xì)胞培養(yǎng)劑相接 觸；
[0027] V)重新定向所述膜以暴露第二膜表面；并且使所述第二膜表面與第二種不同的 細(xì)胞培養(yǎng)劑相接觸；以及任選地
[0028] vi)重復(fù)iv)和/或V)以進(jìn)一步功能化所述細(xì)胞培養(yǎng)膜。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的基材可以是硅基的，例如聚二甲基硅氧烷[PDMS]或彈性印章。顯而 易見的是，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生了具有大表面積的三維細(xì)胞培養(yǎng)膜，其可具有多達(dá)三個(gè) 功能化表面，所述表面可通過多種細(xì)胞培養(yǎng)劑進(jìn)行改性來提供優(yōu)越的細(xì)胞培養(yǎng)膜。細(xì)胞培 養(yǎng)兼容性聚合物通常是可UV固化聚合物，但是本發(fā)明還涵蓋替代固化[例如加熱]。
[0030] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選方法中，步驟ii)至vi)通過包含化學(xué)交聯(lián)劑而進(jìn)一步改性， 所述化學(xué)交聯(lián)劑有助于所述細(xì)胞培養(yǎng)劑與所述細(xì)胞培養(yǎng)膜交聯(lián)。
[0031] 優(yōu)選地，所述化學(xué)交聯(lián)劑是異雙功能交聯(lián)劑。
[0032] 交聯(lián)劑的實(shí)例在本領(lǐng)域是已知的。例如，包括基于丙烯酸的交聯(lián)劑，例如a -丙烯 ?；然歹啺反拙郏ㄒ叶迹?，也稱為acryl-peg-N-羥基琥泊酰亞胺（www. nanocs. net) 〇
[0033] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選方法中，所述劑為a-丙烯?；然牾啺孵ゾ?(乙二醇）并且包括在根據(jù)本發(fā)明之方法的步驟ii)中。
[0034] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選方法中，所述細(xì)胞培養(yǎng)劑是蛋白質(zhì)。
[0035] 在本發(fā)明的一種替代優(yōu)選方法中，所述細(xì)胞培養(yǎng)劑是碳水化合物.
[0036] 在本發(fā)明的另一種替代方法中，所述細(xì)胞培養(yǎng)劑是基于脂質(zhì)的劑，例如糖脂。
[0037] 在本發(fā)明的一種替代優(yōu)選方法中，所述劑是聚氨基酸涂層。
[0038] 聚氨基酸具有模擬蛋白質(zhì)并且特別是細(xì)胞可在其上附著并生長之蛋白質(zhì)的性質(zhì)。 聚氨基酸可以是均聚物或雜聚物?？捎糜诩?xì)胞培養(yǎng)的聚氨基酸的實(shí)例包括聚-L鳥氨酸和 聚-L-賴氨酸。蛋白質(zhì)涂層在本領(lǐng)域是公知的。例如參見Culture of Animal Cells，Ian Freshney，Wiley-Liss 1994〇
[0039] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選方法中，所述一種或更多種試劑是防污劑。
[0040] 防污劑在本領(lǐng)域是已知的并且防止細(xì)胞培養(yǎng)期間所產(chǎn)生的細(xì)胞碎片積聚。防污劑 的實(shí)例為PEG甲基丙烯酸酯或普朗尼克酸（pluronic acid)?。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得或能夠獲得的細(xì)胞 培養(yǎng)膜。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)膜的細(xì)胞培養(yǎng)容 器。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含至少一種細(xì)胞類型和細(xì)胞培養(yǎng)基的根據(jù)本 發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)容器。
[0044] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基材懸浮于所述細(xì)胞培養(yǎng)基中并 在其中得到支持。
[0045] 在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基材包含一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞培 養(yǎng)表面，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)表面不接觸細(xì)胞培養(yǎng)容器表面。
[0046] "細(xì)胞培養(yǎng)容器"定義為適于含有上述細(xì)胞培養(yǎng)基材的任意設(shè)備。通常，這樣的容 器的實(shí)例是培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶或燒瓶或多孔培養(yǎng)皿或孔插入物。多孔培養(yǎng)皿是規(guī)格為例 如6、12、48、96和384孔的多孔微量滴定板，其通常用于與自動(dòng)化加載和自動(dòng)處理系統(tǒng)兼 容。通常，高通量篩選使用試劑與指示劑化合物的均勻混合物，所述指示劑化合物經(jīng)轉(zhuǎn)化或 經(jīng)改性而導(dǎo)致信號(hào)產(chǎn)生。通過合適方法（例如熒光發(fā)射、光密度或放射性的檢測）測量所 述信號(hào)，然后整合來自包含細(xì)胞、基材/試劑和指示劑化合物的各孔的信號(hào)。
[0047] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0048] 在本發(fā)明的一個(gè)替代優(yōu)選實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，例如 大鼠、小鼠或倉鼠細(xì)胞。
[0049] 在本發(fā)明的一個(gè)替代優(yōu)選實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是靈長類動(dòng)物細(xì)胞；優(yōu) 選地，所述靈長類動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。
[0050] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自：表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、 成纖維細(xì)胞（例如，皮膚、角膜、腸粘膜、口腔粘膜、膀胱、尿道、前列腺、肝臟）、上皮細(xì)胞 (例如，角膜、皮膚、角膜；腸粘膜、口腔粘膜、膀胱、尿道、前列腺、肝臟）、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 (neuronal glial cell)或神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞或肝星狀細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、肌細(xì)胞（心肌細(xì)胞 或肌管細(xì)胞）、腎細(xì)胞、血細(xì)胞（例如，CD4+淋巴細(xì)胞、CD8+淋巴細(xì)胞）、胰0-細(xì)胞或內(nèi)皮 細(xì)胞。
[0051] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是肝細(xì)胞。
[0052] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是來源于癌組織的癌細(xì)胞。
[0053] 如本文所用的術(shù)語"癌癥（cancer) "是指具有自主增長能力的細(xì)胞，即以快速增 殖的細(xì)胞生長為特征的異常狀態(tài)或病癥。該術(shù)語意指包括所有類型的癌生長和致癌過程， 轉(zhuǎn)移組織或惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞、組織或器官，而不考慮組織病理學(xué)類型或侵入階段。術(shù)語"癌癥" 包括多種器官系統(tǒng)的惡性腫瘤（例如影響如肺、乳腺、甲狀腺、淋巴、胃腸道和泌尿生殖道 的那些）以及腺癌包括惡性腫瘤，例如最常見的結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌和/或睪丸腫 瘤、非小細(xì)胞肺癌、小腸癌和食道癌。術(shù)語"癌（carcinoma)"是本領(lǐng)域公認(rèn)的并且是指上皮 組織或內(nèi)分泌組織的惡性腫瘤，包括呼吸系統(tǒng)癌、胃腸系統(tǒng)癌、泌尿生殖系統(tǒng)癌、睪丸癌、乳 腺癌、前列腺癌、內(nèi)分