構(gòu)[27]中觀察到的 BC類似。具有任意形態(tài)的BC在微孔中維持功能，這通過CLF測試得到證實(shí)（圖12)。
[0167] 當(dāng)細(xì)胞僅粘附至微孔的側(cè)面時（F/P構(gòu)造），肝細(xì)胞并排定位（圖5C、5D)。BC垂直 形成，跨越大部分細(xì)胞-細(xì)胞接觸區(qū)域，表現(xiàn)出扁平的形態(tài)（2 ym至3 ym厚）。我們的觀察 表明了細(xì)胞ECM粘附的空間結(jié)構(gòu)可控制BC的中尺度形態(tài)。為了證實(shí)細(xì)胞-ECM粘附在獲得 扁平的管狀BC中的重要性，我們在第1天用可溶R⑶肽（250 yM，過夜）處理F/F微孔中 的肝細(xì)胞，所述RGD肽對抗整合素介導(dǎo)的細(xì)胞-ECM細(xì)胞同時保持化學(xué)信號不受干擾。實(shí)際 上，在細(xì)胞與微孔分離時，其BC聚攏成形態(tài)上等于在P/F情況下所觀察到的那些（圖6A)。
[0168] 細(xì)胞-ECM相互作用復(fù)合體與肌動蛋白細(xì)胞骨架密切相關(guān)[28]，并且顯示出 肌動球蛋白收縮性調(diào)節(jié)BC動力學(xué)[29]。因此，我們測試了對于通過細(xì)胞-ECM粘附 的空間結(jié)構(gòu)來差異性控制BC形態(tài)，是否需要肌動球蛋白收縮性。我們發(fā)現(xiàn)，在使用 blebbistatin (100 y M，4小時）或Y27632 (10 y M，4小時）通過多種途徑抑制II型肌球蛋 白活性后，F(xiàn)/F微孔中形成的折疊的BC聚攏。所得形態(tài)類似于在P/F構(gòu)造中所獲得的那些 (圖 6B、6C)。
[0169] 不同條件下的BC形態(tài)通過兩個無量綱參數(shù)來定量評估：折疊程度和垂直縱橫比。 折疊程度r = PV (4 A)通過測量BC投影周長P與投影面積A的比率來評估。該形態(tài)指 數(shù)r范圍為由1(圓）往上（折疊的管狀結(jié)構(gòu)）。垂直縱橫比i如下計(jì)算：BC最大高度除以 XY平面上最大伸長的比率。較高的垂直縱橫比代表BC較厚。
[0170]當(dāng)將折疊程度!相對垂直縱橫比i作圖時（圖6D)，F(xiàn)/F微孔中BC的扁平且管狀 形狀由低的垂直縱橫比和高的折疊程度來反映。相反地，假定P/F微孔、具有可溶RGD的F/ F微孔、具有blebbistatin的F/F微孔或具有Y27632的F/F微孔中BC的垂直縱橫比較高 并且折疊程度較低，特征在于其膨脹的形狀。在藥物處理下，F(xiàn)/F微孔中的BC形態(tài)集合成 明顯與P/F構(gòu)造或F/F構(gòu)造的情況不同的簇。
[0171] 實(shí)施例6
[0172] 物理約束與特定3DECM結(jié)構(gòu)相結(jié)合控制膽小管伸長
[0173] 因?yàn)榧忧虻鞍资湛s性通過細(xì)胞-ECM粘附參與BC形態(tài)的遠(yuǎn)程調(diào)節(jié)，所以我們假 設(shè)BC伸長受已知調(diào)節(jié)肌動球蛋白收縮性的物理約束[30]影響。采用具有不同形狀的微孔 來施加物理約束并調(diào)控肌動球蛋白收縮性。我們在經(jīng)F/F涂覆的等邊三角形微孔（邊線 45 ym)中接種肝細(xì)胞，原因是在頂點(diǎn)附近通過局部肌動球蛋白聚集而產(chǎn)生了肌動球蛋白收 縮性[31]。在接種兩天后，肝細(xì)胞與其BC仍然采用指向三角形頂點(diǎn)方向的3葉苜蓿葉片 形狀堆疊（圖7B(i))。然而，在P/F三角形微孔中沒有形成BC，原因是觀測到很少的雙聯(lián) 體（數(shù)據(jù)未示出）。在微孔邊緣對齊后重疊BC的二進(jìn)制圖像，我們計(jì)算了在三角形微孔內(nèi) 部細(xì)胞-細(xì)胞接觸的給定點(diǎn)發(fā)現(xiàn)BC的概率（圖7B (ii))。此外，還評價了 BC的中心分布和 最遠(yuǎn)點(diǎn)分布（圖7B(ii))。揭示出BC的平均形狀實(shí)際為三葉結(jié)構(gòu)，其各分支朝向三角形微 孔的頂點(diǎn)延伸。作為對照，我們評價了 BC在圓形微孔中的概率圖，其中BC延伸是各向同性 的（圖7A(i))。圓形微孔中最可能的BC形狀是其葉端各向同性分布的圓形（圖7A(ii))。 因此，這些結(jié)果支持物理約束可經(jīng)由肌動球蛋白收縮性來引導(dǎo)BC伸長。
[0174] 同樣地，細(xì)胞-細(xì)胞相互作用可能影響肌動球蛋白收縮性，如細(xì)胞-ECM相互作用
[32]。因此，預(yù)期細(xì)胞-細(xì)胞相互作用影響B(tài)C形態(tài)。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，我們將多個肝細(xì) 胞接種到長形的微孔（F/P)中以改變細(xì)胞-細(xì)胞接觸狀態(tài)。與其他涂層構(gòu)造相比，F(xiàn)/P長 形微孔最佳地確保細(xì)胞自發(fā)容納到具有垂直界面的兩個面對的排中（圖13)?；谖覀冊?類似涂層構(gòu)造中對雙聯(lián)體的觀察預(yù)期扁平的垂直BC具有橫向分支（圖5C)。然而，BC采用 向僅具有較小橫向分支的以長形微孔長軸方向延伸的長管狀結(jié)構(gòu)（圖7C(i))。BC在這些 長形微孔中的概率圖沿微孔長軸聚集在中心（圖7C(ii))。
[0175] 總之，我們的觀測結(jié)果支持這樣的假設(shè)：受物理約束、細(xì)胞-ECM相互作用或細(xì) 胞-細(xì)胞間相互作用影響的肌動球蛋白收縮性可決定中尺度的BC形態(tài)。我們進(jìn)而開發(fā)了 具有細(xì)胞-細(xì)胞/ECM相互作用與物理約束之組合作用的支架生物力學(xué)微環(huán)境來控制BC形 態(tài)。我們使用具有F/P涂層構(gòu)造的交叉長形微孔（30 ym寬以及300 ym長）來模擬肝索。 我們觀察到跨越微孔整個長度的長功能性膽小管（300 y m)(圖8)。僅在F/P涂層構(gòu)造（肝 細(xì)胞弱粘附在基材底部上）中觀察到這種形態(tài)，其中肌動球蛋白收縮性可能水平分布，因 此使BC連接入長形結(jié)構(gòu)中。所形成的管狀網(wǎng)絡(luò)具有與體內(nèi)肝索類似的尺寸和形態(tài)。
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