泌系統(tǒng)癌和黑素瘤。示例性癌包括由宮頸、肺、前列腺、乳腺、頭頸、結(jié) 腸和卵巢的組織形成的那些。術(shù)語"癌"還包括癌肉瘤，例如其包括由癌性組織和肉瘤組織 構(gòu)成的惡性腫瘤。"腺癌"是指來源于腺組織或其中腫瘤細(xì)胞形成可辨識(shí)腺結(jié)構(gòu)的癌。術(shù)語 "肉瘤"是本領(lǐng)域公認(rèn)的并且是指間充質(zhì)衍生的惡性腫瘤。
[0054] 在本發(fā)明的一個(gè)替代優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是干細(xì)胞。
[0055] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞選自：造血干細(xì)胞；神經(jīng)干細(xì)胞；骨 干細(xì)胞；肌肉干細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；上皮干細(xì)胞（來源于器官例如皮膚、胃腸道粘膜、腎、 膀胱、乳腺、子宮、前列腺和內(nèi)分泌腺如垂體）；內(nèi)胚層干細(xì)胞（來源于器官如肝臟、胰腺、肺 和血管）；胚胎干細(xì)胞；胚胎生殖細(xì)胞；胚胎癌干細(xì)胞。
[0056] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述胚胎干細(xì)胞/胚胎生殖細(xì)胞是多能細(xì)胞而 非全能細(xì)胞。
[0057] 在本發(fā)明的一個(gè)替代優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)容器包含飼養(yǎng)細(xì)胞；優(yōu)選成 纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞。
[0058] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞。
[0059] 在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞通過用分離的核酸或表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 進(jìn)行基因修飾以在所述細(xì)胞中重組表達(dá)選定的核酸。
[0060] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸或表達(dá)載體適于表達(dá)報(bào)告多肽。
[0061] 細(xì)胞中啟動(dòng)子活性的分析可常規(guī)地通過將啟動(dòng)子與編碼"報(bào)告"蛋白質(zhì)或多肽的 核酸融合來進(jìn)行監(jiān)測(cè)。實(shí)例在本領(lǐng)域是已知的并且包括酶例如e葡糖醛酸糖苷酶。報(bào)告 分子（即蛋白質(zhì)熒光團(tuán)）在本領(lǐng)域也是公知的。綠色熒光蛋白GFP是從腔腸動(dòng)物（例如太 平洋海蜜;、水母（Aequoria victoria))中分離的自發(fā)焚光蛋白。其作用是通過能量轉(zhuǎn)移將 另一種蛋白質(zhì)（水母發(fā)光蛋白）的藍(lán)色化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)換為綠色熒光。GFP可起蛋白標(biāo)簽的作 用，因?yàn)槠湓试S與各種各樣的蛋白質(zhì)的N末端和C末端融合，其中多數(shù)已示出保留了天然功 能。最常見的是以增強(qiáng)型GFP的形式使用，其中密碼子使用適于人密碼。其他蛋白質(zhì)熒光 團(tuán)包括黃色、紅色和藍(lán)色焚光蛋白。這殘可商購自例如Clontech(www. clontech. com)〇另 一個(gè)實(shí)例是螢火蟲螢光素酶。
[0062] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其包括以下步驟：
[0063] i)提供細(xì)胞培養(yǎng)容器，其包含：
[0064] a)細(xì)胞；
[0065] b)根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基材；
[0066] c)足以支持所述細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基；以及
[0067] ii)提供促進(jìn)所述細(xì)胞之增殖和/或分化和/或功能的細(xì)胞培養(yǎng)條件。
[0068] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選方法中，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞；優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0069] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，例如大鼠 細(xì)胞。
[0070] 在本發(fā)明的一種替代優(yōu)選方法中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人。
[0071 ] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選方法中，所述細(xì)胞是肝細(xì)胞。
[0072] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選方法中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基材懸浮于所述細(xì)胞培養(yǎng)基中并在其 中得到支持。
[0073] 在本發(fā)明的另一種優(yōu)選方法中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基材包含一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)表 面，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)表面不接觸細(xì)胞培養(yǎng)容器表面。
[0074] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了篩選試劑的方法，其中所述試劑影響細(xì)胞的增 殖、分化或功能，所述方法包括以下步驟：
[0075] i)提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含至少一種細(xì)胞和根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基材；
[0076] ii)添加至少一種待測(cè)試的試劑；以及
[0077] iii)監(jiān)測(cè)所述試劑對(duì)于所述細(xì)胞的增殖、分化或功能的活性。
[0078] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選方法中，所述細(xì)胞是肝細(xì)胞。
[0079] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選方法中，所述篩選方法包括以下步驟：整理以上（iii)中的 活性數(shù)據(jù)；將所整理數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為可數(shù)據(jù)分析形式；以及任選地提供所分析數(shù)據(jù)的輸出。
[0080] 許多方法是已知的，其成像并提取關(guān)于細(xì)胞表達(dá)中發(fā)生的時(shí)空變化的信息，例如 熒光蛋白和基因表達(dá)的其他標(biāo)志物，（參見Taylor等Am. Scientist 80:322-335,1992)， 其通過引用并入本文。此外，US5, 989,835和US09, 031,271(兩者均通過引用并入）公開 了用于測(cè)定細(xì)胞中熒光報(bào)告分子的分布或活性的光學(xué)系統(tǒng)，以篩選用于生物活性的大量試 劑。以上專利中公開的系統(tǒng)還描述了用于處理、存儲(chǔ)和顯示所生成數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)化方法。
[0081] 大量試劑的篩選需要制備細(xì)胞陣列用以處理細(xì)胞并施用試劑。測(cè)定裝置例如包括 標(biāo)準(zhǔn)多孔微滴定板（規(guī)格為例如6、12、48、96和384孔），其通常用于與自動(dòng)化加載和自動(dòng) 處理系統(tǒng)兼容。通常，高通量篩選使用試劑與指示劑化合物的均勻混合物，所述指示劑化合 物經(jīng)轉(zhuǎn)化或經(jīng)改性而導(dǎo)致信號(hào)產(chǎn)生。通過合適的方法（例如檢測(cè)熒光發(fā)射、光密度或放射 性）測(cè)量所述信號(hào)，然后整合包含細(xì)胞、基材/試劑和指示劑化合物的各孔的信號(hào)。
[0082] 術(shù)語"試劑"包括任意的小分子、抗體、多肽、肽、適配體、雙鏈或小抑制性RNA。這 些可以是激動(dòng)劑或拮抗劑。小分子拮抗劑包括用于治療疾?。ɡ绨┌Y）的化學(xué)治療劑。
[0083] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了測(cè)試試劑之肝毒性的方法，其包括以下步驟：
[0084] i)提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含至少一種肝細(xì)胞和根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基材；
[0085] ii)添加至少一種待測(cè)試的試劑；以及
[0086] iii)監(jiān)測(cè)所述試劑對(duì)于所述肝細(xì)胞之增殖、分化或功能的活性，將所述活性作為 所述試劑的毒性度量。
[0087] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑是化學(xué)治療劑。
[0088] 在本發(fā)明的一種替代方法中，所述試劑是病毒，例如病毒基因治療載體。
[0089] 貫穿本說明書的描述和權(quán)利要求，詞語"包括"和"包含"以及這些詞語的變體，例 如"含"和"含有"意指"包括但不限于"，并且不旨在（并且不）排除其他部分、添加物、組 分、整體或步驟。"基本上由......組成"意指具有基本整體但是包括不實(shí)質(zhì)影響基本整體 之功能的整體。
[0090] 貫穿本說明書的描述和權(quán)利要求，除非上下文另有要求，否則單數(shù)涵蓋復(fù)數(shù)。特別 地，在使用不定冠詞時(shí)，除非上下文另有要求，否則該說明應(yīng)理解為考慮復(fù)數(shù)以及單數(shù)。
[0091] 除非相互矛盾，否則結(jié)合本發(fā)明的特定方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├枋龅奶匦浴⒄?體、特征、化合物、化學(xué)部分或組都應(yīng)理解為適用于本文所述的任何其他方面、實(shí)施方案或 實(shí)施例。
[0092] 現(xiàn)在僅通過舉例并參照以下附圖來描述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案：
[0093] 圖1 :微孔制造和涂覆方法，（A)微孔制造方法的示意性圖示。使用經(jīng)典的軟光刻 方法制造PDMS模版（步驟1)并放置在扁平的基材上。間隙用UV預(yù)聚物混合物（N0A 64) 通過毛細(xì)作用來填充（步驟2)。在UV固化后，移除模版并在最終將涂覆孔側(cè)面的蛋白質(zhì) 溶液中孵育NOA膜（步驟3至步驟4)。沖洗所述膜、干燥并翻轉(zhuǎn)放置在涂覆有待定位在孔 底部之蛋白質(zhì)的載玻片上（步驟5至步驟7)。普朗尼克酸最終用于鈍化孔的頂部（步驟 8至步驟9)。⑶12mm玻璃底培養(yǎng)皿上微孔膜的圖片（比例尺=Icm)。（C)微孔中肝細(xì)胞 的DIC圖像（比例尺=IOOy m)。（D)微孔的空間結(jié)構(gòu)涂層的共聚焦圖像。使用普朗尼克 酸（P，綠色，Alexa 488)和纖連蛋白（F，紅色，Alexa 561)。X/X指示涂層的側(cè)面/底部順 序。其中X是F或P。（比例尺=5ym);
[0094] 圖2 :A :具有各種不同涂層的圓孔的共聚焦成像（直徑30 ym，高度40 ym)。綠色： BSA-GFP+PEG，紅色：纖連蛋白-Alexa 568。B:接種密度在4X和IOX放大率下的明場(chǎng)圖 像。根據(jù)所述方案以50萬/ml接種肝細(xì)胞并輕輕攪拌；
[0095] 圖3:細(xì)胞存活測(cè)定。所有細(xì)胞存活的微孔隨的分?jǐn)?shù)作為時(shí)間的函數(shù)。所有條件 用聚合物和三種涂層組合兩者表示。在NOA孔中，存活概率幾乎不依賴于涂層組合并且明 顯大于 MyPolyl33 ;
[0096] 圖4 :不同涂層對(duì)肝細(xì)胞雙聯(lián)體形態(tài)和形狀的影響。固定的樣品，肌動(dòng)蛋白為綠色 (鬼筆環(huán)肽Alexa 488)，核藍(lán)（DAPI)并且MrP2為紅色（抗體Alexa 568)。A :粘附在側(cè)面 和底部的肝細(xì)胞雙聯(lián)體呈現(xiàn)具有分支形態(tài)的膽小管（可能是由于由肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維產(chǎn) 生的內(nèi)部張力）。如果僅底部細(xì)胞可粘附至基材，則膽小管繞行。B :如果細(xì)胞僅粘附至側(cè) 面，則膽小管主要垂直地形成，如右側(cè)圖上的z投影所示。該定向?qū)τ谘绣硜碜约?xì)胞質(zhì)之蛋 白質(zhì)的積聚是非常有用的；
[0097] 圖5 :細(xì)胞-ECM粘附的3D結(jié)構(gòu)影響肝細(xì)胞雙聯(lián)體的定向和BC形態(tài)。在（A至C) 中證明了在具有多種涂層（左列）的微孔中培養(yǎng)2天的肝細(xì)胞雙聯(lián)體的3D側(cè)視圖（右列， 綠色，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白；藍(lán)色，核）和Z投影（中間列）。F/F(A，n = 39)和P/F(B，n = 48)中 的雙聯(lián)體主要形成水平的膽小管。在F/P(C，n = 44)中，BC大多數(shù)是垂直的。F/F(A，XY) 中的BC顯示像體內(nèi)的管狀形狀；在P/F(B，XY)中，其擴(kuò)張為球形。白色虛線是用于視覺引 導(dǎo)的虛擬微孔邊界。（比例尺=5 ym) (D)與微孔底部相比，BC定向的定量分析。平行定向 對(duì)應(yīng)于零位偏角（null angle)。（ * *，t-檢驗(yàn)，p <0? 05);
[0098] 圖6 :在F/F微孔中，細(xì)胞-ECM粘附的干擾或肌動(dòng)球蛋白收縮性驅(qū)動(dòng)BC成為球形。 (八）可溶1?〇)(250碰，過夜）、（8)1316131^8七3衍11+/-(100 1^，4小時(shí)）或（〇￥27632(10 1^，4 小時(shí)）的處理將使管狀BC轉(zhuǎn)化為球形BC(藍(lán)色，核；綠色，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白；比例尺=5 ym)。 (D) BC形態(tài)根據(jù)無量綱形態(tài)指數(shù)和垂直縱橫比進(jìn)行分類。與經(jīng)可溶RGD (藍(lán)色三角，n = 39)、 blebbistatin (綠色菱形，n = 44)或Y27632(紫色三角，n = 42)處理的細(xì)胞相比，對(duì)照F/ F孔中的BC(黃色圓圈，n = 35)明顯顯示出更高的折疊程度r以及更扁平的管狀形狀（低 i)。藥物處理導(dǎo)致F/F微孔中的BC形態(tài)與P/F涂層（紅色正方形，n = 37)微孔中的BC形 態(tài)難以區(qū)分；
[0099] 圖7 :與特定3D ECM結(jié)構(gòu)相組合的物理約束通過肌動(dòng)球蛋白收縮性引導(dǎo)BC延長(zhǎng)。 用F-肌動(dòng)蛋白對(duì)典型BC形狀進(jìn)行的染色（i)以及在第二天微孔中具有不同形狀的BC的 概率圖（ii)。BC中心（黑色圓圈）和BC的最遠(yuǎn)頂點(diǎn)（白色三角）相重疊。圓形F/F微孔 (A，n = 35)導(dǎo)致各向同性折疊的BC，而在F/F三角形微孔（B，n = 29)中培養(yǎng)的雙聯(lián)體形 成具有主要朝向三個(gè)頂點(diǎn)突出的分支的BC。BC主要沿著包含約6個(gè)肝細(xì)胞的F/P長(zhǎng)形微 孔（C，n = 46)的長(zhǎng)軸伸長(zhǎng)。應(yīng)注意相對(duì)沒有沿短軸的BC突出。（比例尺=5 ym);
[0100] 圖8 :在具有F/P涂層的交叉長(zhǎng)形微孔中形成的BC的肝索狀網(wǎng)絡(luò)。（A)在第2天 含有約60個(gè)肝細(xì)胞的交叉長(zhǎng)形微孔（各個(gè)交叉長(zhǎng)度為300 ym)內(nèi)肝細(xì)胞的相襯圖像。（B) 在（A)的相同視圖下CLF的熒光圖像。（C)在交叉長(zhǎng)形微孔中形成的膽小管網(wǎng)絡(luò)的免疫染 色圖像。對(duì)F-肌動(dòng)蛋白（綠色）和核（紅色）進(jìn)行染色。應(yīng)注意相對(duì)沒有橫向BC。（D) (C) 的表面渲染圖像。示出了 F-肌動(dòng)蛋白（綠色）和pan-鈣粘蛋白（紅色）。（E)放大 (D) 的一個(gè)分支。（比例尺=30 ym);
[0101] 圖9舉例說明了微孔裝置中肝細(xì)胞的生存力；
[0102] 圖10舉例說明了微孔裝置中膽小管的功能性；
[0103] 圖11舉例說明了微孔裝置中F-肌動(dòng)蛋白和ZO-I的染色；
[0104] 圖12舉例說明了微孔裝置中膽小管的分泌；并且
[0105] 圖13舉例說明了包含不同表面涂層的微孔裝置中膽小管的形態(tài)。
[0106] 材料和方法
[0107] 微孔制i告
[0108] 使用標(biāo)準(zhǔn)軟光刻方法在涂覆有SU8的硅晶片上制造彈性印章（聚二甲基硅氧烷 PDMS)。印章形狀的典型尺寸是高度和寬度均為20 y m至40 y m。
[0109] 1切出具有柱形狀的PDMS塊。不要留下圍繞柱形狀的任意平整表面以使得在下一 步驟中能夠進(jìn)行高效毛細(xì)填充。
[0110] 2將PDMS塊放置在培養(yǎng)皿上，使柱抵靠培養(yǎng)皿的表面。使用尖端來挑取聚合物并 使少許滴落在PDMS的一側(cè)上。聚合物將通過毛細(xì)管效應(yīng)在柱之間流動(dòng)。
[0111] 3打開UV燈并允許燈加熱15分鐘。在柱之間的空間被聚合物填充后，將更多的聚 合物放置在PDMS印章周圍。
[0112] 4如果使用NOA，則使UV光照射PDMS和聚合物20秒，或者如果使用Mypolyl33則 照射5分鐘。用刀從固化聚合物片上剝?nèi)DMS塊。微孔在聚合物膜中形成。
[0113] 5在聚合物片層上添加一滴包含期望涂覆孔內(nèi)側(cè)之試劑的溶液A ;