使用mes和mops作為流動相改性劑從多峰樹脂洗脫生物分子的制作方法
【專利說明】使用MES和MOPS作為流動相改性劑從多峰樹脂洗脫生物分 子
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年10月24日提交的美國申請序列號61/717, 880的優(yōu)先權(quán)，其 通過提述以其整體并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及使用多峰（multimodal)樹脂和包含Good' S緩沖液的洗脫緩沖液來純 化或富集生物分子的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 多峰樹脂（也稱混合模式樹脂）是包含至少兩種不同的基團的層析介質(zhì)，其中所 述基團與靶分子通過至少兩種不同的機制相互作用。例如，多峰離子交換劑攜帶帶電基 團（例如，帶正電的氨基基團、帶正電的季銨基基團、帶負電的羧酸基團、帶負電的磺酸基 團），所述帶電基團可通過電荷-電荷相互作用與靶分子相互作用。這些多峰離子交換劑額 外攜帶其他可與靶分子通過不同作用模式（如疏水相互作用、范德華相互作用、偶極相互 作用、陽離子-π相互作用或氫鍵）進行相互作用的基團。
[0006] EP 2 167 526 Bl描述使用包含含有疏水部分和帶負電部分的配體的多峰樹脂純 化凝血因子VIII。洗脫用包含高濃度的鹽（>1.5Μ)、至少40% (w/v)的乙二醇、丙二醇或其 組合和鈣離子的洗脫緩沖液實施。
[0007] US 2011/0160435 Al描述另一使用多峰樹脂純化凝血因子VIII的工藝。洗脫緩 沖液包含至少一種在PH6至8帶正電的氨基酸。優(yōu)選地，所述氨基酸選自下組：賴氨酸、精 氨酸和組氨酸，且所述氨基酸以高于0. 4M，特別是高于0. 5M的濃度使用。
[0008] US 2011/0166332 Al描述用于從液體蛋白制備物通過將所述制備物與多峰陰離 子交換劑接觸來分離至少一種非聚集蛋白的方法。實驗部分描述使用在20mM Tris、20mM H印es、20mM MES、50mM NaCl中包含IM甘氨酸的洗脫緩沖液及pH9. 0至pH4. 5的線性梯度 分離非聚集IgG。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 在第一方面，本發(fā)明涉及用于純化或富集生物分子的方法，所述方法包括如下步 驟：
[0011] (a)提供包含所述生物分子的水溶液；
[0012] (b)將所述水溶液與多峰樹脂接觸；
[0013] (C)任選地用水性洗滌緩沖液洗滌所述多峰樹脂；
[0014] (d)用水性緩沖溶液從所述多峰樹脂洗脫所述生物分子，其中所述水性緩沖溶 液包含如下、基本上由如下組成或者由如下組成：至少15mM的Good's緩沖液；總濃度為 0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組 氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪 氨酸或纈氨酸中的一種或多種；總濃度為0_400mM的尿素、鹽酸胍、硫氰酸胍、氯化銨、硫酸 銨、磷酸銨、乙酸銨、氯化鈉、檸檬酸鈉、辛酸鈉、磷酸鈉、碘化鈉、氯化鉀、檸檬酸鉀、硫酸鉀、 磷酸鉀、碘化鉀、氯化鎂、硫酸鎂、磷酸鎂、氯化鈣、硫酸鈣、磷酸鈣和?；撬嶂械囊环N或多 種；和O% -60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物；并
[0015] (e)收集包含生物分子的級分，由此獲得純化或富集形式的生物分子。
[0016] 在一個實施方案中，所述水性緩沖溶液包含15mM至2. 5mM的Good's緩沖液，如至 少20mM、50mM、100mM、150mM、200mM或更多的Good's緩沖液。在另一實施方案中，所述水性 緩沖溶液包含10mM-400mM的丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組 氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪 氨酸和纈氨酸中的一種或多種；10mM-400mM的硫氰酸胍、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨、乙酸銨、 氯化鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉、碘化鈉、氯化鉀、檸檬酸鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、碘化鉀、氯化鎂、硫 酸鎂、磷酸鎂、氯化鈣、硫酸鈣、磷酸鈣和?；撬嶂械囊环N或多種；和1%-60% (v/v)的乙二 醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0017] 在一個實施方案中，在水性緩沖液中的所述Good' s緩沖液是MES、M0PS或Tris。
[0018] 第二方面，本發(fā)明涉及通過根據(jù)所述第一方面的方法可獲得的純化的生物分子， 如蛋白。
[0019] 第三方面本發(fā)明涉及制備物，其包含：
[0020] (a)生物分子，和
[0021] (b)水性緩沖溶液，所述水性緩沖溶液包含如下、基本上由如下組成或者由如下組 成：至少15mM的至少一種Good's緩沖液；總濃度為0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、 天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨 酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸中的一種或多種；總濃度為 0-400mM的尿素、鹽酸胍、硫氰酸胍、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨、乙酸銨、氯化鈉、檸檬酸鈉、辛 酸鈉、磷酸鈉、碘化鈉、氯化鉀、檸檬酸鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、碘化鉀、氯化鎂、硫酸鎂、磷酸鎂、 氯化鈣、硫酸鈣、磷酸鈣和?；撬嶂械囊环N或多種；和0%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或 乙二醇和丙二醇的混合物。
[0022] 在一個實施方案中，所述水性緩沖溶液包含15mM至2. 5mM的Good's緩沖液，如至 少20mM、50mM、100mM、150mM、200mM或更多的Good's緩沖液。在另一實施方案中，所述水性 緩沖液包含10mM-400mM的丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨 酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨 酸和纈氨酸中的一種或多種；10mM-400mM的硫氰酸胍、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨、乙酸銨、氯 化鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉、碘化鈉、氯化鉀、檸檬酸鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、碘化鉀、氯化鎂、硫酸 鎂、磷酸鎂、氯化鈣、硫酸鈣、磷酸鈣和?；撬嶂械囊环N或多種；和1%-60% (v/v)的乙二醇 或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0023] 在一個實施方案中，在所述水性緩沖液中的所述Good' s緩沖液是MES、MOPS或 Tris0
[0024] 第四方面，本發(fā)明涉及水性緩沖溶液用于從多峰樹脂解吸生物分子的用途，其中 所述水性緩沖溶液包含如下、基本上由如下組成或者由如下組成：至少15mM的至少一種 Good' s緩沖液；總濃度為0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨 酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲 氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸中的一種或多種；總濃度為0_400mM的尿素、鹽酸 胍、硫氰酸胍、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨、乙酸銨、氯化鈉、檸檬酸鈉、辛酸鈉、磷酸鈉、碘化鈉、 氯化鉀、檸檬酸鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、碘化鉀、氯化鎂、硫酸鎂、磷酸鎂、氯化鈣、硫酸鈣、磷酸 鈣和?；撬嶂械囊环N或多種；和0%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混 合物。
[0025] 例如，在一些實施方案中，所述水性緩沖溶液包含15mM至2. 5mM的Good' s緩沖 液，如至少20mM、50mM、100mM、150mM、200mM或更多的Good' s緩沖液。在另一實施方案中， 所述水性緩沖液包含10mM-400mM的丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色 氨酸、酪氨酸和纈氨酸中的一種或多種；10mM-400mM的硫氰酸胍、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨、 乙酸銨、氯化鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉、碘化鈉、氯化鉀、檸檬酸鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、碘化鉀、氯 化鎂、硫酸鎂、磷酸鎂、氯化鈣、硫酸鈣、磷酸鈣和?；撬嶂械囊环N或多種；和1% -60% (v/ V)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0026] 在一個實施方案中，在所述水性緩沖液中的所述Good' s緩沖液是MES、MOPS或 Tris0
[0027] 第五方面，本發(fā)明涉及水性緩沖溶液用于增加吸附在多峰樹脂上的生物分子回收 率的用途，其通過將（a)其上已吸附所述生物分子的多峰樹脂與（b)水性緩沖溶液接觸， 其中所述水性緩沖溶液包含如下、基本上由如下組成或者由如下組成：至少15mM的至少一 種Good's緩沖液；總濃度為0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷 氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸中的一種或多種；總濃度為0_400mM的尿素、鹽酸 胍、硫氰酸胍、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨、乙酸銨、氯化鈉、檸檬酸鈉、辛酸鈉、磷酸鈉、碘化鈉、 氯化鉀、檸檬酸鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、碘化鉀、氯化鎂、硫酸鎂、磷酸鎂、氯化鈣、硫酸鈣、磷酸 鈣和?；撬嶂械囊环N或多種；和0% -60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的 混合物。例如，所述用于增加吸附在多峰樹脂上的生物分子的回收率的水性緩沖溶液可包 括至少15mM、至少IOOmM或至少200mM的Good' s緩沖液；10mM-400mM的丙氨酸、天冬酰 胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、 苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸中的一種或多種；一種或多種 10mM-400mM的硫氰酸胍、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨、乙酸銨、氯化鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉、碘化 鈉、氯化鉀、檸檬酸鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、碘化鉀、氯化鎂、硫酸鎂、磷酸鎂、氯化鈣、硫酸鈣、磷 酸鈣和牛磺酸；和1% -60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0028] 在一個實施方案中，將包含從所述多峰樹脂回收的生物分子的溶液應(yīng)用于超濾/ 滲濾（UF/DF)、切向流過濾（TFF)、微濾（MF)和疏水相互作用層析（HIC)。在一個實施方案 中，將包含從多峰樹脂回收的生物分子的溶液應(yīng)用于HIC。
[0029] 第六方面，本發(fā)明涉及制品，其包含：
[0030] (a)包裝材料或容器；
[0031] (b)水性緩沖溶液，所述水性緩沖溶液包含如下、基本上由如下組成或者由如下組 成：
[0032] -至少15mM的至少一種Good' s緩沖液；
[0033] -總濃度為0_400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷 氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸；
[0034] -總濃度為0_400mM的尿素、鹽酸胍、硫氰酸胍、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨、乙酸銨、 氯化鈉、檸檬酸鈉、辛酸鈉、磷酸鈉、碘化鈉、氯化鉀、檸檬酸鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、碘化鉀、氯 化鎂、硫酸鎂、磷酸鎂、氯化鈣、硫酸鈣、磷酸鈣和?；撬?；和
[0035] _0%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物；和
[0036] (C)包含用于實施根據(jù)第一方面的方法的說明的數(shù)據(jù)載體。
[0037] 在一個實施方案中，在所述制品中的水性緩沖溶液包括至少15mM、至少IOOmM或 至少200mM的Good' s緩沖液；10mM-400mM的丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷 氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸中的一種或多種；10mM-400mM的硫氰酸胍、氯化銨、硫酸 銨、磷酸銨、乙酸銨、氯化鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉、碘化鈉、氯化鉀、檸檬酸鉀、硫酸鉀、磷酸 鉀、碘化鉀、氯化鎂、硫酸鎂、磷酸鎂、氯化鈣、硫酸鈣、磷酸鈣和牛磺酸中的一種或多種；和 1%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0038] 其他特征和優(yōu)勢將從附圖和說明書以及從權(quán)利要求顯而易見。
[0039] 圖簡述
[0040] 圖1是由包含MES和精氨酸的洗脫緩沖液從多峰層析樹脂Capto? Adhere (GE Healthcare)解吸阿加糖酶β的實驗的產(chǎn)率的等高線圖。等高線圖是對于6. 25的pH值計 算。
[0041] 圖2是由包含MOPS和精氨酸的洗脫緩沖液從多峰層析樹脂Capto? A