以離子液體為反應介質的未變性膠原基生物表面活性劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了以離子液體為反應介質的未變性膠原基生物表面活性劑及其制備方法，其特點是將1重量份冷凍干燥的未變性天然膠原溶于50～300重量份的離子液體中，加入以5～15重量份有機溶劑溶解的0.03～0.3重量份的長鏈疏水羰基化合物，4～10℃冰浴下反應6～10h，反應結束后用酸調節(jié)pH至9～10，再緩慢加入以5～15重量份有機溶劑溶解的0.1～0.5重量份的短鏈二元酸酐，同時用堿將pH穩(wěn)定在9～10，4～10℃冰浴下反應3～5h，反應結束后用酸調節(jié)pH至出現沉淀為止，沉淀物用酸調節(jié)pH＝4.2～4.6的去離子水洗滌3～5次，獲得疏水長鏈接枝率高、表面活性良好且中性水溶的未變性膠原基生物表面活性劑。
【專利說明】
以離子液體為反應介質的未變性膠原基生物表面活性劑及其 制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及以離子液體為反應介質的未變性膠原基生物表面活性劑及其制備方 法，屬于美容化妝品和生物醫(yī)藥領域。 技術背景
[0002] 膠原（collagen)作為細胞外基質的主要成分，是一種廣泛分布于動物有機體皮 膚、骨骼、肌腱等組織的結構蛋白，起支撐器官和保護機體的作用，約占所有脊椎動物機體 蛋白質的三分之一。膠原的相對分子質量為30萬，具有典型的三股螺旋結構，其獨特的分子 結構賦予其許多優(yōu)異的生物學性能，如低抗原性、生物降解性和良好的生物相容性等，常應 用于生物醫(yī)藥、功能保健和化妝品領域。
[0003] 生物表面活性劑(Biosurfactant)是來源于動物或植物等集親水基和疏水基結構 于一體的具有一定表面活性的物質。與傳統(tǒng)化學合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑 具有更強的表面活性、生物降解性和良好的生物相容性等特點，在工業(yè)生產中具有廣泛的 潛在的應用價值，正成為最新的研究熱點。而膠原不僅具有優(yōu)異的生物學性能，且類似于生 物表面活性劑，是一種同時含有親水和疏水氨基酸殘基的生物大分子。但是，由于膠原分子 量較大以及相對少且短的疏水基團和親水基團，導致天然膠原的表面活性較低，因此欲發(fā) 揮膠原獨特的生物學性能制備生物表面活性劑需通過化學改性來實現。目前，國內外基于 天然膠原制備生物表面活性劑的研究較少，僅有研究者鄧茹等采用月桂酸酐(鄧茹、李國英 《基于未變性膠原生物表面活性劑的性能研究》）、李從虎等采用月桂酰氯(李從虎、劉文濤、 田振華、段煉、李國英《未變性膠原生物表面活性劑的表面張力及其表面吸附》）以及梁育松 等采用月桂醛(梁育松、劉文濤、李國英《一種保留膠原天然結構的新型生物表面活性劑的 性能表征》)作為疏水長鏈修飾天然膠原，同時輔以親水短鏈琥珀酸酐賦予膠原水溶性，得 到了具有一定表面活性的未變性膠原基生物表面活性劑，其表面張力分別為54.5mN/m、 55.92mN/m和50.5mN/m。由于鏈長及反應介質的影響，疏水長鏈較親水短鏈更不易接枝成 功，從而使得疏水長鏈的接枝率成為影響未變性膠原基生物表面活性劑表面張力大小的關 鍵因素。前期，研究者主要通過探索疏水長鏈的種類以及疏水長鏈與親水短鏈的比例來降 低未變性膠原基生物表面活性劑的表面張力，初步探索了疏水長鏈的可選類別，并發(fā)現當 疏水長鏈與親水短鏈的接枝率之比接近1:1時得到的未變性膠原基生物表面活性劑的表面 張力最低、表面活性最好，為未變性膠原基生物表面活性劑的進一步研究奠定了基礎。但由 于前期膠原與疏水長鏈均是在有機溶劑中以固液反應的形式接觸反應，分散不均且反應效 率較低，具有一定的局限性，使得疏水長鏈的接枝率一直低于38%，從而導致未變性膠原基 生物表面活性劑的表面張力仍未達到理想要求，因此提高疏水長鏈的接枝率是降低未變性 膠原基生物表面活性劑表面張力的關鍵。所以，尋求一種可使膠原與疏水長鏈既穩(wěn)定存在 又分散均勻的適當反應介質以提高疏水長鏈的接枝率成為必需。
[0004] 尚子液體（ionic liquids)是一種恪融鹽，由分子量大的有機陽尚子和分子量小 的無機陰離子組成，具有高度的可調節(jié)性、與水和有機溶劑可充分混溶、幾乎無蒸汽壓、離 子導電性高、耐燃且催化性能顯著，被稱為"綠色溶劑"。由于其陰陽離子的可調節(jié)性好，特 別是在蛋白質方面易產生預期的效果，而又被稱為"需求特定"或"量體裁衣"型溶劑。離子 液體在蛋白質組學中被研究最多的有機陽離子為咪唑類、季銨類、雜環(huán)芳香族類和吡咯烷 鑰鹽類，并結合多種陰離子如(^』^、1'，％]、，?幻、[01 30)0-]，形成一種廣泛的溶劑。 本發(fā)明是利用離子液體高度可調節(jié)的性質，使膠原與疏水長鏈均勻穩(wěn)定的分散在同一體系 中發(fā)生液液反應以提高反應效率，增加疏水長鏈的接枝率，從而降低未變性膠原基生物表 面活性劑的表面張力。由固液反應到液液反應的改變以及通過調節(jié)疏水長鏈與親水短鏈的 比例，可使疏水長鏈的接枝率提高并控制在45 %~50%，并使疏水長鏈與親水短鏈的接枝 率之比接近1:1，從而使其表面張力降低至40mN/m以下。該發(fā)明制得的未變性膠原基生物表 面活性劑，一方面保留了膠原的三股螺旋結構，也就完整保留了膠原的生物學性能；另一方 面其接枝率與表面活性的大幅度提升使其具有良好的表面活性和中性水溶性，拓寬了膠原 在日用品、化妝品、保健品以及生物醫(yī)用材料領域的應用范圍。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現有技術的不足提供以離子液體為反應介質的未變性膠原 基生物表面活性劑及其制備方法，其特點是以離子液體為反應介質并用長鏈疏水羰基化合 物、短鏈二元酸酐與未變性天然膠原進行接枝反應，提高了疏水長鏈的接枝率，所得到的未 變性膠原基生物表面活性劑的表面張力更低、表面活性更好。
[0006] 本發(fā)明的目的由以下技術實現，其中所述原料份數除特殊說明外，均為重量份數。
[0007] 以離子液體為反應介質的未變性膠原基生物表面活性劑包括以下原料組分： 未變性天然膠原 1份 離子液體 50~300份
[0008] 長鏈疏水羰基化合物 0.03~0.3份 短鏈二元酸酐 0.1-0.5份 有機溶劑 10-30份
[0009] 所述未變性天然膠原為牛皮膠原、豬皮膠原或魚皮膠原中的任一種。
[0010] 所述離子液體為1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸鹽、1-丁基-3甲基咪唑氯鹽或磷酸二氫膽堿鹽中的任一種。
[0011] 所述長鏈疏水羰基化合物為辛酸酐、正辛醛、壬酸酐、肉桂醛、正十一醛、月桂酸 酐、月桂酰氯、月桂醛、肉豆蔻酸酐、肉豆蔻醛、棕櫚酸酐、棕櫚醛、硬脂酸酐、硬脂醛或C8~ Cl8的羰基化合物中的任一種。；
[0012]所述短鏈二元酸酐為丙二酸酐、丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、庚二酸酐或C2~C8 的二元酸酐中的任一種。
[0013]所述有機溶劑為丙酮、乙醇、聚乙二醇、乙醚、苯甲醚、1-丙醇、2-丙醇、異辛烷、 異丙醚、甲基異丙酮、二甲基亞砜、甲基四氫呋喃或石油醚中的任一種。
[0014]以離子液體為反應介質的未變性膠原基生物表面活性劑的制備方法包括以下步 驟：
[0015] (1)將1重量份冷凍干燥的未變性天然膠原溶于50~300重量份的離子液體中，加 入以5~15重量份有機溶劑溶解的0.03~0.3重量份的長鏈疏水羰基化合物，4~10°C冰浴 下反應6~10h，反應結束后用酸調節(jié)pH至9~10,再緩慢加入以5~15重量份有機溶劑溶解 的0.1~0.5重量份的短鏈二元酸酐，同時用堿將pH穩(wěn)定在9~10，4~10 °C冰浴下反應3~ 5h;
[0016] (2)反應結束后用酸調節(jié)pH至出現沉淀為止，沉淀物用酸調節(jié)pH = 4.2~4.6的去 離子水洗滌3~5次，獲得所需表面活性良好的未變性膠原基生物表面活性劑。
[0017] 性能測試：
[0018] 1. SDS-PAGE 電泳測定
[0019] SDS-PAGE電泳法(十二烷基硫酸鈉 一聚丙烯酰胺凝膠電泳法)測得未變性膠原基 生物表面活性劑的分子量分別為α鏈10萬、β鏈20萬、γ鏈30萬，詳見圖1所示。結果表明所得 未變性膠原基生物表面活性劑保留了膠原的三股螺旋結構，也就完整保留了膠原的生物活 性。
[0020] 2.接枝率測定
[0021 ]將長鏈疏水羰基化合物接枝改性的初步樣品溶液(0.15mL)與磷酸鹽緩沖液(ρΗ = 10.0，1.2mL)和現配0.1 %的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)溶液（1.2mL)混合，在50 °C下水浴 避光反應60min，然后加入2.4mL0. lmol/L的HC1，在室溫下反應30min，用紫外分光光度儀在 340nm處測定混合液的吸光度，并用甘氨酸作標準曲線，以天然膠原作為對照。所有樣品測 定3次并取平均值。
[0023]所得未變性膠原基生物表面活性劑疏水長鏈的接枝率穩(wěn)定在45%~50%。
[0024] 3.表面張力測定
[0025] 將未變性膠原基生物表面活性劑海綿溶解至蒸餾水中制備5mg/mL的母液，并稀釋 至一系列濃度作為樣品待測液，將天然膠原溶解在0. lmol/L醋酸中作對照。用表面張力儀 0CA-H200采用懸滴法測定樣品的表面張力，實驗前用蒸餾水多次清洗針管和針頭，并以蒸 餾水校準表面張力儀。測樣品前，先用待測液多次潤洗針管和針頭。測試中選擇最佳液體擠 出體積，確保液滴處于臨界點，測試溫度為常溫。所得未變性膠原基生物表面活性劑的表面 張力小于40mN/m。
[0026] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0027] 1.本發(fā)明得到的未變性膠原基生物表面活性劑保留了膠原的三股螺旋結構，也就 完整保留了膠原的生物學性能。
[0028] 2.本發(fā)明得到的未變性膠原基生物表面活性劑，以離子液體為反應介質，擴展了 疏水長鏈的可選范圍，提高了疏水長鏈的接枝率，所得到的未變性膠原基生物表面活性劑 的表面張力更低、表面活性更好，拓寬了其在日用品、化妝品、保健品以及生物醫(yī)用材料領 域的應用范圍。
[0029] 3.本發(fā)明得到的未變性膠原基生物表面活性劑，通過調節(jié)疏水長鏈羰基化合物與 親水短鏈二元酸酐的反應摩爾比使其接枝率之比接近1:1，達到丁提高和調控其表面活性 的目的。
【附圖說明】
[0030] 圖1為未變性膠原基生物表面活性劑的SDS-PAGE電泳(十二烷基硫酸鈉一聚丙烯 酰胺凝膠電泳)分析圖，1為Marker，2為天然膠原，3為未變性膠原基生物表面活性劑。
【具體實施方式】
[0031] 下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對 本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員可 以根據上述發(fā)明的內容作出一些非本質的改進和調整。
[0032] 實施例1
[0033]取冷凍干燥的未變性天然牛皮膠原O.lg于50mL玻璃燒杯中剪碎，并加入5g 1-乙 基-3-甲基咪唑醋酸鹽離子液體，持續(xù)攪拌5h以充分溶解，然后加入以l.OmL二甲基亞砜溶 解的0.003g的月桂醛，4°C冰浴下反應10h，反應結束后用HC1調節(jié)pH至9，再緩慢加入以 0.5mL二甲基亞砜溶解的0.01 g的丁二酸酐，同時用NaOH將pH穩(wěn)定在9，4°C冰浴下反應5h，反 應結束后加 HC1直至出現沉淀為止，離心后沉淀物用HC1調節(jié)pH=4.2~4.6的去離子水洗滌 5次，獲得以1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽離子液體為反應介質月桂醛和丁二酸酐接枝改性的 未變性膠原基生物表面活性劑。
[0034] 用甘氨酸作標準曲線，并以天然膠原作對照，紫外分光光度儀340nm處測定混合液 的吸光度，計算可得接枝率為48.7 % ;以5mg/mL未變性膠原基生物表面活性劑溶液為母液， 稀釋至一系列濃度作為樣品待測液，并以天然膠原作對照，用表面張力儀0CA-H200采用懸 滴法測定樣品的表面張力，得到未變性膠原基生物表面活性劑的表面張力為37.59mN/m。
[0035] 實施例2
[0036]取冷凍干燥的未變性天然豬皮膠原0. lg于50mL玻璃燒杯中剪碎，并加入20g 1-丁 基-3-甲基咪唑醋酸鹽離子液體，持續(xù)攪拌5h以充分溶解，然后加入以l.OmL丙酮溶解的 〇. 〇lg的月桂酰氯，6°C冰浴下反應10h，反應結束后用HC1調節(jié)pH至9.5，再緩慢加入以1. OmL 丙酮溶解的〇.〇3g的丙二酸酐，同時用NaOH將pH穩(wěn)定在9.5，6°C冰浴下反應5h，反應結束后 加 HC1直至出現沉淀為止，離心后沉淀物用HC1調節(jié)pH=4.2~4.6的去離子水洗滌5次，獲得 以1-丁基-3-甲基咪唑醋酸鹽離子液體為反應介質月桂酰氯和丙二酸酐接枝改性的未變性 膠原基生物表面活性劑。
[0037] 用甘氨酸作標準曲線，并以天然膠原作對照，紫外分光光度儀340nm處測定混合液 的吸光度，計算可得接枝率為50 % ;以5mg/mL未變性膠原基生物表面活性劑溶液為母液，稀 釋至一系列濃度作為樣品待測液，并以天然膠原作對照，用表面張力儀0CA-H200采用懸滴 法測定樣品的表面張力，得到未變性膠原基生物表面活性劑的表面張力為36.27mN/m。
[0038] 實施例3
[0039]取冷凍干燥的未變性天然魚皮膠原0. lg于50mL玻璃燒杯中剪碎，并加入30g磷酸 二氫膽堿鹽離子液體，持續(xù)攪拌5h以充分溶解，然后加入以0.5mL乙醚溶解的0.03g的肉豆 蔻酸酐，10°C冰浴下反應10h，反應結束后用HC1調節(jié)pH至9，再緩慢加入以1.5mL乙醚溶解的 〇. 〇5g的戊二酸酐，同時用NaOH將pH穩(wěn)定在9，10°C冰浴下反應5h，反應結束后加 HC1直至出 現沉淀為止，離心后沉淀物用HC1調節(jié)pH=4.2~4.6的去離子水洗滌5次，獲得以磷酸二氫 膽堿鹽離子液體為反應介質肉豆蔻酸酐和戊二酸酐接枝改性的未變性膠原基生物表面活 性劑。
[0040]用甘氨酸作標準曲線，并以天然膠原作對照，紫外分光光度儀340nm處測定混合液 的吸光度，計算可得接枝率為45 % ;以5mg/mL未變性膠原基生物表面活性劑溶液為母液，稀 釋至一系列濃度作為樣品待測液，并以天然膠原作對照，用表面張力儀0CA-H200采用懸滴 法測定樣品的表面張力，得到未變性膠原基生物表面活性劑的表面張力為39.36mN/m。
[0041 ] 應用實例1
[0042]制備作為藥物丁卡因吸附載體的未變性膠原基生物表面活性劑微乳 [0043]將實施例1中冷凍干燥的未變性膠原基生物表面活性劑溶于0.01m〇l/L的PBS (pH7.4)中制備7.5mg/mL的溶液。將25g液體石蠟和lg司盤20混合均勻后，加入8.5g上述制 備的未變性膠原基生物表面活性劑溶液，2000rmp攪拌20min。而后加入30mL丙酮，7900rmp 冷凍離心10min，取沉淀，去離子水分散均勻后冷凍干燥，得未變性膠原基生物表面活性劑 微乳。將上述微乳置于去離子水中制備5mg/mL的懸浮液，并加入1.5mg/mL的丁卡因，20°C下 振搖5h，用0.45μπι濾膜過濾并用去離子水洗滌沉淀，收集沉淀冷凍干燥，測定丁卡因的緩釋 性能。顯微觀察所制未變性膠原基生物表面活性劑微乳的粒度很小，形成微乳的能力很強。 所制未變性膠原基生物表面活性劑微乳對丁卡因的飽和吸附量為22.13%，5h后釋放達平 衡，釋放量為65.36 %。
[0044] 應用實例2
[0045] 制備未變性膠原基生物表面活性劑乳液
[0046]將實施例2中冷凍干燥的未變性膠原基生物表面活性劑溶解于0.01m〇l/L的PBS (pH7 · 4)中制備0 · 4mg/mL的溶液。取20mL該溶液與2mL植物油混合均勻，2000rmp攪拌10min， 得到未變性膠原基生物表面活性劑乳液。所制未變性膠原基生物表面活性劑乳液為ο/w型 乳液，乳化活性ΕΑΙο為312.05m 2/g，乳化活性EAI1Q為275.16m2/g，乳化穩(wěn)定性ESI為 88.39min〇
【主權項】
1. W離子液體為反應介質的未變性膠原基生物表面活性劑，其特征在于該表面活性劑 由W下原料組分組成，按重量份計為： 未變性天然膠原 1份 離子液體 紳~300份 長鏈疏水鑛基化合物 0.03~0.3份 短鏈二元酸巧 0.]~0.5份 有機溶劑 10~30份。2. 如權利要求1所述W離子液體為反應介質的未變性膠原基生物表面活性劑，其特征 在于未變性天然膠原為牛皮膠原、豬皮膠原或魚皮膠原中的任一種。3. 如權利要求1所述W離子液體為反應介質的未變性膠原基生物表面活性劑，其特征 在于離子液體為1-乙基-3-甲基咪挫醋酸鹽、1-下基-3-甲基咪挫醋酸鹽、1-下基-3甲基咪 挫氯鹽或憐酸二氨膽堿鹽中的任一種。4. 如權利要求1所述W離子液體為反應介質的未變性膠原基生物表面活性劑，其特征 在于長鏈疏水幾基化合物為辛酸酢、正辛醒、壬酸酢、肉桂醒、正十一醒、月桂酸酢、月桂酷 氯、月桂醒、肉豆違酸酢、肉豆違醒、棟桐酸酢、棟桐醒、硬脂酸酢、硬脂醒或C8~Cl8的幾基化 合物中的任一種。5. 如權利要求1所述W離子液體為反應介質的未變性膠原基生物表面活性劑，其特征 在于短鏈二元酸酢為丙二酸酢、下二酸酢、戊二酸酢、己二酸酢、庚二酸酢或C2~C8的二元酸 酢中的任一種。6. 如權利要求1所述W離子液體為反應介質的未變性膠原基生物表面活性劑，其特征 在于有機溶劑為丙酬、乙醇、聚乙二醇、乙酸、苯甲酸、1-丙醇、2-丙醇、異辛燒、異丙酸、甲 基異丙酬、二甲基亞諷、甲基四氨巧喃或石油酸中的任一種。7. 如權利要求1~6之一所述W離子液體為反應介質的未變性膠原基生物表面活性劑 的制備方法，其特征在于該方法包括W下步驟： (1) 將1重量份冷凍干燥的未變性天然膠原溶于50~300重量份的離子液體中，加入W5 ~15重量份有機溶劑溶解的0.03~0.3重量份的長鏈疏水幾基化合物，4~10°C冰浴下反 應6~lOh，反應結束后用酸調節(jié)抑至9~10,再緩慢加入W5~15重量份有機溶劑溶解的0.1 ~0.5重量份的短鏈二元酸酢，同時用堿將pH穩(wěn)定在9~10,4~10 °C冰浴下反應3~化； (2) 反應結束后用酸調節(jié)pH至出現沉淀為止，沉淀物用酸調節(jié)pH = 4.2~4.6的去離子 水洗涂3~5次，獲得所需表面活性良好的未變性膠原基生物表面活性劑。8. 如權利要求1所述W離子液體為反應介質的未變性膠原基生物表面活性劑，其特征 在于未變性膠原基生物表面活性劑用于日用品、化妝品、保健品和生物醫(yī)用材料領域。
【文檔編號】A61K47/42GK106076193SQ201610409463
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】李國英, 李倩, 劉文濤
【申請人】四川大學