選擇性功能化的納米流體生物傳感器中的生物分子的快速定量及其方法
【專利摘要】本發(fā)明要求保護(hù)用于快速定量納米通道(210)中存在的生物分子(320)的方法和設(shè)備。具體地，本發(fā)明涉及納米通道中的液體驅(qū)動(dòng)和選擇性功能化表面的新構(gòu)思，其形成短暫固定化的生物分子(340)跨所述納米通道的濃度梯度。此構(gòu)思使得對目的生物分子相互作用(320)的定量成為可能。
【專利說明】選擇性功能化的納米流體生物傳感器中的生物分子的快速定量及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及使用光學(xué)系統(tǒng)檢測選擇性功能化的納米流體生物傳感器中的熒光標(biāo)記的生物分子的方法和設(shè)備。本發(fā)明可以有利地用于生物醫(yī)學(xué)樣品和生物樣品的快速定量。
【背景技術(shù)】
[0002]納米流體生物傳感器被定義為具有納米尺寸限制件(confinement)和/或側(cè)孔的流體系統(tǒng)，其用于定量溶液中生物分子的存在。目前對納米流體生物傳感器的開發(fā)大多數(shù)意圖用于生物工程和生物技術(shù)應(yīng)用。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，生物傳感器用于定量溶液中生物分子的存在，以用于體外診斷應(yīng)用。
[0003]瑞士專利申請CH 01824/09公開了具有側(cè)孔的生物傳感器，其用于檢測生物分子相互作用，PCT申請IB2010/050867公開了其與簡單光學(xué)系統(tǒng)的應(yīng)用。生物分子在這些構(gòu)造中的擴(kuò)散是緩慢的，需要長的等待時(shí)間以獲得穩(wěn)定的測量條件，或需要高度濃縮的溶液用于觀察生物分子相互作用。
[0004]生物標(biāo)志物，也稱為生物學(xué)標(biāo)志物，是用作用于檢測生物分子的存在的特異性指標(biāo)的物質(zhì)。其特征在于作為生物學(xué)過程、發(fā)病過程或?qū)χ委熜愿深A(yù)的藥理學(xué)反應(yīng)的指標(biāo)被客觀測量和評估。
[0005]目前對特異性生物分子的檢測的實(shí)踐可以分為兩類:(a)標(biāo)記技術(shù)和(b)無標(biāo)記技術(shù)。
[0006]在標(biāo)記技術(shù)中，廣泛使用的是熒光、比色法、放射性、磷光、生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光。功能化磁珠也可以被認(rèn)為是標(biāo)記技術(shù)。標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是比無標(biāo)記法靈敏以及歸因于特異性標(biāo)記的分子識別。
[0007]在無標(biāo)記技術(shù)中，廣泛使用的是電化學(xué)生物傳感器，涉及電流型傳感器、電容型傳感器、電導(dǎo)型傳感器或阻抗型傳感器，其優(yōu)點(diǎn)是快速和廉價(jià)。當(dāng)生物分子陷入或固定化在電極上或附近時(shí)，它們測量電極結(jié)構(gòu)的電性能的改變，但所有這些構(gòu)思缺乏分子特異性對比度、靈敏度和可靠度。
[0008]酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是一種重要的生物化學(xué)技術(shù)，其主要用來檢測血清中可溶性生物分子的存在，因此被廣泛用作醫(yī)學(xué)中的診斷工具和多個(gè)行業(yè)中的質(zhì)量控制檢驗(yàn)。然而ELISA分析是昂貴的，要求大量的溶液并且是耗時(shí)的。
[0009]用于生物分子診斷學(xué)的其他重要技術(shù)是Western和Northern印跡、蛋白電泳和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。然而，這些方法要求高度濃縮的分析物并且不允許高通量樣品測試。
[0010]目的
[0011]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供廉價(jià)的和快速的納米流體生物傳感器，其不要求復(fù)雜的操作。
[0012]本發(fā)明的另一目的是使用納米流體從幾何學(xué)上限制光學(xué)測量空間，并且選擇性地功能化納米通道表面，以獲得生物傳感器的高靈敏度。
[0013]本發(fā)明的又另一目的是通過迫使形成貫穿納米尺寸限制件(納米通道)的對流，以增加生物分子與固定化的生物標(biāo)志物相互作用的概率，從而增加檢測的靈敏度。
[0014]參照下面的附圖以及優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的這些和其他目的將變得越來越明顯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明基于下面的發(fā)現(xiàn):迫使生物分子進(jìn)入具有選擇性功能化表面的納米尺寸限制件，會(huì)強(qiáng)烈地增加生物分子與固定化的生物標(biāo)志物相互作用的概率。這允許對超低濃度的熒光標(biāo)記的生物分子的存在進(jìn)行定量。
[0016]本發(fā)明還基于下面的發(fā)現(xiàn):監(jiān)控與生物分子連接的熒光團(tuán)的光漂白可以用來區(qū)分已經(jīng)與生物標(biāo)志物相互作用并且被固定化在納米通道中的生物分子與只是擴(kuò)散通過檢測空間的那些生物分子。
[0017]此外，本發(fā)明強(qiáng)調(diào)使用驅(qū)動(dòng)組件來迫使待分析的溶液通過納米通道對流的概率。
[0018]在本文中，術(shù)語“驅(qū)動(dòng)組件”必須要被理解為能夠用于促進(jìn)溶液流動(dòng)通過納米通道的任何元件，例如，吸收元件。
[0019]在本發(fā)明的范圍內(nèi)，使用納米流體，因?yàn)槠渚哂懈叩谋砻骟w積比，這意味著包含在檢測空間中的表面使得生物分子與表面上固定化的生物標(biāo)志物之間的相互作用的概率最大化。由于位于檢測空間內(nèi)的小部分基底，其也強(qiáng)烈地減少了溶液的背景信號。
[0020]本發(fā)明因此涉及如權(quán)利要求中所限定的生物傳感器。
[0021]本發(fā)明還涉及使用所述生物傳感器的組合件和方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1a是含有納米流體生物傳感器200的陣列的密封容器系統(tǒng)101的立體圖。含有熒光標(biāo)記的生物分子的溶液300通過移液管系統(tǒng)400被放置在密封容器101內(nèi)?；诩す馐?10的光學(xué)系統(tǒng)500用于測量。
[0023]圖1b是含有納米流體生物傳感器200的陣列的表面102的立體圖。含有熒光標(biāo)記的生物分子的溶液300通過移液管系統(tǒng)400被放置在表面102上。基于激光束510的光學(xué)系統(tǒng)500用于測量。
[0024]圖2a顯示由兩個(gè)基底201和202所限定的納米流體生物傳感器的橫截面，這兩個(gè)基底的局部結(jié)構(gòu)由區(qū)域211和另一區(qū)域203構(gòu)成，區(qū)域211被生物標(biāo)志物310功能化，區(qū)域203阻止該功能化。含有生物分子的試劑溶液300進(jìn)入納米通道210并且由外部驅(qū)動(dòng)組件241驅(qū)動(dòng)。激光束510監(jiān)測檢測空間520中的固定化的生物分子340的光漂白。
[0025]圖2b顯示由兩個(gè)基底201和202所限定的納米流體生物傳感器的橫截面。僅一個(gè)基底的局部結(jié)構(gòu)由區(qū)域211和另一區(qū)域203構(gòu)成，區(qū)域211被生物標(biāo)志物310功能化，區(qū)域203阻止該功能化。含有生物分子的試劑溶液300進(jìn)入納米通道210并且由內(nèi)部驅(qū)動(dòng)組件242驅(qū)動(dòng)。激光束510監(jiān)測檢測空間520中的固定化的生物分子340的光漂白。
[0026]圖3圖示在納米通道長度上特異性生物分子的濃度隨時(shí)間的變化。
[0027]圖4顯示在納米通道長度上特異性生物分子在給定時(shí)間L的濃度分布曲線。標(biāo)記的區(qū)域代表特異性生物分子的檢測部分。
[0028]圖5圖示在納米通道長度上非特異性生物分子(背景)的濃度隨時(shí)間的變化。
[0029]圖6顯示在納米通道長度上非特異性生物分子在給定時(shí)間h的濃度分布曲線。標(biāo)記的區(qū)域代表特異性生物分子的檢測部分，對應(yīng)于背景噪聲。
[0030]圖7圖示與固定化的特異性生物分子連接的熒光團(tuán)的標(biāo)準(zhǔn)光漂白曲線。
[0031]圖8圖示納米通道內(nèi)部非特異性生物分子隨時(shí)間變化的熒光強(qiáng)度曲線，顯示僅檢測到背景噪聲。
[0032]圖9顯示納米通道內(nèi)隨時(shí)間變化的溶液流速。
【具體實(shí)施方式】
[0033]當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語“生物分子”意指是通稱，其包括例如(但不限于)蛋白諸如抗體或細(xì)胞因子、肽、核酸、脂質(zhì)分子、多糖和病毒。
[0034]當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語“納米通道”意指是通稱，其意思是具有至少一個(gè)納米尺寸維度的清楚界定的微制結(jié)構(gòu)。納米通道的納米尺寸維度被限定為大于2nm，因?yàn)榇龣z測的最小生物分子的尺寸必須進(jìn)入狹縫并處于相同數(shù)量級。本發(fā)明限于高度小于I微米的納米通道，因?yàn)楣鈱W(xué)系統(tǒng)的檢測空間的范圍通常處于相同數(shù)量級。
[0035]本發(fā)明旨在通過歸因于對功能化表面的限制而增加與特異性生物標(biāo)志物的相互作用的概率來增強(qiáng)對生物分子的檢測。如在圖1a和圖1b中所示，納米流體生物傳感器200的陣列被固定化在密封容器系統(tǒng)101中或表面102上。含有熒光標(biāo)記的目的生物分子的混合溶液300通過移液管系統(tǒng)400被放置在密封容器101內(nèi)或表面102上。密封容器101可以被氣密性密封以避免污染。最后，將光學(xué)裝置500用來通過將激光束510聚焦在生物傳感器納米通道內(nèi)部來測量生物傳感器200內(nèi)部的生物分子相互作用。
[0036]圖2a和圖2b圖示出本發(fā)明生物傳感器的檢測原理和橫截面。該系統(tǒng)包含將輸入側(cè)口 220與輸出側(cè)口 230連接在一起的納米通道210?？梢允峭獠康?241)或內(nèi)部的(242)驅(qū)動(dòng)組件位于輸出側(cè)口 230附近。首先，生物標(biāo)志物310被固定化在基底201和202的一個(gè)或兩個(gè)的選擇性功能化的納米通道表面上。其他納米通道表面和側(cè)口表面可以通過放置非功能化層203而被保護(hù)。檢測空間520必須集中在納米通道210內(nèi)，諸如由納米通道210的空間所限定的相交空間，并且檢測空間520是最大的，并且緊靠輸入側(cè)口 220。下一步，將含有熒光標(biāo)記的特異性生物分子320和非特異性生物分子330的溶液300通過毛細(xì)管作用從輸入側(cè)口 220填充至系統(tǒng)中。當(dāng)?shù)竭_(dá)驅(qū)動(dòng)組件241或242時(shí)，溶液300通過例如吸收填充驅(qū)動(dòng)組件，導(dǎo)致形成貫穿生物傳感器的強(qiáng)制對流。當(dāng)驅(qū)動(dòng)組件241或242達(dá)到其最大填充容量時(shí)，對流停止并且系統(tǒng)達(dá)到平衡。在對流期間，由于布朗運(yùn)動(dòng)，生物分子320與固定化在納米通道210內(nèi)部的生物標(biāo)志物310相互作用，并且可以形成分子復(fù)合物340。獲得了跨納米通道210的濃度梯度。非特異性生物分子330將在納米通道210中擴(kuò)散，但不與固定化的生物標(biāo)志物310形成分子復(fù)合物。非特異性生物分子331將出現(xiàn)在輸出側(cè)口 230中，一些332也可以出現(xiàn)在驅(qū)動(dòng)組件241或242內(nèi)部。當(dāng)由激光束510激發(fā)時(shí)，固定化的熒光發(fā)射復(fù)合物340和擴(kuò)散通過光學(xué)檢測空間的擴(kuò)散的熒光發(fā)射生物分子330均被光學(xué)系統(tǒng)檢測到。
[0037]本發(fā)明區(qū)別于目前用來檢測分子相互作用的技術(shù)。本發(fā)明的獨(dú)特方法測量跨選擇性功能化的納米通道的固定化的復(fù)合物的濃度，所述納米通道與側(cè)口連接，該獨(dú)特方法不同于基于測量單個(gè)表面或儲(chǔ)器上的相互作用的當(dāng)前技術(shù)。這些當(dāng)前技術(shù)的解決方案并未受益于出現(xiàn)在本專利中給出的獨(dú)特設(shè)計(jì)中的增加的相互作用事件概率。
[0038]圖3顯示了當(dāng)溶液含有特異性生物分子時(shí)，跨生物傳感器的濃度隨時(shí)間的變化。在毛細(xì)管填充后立即(時(shí)間h)，在輸入側(cè)口內(nèi)部存在熒光標(biāo)記分子的背景濃度C(l。進(jìn)入納米通道的特異性生物分子與納米通道功能化表面迅速相互作用，導(dǎo)致濃度增加(短劃線)。最大濃度Csat對應(yīng)于下面的情況，對于給定的X位置，所有生物標(biāo)志物均已經(jīng)與特異性生物分子發(fā)生了相互作用。隨著時(shí)間的變化，濃度梯度將趨向于tinf點(diǎn)線，對應(yīng)于納米通道生物標(biāo)志物的總飽和度(點(diǎn)線)。
[0039]圖4圖示了在時(shí)間h時(shí)跨生物傳感器的濃度梯度，對應(yīng)于當(dāng)溶液已經(jīng)充滿了生物傳感器以及吸收組件時(shí)的情況。由于布朗運(yùn)動(dòng)，生物分子繼續(xù)進(jìn)入納米通道并且繼續(xù)與生物標(biāo)志物相互作用，但取決于背景濃度Ctl,向飽和tinf的過渡可能非常長。這允許對跨納米通道的濃度分布曲線的穩(wěn)定測量。測量空間(畫有陰影線的區(qū)域)對應(yīng)于寬度為b的激光束與納米通道的相交區(qū)域。
[0040]圖5顯示當(dāng)溶液僅含有非特異性生物分子時(shí)，跨生物傳感器的濃度隨時(shí)間的變化。在毛細(xì)管填充后(時(shí)間&)，在輸入側(cè)口和納米通道內(nèi)部立即存在熒光標(biāo)記分子的背景濃度(V預(yù)期沒有進(jìn)一步的濃度增加，因?yàn)椴淮嬖谂c功能化表面的相互作用。在此情況下，對于所有X位置并且隨時(shí)間的變化，濃度Ctl均保持恒定。
[0041]圖6圖示在時(shí)間h時(shí)跨生物傳感器的濃度梯度，對應(yīng)于當(dāng)溶液不含特異性生物分子并且已經(jīng)充滿了生物傳感器以及吸收組件時(shí)的情況。測量空間(畫有陰影線的區(qū)域)對應(yīng)于寬度為b的激光束與納米通道的相交區(qū)域。
[0042]圖7顯示了對于納米通道內(nèi)的給定位置，當(dāng)溶液含有特異性生物分子時(shí)，在測量期間熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。當(dāng)光學(xué)系統(tǒng)的快門打開時(shí)測量開始。獲得了含有關(guān)于存在于測量空間內(nèi)的固定化和熒光標(biāo)記的分子的數(shù)目的定量信息的標(biāo)準(zhǔn)光漂白曲線。
[0043]圖8顯示了對于納米通道內(nèi)的給定位置，當(dāng)溶液不含有任何特異性生物分子時(shí)，在測量期間熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。當(dāng)光學(xué)系統(tǒng)的快門打開時(shí)測量開始。沒有獲得光漂白曲線，因?yàn)樵跍y量空間內(nèi)僅存在擴(kuò)散的熒光標(biāo)記的生物分子，導(dǎo)致恒定的背景信號。
[0044]圖9顯示納米通道內(nèi)溶液對流隨時(shí)間的變化。首先，在時(shí)間tMp期間通過毛細(xì)管作用填充納米通道，導(dǎo)致流速的增加。當(dāng)?shù)竭_(dá)吸收組件時(shí)，溶液完全填充納米通道，并且流動(dòng)不再由毛細(xì)管作用驅(qū)動(dòng)而是由吸收驅(qū)動(dòng)。這導(dǎo)致在時(shí)間tac;t期間流速的改變。最后，在納米通道內(nèi)的溶液流動(dòng)趨于0，并且生物分子僅由于布朗運(yùn)動(dòng)而移動(dòng)。測量時(shí)間tm應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)在對流停止后。
[0045]根據(jù)本發(fā)明，所述裝置對與其他固定化的生物分子相互作用或不相互作用的生物分子的檢測、計(jì)數(shù)、鑒定和表征提供了極大的改進(jìn)。本發(fā)明的應(yīng)用可以涵蓋生物醫(yī)藥分析、生物學(xué)分析或食品分析，以及分析化學(xué)和生物分析化學(xué)中的基礎(chǔ)研究。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測和定量熒光標(biāo)記的生物分子(320)的生物傳感器(200)，所述生物傳感器(200)包含納米通道(210)，所述納米通道在兩個(gè)基底(201，202)之間限定并且含有一個(gè)或數(shù)個(gè)選擇性功能化的區(qū)域(211)，所述選擇性功能化的區(qū)域(211)上有固定化的生物標(biāo)志物(310)，所述納米通道還由輸入側(cè)口(220)和輸出側(cè)口(230)限定，所述輸入側(cè)口(220)適于使含有生物分子(320)的溶液進(jìn)入所述納米通道(210)中，并且所述輸出側(cè)口(230)適于通過毛細(xì)管作用驅(qū)動(dòng)所述溶液通過所述納米通道(210)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器(200)，其中所述生物標(biāo)志物(310)適于與特異性生物分子(320)以生物學(xué)或化學(xué)方式相互作用，和/或不與所述溶液(300)中包含的非特異性生物分子(330)相互作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物傳感器(200)，其中所述基底(201，202)由選自由硅、玻璃、塑料和氧化物化合物構(gòu)成的組中的材料制成。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物傳感器(200)，其中所述輸出側(cè)口(230)容納驅(qū)動(dòng)組件(241或242)或與驅(qū)動(dòng)組件(241或242)接觸，所述驅(qū)動(dòng)組件(241或242)適于驅(qū)動(dòng)所述溶液通過所述納米通道(210)。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物傳感器(200)，其中所述納米通道(210)和所述側(cè)口(220，230)內(nèi)的非功能化表面含有厚度為1nm至1000nm的薄層材料，所述材料選自由金屬、塑料和氧化物化合物構(gòu)成的組。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物傳感器(200)，其中所述側(cè)口(220，230)的面積為1OOnm2至20mm2,且所述納米通道(210)的高度為2nm至1000nm,寬度為2nm至20mm,且長度為2nm至20nm。
7.—種陣列，其包括數(shù)個(gè)如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物傳感器(200)，所述生物傳感器(200)被固定在密封容器系統(tǒng)(101)內(nèi)或被固定在表面(102)上。
8.一種組合件，由一個(gè)或數(shù)個(gè)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物傳感器(200)組成，并且包含用于熒光激發(fā)和檢測的光學(xué)裝置(500)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合件，其中所述光學(xué)裝置(500)是包含檢測器的熒光測量部件，所述檢測器是單光子檢測器，諸如檢測器陣列(CMOS或CCD)、雪崩光電二極管(APD)或光電倍增管(PMT)。
10.一種用于檢測和定量溶液(300)中熒光標(biāo)記的生物分子(320)的存在的方法，包括: a.至少一個(gè)如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的生物傳感器(200)； b.從輸入側(cè)口(220)至輸出側(cè)口(230)、貫穿納米通道(210)的所述生物傳感器(200)的填充機(jī)構(gòu)，通過放置含有熒光標(biāo)記的生物分子(320和或330)的水溶液(300)，所述熒光標(biāo)記的生物分子(320和或330)可以對固定化在所述納米通道中并且未固定化在密封容器系統(tǒng)(101)中或表面(102)上的生物標(biāo)志物(310)特異； c.光學(xué)系統(tǒng)(500)； d.借助于與所述生物分子(320)連接的熒光團(tuán)的光漂白對固定化在所述納米通道(210)內(nèi)部的生物標(biāo)志物(310)上的特異性生物分子(320)的檢測，以及跨所述納米通道(210)的長度的濃度梯度的測定。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述生物分子(320)是蛋白質(zhì)、DNA、RNA、抗體、氨基酸、核酸、酶、脂質(zhì)分子 、肽、多糖或病毒。
【文檔編號】B82Y15/00GK103502795SQ201280012408
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年2月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月9日
【發(fā)明者】N·杜蘭德, I·梅爾基, S·布羅伊萊特, A·梅爾, T·拉瑟 申請人:阿比奧尼克公司