專利名稱：一種蛋白芯片及其制備方法并用其篩選單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬分子生物學領域，涉及一種蛋白芯片及其制備方法，并用其來大規(guī)?？焖俚睾Y選單克隆抗體的靈敏的方法。
單克隆抗體技術發(fā)明于1975年，其制備過程基本如下①用抗原免疫小鼠，②取小鼠的脾淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，③雜交瘤細胞克隆化，④篩選特異的單克隆抗體。
克隆化方法有①有限稀釋法，②軟瓊脂培養(yǎng)法，③單細胞顯微操作法，④單克隆細胞集團顯微操作法，⑤螢光激活細胞分類儀(流式細胞儀)分離法。
經(jīng)典的篩選特異性單克隆抗體的方法有①免疫酶技術、②免疫熒光技術、③放射免疫測定、④化學發(fā)光免疫分析、⑤間接凝血試驗。其中免疫酶技術用得最多，現(xiàn)以免疫酶技術的一種技術——間接酶聯(lián)免疫分析(ELISA)來說明篩選過程。用抗原包被載體，加入待測的單克隆化雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清液，若上清液中有對應的單克隆抗體，則與包被的抗原結(jié)合；洗滌后再加入酶標記的第二抗體，形成固定化的抗原-抗體-酶標記的第二抗體復合物；依據(jù)底物顯色反應的強度，可對待測的單克隆抗體樣品進行定性或定量分析。
經(jīng)典的篩選特異性單克隆抗體的方法最大的缺點是得到的數(shù)個克隆中只能篩選出一種抗原的單克隆抗體、浪費大、效率低。
應用蛋白芯片能快速檢測大量抗原抗體的結(jié)合反應。如果用組織勻漿免疫小鼠，把克隆化的雜交瘤細胞分泌的抗體固化到載體(通常為尼龍膜、硝酸纖維膜或玻片)上，用不同抗原和其多克隆抗體便可篩選到不同抗原的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。從理論上講，如果克隆化的雜交瘤細胞庫足夠大，可篩選到所有蛋白質(zhì)的單克隆抗體。
經(jīng)檢索提供的對比文獻及參考目錄附后。
本發(fā)明的目的是發(fā)明一種蛋白芯片，通過其制備方法產(chǎn)生的蛋白芯片，能用于大規(guī)?？焖俚睾Y選單克隆抗體，方法簡單，成本低，并且同時建立雜交瘤細胞庫；本發(fā)明還涉及建立用特異性抗原和多克隆抗體篩選對應的單克隆抗體的方法。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的采取的方案①用組織勻漿免疫BALB/c小鼠；②取BALB/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合；③用流式細胞儀分離單個雜交瘤細胞，擴增培養(yǎng)；④制備蛋白芯片，用來鑒定產(chǎn)生的抗體，同時建立雜交瘤細胞庫；⑤制備篩選用蛋白芯片，用特異性抗原和多克隆抗體篩選對應的單克隆抗體。
結(jié)合附圖對本發(fā)明進一步具體的說明所謂蛋白芯片即將大量特定的抗原(抗體)，有序地固化在載體上，載體可以是硝酸纖維素膜、尼龍膜或玻片等其它載體，利用抗原抗體的親和反應檢測對應的抗體(抗原)的陣列。
本發(fā)明的流程和經(jīng)典單克隆抗體制備的流程比較見圖1。圖中1為經(jīng)典的雜交瘤抗體制備的流程圖，2為本發(fā)明流程圖，圖中本發(fā)明①-⑤為五個操作步驟為①用組織勻漿免疫BALB/c小鼠；②取BALB/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合；③用流式細胞儀分離單個雜交瘤細胞，擴增培養(yǎng)；④制備蛋白芯片，用來鑒定產(chǎn)生的抗體，同時建立雜交瘤細胞庫；⑤制備篩選用蛋白芯片，用特異性抗原和多克隆抗體篩選對應的單克隆抗體。
圖1中3、組織勻漿 4、特種抗原5、脾細胞 6、雜交瘤細胞7、克隆 8、單克隆抗體 9、流式分離儀分離單個雜交瘤細胞10、蛋白芯片鑒定產(chǎn)生的抗體，建立雜交瘤細胞庫11、蛋白芯片篩選特異性單克隆抗體 12、融合13、骨髓瘤細胞。
經(jīng)典的制備方法也對應五個步驟，如圖1中以上所注。
用蛋白芯片鑒定產(chǎn)生的抗體的原理見圖2。
圖2中1、為蛋白芯片篩選特異性單克隆抗體的示意圖黑色圓點表示對應的孔有抗體產(chǎn)生；白色圓點表示無抗體產(chǎn)生，為啞克隆。
2、為顯示無抗體產(chǎn)生時不顯色的原理，當克隆中無小鼠的抗體IgG(免疫球蛋白)時，F(xiàn)ITC(異硫氰酸熒光素)標記的抗小鼠IgG抗體不能結(jié)合，在洗滌時洗去，對應點無熒光顯示。
3、為顯示有抗體產(chǎn)生顯色的原理，當克隆中有小鼠的IgG抗體時，把雜交瘤細胞培養(yǎng)的上清液順序點印在玻片上，點印密度為1000點/cm2，IgG會被固化在玻片上特定的位置；用FITC標記的兔抗鼠IgG在玻片上孵育，有鼠IgG的點便會有熒光，通過此方法可方便去掉大量的啞克隆。
4為有效抗體，5為無效抗體，6為FITC標記的小鼠IgG抗體。
蛋白芯片篩選特異的抗體以AFP(甲胎球蛋白)為例，原理見圖3，把產(chǎn)生IgG抗體的克隆上清液點印在玻片上，點印密度為1000點/cm2，用AFP及標記FITC的免疫AFP多克隆抗體，在玻片上孵育，如果玻片上某點有AFP的單克隆抗體存在便會在激發(fā)光下產(chǎn)生熒光。
圖3中，1為蛋白芯片篩選特異性單克隆抗體的結(jié)果示意圖，黑色表示陽性克隆，白色為陰性；2為無抗體不產(chǎn)生顯色原理圖，非特異性單克隆抗體不能識別特異性抗原，故不能形成特異性單克隆抗體-抗原-多克隆抗體-熒光復合物，故對應點無熒光；3為有抗體產(chǎn)生熒光顯色原理圖，特異性單克隆抗體能識別特異性抗原，故能形成特異性單克隆抗體-抗原-多克隆抗體-熒光復合物，故對應點有熒光；4為特異性抗體，5為非特異性抗體，6為FITC標記的特異性抗原的抗體。
具體方法可細分為五部分1、用組織勻漿免疫BALB/c小鼠；2、取BALB/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合；3、用流式細胞儀分離單個雜交瘤細胞，擴增培養(yǎng)；4、制備蛋白芯片，用來鑒定產(chǎn)生的抗體，同時建立雜交瘤細胞庫；
5、制備篩選用蛋白芯片，用特異性抗原和多克隆抗體篩選對應的單克隆抗體。
1、用組織勻漿免疫BALB/c小鼠取2克組織(各種正常組織及腫瘤組織均可)制成勻漿，離心，去掉大的細胞碎片，按常規(guī)免疫。
2、取BALB/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合取免疫BALB/c小鼠的脾細胞和適量的骨髓瘤細胞，用PEG(聚乙二醇)融合，融合后立即將細胞移入HAT培養(yǎng)液[含次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中，4-5天換HT培養(yǎng)液，6-7天后換普通培養(yǎng)液。
3、用流式細胞儀分離單個雜交瘤細胞，擴增培養(yǎng)；收集融合雜交瘤細胞，并培養(yǎng)7-8天，制備成懸液；用流式細胞儀分離單個細胞，收集在384孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)孔中需預先加入培養(yǎng)液和飼養(yǎng)細胞(通常用小鼠腹腔巨噬細胞)；培養(yǎng)5天，檢測是否有抗體產(chǎn)生，培養(yǎng)8天再檢測一次。
4、制備蛋白芯片，用來鑒定產(chǎn)生的抗體，同時建立雜交瘤細胞庫；①制備蛋白芯片取培養(yǎng)細胞的上清液，轉(zhuǎn)移到新的384孔板，用點樣器把培養(yǎng)的上清液點在玻片上形成1000點/cm2的陣列；(用不同的點樣器，點印的密度和上清液的體積不同)；每個點對應一個孔，每個點為0.2-1μl的上清液。IgG的濃度為1-100Pg/ml。
②用制備的蛋白芯片鑒定產(chǎn)生的抗體，同時建立雜交瘤的細胞庫在蛋白芯片上加FITC標記的兔抗鼠IgG抗體(效價為1∶50-1∶1000)，37℃濕盒孵育30-60分鐘，用熒光顯微鏡觀察結(jié)果(也可用其它方法獲得圖像，如激光掃描儀)，③建立雜交瘤細胞庫在熒光顯微鏡下，挑選有熒光的點；標記對應的雜交瘤細胞孔，取適量細胞，擴增培養(yǎng)，液氮凍存細胞，建立雜交瘤細胞庫。
蛋白芯片鑒定產(chǎn)生抗體的熒光顯微圖象見圖4，明亮斑點對應的雜交瘤產(chǎn)生抗體，否則為啞克隆。
用FITC標記的兔抗鼠IgG只是一種鑒定方法，其它方法包括用熒光分子標記的其它抗小鼠IgG多克隆抗體，或者抗小鼠IgG多克隆抗體不標記，再偶聯(lián)熒光標記的第二抗體；另一種方法為先加入抗小鼠IgG多克隆抗體，偶聯(lián)生物素標記的第二抗體，再用熒光分子標記的親和素顯示熒光，以提高靈敏度。
5、制備篩選用芯片，用特異性抗原和多克隆抗體篩選對應的單克隆抗體。
①制備蛋白芯片用384孔板復蘇凍存細胞，培養(yǎng)5-10天，收集上清液，用點樣器把培養(yǎng)細胞的上清液點在玻片上形成1000點/cm2的陣列，每個點對應一個孔，每點為0.2-1μl上清液，IgG的濃度為1-100Pg/ml，一次可制備多張蛋白芯片。
②篩選特異性單克隆抗體1)在蛋白芯片上加抗原，濃度為0.1-100Pg/ml，37℃濕盒中孵育30-60分鐘；2)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗芯片3-5次；3)在蛋白芯片上加兔抗特異性多克隆抗體，抗體用FITC標記，抗體效價為1∶5-1∶1000，37℃濕盒孵育30-60分鐘；4)熒光顯微鏡下觀察蛋白芯片，挑選熒光顯色的斑點，從雜交瘤細胞庫中取出對應的雜交瘤細胞，擴增培養(yǎng)，并鑒定，篩選出單克隆抗體；5)換另一種抗原和其熒光標記的多克隆抗體，重復1)-4)步驟，可篩選另一種單克隆抗體。
實施例用胎肝勻漿免疫制備甲胎球蛋白(AFP)和肌動蛋白(Actin)的單克隆抗體。
實施例分五部分1、用胎肝勻漿液免疫BALB/c小鼠；2、用BALB/c小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞融合；3、用流式細胞儀分離單個雜交瘤細胞，擴增培養(yǎng)；4、制備蛋白芯片，去掉啞克隆，建立雜交瘤細胞庫；5、制備篩選用蛋白芯片，用AFP篩選AFP的單克隆抗體，用Actin篩選Acin的單克隆抗體。
1、用胎肝勻漿液免疫BALB/c小鼠；取2g流產(chǎn)胎兒胎肝組織，加10ml磷酸鹽緩沖液研磨，超聲破碎1-5分鐘，離心去掉沉淀，用1升磷酸鹽緩沖液透析3次，勻漿濃縮到1ml，免疫小鼠。免疫BALB/c小鼠5只，間隔2-4周再一次免疫，4周后靜脈加強免疫。
2、取BALB/c小鼠脾細胞和骨髓細胞融合①制備小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞；②5只BALB/c免疫小鼠，摘眼球放血，同時將小鼠處死；無菌操作取脾，用網(wǎng)孔擠壓法得到分散的脾細胞；③融合前36-48小時，將骨髓瘤細胞擴大培養(yǎng)；④分別取含1×108個脾細胞和2-3×107個骨髓瘤細胞，加PEG融合，用HAT培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)。
3、用流式細胞儀分離單個雜交瘤細胞，擴增培養(yǎng)；①將細胞懸液加入已鋪有飼養(yǎng)細胞層的70cm培養(yǎng)皿，置于37℃，含5-8％ CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)；②融合當天HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)，每天觀察一次，第四天出現(xiàn)融合細胞的小集落克隆，立即換HT培養(yǎng)液，一天后再換普通完全培養(yǎng)液；③制備小鼠腹腔巨噬細胞作飼養(yǎng)細胞，384孔板中每孔105個飼養(yǎng)細胞；④在融合后的第六天，輕輕吹吸雜交瘤細胞，制成懸液；⑤懸液用流式細胞儀分離成單個細胞，每孔中加入一個細胞，共100個384孔板；⑥常規(guī)培養(yǎng)5-8天，觀察克隆生長情況，第8天取培養(yǎng)上清液，轉(zhuǎn)移到新的384孔板。
4、制備蛋白芯片，去掉啞克隆，建立雜交瘤細胞庫①制備蛋白芯片用點樣器把培養(yǎng)上清液點印到玻片(美國Telechem公司，貨號SMA-25)上，每個點0.2μl形成1000點/cm2的陣列，每張玻片點印1920點(對應5塊384孔板)，共點印20張玻片，室溫干燥24小時，加100mg/ml的牛血清蛋白，室溫2小時封閉玻片，雙蒸水緩慢沖洗2分鐘；
②鑒定產(chǎn)生的抗體芯片加上FITC標記的兔抗鼠IgG 0.3ml，效價為1∶500，37℃濕盒孵育45分鐘，磷酸鹽緩沖液沖洗3次。
③熒光顯微鏡觀察用波長為492nm的光激發(fā)，加載525nm濾光片觀察結(jié)果并照相，結(jié)果見圖4，明亮斑點對應的雜交瘤有抗體產(chǎn)生，否則為啞克??；④建立雜交瘤細胞庫挑選表達IgG的孔(共6500孔)，懸浮細胞，轉(zhuǎn)到新的384孔培養(yǎng)板，共17塊板，培養(yǎng)8天，轉(zhuǎn)移上清液到新的384孔板，供制備蛋白芯片用，雜交瘤細胞再擴增培養(yǎng)，編號后凍存。
5、制備篩選用蛋白芯片，用AFP篩選AFP的單克隆抗體；用Actin篩選Actin的單克隆抗體①制備篩選用蛋白芯片；用點樣器把上述獲得的培養(yǎng)上清液點印到玻片上，每張玻片1920點，共4張玻片，重復點印1000套，室溫干燥24小時，100mg/ml小牛血清封閉2小時，雙蒸水緩慢沖洗2分鐘，干燥保存。
②篩選AFP抗體1)在芯片上加AFP抗原0.3ml濃度為20Pg/ml，37℃濕盒中孵育45分鐘，PBS洗芯片三次；2)用FITC標記兔抗AFP多克隆抗體(美國Chemicon公司，貨號AB562)，稀釋到效價為1∶100；3)在芯片上加FITC標記的兔抗AFP多克隆抗體0.3ml，37℃濕盒孵育45分鐘；4)熒光顯微鏡觀察芯片激發(fā)光用492nm，加載525nm濾光片觀察，并照相，記錄顯微熒光的位置，結(jié)果見圖5，篩選到2株AFP單克隆抗體，分別用1.2表示。
③篩選Actin單克隆抗體程序同②，兔抗Actin多克隆抗體購自美國Chemicon公司，貨號為AB978，結(jié)果見圖6，篩選到4株Actin單克隆抗體，分別用1，2，3，4表示，從圖中得1，2的親和力最高，4的親和力最低。
本發(fā)明的優(yōu)點成本低廉一次建庫，用蛋白芯片可篩選到多種抗原的單克隆抗體，總體成本可成倍下降；
操作簡單不重復免疫小鼠，不重復融合，建庫后可多次篩選；自動化用流式細胞儀分離單個雜交瘤細胞；用蛋白芯片鑒定抗體，最大限度減少人力；能大規(guī)模快速地篩選單克隆抗體。
本發(fā)明的應用用本發(fā)明的蛋白芯片能大規(guī)模快速地篩選單克隆抗體，同時建立了雜交瘤細胞庫。
說明書


圖1本發(fā)明的流程圖和經(jīng)典單克隆抗體制備流程圖的比較1為經(jīng)典的雜交瘤抗體制備流程；2為本發(fā)明的流程。①-⑤對應五個操作步驟。
①用組織勻漿免疫BALB/c小鼠；②取BALB/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合；③用流式細胞儀分離單個雜交瘤細胞，擴增培養(yǎng)；④制備蛋白芯片，用來鑒定產(chǎn)生的抗體，同時建立雜交瘤細胞庫；⑤制備篩選用蛋白芯片，用特異性抗原和多克隆抗體篩選對應的單克隆抗體。
圖1中3、組織勻漿 4、特種抗原5、脾細胞 6、 雜交瘤細胞7、克隆 8、單克隆抗體 9、流式分離儀分離單個雜交瘤細胞10、蛋白芯片鑒定產(chǎn)生的抗體，建立雜交流細胞庫11、蛋白芯片篩選特異性單克隆抗體 12、融合13、骨髓瘤細胞。
經(jīng)典的制備方法也對應五個步驟，如圖1中以上所注。
圖2蛋白芯片鑒定產(chǎn)生抗體的原理圖1為蛋白芯片檢測結(jié)果示意圖，黑色表示對應的孔有抗體產(chǎn)生，白色表示無抗體產(chǎn)生，為啞克隆。
2、顯示無抗體產(chǎn)生時不顯色的原理。當克隆中無小鼠的抗體IgG時，F(xiàn)ITC標記的抗小鼠IgG抗體不能與其結(jié)合，對應的點無熒光顯示。
3、顯示有抗體產(chǎn)生時顯色的原理，當克隆中有小鼠的IgG抗體時，F(xiàn)ITC標記的抗小鼠IgG抗體與其結(jié)合，對應點有熒光顯示。
4、為有效抗體5、為無效抗體6、為FITC標記的兔抗鼠IgG抗體。
圖3為蛋白芯片篩選特異性單克隆抗體的原理圖。
1、為蛋白芯片篩選特異性單克隆抗體的結(jié)果示意圖，黑色表示陽性克隆，白色表示陰性克隆。
2、為無抗體不產(chǎn)生顯色原理圖，非特異性單克隆抗體不能識別特異性抗原，故不能形成特異性單克隆抗體-抗原-多克隆抗體-熒光復合物，故對應點無熒光；3、為有抗體產(chǎn)生熒光顯色原理圖，特異性單克隆抗體能識別特異性抗原，故能形成特異性單克隆抗體-抗原-多克隆抗體-熒光復合物，故對應點有熒光。
4、為特異性抗體5、為非特異性抗體6、為F1TC標記的特異性抗原的抗體圖4為蛋白芯片鑒定產(chǎn)生的抗體的熒光顯微鏡圖象。
明亮斑點對應的雜交瘤株有抗體產(chǎn)生，否則為啞克隆。
圖5為蛋白芯片篩選AFP單克隆抗體。
篩選到2株AFP單克隆抗體，分別用1，2表示。
圖6為蛋白芯片篩選Actin單克隆抗體篩選到4株Actin單克隆抗體，分別用1，2，3，4表示，從圖知1，2的親和力最高而4親和力最低。
參考文獻1、汪美先單克隆抗體技術及其應用。第四軍醫(yī)大學學報，1983461；2、張和君等主編單克隆抗體及細胞免疫實驗技術。
昆明云南科技出版社，1986259-2603、徐志凱等主編實用單克隆抗體技術；西安陜西科學技術出版社，199242-734對比文獻徐志凱等主編實用單克隆抗體技術；西安陜西科學技術出版社，199265-7權利要求
1.一種蛋白芯片，它是將大量特定的抗原或抗體，有序地固化在載體上，載體可以為硝酸纖維素膜、尼龍膜或玻片，利用抗原抗體的親和反應檢測對應的抗體或抗原的陣列，其特征是利用這種蛋白芯片可以大規(guī)模篩選單克隆抗體，是一種快速靈敏的篩選方法，具體分為五個步驟①用組織勻漿免疫BALB/c小鼠；②取BALB/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合；③用流式細胞儀分離單個雜交瘤細胞，擴增培養(yǎng)；④制備蛋白芯片，用來鑒定產(chǎn)生的抗體，同時建立雜交瘤細胞庫；⑤制備篩選用蛋白芯片，用特異性抗原和多克隆抗體篩選對應的單克隆抗體；這樣的篩選流程。
2.根據(jù)權利要求1所述的這種蛋白芯片的制備方法其特征是將免疫過的BALB/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合產(chǎn)生的雜交瘤細胞，分離出的單個細胞，培養(yǎng)在384孔板中，取培養(yǎng)雜交瘤細胞的上清液轉(zhuǎn)移到新的384孔板，用點樣器把上清液點在玻片上形成1000點/cm2的陣列，每個點對應一個孔，每點為0.2-1μl上清液，IgG的濃度為1-100Pg/ml，一次可以制備多張蛋白芯片。
3.根據(jù)權利要求1所述的用這種蛋白芯片鑒定產(chǎn)生的抗體的方法，其特征是用蛋白芯片加FITC即異硫氰酸熒光素標記的兔抗鼠IgG抗體，效價為1∶50-1∶1000，37℃濕盒孵育30-60分鐘，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
4.根據(jù)權利要求1所述的用這種蛋白芯片鑒定產(chǎn)生的抗體的方法，其特征是在鑒定產(chǎn)生的抗體的同時，還建立了雜交瘤細胞庫，具體方法為在熒光顯微鏡下挑選有熒光的點，標記對應的雜交瘤細胞孔，取適量細胞，擴增培養(yǎng)，液氮凍存細胞，建立雜交瘤細胞庫。
5.根據(jù)權利要求1所述的用這種蛋白芯片篩選單克隆抗體的方法，其特征是用特異性抗原和多克隆抗體篩選對應的單克隆抗體，具體方法為1)在蛋白芯片上加抗原，濃度為0.1-100Pg/ml，37℃濕盒孵育30-60分鐘；2)用磷酸鹽緩沖液洗芯片3-5次；3)在蛋白芯片上加兔抗特異性抗原的多克隆抗體，抗體用FITC標記，抗體效價為1∶5-1∶1000，37℃濕盒孵育30-60分鐘；4)熒光顯微鏡下觀察蛋白芯片，挑選熒光顯色的斑點，從雜交瘤細胞庫中取出對應的雜交瘤細胞，擴增培養(yǎng)，鑒定篩選出的單克隆抗體；5)換另一種抗原和其熒光標記的多克隆抗體，重復1)-4)步驟，篩選出另一種單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白芯片及其制備,并用其篩選單克隆抗體的靈敏方法,包括步驟:①用組織勻漿免疫BALB/c小鼠;②取BALB/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合;③用流式細胞儀分離單個雜交瘤細胞,擴增培養(yǎng);④制備蛋白芯片,用來鑒定產(chǎn)生的抗體,同時建立雜交瘤細胞庫;⑤制備篩選用蛋白芯片,用特異性抗原和多克隆抗體篩選對應的單克隆抗體。本發(fā)明用于單克隆抗體的大規(guī)?？焖俸Y選。
文檔編號G01N33/68GK1274085SQ00105820
公開日2000年11月22日 申請日期2000年4月13日 優(yōu)先權日2000年4月13日
發(fā)明者陳高明 申請人:陳學銀