專利名稱：一種應(yīng)用噬菌體展示文庫(kù)篩選鑒定單克隆抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用噬菌體展示文庫(kù)篩選 鑒定單克隆抗體的方法。
技術(shù)背景傳統(tǒng)的單克隆抗體開(kāi)發(fā)路線是從獲得單一的純化抗原開(kāi)始，經(jīng)過(guò)免疫 等過(guò)程得到針對(duì)此抗原的單克隆抗體，這樣得到的單克隆抗體并不能知道 其所針對(duì)的抗原的表位(抗原決定基)。而要想得到明確抗原決定基的抗 體，傳統(tǒng)路線只能通過(guò)化學(xué)合成小片段多肽，并經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)載體后進(jìn)行動(dòng)物免疫制得。這種方法只能一次制備一種抗體。如CN03131796.0號(hào)專利文獻(xiàn)公開(kāi)了一種禾,噬菌體展示技術(shù)展示抗原制備抗體的方法。該方法是 將已知抗原的基因插入噬菌體基因內(nèi)，然后展示在噬菌體表面，構(gòu)建噬菌 體抗原庫(kù)，將此融合噬菌體顆粒作為免疫原進(jìn)行動(dòng)物免疫，制備抗體，是 針對(duì)cTnl蛋白的抗體。這種方法有一定的難度和復(fù)雜性，需要進(jìn)行基因 工程的操作，抗原不是天然的混合抗原(如完整細(xì)胞)，不能在一次免疫 得到的大量單克隆抗體后進(jìn)行的抗原篩選鑒定。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可以快速開(kāi)發(fā)出數(shù)百種單克隆抗體并確定 它們各自針對(duì)的抗原決定基的應(yīng)用噬菌體展示文庫(kù)篩選鑒定單克隆抗體 的方法。本發(fā)明方法包括以下步驟 一、應(yīng)用混合抗原免疫動(dòng)物；
二、 按常規(guī)方法制備雜交瘤細(xì)胞；三、 應(yīng)用噬菌體文庫(kù)進(jìn)行篩選將雜交瘤分泌的抗體包被在ELISA 板上，加入噬菌體文庫(kù)，洗掉不能結(jié)合的噬菌體；四、 鑒定特異性噬菌體將結(jié)合的特異性噬菌體洗脫，并感染細(xì)菌， 放大和提取菌體里面的含有外源基因片段的載體，通過(guò)DNA序列分析鑒定 出該抗體針對(duì)的抗原。所述方法中步驟一進(jìn)一步是指，混合抗原采用細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞到濃度為1 X 1(T7 X107mL，用注射法進(jìn)行動(dòng)物免疫；最好采用消減免疫法進(jìn)行動(dòng)物免疫， 將正常細(xì)胞免疫動(dòng)物，之后注射免疫抑制劑(如環(huán)磷酰胺)，之后再將另一種細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)免疫同只動(dòng)物。步驟二進(jìn)一步是指，取免疫動(dòng)物脾細(xì)胞，制備成單細(xì)胞與事先培養(yǎng)好 的骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選、克隆化雜交瘤細(xì)胞。步驟三進(jìn)一步是指，將雜交瘤細(xì)胞分泌的上清包被在96孔板中，加 入文庫(kù)進(jìn)行篩選(一) 淘選每個(gè)事先包被了抗體的孔內(nèi)加入一份原始文庫(kù)，孵育，移去用畢的文 庫(kù)，加入洗滌液洗滌；(二) 回收吸附的噬菌體每孔中加入TG1細(xì)胞懸液，孵育后，立即置冰上，收集細(xì)胞；(三) 噬菌體的富集1) 、加入培養(yǎng)基到富集的TG1細(xì)胞，振蕩；2) 、加入氨芐后，加入噬菌體M13K07，振蕩；3) 、離心，棄上清；4) 、將細(xì)胞重新用加了氨芐和卡那的培養(yǎng)基懸浮，振蕩；5) 、離心，將上清轉(zhuǎn)移至另一管；6) 、再離心，將上清轉(zhuǎn)移至另一管；7) 、加入阻斷液，孵育；8) 、加APEG，孵育以沉淀噬菌體；9) 、再離心，棄上清，沉淀用緩沖液再懸浮，離心，收集上清；(四)為ELISA篩選制備噬菌體克隆1) 、挑取上述分離好的單克隆于標(biāo)記有"PCl+克隆號(hào)"的離心管內(nèi)，加入培養(yǎng)基，振蕩，即為PC1;2) 、將PC1培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到標(biāo)記有"PC2+克隆號(hào)"的管中，加入含有輔 助噬菌體M13K07的培養(yǎng)基，振蕩；3) 、離心，棄上清，用培養(yǎng)基重懸浮細(xì)胞，振蕩，即為超感染的單個(gè)噬菌體克隆PC2;4) 、純化噬菌體克隆a、 離心，轉(zhuǎn)移上清到標(biāo)記有"PC3+克隆號(hào)"的管中，加入阻斷液， 培養(yǎng)；b、 加APEG，培養(yǎng)；c、 離心，棄上清，用緩沖液懸浮細(xì)胞。這就是純化后的噬菌體克隆，即PC3;最好(一)至(三)反復(fù)進(jìn)行3至4次。步驟四進(jìn)一步是指，鑒定特異性抗原，包括(一)ELISA篩選1) 、加PC3噬菌體至抱被了抗體的ELISA板孔中，孵育；2) 、移掉噬菌體懸液，用洗滌液洗，每孔加pVIII抗體，孵育后，移
除，洗滌；3) 、每孔中加入標(biāo)記的二抗，孵育后，移除二抗，洗滌；4) 、每孔加入顯色劑，孵育直到變色；5) 、每孔中加入終止液停止顯色反應(yīng)，讀取吸光率；6) 、根據(jù)ELISA的結(jié)果，選出PC1或PC3克隆；(二)分析陽(yáng)性克隆1) 、消除非特異性克??；2) 、陽(yáng)性PC1克隆中在氨芐培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分離提取出重組質(zhì)粒；3) 、用提供的引物對(duì)分離出的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。 本發(fā)明中的抗體生產(chǎn)路線，是先用完整的正常細(xì)胞作為抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫，然后用免疫抑制劑封閉動(dòng)物對(duì)正常細(xì)胞抗原的記憶后，再用完整的 腫瘤細(xì)胞作為抗原免疫相同動(dòng)物，這只動(dòng)物只會(huì)產(chǎn)生針對(duì)腫瘤細(xì)胞抗原的 免疫反應(yīng)，而對(duì)正常細(xì)胞的抗原不產(chǎn)生反應(yīng)。接下來(lái)的幾個(gè)步驟與常規(guī) 方法一樣，分離脾單細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，篩選、克隆化雜交瘤 細(xì)胞等。這樣獲得的雜交瘤細(xì)胞都可以分泌出針對(duì)該腫瘤細(xì)胞的抗體，而 且一次性可以獲得大量的細(xì)胞株，成為混合雜交瘤細(xì)胞克隆庫(kù)。 這些可以分泌特異性抗體的細(xì)胞株分泌出來(lái)的抗體可與腫瘤細(xì)胞發(fā)生免 疫反應(yīng)，接下來(lái)要用人類cDNA / EST噬菌體表面展示文庫(kù)(文庫(kù)早已建成) 鑒定這些單克隆抗體是針對(duì)哪個(gè)抗原決定基的。人類cDNA/EST噬菌體表面展現(xiàn)文庫(kù)中含有各種不同的人類EST表現(xiàn)型噬 菌體，不同噬菌體上的人類蛋白質(zhì)片段也不同，每種蛋白可以就是一種人 類抗原。將制備出的抗體結(jié)合在ELISA板上，加入噬菌體文庫(kù)，抗體可以 和其對(duì)應(yīng)的表達(dá)在噬菌體外的人類蛋白質(zhì)片段結(jié)合，而不能結(jié)合的噬菌體 被洗掉。洗脫結(jié)合的噬菌體，并感染細(xì)菌，放大和提取菌體里面的含有人
類蛋白質(zhì)片段的載體，通過(guò)DNA序列分析就可以得知是什么人類蛋白質(zhì)， 也就鑒定出了該抗體針對(duì)的抗原。本方法中的噬菌體包括但不限于M13 絲狀噬菌體，如還包括fd、 fl、 T7、 T4和Lambda噬菌體等，噬菌體 展示文庫(kù)不限于人類cDNA文庫(kù)，還包括鼠組織cDNA文庫(kù)(制備鼠抗體)等。
應(yīng)用人類cDNA/EST噬菌體表面展現(xiàn)文庫(kù)技術(shù)對(duì)大量的融合雜交瘤細(xì) 胞分泌的單克隆抗體進(jìn)行篩選鑒定，可以極大地縮短抗體從研發(fā)到生產(chǎn)制 備的時(shí)間，迅速制備出大量抗人類腫瘤細(xì)胞的單克隆抗體，從而改變傳統(tǒng) 抗體生產(chǎn)的方式，顯著提高生產(chǎn)效率。傳統(tǒng)方法制備一種單抗，從免疫開(kāi) 始需要3-4個(gè)月，加上克隆、轉(zhuǎn)化、表達(dá)、純化、偶聯(lián)抗原等的前期準(zhǔn)備 時(shí)間，能否成功更是不可預(yù)計(jì)。隨著制備抗體種類的增加，所用的動(dòng)物數(shù) 量和工作量就會(huì)線性擴(kuò)大；而該發(fā)明中的方法則在幾乎相同的時(shí)間內(nèi)，僅 用一只動(dòng)物(理論上)進(jìn)行免疫，就可得到數(shù)百種單抗，生產(chǎn)效率大大提 高。
大量抗人類腫瘤細(xì)胞的單克隆抗體的面市，將會(huì)為臨床腫瘤病理檢測(cè) 試劑與試劑盒、單克隆抗體腫瘤治療藥物等的研發(fā)提供豐富原料。 下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明方法。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1本發(fā)明方法采用以下步驟一、 以細(xì)胞作為抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫 將細(xì)胞作為免疫原進(jìn)行小鼠免疫，每只小鼠注射0.3mL濃度為IX1(T7X10VraL細(xì)胞懸液。二、 制備雜交瘤
取免疫小鼠脾，制備成脾單細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，用HAT 培養(yǎng)基篩選出陽(yáng)性克隆，每個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行克隆化，得到雜交瘤單克隆細(xì) 胞株。
三、應(yīng)用噬菌體文庫(kù)進(jìn)行篩選
(一) 、淘選1 、將噬菌體文庫(kù)等分加入到事先包被了雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗體的 96孔板中。2、 第一輪淘選，用一份109個(gè)克隆的原始文庫(kù)，加入到l個(gè)孔內(nèi)(lcm3 ) 進(jìn)行淘選，通常足夠識(shí)別中等豐度或極低豐度的cDNA。3、 37"C孵育1小時(shí)，也可以25'C或4"C孵育最長(zhǎng)4小時(shí)。4、 移去用畢的文庫(kù)，每孔加入約200 u l洗滌液，洗滌5至20次。
(二) 、回收吸附的噬菌體1、 孔中加入預(yù)冷的TGl細(xì)胞懸液O. lml2、 37。C孵育30分鐘，立即置冰上或4。C,收集細(xì)胞3、 將富集的TG1細(xì)胞移至干凈的小離心管內(nèi)，4X:可以保存3天，或者 加入終濃度15%的無(wú)菌甘油，-70。C可以保存l年。
(三) 、噬菌體的富集1、 加入2XYT/甘油培養(yǎng)基lm到501ul富集TGl細(xì)胞，37°C， 250rpm 搖l小時(shí)2、 加入終濃度100ug/ml的氨芐3、 立即加入5X10Vfu的輔助噬菌體M13K07 (約O. lml)到培養(yǎng)基中， 37°C， 250rpm搖l小時(shí)4、 2,000 x g 4。C或室溫離心10分鐘，棄上清5、 將細(xì)胞重新用加了氨芐和卡那的2XYT培養(yǎng)基懸浮，37°C， 250rpm
搖過(guò)夜6、 10， 000 x g4。C離心20分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至另一管。7、 10， 000 x g化再離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至一無(wú)菌的聚丙烯管中。8、 加入10ml阻斷液到10ml富集的噬菌體庫(kù)中，4"C孵育10分鐘9、 加入4ml20y。PEG， 4。C孵育30分鐘以沉淀噬菌體10、 10， 000 x g4。C再離心20分鐘，棄上清，沉淀用lml PBS再懸浮， 轉(zhuǎn)移至一只無(wú)菌小離心管中，14,000 rpm 4"C離心10分鐘。11、 收集上清，這就是富集后的噬菌體文庫(kù)。 如此重復(fù)4遍淘選。(四)、為ELISA篩選制備噬菌體克隆 1 、在預(yù)先標(biāo)記好的l. 5ml離心管內(nèi)加入400 u 12 X YT氨芐葡萄糖培養(yǎng) 基，標(biāo)記為PCl+該克隆的數(shù)字。2、 用無(wú)菌的吸頭挑取44-88個(gè)分離好的單克隆，分別培養(yǎng)于小管中， 37°C 250rpm搖過(guò)夜，這就是TG1里的單克隆噬菌體，叫做PC13、 將培養(yǎng)過(guò)夜的PCl培養(yǎng)物50u l轉(zhuǎn)移到標(biāo)記著PC2+克隆號(hào)的管中。4、 加入400u 12XYT氨芐葡萄糖培養(yǎng)基到PC2管中，其中含有5x 108pfu 輔助噬菌體M13K07 (約10iU) ， 37°C200-250rpm搖l-2小時(shí)5、 25。C14000rpm離心5分鐘6 、棄上清。用2 X YT/氨芐/卡那培養(yǎng)基400 " 1重懸浮細(xì)胞。37。C250rpm 搖過(guò)夜。這些雙重感染的單個(gè)噬菌體克隆就是PC2 7、純化噬菌體克隆a) 25 。C 14000ipm離心5分鐘b) 轉(zhuǎn)移300u l上清到標(biāo)記了PC3+克隆號(hào)的小管中c) 加入300ul阻斷液，4。C培養(yǎng)10分鐘d) 加入120 u 12(Fo無(wú)謝EG， 4"C培養(yǎng)30分鐘e) 4。C10，000xg離心20分鐘f) 棄上清，用100yl PBS懸浮細(xì)胞。這就是純化后的噬菌體克隆， 叫做PC3。四、鑒定特異性抗原(一) 、ELISA篩選1、 加50ulPC3噬菌體到包被了抗體的ELISA板孔中，25。C孵育2小時(shí)。2、 移掉噬菌體懸液，用洗滌液洗3次，每次200ul。3、 用阻斷液l:50稀PpVIII抗體，每孔加50ul， 25。C孵育l小時(shí)，移 除一抗。4、 用洗滌液洗三次，每次200ul5、 用阻斷液1:50稀釋HRP標(biāo)記的二抗，每孔中加入50ul， 25'C孵育1小時(shí)6、 移除二抗，用洗滌液洗三次，每次200ul7、 每孑L加入50ulTMB， 25r孵育直到出現(xiàn)穩(wěn)定的藍(lán)色。8、 每孔中加入10ul鵬S04停止顯色反應(yīng)，藍(lán)色 L會(huì)變成黃色，讀405 或410nm的吸光率。9、 根據(jù)ELISA的結(jié)果，選出PC1或PC3克隆，保留所有的陽(yáng)性克隆和少 量陰性克隆做后續(xù)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。(二) 、分析陽(yáng)性克隆1、 消除非特異性克隆2、 陽(yáng)性PCl克隆中在2xYT/氨芐培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分離提取出重組質(zhì)粒3、 用提供的引物對(duì)分離出的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序 實(shí)施例2 本方法的應(yīng)用混合抗原免疫動(dòng)物步驟中采用消減免疫法進(jìn)行動(dòng)物免 疫，將正常細(xì)胞免疫動(dòng)物，之后注射環(huán)磷酰胺，之后再將另一種腫瘤細(xì)胞 免疫同只動(dòng)物。其余與實(shí)施例1相同實(shí)施例3本方法的應(yīng)用噬菌體文庫(kù)進(jìn)行篩選步驟中，(一)淘選、(二)回收吸附的噬菌體、(三)噬菌體的富集反復(fù)4次，其余與實(shí)施例l相同。
權(quán)利要求
1、一種應(yīng)用噬菌體展示文庫(kù)篩選鑒定單克隆抗體的方法，其特征是包括以下步驟一、應(yīng)用混合抗原免疫動(dòng)物；二、按常規(guī)方法制備雜交瘤細(xì)胞；三、應(yīng)用噬菌體文庫(kù)進(jìn)行篩選將雜交瘤分泌的抗體包被在ELISA板上，加入噬菌體文庫(kù)，洗掉不能結(jié)合的噬菌體；四、鑒定特異性噬菌體將結(jié)合的特異性噬菌體洗脫，并感染細(xì)菌，放大和提取菌體里面的含有外源基因片段的載體，通過(guò)DNA序列分析鑒定出該抗體針對(duì)的抗原。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用噬菌體展示文庫(kù)篩選鑒定單克隆抗體的方法，其特征是步驟一所述的應(yīng)用混合抗原免疫動(dòng)物是指混合抗原采 用細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞到濃度為lXl(T7X107mL，用注射法進(jìn)行動(dòng)物免疫。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用噬菌體展示文庫(kù)篩選鑒定單克隆抗體 的方法，其特征是步驟二所述的按常規(guī)方法制備雜交瘤細(xì)胞是指取免疫動(dòng)物脾細(xì)胞，制備成單細(xì)胞與事先培養(yǎng)好的骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選、克隆 化雜交瘤細(xì)胞。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用噬菌體展示文庫(kù)篩選鑒定單克隆抗體 的方法，其特征是步驟三所述的應(yīng)用噬菌體文庫(kù)進(jìn)行篩選是指將雜交瘤 細(xì)胞分泌的上清包被在96孔板中，加入文庫(kù)進(jìn)行篩選，包括(一) 淘選每個(gè)事先包被了抗體的孔內(nèi)加入一份原始文庫(kù)，孵育，移去用畢的文庫(kù)，加入洗滌液洗滌；(二) 回收吸附的噬菌體 每孔中加入TG1細(xì)胞懸液，孵育后，立即置冰上，收集細(xì)胞; (三)噬菌體的富集1)、加入培養(yǎng)基到富集的TG1細(xì)胞，振蕩；2)、加入氨芐后，加入噬菌體M13K07，振蕩；3)、離心，棄上清；4)、將細(xì)胞重新用加了氨芐和卡那的培養(yǎng)基懸浮，振蕩；5)、離心，將上清轉(zhuǎn)移至另一管；6)、再離心，將上清轉(zhuǎn)移至另一管；7)、加入阻斷液，孵育；8)、加APEG，孵育以沉淀噬菌體；9)、再離心，棄上清，沉淀用緩沖液再懸浮，離心，收集上清;(四)為ELISA篩選制備噬菌體克隆1) 、挑取上述分離好的單克隆于標(biāo)記有"PCl+克隆號(hào)"的離心管內(nèi)， 加入培養(yǎng)基，振蕩，即為PC1;2) 、將PC1培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到標(biāo)記有"PC2+克隆號(hào)"的管中，加入含有輔 助噬菌體M13K07的培養(yǎng)基，振蕩；3) 、離心，棄上清，用培養(yǎng)基重懸浮細(xì)胞，振蕩，即為超感染的單個(gè) 噬菌體克隆PC2;4) 、純化噬菌體克隆a、 離心，轉(zhuǎn)移上清到標(biāo)記有"PC3+克隆號(hào)"的管中，加入阻斷液， 培養(yǎng)；b、 加入PEG，培養(yǎng)；c、 離心，棄上清，用緩沖液懸浮細(xì)胞。這就是純化后的噬菌體克 隆，即PC3。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用噬菌體展示文庫(kù)篩選鑒定單克隆抗體 的方法，其特征是步驟三所述的鑒定特異性噬菌體是指:鑒定特異性抗原， 包括(一) ELISA篩選1) 、加PC3噬菌體到包被了抗體的ELISA板孔中，孵育；2) 、移掉噬菌體懸液，用洗滌液洗，每 L加pVin抗體，孵育后，移 除，洗滌；3) 、每孔中加入^i己的二抗，孵育后，移除二抗，洗滌；4) 、每 L加入顯色劑，孵育直到變色；5) 、每孔中加入終止液停止顯色反應(yīng)，讀取吸光率；6) 、根據(jù)ELISA的結(jié)果，選出PC1或PC3克?。?二) 分析陽(yáng)性克隆1) 、消除非特異性克??；2) 、陽(yáng)性PC1克隆中在氨芐培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分離提取出重組質(zhì)粒；3) 、用提供的引物對(duì)分離出的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用噬菌體展示文庫(kù)篩選鑒定單克隆抗體 的方法，其特征是應(yīng)用混合抗原免疫動(dòng)物采用消減免疫法進(jìn)行動(dòng)物免疫， 將正常細(xì)胞免疫動(dòng)物，之后注射環(huán)磷翻安，之后再將另一種細(xì)胞免疫同只 動(dòng)物。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用噬菌體展示文庫(kù)篩選鑒定單克隆抗體的 方法，其特征是應(yīng)用噬菌體文庫(kù)進(jìn)行篩選中的(一)至(三)步驟反復(fù)進(jìn) 行3至4次。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種應(yīng)用噬菌體展示文庫(kù)篩選鑒定單克隆抗體的方法。包括以下步驟一、應(yīng)用混合抗原免疫動(dòng)物；二、按常規(guī)方法制備雜交瘤細(xì)胞；三、應(yīng)用噬菌體文庫(kù)進(jìn)行篩選將雜交瘤分泌的抗體包被在ELISA板上，加入噬菌體文庫(kù)，洗掉不能結(jié)合的噬菌體；四、鑒定特異性噬菌體將結(jié)合的特異性噬菌體洗脫，并感染細(xì)菌，放大和提取菌體里面的含有外源基因片段的載體，通過(guò)DNA序列分析鑒定出該抗體針對(duì)的抗原。應(yīng)用人類cDNA/EST噬菌體表面展現(xiàn)文庫(kù)技術(shù)對(duì)大量的融合雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體進(jìn)行篩選鑒定，可以極大地縮短抗體從研發(fā)到生產(chǎn)制備的時(shí)間，迅速制備出大量抗人類腫瘤細(xì)胞的單克隆抗體，從而改變傳統(tǒng)抗體生產(chǎn)的方式，顯著提高生產(chǎn)效率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101126175SQ20061003208
公開(kāi)日2008年2月20日 申請(qǐng)日期2006年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月14日
發(fā)明者彭早元 申請(qǐng)人:長(zhǎng)沙三創(chuàng)生物技術(shù)有限公司