專利名稱：：Mcv分析中的稀釋劑以及確保其具有不隨時(shí)間變化的一致性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分析血樣中的平均紅細(xì)胞容積(MCV)，特別是涉及一種用顆粒分析儀在進(jìn)行MCV分析的過程中使用的試劑和方法?，F(xiàn)在，臨床檢查領(lǐng)域廣泛使用了自動(dòng)血液分析儀。作為醫(yī)療診斷過程中對病人作檢查的裝置，它們被設(shè)計(jì)為可對血液成分進(jìn)行快速分析。這些裝置能夠進(jìn)行全部血球數(shù)(CBC)的多種分析，包括諸如紅血球(RBC)數(shù)、白血球(WBC)數(shù)、白血球分類、血紅蛋白濃度(Hb)、血細(xì)胞比容(Ht)和血小板數(shù)(PLT)這些項(xiàng)目。MCV是從這些細(xì)胞分析值中計(jì)算得到重要項(xiàng)目中的一項(xiàng)。MCV可以由血細(xì)胞比容被紅細(xì)胞數(shù)所除，就是Ht/RBC值而得到，血細(xì)胞比容就是一個(gè)單位容積的全血中紅血球的百分含量。那么MCV就是單個(gè)紅血球的平均容積，相應(yīng)的其單位是fL、飛升、或10-15L。上述血液分析儀采用流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)器。在流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中，稀釋后的血液以高速通過一個(gè)非常細(xì)小的噴嘴導(dǎo)入流動(dòng)槽，并且，噴嘴導(dǎo)出的液流被包覆液體(層流)的圓柱形流所包圍。通過使該層流變窄，可以由此將樣品流聚集至如下程度，即該樣品流基本上呈一個(gè)細(xì)胞接一個(gè)細(xì)胞的線性序列。從而這些樣品流中細(xì)胞的通過被該層流控制，通過采用激光照射液流，用光學(xué)方法檢測該細(xì)胞，以及通過測量電阻和電導(dǎo)率，用電學(xué)方法檢測該細(xì)胞。為給上述的血液分析儀中使用的流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)器分析制備全血樣品，樣品一般必須使用抗凝劑如EDTA鹽處理，并用生理等滲溶液稀釋。作為用來稀釋整個(gè)血液的稀釋劑，一般有如下溶液例如生理鹽水、林格式溶液(Ringer’ssolution)、洛克式溶液(Lock’ssolution)和臺羅德式溶液(Tyrode’ssolution)。在前述血液分析器的分析過程中也可以使用上述稀釋劑。然而通常，每臺分析儀選用最佳稀釋劑。在制備MCV分析的全血樣品過程中，目前技術(shù)上存在的主要問題是實(shí)際的MCV會隨血液采集后經(jīng)歷的時(shí)間而改變。臨床診斷中MCV值是必要而又重要的，它應(yīng)在血樣采集后立即獲得，也就是，該值應(yīng)當(dāng)與原始血液的MCV值相一致。實(shí)踐中，作為CBC一部分的MCV值直到采集血樣72小時(shí)后才會被測量。而此時(shí)這樣的血樣再也不能產(chǎn)生適宜的MCV分析值了。血液采集后，樣品中的RBC膨脹，使得經(jīng)過采集后的經(jīng)歷時(shí)間所測得的MCV值漸漸大于原始RBC的平均容積。原始MCV才是診斷所需的真正測量。日本專利公告8-33388(1996)，日本專利公告7-82010(1995)和日本專利申請公開8-122327(1996)公開了各種含有非離子型表面活性劑的水溶液。然而，不管這些溶液中的哪一種用作流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的包覆液，都需要在流動(dòng)腔內(nèi)加入非離子型表面活性劑以消除氣泡。另外，日本專利公告1-33780(1989)公開了一種稀釋劑，在其中加入一種非離子型表面活性劑以抵銷防腐劑對紅細(xì)胞的影響，最終目的是在所測的MCV中抑制由于防腐劑而產(chǎn)生的稀釋后的變化。然而，日本專利公告1-33780沒有公開在所測的MCV中抑制因?yàn)檠獦硬杉蟮慕?jīng)歷時(shí)間而產(chǎn)生的變化的方法。如果能找到一種在血液采集72小時(shí)后測得的血細(xì)胞比容和紅細(xì)胞數(shù)與血樣原始值一致的方法，這將是本領(lǐng)域中的重要進(jìn)步。本發(fā)明使得采集后的血液經(jīng)過一段時(shí)間后分析仍能產(chǎn)生一個(gè)與該樣品原始值非常一致的MCV值，也就是與采集后立刻測量的MCV值相一致。根據(jù)本發(fā)明的試劑是一種血樣的水稀釋溶液，它包括在有限的濃度范圍內(nèi)加入少量的預(yù)定表面活性劑。用合適的物質(zhì)將該試劑的滲透壓調(diào)至預(yù)定范圍。用于本發(fā)明的試劑是一種水溶液，它包括非離子型表面活性劑和用于將滲透壓(π)調(diào)至大約150-400mOsm/Kg的一種鹽或合適的物質(zhì)。該試劑優(yōu)選的滲透壓(π)大約是230-350mOsm/Kg；特別優(yōu)選的是大約260-320mOsm/Kg的滲透壓(π)。本發(fā)明實(shí)施例中的非離子型表面活性劑的例子可以是下面任何一個(gè)。(1)R-O(CH2CH2O)nH(2)R-COO(CH2CH2O)nH(3)R-COO(CH2CH2O)nCO-R(4)(5)(6)-或-(7)其中，R代表碳數(shù)12～24的烷基鏈、烯基鏈或炔基鏈，并且n、n1+n2+n3和n1+n2+n3+n4+n5+n6代表5-70的整數(shù)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，非離子型表面活性劑包括至少一個(gè)烷基鏈，一個(gè)烯基鏈和一個(gè)炔基鏈，分別有12-24個(gè)碳原子。該非離子型表面活性劑較好包括一個(gè)聚氧乙烯鏈，該鏈上有5-70摩爾加成數(shù)的氧乙烯。作為具體例子，下面所述的非離子型表面活性劑中的任何一種都可用于根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例中。a)吐溫-80(加入20摩爾PEG的脫水山梨醇油酸酯)，Croda公司“Crillet4”。b)Steareth-20(十八醇+PEG20)，Croda公司“VolpoS-20”。c)PEG-60杏仁甘油酯(有60摩爾PEG的杏仁甘油單甘油酯和杏仁二甘油酯)，Croda公司“CrovolA-70”。d)PEG-23油酸(加入PEG23酯的油酸)，Croda公司“crodetO23”。更優(yōu)選的非離子型表面活性劑是Oleth-20(聚氧乙烯[20]油醚)。這種表面活性劑含有一個(gè)聚氧乙烯油醚的混合物，其中每分子中氧乙烯單元的平均數(shù)大約是20。將CTFAName作為上述提到物質(zhì)的總稱。應(yīng)明確，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，也可使用此處限定的非離子型表面活性劑的混合物。也應(yīng)當(dāng)明確，假如在其它方面符合此處給定的參量，在市場上買到的非離子型表面活性劑也適用于本發(fā)明。眾所周知，市場上買到的非離子型表面活性劑不是化學(xué)純材料。因此，在前述參數(shù)都可滿足的條件下，根據(jù)本發(fā)明的試劑中采用相關(guān)非離子型結(jié)構(gòu)所引入的伴生物和無關(guān)的材料，也在它們的范圍之內(nèi)。特別重要的是這些表面活性劑或混合物在鹽溶液中是透明的。該非離子型表面活性劑必需在水中完全可溶，并在最小的0.1％的重量濃度產(chǎn)生透明溶液。根據(jù)滲透壓和作為溶劑的鹽溶液的成分能夠合理確定試劑中含有的給定非離子型表面活性劑的濃度。然而，一般非離子型表面活性劑在約0.0005％～0.5％的低濃度范圍內(nèi)使用，優(yōu)選的濃度范圍是約0.001％～0.1％，最優(yōu)選是約0.005％～0.05％的范圍。根據(jù)本發(fā)明，在鹽溶液中使用非離子型表面活性劑，以此來為血液分析稀釋和穩(wěn)定血樣。該非離子型表面活性劑優(yōu)選具有10-20的親水/親油平衡值。根據(jù)本發(fā)明試劑的PH值優(yōu)選是6.0～8.5。本發(fā)明給出的試劑還包括一個(gè)用以穩(wěn)定其PH值的緩沖溶液，一個(gè)用以調(diào)節(jié)試劑溶液滲透壓的添加劑，一種防腐物質(zhì)，或一種抗氧化劑。不特別限制合適的緩沖溶液；然而磷酸鹽緩沖溶液，硼酸鹽緩沖溶液，三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸(tris)緩沖溶液，咪唑緩沖溶液等都是優(yōu)選的。不特別限定用于調(diào)整試劑PH值的合適物質(zhì)，但例如，它們可以是鹽酸或氫氧化鈉。不特別限定用于調(diào)整滲透壓的合適物質(zhì)，例如，可以使用至少一種選自氯化鈉或氯化鉀的堿金屬鹽或堿土金屬鹽。或者，也可使用象蔗糖、葡萄糖等糖類或聚乙二醇。根據(jù)本發(fā)明的方法包括a)抗凝處理步驟，其中用抗凝劑處理血樣；b)稀釋步驟，其中用含有表面活性劑的試劑溶液稀釋經(jīng)抗凝劑處理的血樣，確保樣品中的紅血球形態(tài)發(fā)生變化；c)分析步驟，其中，血樣在取血后經(jīng)過例如至少48小時(shí)的時(shí)間后接著稀釋步驟用顆粒分析儀進(jìn)行分析。本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)方面是，在顆粒分析儀中基于電阻原理進(jìn)行血液分析；層流電阻裝置是更優(yōu)選的。該分析過程可以是這樣一個(gè)過程，在經(jīng)過至少72小時(shí)的時(shí)間后接著稀釋步驟用顆粒分析儀分析血液。分析前，全血需用抗凝劑進(jìn)行處理。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的抗凝處理是，血液被采集后立即將適量例如EDTA鹽的抗凝劑加到全血樣品中去。以下給出一個(gè)抗凝劑例子的分子式EDTA-3K優(yōu)選使用真空血液采集管獲取樣品，并優(yōu)選是在血液采集時(shí)就用抗凝結(jié)劑處理該樣品。本發(fā)明的稀釋溶液強(qiáng)迫血樣紅血球中的形態(tài)變化，并且與血樣作用可高達(dá)至少72小時(shí)，因此能產(chǎn)生與那些樣品采集后立即測定所取得的數(shù)據(jù)相一致的MCV結(jié)果。本發(fā)明的作用機(jī)理還沒有被證明。但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用調(diào)整到預(yù)定滲透壓的溶液稀釋血樣并含有預(yù)表面活性劑，能迫使血樣的紅血球發(fā)生形態(tài)變化，就保持了所分析的MCV的一致性。該形態(tài)變化達(dá)到一定程度使得采集后經(jīng)過一段時(shí)間后，測得的紅血球的MCV值能與血樣采集后立即測得的MCV值在診斷可接受的范圍內(nèi)相等。所以，本發(fā)明可提供貫穿血樣整個(gè)診斷過程中一致的MCV值。根據(jù)本發(fā)明，通過將新采集的血樣和已經(jīng)過72小時(shí)的血樣懸浮到稀釋溶液試劑中，并分別用顯微鏡檢測樣品，可證明該觀點(diǎn)。在這兩個(gè)樣品中都發(fā)現(xiàn)了類似程度的裂口紅細(xì)胞。通過使用一種根據(jù)本發(fā)明的試劑，可以限制血樣的MCV隨時(shí)間的變化。在樣品采集和其后的至少72小時(shí)之內(nèi)，不同時(shí)間所測得的MCV分析的差異能被控制在大約±4(fL)內(nèi)，在診斷可接受的范圍內(nèi)這是很好的。本發(fā)明前述和其它的目的、特征、方面和優(yōu)點(diǎn)從下面的詳細(xì)描述中將更為清楚。實(shí)施例1用EDTA-3K抗凝結(jié)劑處理血樣。然后分別在血樣剛采集后和采集后72小時(shí)使用Sysmex公司的自動(dòng)血液分析儀SE-9500進(jìn)行MCV分析。血樣應(yīng)在25℃下儲存。試劑A(傳統(tǒng)型)15mM磷酸鹽緩沖溶液用氯化鈉將該試劑的滲透壓調(diào)至大約250mOsm/Kg，和試劑B15mM磷酸鹽緩沖溶液；0.015％的聚氧乙烯(20)油醚用氯化鈉將該試劑的滲透壓調(diào)至大約320mOsm/Kg，用氫氧化鈉將它的PH值調(diào)到大約7.8。實(shí)施例2用EDTA-3K抗凝結(jié)劑處理血樣。然后分別在血樣剛采集后和采集后48小時(shí)使用Sysmex公司的自動(dòng)血液分析儀SE-9500進(jìn)行MCV分析。血樣應(yīng)在25℃下儲存。試劑A15mM磷酸鹽緩沖溶液用氯化鈉將該試劑的滲透壓調(diào)至大約250mOsm/Kg，用氫氧化鈉將它的PH值大約調(diào)到7.8。試劑C15mM磷酸鹽緩沖溶液；用氯化鈉將該試劑的滲透壓調(diào)至大約285mOsm/Kg，用氫氧化鈉將它的PH值大約調(diào)到7.8。試劑D15mM磷酸鹽緩沖溶液；0.015％的聚氧乙烯(20)油醚用氯化鈉將該試劑的滲透壓調(diào)至大約285mOsm/Kg，用氫氧化鈉將它的PH值大約調(diào)到7.8。結(jié)果表明稀釋劑滲透壓的增加設(shè)有對采樣后經(jīng)過一段時(shí)間的血樣MCV值變化產(chǎn)生控制。然而，稀釋劑中非離子表面活性劑的加入對控制MCV的變化中被證明有很好的效果。實(shí)施例3在實(shí)施例3中，采用通過改變試劑D的滲透壓制得的試劑測量MCV值的變化。試劑滲透壓可通過改變氯化鈉的加入量來調(diào)節(jié)。血樣應(yīng)在25℃下儲存。使用Sysmex公司的自動(dòng)血液分析儀SE-9500分析樣品以測定MCV值。試劑Dπ＝285mOsm/Kg(PH7.8)試劑Eπ＝250mOsm/Kg(PH7.8)試劑Fπ＝268mOsm/Kg(PH7.8)試劑Gπ＝300mOsm/Kg(PH7.8)試劑Hπ＝320mOsm/Kg(PH7.8)實(shí)施例3-2平均細(xì)胞飛升容積(fL)結(jié)果表明，通過將試劑的滲透壓保持在260-320mOsm/kg的范圍之內(nèi)，MCV的變化可以控制在±4(fL)之內(nèi)。在該滲透壓范圍之內(nèi)，較高的滲透壓對MCV變化有更強(qiáng)的控制力。實(shí)施例4在實(shí)施例4中，將不同濃度的非離子表面活性劑聚氧乙烯(20)油醚加到試劑A中，通過采用由此制得的試劑測量MCV值的變化。血樣應(yīng)在25℃下儲存。使用Sysmex公司的自動(dòng)血液分析儀SE-9500分析樣品以測定MCV值。試劑A0.000％非離子表面活性劑試劑E0.015％非離子表面活性劑試劑I0.150％非離子表面活性劑試劑J0.300％非離子表面活性劑</tables>該結(jié)果表明寬濃度范圍內(nèi)的非離子表面活性劑對控制MCV值的變化比較有效。實(shí)施例5通過在試劑E中加入大約0.015％的聚氧乙烯(20)油醚制備實(shí)施例5中的試劑，然后用下列物質(zhì)將該稀釋劑的滲透壓調(diào)至285mOsm/Kg。試劑D氯化鈉試劑K蔗糖試劑L葡萄糖試劑M聚乙二醇(分子量400)在實(shí)施例5中測定用來調(diào)節(jié)試劑滲透壓的上述物質(zhì)對MCV變化的影響。血樣應(yīng)在25℃下儲存。使用Sysmex公司的自動(dòng)血液分析儀SE-9500分析樣品以測定MCV值。一般用來調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)并不僅限于實(shí)施例5-1和實(shí)施例5-2中所給出的。然而，該結(jié)果表明鹽、糖和聚氧乙烯油醚是比較好的。選擇這幾個(gè)實(shí)施例僅是為了解釋本發(fā)明，很明顯，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在該公開文本的基礎(chǔ)上作出變化和修改，而不脫離由本發(fā)明附加權(quán)利要求和它們的等同物所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種用于MCV分析的血樣稀釋劑，所述的試劑是水溶液，它包括至少一種非離子表面活性劑；和一種用于將該水溶液滲透壓調(diào)至大約150～400mOsm/Kg的物質(zhì)；其中選擇所述非離子表面活性劑和用于調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)，以使所述的稀釋劑能確保采集后經(jīng)過一段時(shí)間后的血樣的MCV測定值與血樣采集后立即測定所得的MCV值在診斷可接受的范圍一致。2.如權(quán)利要求1所述的血樣稀釋劑，其中滲透壓調(diào)至大約230～350mOsm/Kg。3.如權(quán)利要求2所述的血樣稀釋劑，其中滲透壓調(diào)至大約260～320mOsm/Kg。4.如權(quán)利要求1所述的血樣稀釋劑，其中所述的非離子表面活性劑選自以下一組物質(zhì)(1)R-O(CH2CH2O)nH(2)R-COO(CH2CH2O)nH(3)R-COO(CH2CH2O)nCO-R(4)(5)(6)-或-(7)其中，R代表碳數(shù)為12～24的烷基鏈、烯基鏈或炔基鏈，并且n、n1+n2+n3和n1+n2+n3+n4+n5+n6代表5-70的整數(shù)。5.如權(quán)利要求5所述的血樣稀釋劑，其中所述的非離子表面活性劑是聚氧乙烯(20)油醚。6.如權(quán)利要求1所述的血樣稀釋劑，其中所述的非離子表面活性劑具有10-20的親水/親油平衡值。7.如權(quán)利要求1所述的血樣稀釋劑，其中所述的非離子表面活性劑在水溶液中的濃度是5.0×10-4％到5.0×10-1％。8.如權(quán)利要求1所述的血樣稀釋劑，其中所述的稀釋劑的PH值是6.0-8.5。9.一種對保存高達(dá)至少72小時(shí)的血樣進(jìn)行MCV分析的方法，該方法包括用抗凝劑處理所采集的血樣的步驟；采用稀釋劑稀釋經(jīng)抗凝劑處理的血樣的步驟，目的在于確保血樣中的紅血球發(fā)生形態(tài)變化，而以便使采集后經(jīng)過一段時(shí)間后的血樣的MCV測定值與血樣采集后立即測定所得的MCV值在診斷可接受的范圍保持一致；和用顆粒分析儀分析血樣獲得MCV值的步驟。10.如權(quán)利要求9所述的MCV分析方法，其中所述血樣的分析步驟中，顆粒分析儀采用電阻原理。11.如權(quán)利要求10所述的MCV分析方法，其中所述的顆粒分析儀是通過層流電阻原理分析的。12.如權(quán)利要求9所述的MCV分析方法，其中稀釋劑水溶液中含有至少一種非離子表面活性劑，以及一種用于將該水溶液的滲透壓調(diào)至大約150-400mOsm/Kg的物質(zhì)。13.如權(quán)利要求12所述的MCV分析方法，其中稀釋劑包括至少一種選自以下一組物質(zhì)的非離子表面活性劑(1)R-O(CH2CH2O)nH(2)R-COO(CH2CH2O)nH(3)R-COO(CH2CH2O)nCO-R(4)(5)(6)-或-(7)其中R代表碳數(shù)12～24的烷基鏈、烯基鏈或炔基鏈，并且n、n1+n2+n3和n1+n2+n3+n4+n5+n6代表5-70的整數(shù)。14.如權(quán)利要求13所述的MCV分析方法，其中非離子表面活性劑是聚氧乙烯(20)油醚。15.如權(quán)利要求12所述的MCV分析方法，其中非離子表面活性劑具有10-20的親水/親油平衡值。16.如權(quán)利要求12所述的MCV分析方法，其中非離子表面活性劑在水溶液中的濃度是5.0×10-4％到5.0×10-1％。17.如權(quán)利要求12所述的MCV分析方法，其中稀釋劑的PH值是6.0-8.5。全文摘要一種MCV分析方法,它包括如下步驟:血樣采集后立即用抗凝結(jié)劑處理;用一種含有預(yù)定滲透濃度的預(yù)定表面活性劑的試劑稀釋采集后經(jīng)抗凝結(jié)劑處理并且經(jīng)過至少72小時(shí)時(shí)間的血樣,以強(qiáng)制血樣中的紅血球發(fā)生形態(tài)變化;并使用顆粒分析儀分析該血樣。該試劑包括一種非離子表面活性劑,一種用來調(diào)節(jié)滲透壓的鹽,和水,該試劑的滲透壓(π)大約是150—400mOsm/kg,pH值是6.0—8.5。表面活性劑的濃度是0.0005%到0.5%,并具有10—20的親水/親油平衡(HLB)。文檔編號G01N33/49GK1276526SQ0010639公開日2000年12月13日申請日期2000年6月2日優(yōu)先權(quán)日1999年6月2日發(fā)明者B·豪溫,內(nèi)橋欣也,浜口行雄,R·馬斯特申請人:希森美康株式會社