專利名稱：一種用于檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)學(xué)檢測(cè)方法。
甲胎蛋白(AFP)檢測(cè)是用于肝癌早期診斷的首要方法，甲胎蛋白異質(zhì)體的檢測(cè)是目前用于區(qū)分肝癌和非癌所產(chǎn)生的甲胎蛋白的唯一方法。在第四屆全國(guó)肝癌學(xué)術(shù)交流會(huì)上，已作為原發(fā)性肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，推薦給醫(yī)師使用。崔貞福等(中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1986，9(3)154-155)介紹了親和交叉免疫電泳自顯影法檢測(cè)甲胎蛋白糖鏈異質(zhì)體。關(guān)賽芳等(腫瘤，1990，10(1)38-39)介紹了Western免疫酶標(biāo)印跡法鑒別異源性AFP分子變異體。韓玲，等(上海免疫學(xué)雜志，1993，13(4)227-228)介紹了人甲胎蛋白異質(zhì)體直接固相時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定。目前使用的檢測(cè)方法，主要存在的問題是1)檢測(cè)花費(fèi)時(shí)間多，需要3天才能出結(jié)果。
2)需要使用放射性同位素，因此無(wú)論在試劑制備(125-碘標(biāo)記抗甲胎蛋白抗體)，還是在醫(yī)院使用，都存在同位素污染的問題。
3)在制備含凝聚素的瓊脂糖膠時(shí)，質(zhì)量不容易控制；因?yàn)槟鬯厥且环N植物蛋白，對(duì)熱敏感，而瓊脂糖膠在50℃以下，就會(huì)凝固。因此，制備時(shí)要在不低于56℃時(shí)加入凝聚素，質(zhì)量不容易控制。此外，受不同批號(hào)的凝聚素、瓊脂糖和聚合度的影響，使檢驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定。
4)檢驗(yàn)結(jié)果是通過放射自顯影來(lái)獲得，需要膠片沖洗設(shè)備。曝光不足或顯影不良都會(huì)影響結(jié)果。
5)由于瓊脂糖膠的保存問題難以解決，故試劑標(biāo)準(zhǔn)化問題難以解決，無(wú)法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的在于提供一種不存在放射性污染、不需要專門設(shè)備、有利于標(biāo)準(zhǔn)化、便于醫(yī)院檢驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量控制、檢測(cè)快速的用于檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的方法。
用于檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的方法是1)將醋酸纖維素膜條帶的兩端浸泡于巴比妥緩沖液中，取出后吸干。
2)取待檢血清1～2μL與1～5mg/mL的植物凝聚素1～10μL預(yù)先混合，在室溫下放置待用。
3)將混合血清滴加到醋酸纖維素膜的一端，在其另一端滴加標(biāo)記抗甲胎蛋白抗體，再吹干。
4)將加好待測(cè)樣品的醋酸纖維素膜放在電泳槽上，加入電泳緩沖液，并通電電泳。
5)電泳后取下醋酸纖維素膜，用生理鹽水浸泡洗滌，洗去未結(jié)合的物質(zhì)，吸干后觀察結(jié)果若為甲胎蛋白異質(zhì)體陽(yáng)性的肝癌血清，則有2條帶，而其他甲胎蛋白陽(yáng)性的肝病病人血清，則僅有1條帶；不產(chǎn)生甲胎蛋白的肝病病人，則不出現(xiàn)條帶。
在已有技術(shù)中，是將凝聚素加入到瓊脂糖膠中，使其在電泳過程中完成甲胎蛋白異質(zhì)體與植物凝聚素的結(jié)合，從而達(dá)到區(qū)分的目的。而本發(fā)明的技術(shù)關(guān)鍵是血清與植物凝聚素預(yù)先混合，讓甲胎蛋白異質(zhì)體與植物凝聚素預(yù)先結(jié)合，再用電泳分離此結(jié)合物。因此本發(fā)明從根本上克服我們?cè)诒尘凹夹g(shù)部分所指出的困難，其主要優(yōu)點(diǎn)是1)可以快速檢測(cè)，一小時(shí)可獲得結(jié)果。
2)若使用了熒光素標(biāo)記物，不存在放射性污染，同時(shí)也就不需要放射自顯影，節(jié)省了膠片和沖洗設(shè)備，醫(yī)院減少了設(shè)備投資，可通過紫外燈(如驗(yàn)鈔儀)直接觀察，降低了檢驗(yàn)費(fèi)用。
3)由于通過免疫電泳方法濃縮熒光素標(biāo)記物，不需要專門設(shè)備(用熒光顯微鏡或熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光)，使基層醫(yī)院都可以使用，有利于肝癌的早期檢測(cè)和早期診斷。
4)通過檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，有利于對(duì)各醫(yī)院的檢驗(yàn)結(jié)果的比較，使醫(yī)院檢驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量控制得以實(shí)現(xiàn)。
5)節(jié)省植物凝聚素，因?yàn)橹参锬鬯厥莾r(jià)格昂貴的制品，每克高達(dá)1800元，因此可降低試劑成本。
6)由于采用預(yù)先混合凝聚素的方法，就沒有必要用瓊脂糖膠分離甲胎蛋白異質(zhì)體，可以用醋酸纖維素膜代替瓊脂糖，從而降低成本。
7)不需要制備瓊脂糖，解決了試劑的保存問題(以往都是臨時(shí)制備)，因此有利于甲胎蛋白異質(zhì)體檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)化，可以進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
實(shí)施例1為了進(jìn)行甲胎蛋白異質(zhì)體的快速檢測(cè)，需先準(zhǔn)備有關(guān)試劑和材料1)巴比妥緩沖液，PH8.6，用于電泳，巴比妥鈉10.3g，0.25N HCl 38.2mL，NaN30.1g，加無(wú)離子水至1000mL；2)醋酸纖維素膜；3)標(biāo)記抗甲胎蛋白抗體；4)植物凝聚素；5)電泳儀和平板電泳槽。以下給出具體方法1)將8cm×10cm醋酸纖維素膜用鉛筆劃成1cm寬的條帶，并在兩端各1cm處劃線，浸入巴比妥緩沖液中浸泡后取出，用濾紙吸干。
2)取待檢血清3μL，與2mg/mL的伴刀豆凝聚素ConA 1μL混合，室溫下放置待用。
3)將混合血清滴加到醋酸纖維素膜的一端，在另一端滴加熒光素標(biāo)記抗甲胎蛋白抗體5μL，用電吹風(fēng)吹干。
4)將加好待測(cè)樣品的醋酸纖維素膜放到電泳槽上，其中血清端為陰極，熒光素標(biāo)記抗甲胎蛋白抗體端為陽(yáng)極，用濾紙作電極橋，按15～20V/cm調(diào)整電壓，通電電泳25～30min。
5)電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，取下醋酸纖維素膜，用生理鹽水浸泡洗滌，洗去未結(jié)合的物質(zhì)，取出后用濾紙吸干，置于紫外燈下觀察。
6)結(jié)果甲胎蛋白異質(zhì)體陽(yáng)性的肝癌血清有二條帶，而其它甲胎蛋白陽(yáng)性的肝病病人血清，僅有一條帶；甲胎蛋白陰性的病人不出現(xiàn)條帶。
實(shí)施例2將8cm×12cm醋酸纖維素膜用鉛筆劃成1.2cm寬的條帶，并在兩端各1.2cm處劃線，浸入巴比妥緩沖液中浸泡后取出，用濾紙吸干。取待檢血清15～2μL，與4～5mg/mL的植物凝聚素ConA 8～10μL混合，室溫下放置待用，將混合血清滴加到醋酸纖維素膜的一端，在另一端滴加常和的酶聯(lián)免疫標(biāo)記物如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶1～5μL，用電吹風(fēng)吹干。將加好待測(cè)樣品的醋酸纖維素膜放到電泳槽上，按10～15V/cm調(diào)整電壓，通電電泳45～60min。電泳結(jié)束后，取下醋酸纖維素膜，用生理鹽水浸泡洗滌，取出后吸干再觀察。可通過酶底物系統(tǒng)顯色。
實(shí)施例3將長(zhǎng)為8cm的醋酸纖維素膜處理后浸入巴比妥緩沖液中，取待檢血清1～2μL，與3～4mg/mL的小豌豆凝聚素2～4μL混合，室溫下放置待用。將混合血清滴加到醋酸纖維素膜的一端，在另一端滴加常用的酶聯(lián)免疫標(biāo)記物如酸性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，D-半乳糖苷酶或生物素等標(biāo)記抗甲胎蛋白抗體1～5μL，用電吹風(fēng)吹干，也可以用小濾紙條滴加血清或抗體后放到上面。將加好待測(cè)樣品的醋酸纖維素膜放到電泳槽上，按2～5V/cm調(diào)整電壓，通電電泳20～25min，電泳后的做法與實(shí)施例2相同。
實(shí)施例4將10cm×14cm醋酸纖維素膜劃成1cm寬的條帶，并在兩端劃線，浸入巴比妥緩沖液中浸泡后取出吸干。取待檢血清5～10μL，與2～3mg/mL的小扁豆凝聚素5～7μL混合，室溫下放置待用，將混合血清滴加到醋酸纖維素膜的一端，在另一端滴加熒光素標(biāo)記抗甲胎蛋白抗體1～5μL，吹干，也可用小濾紙條滴加血清或抗體后放到上面。將加好待測(cè)樣品的醋酸纖維素膜放到電泳槽上，按6～10V/cm調(diào)整電壓，通電電泳35～40min，電泳結(jié)束后取下醋酸纖維素膜，用生理鹽水浸泡洗滌，取出后吸干置于紫外燈下觀察，即可得出結(jié)果，不需進(jìn)行底物顯色。
用熒光素標(biāo)記的抗甲胎蛋白抗體是用熒光素取代125-碘標(biāo)記的抗甲胎蛋白抗體，常用熒光素如異硫氰酸熒光素(FITC)、二氯三嗪基氨基熒光素(DTAF)、四乙基羅丹明(RB200)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TMRITC)等。制備熒光素標(biāo)記的甲胎蛋白抗體的方法以熒光素FITC為例說(shuō)明如下取30mL的抗甲胎蛋白抗體溶液，配制3mg(相不于甲胎蛋白抗體蛋白量為1/100)的FITC，將FITC緩慢滴加入抗體溶液中，注意測(cè)定溶液的PH保持在9.0～9.5。熒光素加畢，將反應(yīng)物移入冰箱攪拌。將標(biāo)記溶液裝入透析袋中，在流水中透析，再移入1000～2000mL的0.01mol/L PH7.2磷酸緩沖液(PBS)中，在冰箱中繼續(xù)透析。用葡聚糖凝膠(Sephadex)G-25(或G-50)柱(1.2×30cm)，在0.01mol/L PH7.2磷酸緩沖液(PBS)平衡后，加入透析液，用相同的PBS溶液洗脫，收集第一著色峰，即為所需的產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的方法，其特征在于1)將醋酸纖維素膜條帶的兩端浸泡于巴比妥緩沖液中，取出后吸干；2)取待檢血清1～20μL與1～5mg/mL的植物凝聚素1～10μL預(yù)先混合，在室溫下放置待用；3)將混合血清滴加到醋酸纖維素膜的一端，在另一端滴加標(biāo)記抗甲胎蛋白抗體，再吹干；4)將加好待測(cè)樣品的醋酸纖維素膜放在電泳槽上，并通電電泳；5)電泳后取下醋酸纖維素膜，用生理鹽水浸泡洗滌，吸干后觀察結(jié)果若為甲胎蛋白異質(zhì)體陽(yáng)性的肝癌血清，則有2條帶；而其他甲胎蛋白陽(yáng)性的肝病病人血清，則僅有1條帶；甲胎蛋白陰性的病人不出現(xiàn)條帶。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的方法，其特征在于所說(shuō)的待檢血清為3μL-與2mg/mL的植物凝聚素1μL預(yù)先混合。
3.如權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的方法，其特征在于所說(shuō)的植物凝聚素為伴刀豆凝聚素，小豌豆凝聚素或小扁豆凝聚素。
4.如權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的方法，其特征在于所說(shuō)的抗甲胎蛋白抗體用酶聯(lián)免疫標(biāo)記物，如辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，酸性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，D-半乳糖苷酶或生物素標(biāo)記，電泳后用各自的酶底物顯色。
5.如權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的方法，其特征在于所說(shuō)的抗甲胎蛋白抗體用熒光素標(biāo)記物，電泳后醋酸纖維素膜用紫外燈觀察。
6.如權(quán)利要求3所述的一種用于檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的方法，其特征在于所說(shuō)的植物凝聚素用伴刀豆凝聚素ConA。
全文摘要
涉及一種醫(yī)學(xué)檢測(cè)法。檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體的方法是將醋酸纖維素膜條帶兩端浸泡于緩沖液中,后吸干,取待檢血清與植物凝聚素預(yù)先混合,再將混合血清滴加到醋酸纖維素膜的一端,另一端加標(biāo)記抗甲胎蛋白抗體,通電電泳,后觀察結(jié)果。因血清與植物凝聚素預(yù)先混合,即讓甲胎蛋白異質(zhì)體與植物凝聚素預(yù)先結(jié)合,再用電泳分離此結(jié)合物,故檢測(cè)快速,不需制備傳統(tǒng)的瓊脂糖,有利于標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化生產(chǎn),不存在放射性污染,節(jié)省設(shè)備,降低成本。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1278065SQ0011937
公開日2000年12月27日 申請(qǐng)日期2000年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月13日
發(fā)明者廖綿初, 干侶仙 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)