專利名稱：肝細(xì)胞生成素自分泌循環(huán)在診斷和治療肝癌方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝細(xì)胞生成素自分泌循環(huán)在診斷和治療肝癌方面的應(yīng)用。
肝細(xì)胞生成素(Hepatopoietin，HPO)是一種新型肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，具有刺激肝再生、緩解CCl4和D-氨基半乳糖引起的肝損傷及刺激原代肝細(xì)胞增殖等作用。
據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，在城鎮(zhèn)居民中，肝癌已上升為我國(guó)第二位癌癥殺手，但目前還缺乏診斷和治療肝癌的有效方法。
本發(fā)明的目的是提供一種診斷和治療肝癌的新靶點(diǎn)。
本發(fā)明的發(fā)明人以體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞系HepG2、Bel-7402和SMMC-7721為模型，意外地發(fā)現(xiàn)并證明肝癌細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞生成素及其特異性受體，并可分泌肝細(xì)胞生成素到細(xì)胞培養(yǎng)液中；外加肝細(xì)胞生成素對(duì)原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞具有增殖刺激作用；肝癌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基對(duì)其自身具有增殖刺激作用，肝細(xì)胞生成素中和抗體可降低這種作用；肝細(xì)胞生成素中和抗體可部分抑制肝癌細(xì)胞的自主性生長(zhǎng)。綜合這些結(jié)果，表明在體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中存在維持其自主性生長(zhǎng)的肝細(xì)胞生成素自分泌循環(huán)。
用ELISA方法檢測(cè)到肝細(xì)胞生成素在細(xì)胞裂解液和條件培養(yǎng)液中均有表達(dá)。肝細(xì)胞生成素在細(xì)胞中的表達(dá)量約為3納克/105細(xì)胞，在培養(yǎng)液中的表達(dá)量約為1×106細(xì)胞培養(yǎng)60小時(shí)，分泌肝細(xì)胞生成素約5納克。
利用肝細(xì)胞生成素自分泌循環(huán)可以為診斷和治療肝癌的提供新方法。


圖1為用RT-PCR檢測(cè)肝細(xì)胞生成素mRNA在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果。
圖2為用Western blot檢測(cè)肝細(xì)胞生成素mRNA在肝癌細(xì)胞中表達(dá)結(jié)果。
圖3為ELISA測(cè)定肝細(xì)胞生成素方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖4顯示肝細(xì)胞生成素特異性抗體完全封閉了重組人肝細(xì)胞生成素對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖刺激作用。
圖5顯示HepG2細(xì)胞的濃縮條件培養(yǎng)液對(duì)肝癌細(xì)胞有增殖刺激作用。
圖6顯示肝細(xì)胞生成素特異性抗體可降低HepG2細(xì)胞的濃縮條件培養(yǎng)液對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖刺激作用。
圖7顯示肝細(xì)胞生成素特異性抗體可抑制肝癌細(xì)胞的自主性生長(zhǎng)。
下面用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞系表達(dá)肝細(xì)胞生成素1.肝癌細(xì)胞HepG2、Bel-7402和SMMC-7721表達(dá)肝細(xì)胞生成素mRNA。用肝細(xì)胞生成素特異性引物，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分別在上述三種肝癌細(xì)胞HepG2、Bel-7402和SMMC-7721中擴(kuò)增出長(zhǎng)為375bp的特異性DNA片段。
2.肝癌細(xì)胞HepG2、Bel-7402和SMMC-7721表達(dá)肝細(xì)胞生成素蛋白。用肝細(xì)胞生成素親和純化的抗體，通過(guò)Western blot檢測(cè)到在上述三種肝癌細(xì)胞HepG2、Bel-7402和SMMC-7721中有特異性蛋白表達(dá)，分子量約為25KD。
實(shí)施例2ELISA測(cè)定肝細(xì)胞生成素方法的建立肝細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)品溶解于包被液(含1％BSA的PBS)，加入平底96孔ELISA板，4℃包被過(guò)夜。
棄抗原，用TTBS洗板6次；在室溫下用封閉液封閉4小時(shí)，用TTBS洗板4次；在37℃下，抗肝細(xì)胞生成素抗體孵育1小時(shí)，用TTBS洗板6次；在37℃下，biotinylated anti-mouse IgG孵育30分鐘，用TTBS洗板6次；在37℃下，horseradish peroxidsce streptavidin孵育30分鐘，用TTBS洗板6次；用ELISASubstrate Kit顯色，用microplate spectrophotometer在405納米讀取收據(jù)。
以此方法測(cè)定樣品中肝細(xì)胞生成素的含量，肝細(xì)胞生成素的含量和相應(yīng)的吸光值在.0.5納克到8納克成線性關(guān)系。
權(quán)利要求
1.肝細(xì)胞生成素自分泌循環(huán)在診斷和治療肝癌中的應(yīng)用，其特征在于所說(shuō)的肝細(xì)胞生成素自分泌循環(huán)表現(xiàn)為肝癌細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞生成素及其特異性受體，并可分泌肝細(xì)胞生成素到細(xì)胞培養(yǎng)液中；外加肝細(xì)胞生成素對(duì)原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞具有增殖刺激作用；肝癌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基對(duì)其自身具有增殖刺激作用，肝細(xì)胞生成素中和抗體可降低這種作用；肝細(xì)胞生成素中和抗體可部分抑制肝癌細(xì)胞的自主性生長(zhǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及肝細(xì)胞生成素自分泌循環(huán)在診斷和治療肝癌方面的應(yīng)用,肝細(xì)胞生成素自分泌循環(huán)表現(xiàn)為肝癌細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞生成素及其特異性受體,并可分泌肝細(xì)胞生成素到細(xì)胞培養(yǎng)液中;外加肝細(xì)胞生成素對(duì)原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞具有增殖刺激作用;肝癌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基對(duì)其自身具有增殖刺激作用,肝細(xì)胞生成素中和抗體可降低這種作用;肝細(xì)胞生成素中和抗體可部分抑制肝癌細(xì)胞的自主性生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)G01N33/574GK1358541SQ00128248
公開(kāi)日2002年7月17日 申請(qǐng)日期2000年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月14日
發(fā)明者賀福初, 李勇, 邢桂春, 王清明, 陳吉中, 陳惠鵬 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所