經(jīng)過修飾的豬促生長素多肽和其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供經(jīng)過修飾的豬促生長素多肽和其用途。
【專利說明】經(jīng)過修飾的豬促生長素多肽和其用途
[0001]本申請是國際申請日為2010年12月21日的國際申請PCT/US2010/061671進入中國、申請?zhí)枮?01080058897.3的題為“經(jīng)過修飾的豬促生長素多肽和其用途”的發(fā)明專利申請的分案申請。
【技術(shù)領域】
[0002]本發(fā)明涉及任選用至少一個非天然編碼的氨基酸修飾的豬促生長素(pST)多肽?！颈尘凹夹g(shù)】
[0003]一些生物活性多肽只通過腸胃外投予極少劑量就能實現(xiàn)長期的活性，而一些生物活性多肽則需要達到足夠血清濃度和/或在血清中的半衰期很短以致必須投予相當大劑量才能在較長時間(例如一周或更長時間)內(nèi)提供所需的生物作用。促生長素(生長激素)是此類多肽的一個實例。
[0004]為了防止某些多肽不合需要地迅速釋放到動物的血流中，已經(jīng)利用可任選含有水合作用阻滯劑(抗水合劑)的液體媒劑或結(jié)合進一步降低多肽在體液中的溶解性的金屬或金屬化合物來腸胃外投予這些多肽。為避免對無法接受的大量此類媒劑的需求，且出于包括優(yōu)良的長期釋放性能在內(nèi)的其它原因，宜采用含相當高濃度所述多肽的媒劑，例如，如頒予詹姆斯C.米奇爾(James C.Mitchell)的美國專利第5，739，108號、讓渡于艾利李莉(EliLilly)的美國專利第4，977，140號、讓渡于盧克有限公司(Lucky，Ltd.)的美國專利第5，520，927號和讓渡于LG化學品有限公司(LG Chemicals Ltd.)的美國專利第5，744，163號中所示。然而，仍需要改進使這些多肽以生物活性形式釋放到動物的血流中的效率(“生物利用率”)和/或在一些效用中其提供所需的動物生理反應的有效性(“功效”)。這些因素每一者都可實質(zhì)上影響實現(xiàn)所需生物作用而必須投予的多肽量，并由此實質(zhì)上影響每次投藥的成本。多肽(例如促生長素)可在使用重組DNA轉(zhuǎn)化的原核生物體中產(chǎn)生，但仍然需要能提供改進的促生長素多肽(包括具有較長血清半衰期的促生長素多肽)的蛋白質(zhì)調(diào)配物。用于投予生物活性組合物的各種方法和裝置先前已經(jīng)揭示于公開案中，且這些示范性公開案中的一些包括:克里斯特森(Christensen)等人，W097/03692，揭示一種生長激素與鋅以及任選使用的賴氨酸或鈣離子的調(diào)配物。以此方式配制的生長激素對脫酰胺作用顯示出抗性。
[0005]董(Dong)等人，WO 00/13674，揭示一種定時釋放藥物的機構(gòu)。此機構(gòu)包含一種裝載膠囊的具有半透性壁的容器，所述膠囊包含藥物調(diào)配物、柱塞(piston)和滲透性組合物。這種給藥機構(gòu)以受控制的速率在長達24小時時間內(nèi)通過通路釋放藥物調(diào)配物。艾克雷博(Ekwuribe)，美國專利第5，359, 030號、第5，438，040號和第5，681，811號，揭示一種穩(wěn)定的結(jié)合肽復合物，其包含以結(jié)合方式與包括親脂性部分和親水性部分的聚合物偶合的肽，適于腸胃外和非腸胃外投藥。福格森(Ferguson)等人，美國專利第4，977，140號，揭示一種持續(xù)釋放調(diào)配物，其包含在載劑中的豬促生長素，所述載劑包含蠟(以重量計約1%到20% )和油(以重量計約80%到99% ) ο當注射于乳牛中時，此調(diào)配物使產(chǎn)奶量增加，持續(xù)28天。漢密爾頓(Hamilton)等人,美國專利第4，816，568號,揭示動物生長激素與穩(wěn)定劑的組合物。所述穩(wěn)定劑可溶于水溶液中，并且一般極性極高。教示的這些穩(wěn)定劑包括多元醇、氨基酸、在生理PH下具有帶電側(cè)基的氨基酸聚合物以及膽堿衍生物。此組合物的水性調(diào)配物可通過以下方式形成:(i)將穩(wěn)定劑分散于水溶液中，和(ii)隨后添加生長激素。固體調(diào)配物可通過以下方式形成:(i)混合穩(wěn)定劑與生長激素，(?)任選添加佐劑、粘合劑等到組合物中，和(iii)壓縮組合物，形成片劑或丸粒。
[0006]金(Kim)等人，美國專利第5，520，927號，揭示一種腸胃外投予的緩慢釋放生物活性藥物組合物，其包含促生長素、至少一種生育酚化合物和延遲釋放劑。金等人，美國專利第5，744，163號，揭示一種供持續(xù)釋放動物生長激素的調(diào)配物。此調(diào)配物包含用生物可降解聚合物和泊洛沙姆(poloxamer)構(gòu)成的膜包覆含促生長素的丸?！，敼诺?Magruder)等人，美國專利第5，034，229號，揭示一種用于向動物遞送例如生長激素等有益試劑的裝置。此裝置還可遞送多元醇作為一種粘度調(diào)節(jié)方式。馬汀(Martin)，EP 0216 485，揭示一種制備生長激素與過渡金屬的絡合物的方法。還描述通過用過渡金屬與生長激素的絡合物處理動物來促進動物生長的方法。米奇爾(Mitchell)，美國專利第5，739，108號，揭示生物活性多肽的延長釋放調(diào)配物，其包含以重量計約10%到以重量計約50%多肽于生物相容性油中的分散液。此多肽可與無毒金屬或金屬鹽締合。所述調(diào)配物還可包含抗水合劑，例如單硬脂酸鋁。皮卡(Pikal)等人，美國專利第5，612，315號，揭示用于腸胃外投予人生長激素的調(diào)配物，其包含人生長激素、甘氨酸和甘露糖醇。揭示的調(diào)配物被描述為提供針對蛋白質(zhì)聚集的穩(wěn)定作用。雷曼(Raman)等人，美國專利第5，356，635號，揭示一種持續(xù)釋放組合物，其包含生物活性劑，例如促生長素；生物可降解的非晶形碳水化合物玻璃基質(zhì)，其內(nèi)例如分散有促生長素；和疏水性物質(zhì)。所述非晶形碳水化合物玻璃基質(zhì)包含非晶形碳水化合物和再結(jié)晶延遲劑，并占組合物重量的約60%到組合物重量的90%。組合物在降到至少約18°C時為固體。
[0007]雷曼等人，WO 93/13792，揭示一種植入式裝置，其包含過渡金屬-促生長素絡合物與過渡金屬-增溶物質(zhì)的組合。過渡金屬可為鋅、錳或銅。金屬-增溶物質(zhì)可為氨基酸?？墒褂谜崽莵硎勾偕L素穩(wěn)定。此裝置可包含硅樹脂管或蠟。西里(Seely)等人，W093/19773，揭示包含以下各物的水溶液:(i)凍干的促生長素組合物，其包含促生長素和鹽酸精氨酸；和(ii)包含EDTA的稀釋劑、非離子型表面活性劑，和任選使用的緩沖液或非緩沖試劑，例如鹿糖或海藻糖。希瓦馬克西南(Sivaramakrishnan)等人,美國專利第5，219，572號,揭示一種用于控制釋放例如促生長索等大分子蛋白質(zhì)的裝置。此裝置包含完全包圍含不均勻微型膠囊的內(nèi)室的水溶性外殼。這些微型膠囊包含蠟殼，其包圍核心基質(zhì)。核心基質(zhì)包含例如促生長素和任選使用的賦形劑、穩(wěn)定劑、粘合劑等，例如硬脂酸鎂或蔗糖。當外殼在動物體內(nèi)的流體環(huán)境中溶解時，微型膠囊暴露于流體環(huán)境，并在暴露后各種時間時破裂。SiJremm等人，WO 93/12812，教示組氨酸或組氨酸衍生物的存在可使生長激素穩(wěn)定。如果凍干生長激素，那么組合物也可包含增積劑(bulking agent)，即糖醇、二糖和其混合物。Seremen等人，美國專利第5，849，704號，揭示一種藥物調(diào)配物，其包含生長激索和組氨酸或組氨酸衍生物，所述組氨酸或組氨酸衍生物是作為添加劑或緩沖物質(zhì)添加以使生長激索中的肽鍵對脫酰胺作用、氧化反應或裂解具有穩(wěn)定性。還揭示與已知方法相比較，生長激素在組氨酸或其衍生物存在下結(jié)晶會產(chǎn)生純度較高且產(chǎn)率較高的晶體。[0008]斯特博(Steber)等人，EP O 523 330 Al，揭示一種壓實、帶刻痕、部分包覆的植入式組合物，其包含生物活性多肽(例如促生長索)；脂肪、蠟或其混合物；和糖(例如單糖、二糖或三糖)。斯托斯(Storrs)等人，美國專利第5，986，073號，揭示一種用于純化和回收生物活性促生長索單體的方法。這項工作是基于發(fā)現(xiàn)促生長素單體與促生長素寡聚物盡管具有重疊的等電點，但仍可通過在極窄PH范圍內(nèi)進行選擇性沉淀來分離。不合需要的雜質(zhì)可借助此方法去除，并且回收的經(jīng)過純化的促生長素單體不經(jīng)進一步純化即適于腸胃外施用到目標動物。泰勒(Tyle)，美國專利第4，857，506號，揭示一種用于持續(xù)釋放生長激素的水包油包水型多重乳液。生長激素分散于內(nèi)部水相中；內(nèi)部水相分散于不與水混溶的液相或油相中；且不與水混溶相分散于外部水相中。內(nèi)部水相可包括以重量計高達40%的多元醇、二醇或糖。維斯瓦納安(Viswanathan)等人,美國專利第4，917，685號，揭示一種用于穩(wěn)定動物生長激素的遞送裝置。此裝置包含包圍并界定儲槽的器壁。至少一部分器壁為多孔的，以允許生長激素和穩(wěn)定劑通過。生長激素與穩(wěn)定劑的調(diào)配物實質(zhì)上如上述漢密爾頓等人所揭示。
[0009]盡管以上概述的公開案中描述了眾多嘗試，但此項技術(shù)仍存在巨大改進空間。本發(fā)明通過提供改進的豬促生長索(PST)多肽滿足此需求。本發(fā)明特別針對與pST多肽的活性和制備有關的問題，并且還針對具有改進的生物或藥理學特性和/或改進的治療半衰期的pST多肽的制備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明提供包含一個或一個以上非天然編碼氨基酸的pST多肽。
[0011 ] 在一些實施例中，pST多肽包含一種或一種以上翻譯后修飾。在一些實施例中，pST多肽與連接子、聚合物或生物活性分子連接。在一些實施例中，PST多肽與雙官能聚合物、雙官能連接子或至少另一種PST多肽連接。
[0012]在一些實施例中，非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施例中，非天然編碼氨基酸通過連接子與水溶性聚合物連接或與水溶性聚合物鍵接。在一些實施例中，聚(乙二醇)分子是一種雙官能聚合物。在一些實施例中，雙官能聚合物與第二多肽連接。在一些實施例中，第二多肽是PST多肽。
[0013]在一些實施例中，pST多肽包含至少兩個連接到包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物的氨基酸。在一些實施例中，至少一個氨基酸是非天然編碼氨基酸。
[0014]在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST中的以下一個或一個以上位置:1 位前(即4末端)、1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、I16、I17、I18、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、
135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，蛋白質(zhì)的羧基末端)，以及其任何組合(SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST中的以下一個或一個以上位置:1位前(即，在N末端)、1、3、4、5、6、7、8、9，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、I10、I11、I12、I13、I14、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，蛋白質(zhì)的羧基末端)，以及其任何組合(SEQ ID NO:2)。
[0015]在一些實施例中，一個或一個以上非天然編碼氨基酸在以下一個或一個以上位置進行取代:29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、
142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和 187 (SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，一個或一個以上非天然編碼氨基酸在以下一個或一個以上位置進行取代:29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187 (SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，一個或一個以上非天然編碼氨基酸在豬生長激素蛋白的以下一個或一個以上位置進行取代:29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186 和187。
[0016]在一些實施例中，一個或一個以上非天然編碼氨基酸在以下一個或一個以上位置進行取代:29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、
108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187 (SEQ ID N0:1)。在一些實施例中，一個或一個以上非天然編碼氨基酸在以下一個或一個以上位置進行取代:29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、
143、145、147、154、155、156、186和 187 (SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，一個或一個以上非天然編碼氨基酸在豬生長激素蛋白的以下一個或一個以上位置進行取代:29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186 和 187。
[0017]在一些實施例中，一個或一個以上非天然編碼氨基酸在以下一個或一個以上位置進行取代:35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155 (SEQ ID NO: I)。在一些實施例中，一個或一個以上非天然編碼氨基酸在以下一個或一個以上位置進行取代:35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155 (SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，一個或一個以上非天然編碼氨基酸在豬生長激素蛋白的以下一個或一個以上位置進行取代:35、88、91、92、94、95、99、101、103、
111、131、133、134、135、136、139、140、143、145 和 155。
[0018]在一些實施例中，一個或一個以上非天然編碼氨基酸在以下一個或一個以上位置進行取代:30、74、103(SEQ IDNO:1)。在一些實施例中，一個或一個以上非天然編碼氨基酸在以下一個或一個以上位置進行取代:35、92、143、145(SEQ IDNO:1)。在一些實施例中，一個或一個以上非天然編碼氨基酸在以下一個或一個以上位置進行取代:30、74、103(SEQ IDNO:2)。在一些實施例中，一個或一個以上非天然編碼氨基酸在以下一個或一個以上位置進行取代:35、92、143、145 (SEQ ID NO:2)。
[0019]在一些實施例中，pST多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應PST (例如pST)的親和力相比較時，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)pST對pST (例如pgh多肽)受體的親和力。在一些實施例中，pST(例如pST多肽)包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應PST的穩(wěn)定性相比較時，所述取代、添加或缺失將增加pST多肽的穩(wěn)定性。在一些實施例中，pST多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應PST的免疫原性相比較時，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)PST多肽的免疫原性。在一些實施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應pST的血清半衰期或循環(huán)時間相比較時，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)PST多肽的血清半衰期或循環(huán)時間。在一些實施例中，本發(fā)明包含pgh多肽，其包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應Pgh的親和力相比較時，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)pgh對Pgh受體的親和力。在一些實施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應pgh的穩(wěn)定性相比較時，所述取代、添加或缺失將增加Pgh多肽的穩(wěn)定性。在一些實施例中，pgh多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應Pgh的免疫原性相比較時，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)Pgh多肽的免疫原性。在一些實施例中，pgh多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應Pgh的血清半衰期或循環(huán)時間相比較時，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)Pgh多肽的血清半衰期或循環(huán)時間。
[0020]共價連接親水性聚合物聚(乙二醇)(縮寫為PEG)是一種增加許多生物活性分子(包括蛋白質(zhì)、肽，尤其是疏水性分子)的水溶性、生物利用率；增加血清半衰期；增加治療半衰期；調(diào)節(jié)免疫原性；調(diào)節(jié)生物活性；或延長循環(huán)時間的方法。PEG已被廣泛用于醫(yī)藥品或人工移植物以及生物相容性、無毒和無免疫原性極為重要的其它應用中。為了使PEG的所需特性最大化，與生物活性分子連接的PEG聚合物的總分子量和水合狀態(tài)必須足夠高，以便賦予通常與PEG聚合物連接相關的有利特征，例如增加的水溶性和循環(huán)半衰期，同時不會不利地影響母體分子的生物活性。
[0021]PEG衍生物常常是通過反應性化學官能團(例如賴氨酸、半胱氨酸和組氨酸殘基、N末端和碳水化合物部分)與生物活性分子連接。蛋白質(zhì)和其它分子通常具有少數(shù)反應性位點可供聚合物連接。通常，最適于經(jīng)由聚合物連接而修飾的位點在受體結(jié)合中起到重要作用，并且是保留分子的生物活性所必需的。因此，不加選擇地將聚合物鏈與生物活性分子上的這些反應性位點連接，通常會使經(jīng)聚合物修飾的分子的生物活性顯著降低或甚至完全喪失。R.克拉克(R.Clark)等人，(1996),牛物化學雜志(T.Biol.Chem.), 271:21969-21977。為了形成賦予目標分子所需優(yōu)勢的具有足夠聚合物分子量的結(jié)合物，現(xiàn)有技術(shù)方法通常涉及將多個聚合物臂與分子隨機連接，由此增加了母體分子生物活性降低或甚至完全喪失的風險。
[0022]形成用于連接PEG衍生物與蛋白質(zhì)的基因座的反應性位點由蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)指示。蛋白質(zhì)(包括酶)是由各種α-氨基酸序列構(gòu)成，這些序列的一般結(jié)構(gòu)為H2N--CHR--C00H。一個氨基酸的α氨基部分(H2N-)與相鄰氨基酸的羧基部分(一C00H)接合形成酰胺鍵，其可表示為一(NH--CHR--CO)n--,其中下標“η”可等于數(shù)百或數(shù)千。由R表示的片段可含有提供蛋白質(zhì)生物活性和連接PEG衍生物的反應性位點。
[0023]舉例來說，在氨基酸賴氨酸的情況下，在ε位以及α位中存在一NH2部分。ε -NH2在堿性pH條件下自由反應。用PEG使蛋白質(zhì)衍生化領域中的很多技術(shù)都是針對開發(fā)用于連接蛋白質(zhì)中存在的賴氨酸殘基的ε--ΝΗ2部分的PEG衍生物。“用于先進聚乙二醇化技術(shù)的聚乙二醇和衍生物(Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGy I at ion) ”，奈克塔分子工程目錄(Nektar Molecular Engineering Catalog), 2003,第1-17頁。然而，這些PEG衍生物都具有共同的局限性，即，無法將其選擇性地安裝到存在于蛋白質(zhì)表面上的常見的多個賴氨酸殘基上。在賴氨酸殘基對于蛋白質(zhì)活性極為重要(例如存在于酶活性位點中)的情況下，或在賴氨酸殘基對于介導蛋白質(zhì)與其它生物分子的相互作用起作用的情況下，如在受體結(jié)合位點的情況下，這可成為顯著的局限性。
[0024]現(xiàn)有蛋白質(zhì)聚乙二醇化方法的另一同等重要的限制因素在于，PEG衍生物可與除所需殘基外的殘基發(fā)生不合需要的副反應。組氨酸含有結(jié)構(gòu)以一N(H)--表示的反應性亞氨基部分，而許多與ε -NH2反應的化學反應性物質(zhì)也可與一N(H)--反應。類似地，氨基酸半胱氨酸的側(cè)鏈具有游離硫氫基，結(jié)構(gòu)以-SH表示。在一些情況下，針對賴氨酸￡-冊12基團的PEG衍生物也與半胱氨酸、組氨酸或其它殘基反應。這樣可產(chǎn)生經(jīng)PEG衍生化的生物活性分子的復雜不均勻混合物，并且有破壞目標生物活性分子活性的風險。需要開發(fā)出如下PEG衍生物，其允許在蛋白質(zhì)內(nèi)的單一位點引入化學官能團，隨后使一種或一種以上PEG聚合物能夠在蛋白質(zhì)表面上明確界定且可預測的特定位點與生物活性分子選擇性偶合。
[0025]除賴氨酸殘基外，此項技術(shù)中還曾就開發(fā)靶向其它氨基酸側(cè)鏈(包括半胱氨酸、組氨酸和N末端)的活性PEG試劑進行了大量嘗試。例如參看美國專利第6，610，281號，以引用的方式并入本文中；和“用于先進聚乙二醇化技術(shù)的聚乙二醇和衍生物”，奈克塔分子工程目錄，2003，第1-17頁?？梢允褂枚c誘變和此項技術(shù)中已知的其它技術(shù)，將半胱氨酸殘基位點選擇性地引入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，并且由此得到的游離硫氫基部分可與具有硫醇反應性官能團的PEG衍生物反應。但這種方法比較麻煩，因為引入游離硫氫基會使所得蛋白質(zhì)的表達、折疊和穩(wěn)定性變得復雜。因此，本發(fā)明提供將化學官能團引入PST和pgh中的合意方式，其能使一種或一種以上PEG聚合物與蛋白質(zhì)選擇性偶合，同時還與硫氫基以及蛋白質(zhì)中常見的其它化學官能團相容(即，不會與之發(fā)生不合需要的副反應)。
[0026]從此項技術(shù)的抽樣(sampling)中可以了解到,所開發(fā)的用于連接蛋白質(zhì)側(cè)鏈,尤其賴氨酸氨基酸側(cè)鏈上的一NH2部分和半胱氨酸側(cè)鏈上的-SH部分的許多此類衍生物都證實在合成和使用方面存在問題。一些衍生物與蛋白質(zhì)形成不穩(wěn)定鍵，這些鍵將經(jīng)歷水解，并因此分解、降解，或者以其它方式在水性環(huán)境(例如血流)中不穩(wěn)定。一些衍生物形成較為穩(wěn)定的鍵，但會在形成鍵之前經(jīng)歷水解，這意味著PEG衍生物上的反應性基團可能會在連接蛋白質(zhì)之前就失活。一些衍生物略帶毒性，因此不太適于體內(nèi)使用。一些衍生物反應過慢而無法實際使用。一些衍生物會因連接到負責蛋白質(zhì)活性的位點而導致蛋白質(zhì)活性喪失。一些衍生物對其將連接的位點不具特異性，這也會導致喪失所需活性以及缺乏結(jié)果的可再現(xiàn)性。為了克服用聚(乙二醇)部分修飾蛋白質(zhì)所帶來的問題，已經(jīng)開發(fā)出更為穩(wěn)定(例如，美國專利6，602，498，以引用的方式并入)或與分子和表面上的硫醇部分選擇性反應(例如，美國專利6，610，281，以引用的方式并入)的PEG衍生物。此項技術(shù)中無疑需要在生理環(huán)境中具化學惰性，而只有在需要的情況下才選擇性反應形成穩(wěn)定化學鍵的PEG衍生物。
[0027]已經(jīng)揭示了輕坑基淀粉,尤其是輕乙基淀粉(hydroxyethylstarch, HES)共價連接到多肽的結(jié)合物的使用，以便潛在地改變多肽的免疫原性和/或變應原性。羥乙基淀粉化是一項替代性技術(shù)，其揭示于讓渡于費森尤斯卡比公司(FreseniusKabiAB)的一系列專利申請案中，包括美國專利公開案第20050063943號、第20060121073號、第20010100163號、第 20050234230 號、第 20050238723 號、第 20060019877 號、第 20070134197 號、第20070087961號，以及美國專利第7，285,661號，所有這些專利都以引用的方式并入本文中。HES是一種經(jīng)過修飾的天然聚合物，在臨床上用作血漿增量劑，而羥乙基淀粉化表示將原料藥與HES衍生物偶合以改變藥物特征(例如藥物動力學或水溶性)的技術(shù)。這項技術(shù)還包括經(jīng)由增加分子穩(wěn)定性和降低腎清除率來延長蛋白質(zhì)血漿循環(huán)，由此引起生物活性的增加。此外，也可能降低免疫原性或變應原性。通過改變不同的參數(shù)，例如HES的分子量，可以定制多種HES結(jié)合物。盡管如此，羥乙基淀粉仍與所有其它當前可用的聚合物共有共同的缺點:其多分散性。聚合物結(jié)合物是分子量分布在平均值周圍的分子的混合物。此均質(zhì)性的缺乏會引起較低水平的化學和生物化學特性表征，并且可阻止醫(yī)藥活性組分到達其作用位點(受體、酶等)。在這些情況下，活性藥物需要以其原始的非結(jié)合形式遞送，由此需要借助代謝反應使聚合物裂解以達到其醫(yī)藥功效。
[0028]本發(fā)明的蛋白質(zhì)技術(shù)克服了與蛋白質(zhì)其它位點特異性修飾有關的許多缺點。具體點說，已將新的組分添加到原核生物大腸桿菌(Escherichia coli, E.coli)(例如L.王(L.Wang)等人，(2001)，科學(Science) 292:498-500)和真核生物釀酒酵母菌(Sacchromyces cerevisia, S.cerevisiae)(例如 J.秦(J.Chin)等人，科學 301:964-7(2003))的蛋白質(zhì)生物合成機器中，使得所述機器能夠在體內(nèi)將非基因編碼氨基酸并入蛋白質(zhì)中。已使用這種方法響應琥珀密碼子(TAG)以高保真度將多種具有新穎化學、物理或生物特性的新氨基酸有效地并入大腸桿菌和酵母的蛋白質(zhì)中，所述新氨基酸包括光親和性標記和可光異構(gòu)化氨基酸、光交聯(lián)氨基酸(例如參看秦J.W.(Chin，J.W.)等人(2002)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.)99:11020-11024 ;和秦 J.ff.等人，(2002)美國化學協(xié)會雜志(T.Am.Chem.Soc.) 124 =9026-9027)、酮基氨基酸、含有重原子的氨基酸和糖基化氨基酸。例如參看J.W.秦等人，(2002)，美國化學協(xié)會雜志(Journal ofthe American Chemical Society) 124:9026-9027 ；J.ff.秦和 P.G.查魯茲(P.G.Schultz)，(2002),化學與牛物化學(ChemBioChem) 3 (11):1135-1137 ；J.ff.秦等人，(2002),美國國家科學院院刊(PNAS United States of America) 99:11020-11024 ;以及 L.王(L.Wang)和P.G.查魯茲，(2002),化學通訊(Chem.Comm.), I =1-1l0所有參考文獻都以全文引用的方式并入本文中。這些研究已證實，有可能選擇性地以常規(guī)方式引入化學官能團，例如酮基、炔基和疊氮部分，這些官能團不存在于蛋白質(zhì)中，對20種常見的基因編碼氨基酸中所見的所有官能團具化學惰性，并且可用于有效且選擇性地反應形成穩(wěn)定共價鍵。
[0029]將非基因編碼的氨基酸并入蛋白質(zhì)中的能力允許引入可提供天然存在官能團(例如賴氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的硫氫基-SH、組氨酸的亞氨基等)的有價值替代物的化學官能團。已知某些化學官能團對20種常見的基因編碼氨基酸中所見的官能團呈惰性，但能干凈且有效地反應形成穩(wěn)定鍵。舉例來說，此項技術(shù)中已知，疊氮基和乙炔基在催化量的銅存在下，可在水性條件中進行胡伊斯根(Huisgen) [3+2]環(huán)加成反應。例如參見托尼諾(Tornoe)等人，(2002)有機化學雜志(T.0rg.Chem.)67 =3057-3064 ;和羅斯托瑟夫(Rostovtsev)等人，(2002)德國應用化學(Angew.Chem.1nt.Ed.)41:2596_2599。舉例來說，通過將疊氮部分引入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，就能夠并入對蛋白質(zhì)中所見的胺、硫氫基、羧酸、羥基具化學惰性，但也可與乙炔部分平穩(wěn)且有效地反應形成環(huán)加成產(chǎn)物的官能團。重要的是，在不存在乙炔部分的情況下，疊氮基仍保留化學惰性，而且在其它蛋白質(zhì)側(cè)鏈存在時在生理條件下不發(fā)生反應。
[0030]在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的以下一個或一個以上位置:SEQ ID NO:1 中的 3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、
136、141、159、166、169、170、173，以及其任何組合。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的以下一個或一個以上位置:SEQ ID NO:2中的3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何組合。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的以下一個或一個以上位置:3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何組合。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并ApST 的以下一個或一個以上位置:3、7、33、43、58、62、67、69、99、123、124、133、134、141、166，以及其任何組合(SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入 pST 的以下一個或一個以上位置:3、7、33、43、58、62、67、69、99、123、124、133、134、141,166,以及其任何組合(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的以下一個或一個以上位置:3、7、33、43、58、62、67、69、99、123、124、133、134、141，166和其任何組合。
[0031]在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的以下一個或一個以上位置:SEQ IDNO:1中的3、7、62、133、166，以及其任何組合。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的以下一個或一個以上位置:SEQ ID NO:2中的3、
7、62、133、166，以及其任何組合。在一些實施例中，將一個或一個以上非大然編碼氨基酸并Apgh的以下一個或一個以上位置:3、7、62、133、166，以及其任何組合。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的62位(SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的62位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的62位。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的133位(SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的133位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的133位。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的92位(SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的92位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的92位。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的35位(SEQ ID N0:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的35位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pgh的35位。
[0032]在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的40位(SEQ IDN0:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的40位(SEQ IDNO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pgh的40位。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的95位(SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的95位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的95位。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的96位(SEQ ID N0:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的96位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的96位。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的98位(SEQ ID N0:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的98位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的98位。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的99位(SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的99位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的99位。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的103位(SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的103位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pgh的103位。在一些實施例中，將一個或一個以上非大然編碼氨基酸并入PST的105位(SEQ ID NO:
1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的105位(SEQID NO:
2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pgh的105位。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的137位(SEQIDN0:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的137位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的137位。
[0033]在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的以下一個或一個以上位置:35、91、92、94、95、99、101、133、134、138、139、140、142、144、149、150、154，或其任何組合(SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的以下一個或一個以上位置:35、91、92、94、95、99、101、133、134、138、139、140、142、144、149、150、154，或其任何組合(SEQ IDNO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的以下一個或一個以上位置:Tyr35、Gln91、Phe92、Ser94、Arg95、Asn99、Leul01、Argl33、Alal34、Leul38、Lysl39、Glnl40、Tyrl42、Lysl44、Leul49、Argl50、Alal54，或其任何組合。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的138位(SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的138位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的138位。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的142位(SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的142位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的142位。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的143位(SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的143位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的143位。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的144位(SEQIDN0:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的144位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的144位。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的146位(SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的146位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的146位。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的148位(SEQIDN0:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的148位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非大然編碼氨基酸并入Pgh的148位。
[0034]在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的153位(SEQ IDNO:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pST的153位(SEQ IDNO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入pgh的153位。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的154位(SEQIDN0:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的154位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的154位。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的158位(SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入PST的158位(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入Pgh的158位。在一些實施例中，本發(fā)明的多肽包含一個或一個以上天然氨基酸取代、添加或缺失。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然氨基酸并入在SEQ ID NO:1或者其它pST或pgh序列的N或C末端的前導序列或信號序列中。
[0035]在一些實施例中，將一個或一個以上所述位置的非天然存在氨基酸與水溶性聚合物連接，這些位置包括(但不限于)以下位置:1位前(即，N末端)、1、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、
109、110、111、I12、I13、I14、I15、I16、I17、I18、I19、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192( 即，蛋白質(zhì)的羧基末端)，以及其任何組合(SEQ IDNO:1)。在一些實施例中，將一個或一個以上所述位置的非天然存在氨基酸與水溶性聚合物連接，所述位置包括(但不限于)以下位置:1位前(即，N末端)、1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、I10、I11、I12、I13、I14、I15、I16、I17、I18、I19、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、I48、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192 (即，蛋白質(zhì)的羧基末端)，以及其任何組合(SEQ ID NO:2)。
[0036]在一些實施例中，將一個或一個以上所述位置的一個或一個以上非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，這些位置包括(但不限于)以下位置:35、91、92、94、95、99、101、133、134、138、139、140、142、144、149、150、154，或其任何組合(SEQ ID NO:1) ? 在一些實施例中，將一個或一個以上所述位置的一個或一個以上非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，這些位置包括(但不限于)以下位置:35、91、92、94、95、99、101、133、134、138、139、140、142、144、149、150、154，或其任何組合(SEQ ID NO:2)。在一些實施例中，將一個或一個以上所述位置的一個或一個以上非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，這些位置包括(但不限于)Pgh 的以下位置:Tyr35、Gln91、Phe92、Ser94、Arg95、Asn99、Leul01、Argl33、Alal34、Leul38、Lysl39、Glnl40、Tyrl42、Lysl44、Leul49、Argl50、Alal54，或其任何組合。
[0037]在一些實施例中，將一個或一個以上所述位置的一個或一個以上非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，這些位置包括(但不限于)以下位置:SEQ ID N0:1中的3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何組合。在一些實施例中，將一個或一個以上所述位置的一個或一個以上非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，這些位置包括(但不限于)以下位置:SEQIDN0:2中的3、7、
11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何組合。在一些實施例中，將一個或一個以上所述位置的一個或一個以上非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，這些位置包括(但不限于)Pgh的以下位置:3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何組合。在一些實施例中，非天然存在氨基酸是在Pgh、SEQ IDNO:1或者其它pST序列的N或C末端的信號序列或前導序列中，并與水溶性聚合物連接。
[0038]在一些實施例中，pST多肽包含取代、添加或缺失，其調(diào)節(jié)pST多肽對受體或結(jié)合搭配物(包括(但不限于)蛋白質(zhì)、多肽、小分子或核酸)的親和力。在一些實施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應PST的穩(wěn)定性相比較時，所述取代、添加或缺失增加PST多肽的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性和/或溶解性可以使用所屬領域技術(shù)人員已知的多種不同分析來測量。所述分析包括(但不限于)SE-HPLC和RP-HPLC。在一些實施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應pST的免疫原性相比較時，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)PST多肽的免疫原性。在一些實施例中，pST多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應PST的血清半衰期或循環(huán)時間相比較時，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)PST多肽的血清半衰期或循環(huán)時間。
[0039]在一些實施例中，pST多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應PST的水溶性相比較時，所述取代、添加或缺失將增加pST多肽的水溶性。在一些實施例中，pST多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應PST的溶解性相比較時，所述取代、添加或缺失將增加宿主細胞中產(chǎn)生的PST多肽的溶解性。在一些實施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應pST在宿主細胞中的表達或在體外的合成相比較時，所述取代、添加或缺失將增加PST多肽的表達或增加其合成。包含此取代的PST多肽保留了激動劑活性，并且保持或改進在宿主細胞中的表達水平。在一些實施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應pST的蛋白酶抗性相比較時，所述取代、添加或缺失將增加PST多肽的蛋白酶抗性。在一些實施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，當同受體與無取代、添加或缺失的相應PST多肽相互作用時的信號轉(zhuǎn)導活性相比較時，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)受體的信號轉(zhuǎn)導活性。在一些實施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應PST多肽與另一分子(例如受體)的結(jié)合相比較時，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)PST多肽的結(jié)合。在一些實施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相應pST多肽的造血作用相比較，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)造血作用。在一些實施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相應PST多肽的中性粒細胞增殖相比較，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)中性粒細胞的增殖。在一些實施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相應pST多肽的中性粒細胞成熟相比較，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)中性粒細胞的成熟。
[0040]在一些實施例中，pST多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應PST與醫(yī)藥用防腐劑(例如間甲酚、苯酚、苯甲醇)的相容性相比較時，所述取代、添加或缺失將增加PST多肽的相容性。此增加的相容性將使保存的醫(yī)藥調(diào)配物制劑能夠在儲存期間保持蛋白質(zhì)的生理化學特性和生物活性。
[0041]在一些實施例中，利用一個或一個以上非天然氨基酸產(chǎn)生一個或一個以上經(jīng)工程改造的鍵。分子內(nèi)鍵可以多種方式產(chǎn)生，包括(但不限于)在適合條件下，蛋白質(zhì)中的兩個氨基酸之間發(fā)生反應(一個或兩個氨基酸可以為非天然氨基酸)；在適合條件下，兩個氨基酸與連接子、聚合物或其它分子發(fā)生反應，這兩個氨基酸各自可為天然編碼或非天然編碼
的，等等。
[0042]在一些實施例中，pgh多肽包含取代、添加或缺失，其調(diào)節(jié)pgh多肽對受體或結(jié)合搭配物(包括(但不限于)蛋白質(zhì)、多肽、小分子或核酸)的親和力。在一些實施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應pgh的穩(wěn)定性相比較時，所述取代、添加或缺失將增加Pgh多肽的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性和/或溶解性可以使用所屬領域技術(shù)人員已知的多種不同分析來測量。所述分析包括(但不限于)SE-HPLC和RP-HPLC。在一些實施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應pgh的免疫原性相比較時，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)Pgh多肽的免疫原性。在一些實施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應Pgh的血清半衰期或循環(huán)時間相比較時，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)Pgh多肽的血清半衰期或循環(huán)時間。
[0043]在一些實施例中，pgh多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應Pgh的水溶性相比較時，所述取代、添加或缺失將增加pgh多肽的水溶性。在一些實施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應Pgh的溶解性相比較時，所述取代、添加或缺失將增加宿主細胞中產(chǎn)生的Pgh多肽的溶解性。在一些實施例中，pgh多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應Pgh在宿主細胞中的表達或在體外的合成相比較時，所述取代、添加或缺失將增加Pgh多肽的表達或增加其合成。包含此取代的Pgh多肽保留了激動劑活性，并且保持或改進在宿主細胞中的表達水平。在一些實施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應Pgh的蛋白酶抗性相比較時，所述取代、添加或缺失將增加Pgh多肽的蛋白酶抗性。在一些實施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，當同受體與無取代、添加或缺失的相應Pgh多肽相互作用時的信號轉(zhuǎn)導活性相比較時，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)受體的信號轉(zhuǎn)導活性。在一些實施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，當與尤取代、添加或缺失的相應pgh多肽與另一分子(例如受體)的結(jié)合相比較時，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)Pgh多肽的結(jié)合。在一些實施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相應Pgh多肽的造血作用相比較，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)造血作用。在一些實施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相應Pgh多肽的中性粒細胞增殖相比較，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)中性粒細胞的增殖。在一些實施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，與無取代、添加或缺失的相應pgh多肽的中性粒細胞成熟相比較，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)中性粒細胞的成熟。
[0044]在一些實施例中，pgh多肽包含取代、添加或缺失，當與無取代、添加或缺失的相應Pgh與醫(yī)藥用防腐劑(例如間甲酚、苯酚、苯甲醇)的相容性相比較時，所述取代、添加或缺失將增加Pgh多肽的相容性。此增加的相容性將使保存的醫(yī)藥調(diào)配物制劑能夠在儲存期間保持蛋白質(zhì)的生理化學特性和生物活性。
[0045]在一些實施例中，pST多肽中的一個或一個以上氨基酸可以用一個或一個以上天然存在或非天然存在氨基酸取代。在一些實施例中，pST多肽中的氨基酸可以用天然存在或非天然存在氨基酸取代，只要至少一個取代是用非天然編碼氨基酸進行即可。在一些實施例中，PST多肽中的一個或一個以上氨基酸可以用一個或一個以上天然存在氨基酸取代，并且另外至少一個取代是用非天然編碼氨基酸進行。
[0046]在一些實施例中，Pgh多肽中的一個或一個以上氨基酸可以用一個或一個以上天然存在或非天然存在氨基酸取代。在一些實施例中，Pgh多肽中的氨基酸可以用天然存在或非天然存在氨基酸取代，只要至少一個取代是用非天然編碼氨基酸進行即可。在一些實施例中，Pgh多肽中的一個或一個以上氨基酸可以用一個或一個以上天然存在氨基酸取代，并且另外至少一個取代是用非天然編碼氨基酸進行。
[0047]在一些實施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基、乙?；?、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基服基、置氣基或炔基。
[0048]在一些實施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基。在一些實施例中，非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu):
[0049]
【權(quán)利要求】
1.一種豬促生長素PST多肽，其包含非天然編碼氨基酸， 其中所述非天然編碼氨基酸在SEQ ID NO:1中選自由以下位置組成的群組的位置進行取代:SEQ ID NO:1 的 35、91、92、94、95、99、101、133、134、138、139、140、142、144、149、150、154和其任何組合，且 其中所述多肽任選包含連接到SEQ ID NO:1的N末端的甲硫氨酸，其中所述非天然編碼氨基酸是對乙酰基苯丙氨酸(PAF)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的pST多肽，其中所述多肽與連接子、聚合物或生物活性分子連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的pST多肽，其中所述多肽在所述非天然編碼氨基酸處進行連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的pST多肽，其中所述多肽與水溶性聚合物連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的pST多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的pST多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量介于約0.1kDa與約IOOkDa之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的pST多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量為約30kDa。
8.—種pST多肽，其包含取代SEQ ID NO:1的35位的非天然編碼氨基酸，其中所述多肽任選包含連接到SEQ ID NO:1的N末端的甲硫氨酸， 其中所述非天然編碼氨基酸是對乙?；奖彼?，且 其中所述非天然編碼氨基酸與包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物鍵接。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的pST多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量介于約0.1kDa與約50kDa之間。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的pST多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量為約30kDa。
11.一種pST多肽，其包含取代SEQ ID NO:1的92位的非天然編碼氨基酸，其中所述多肽任選包含連接到SEQ ID NO:1的N末端的甲硫氨酸， 其中所述非天然編碼氨基酸是對乙?；奖彼?，且 其中所述非天然編碼氨基酸與包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物鍵接。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的pST多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量介于約0.1kDa與約50kDa之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的pST多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量為約30kDa。
14.一種醫(yī)藥調(diào)配物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一權(quán)利要求所述的pST多肽、醫(yī)藥學上可接受的載劑和任選存在的一種或一種以上其它試劑或治療劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一權(quán)利要求所述的pST多肽和任選存在的一種或一種以上其它試劑或治療劑，其是用于制備用于治療患有由PST調(diào)節(jié)的病癥的動物的藥物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一權(quán)利要求所述的pST多肽和任選存在的一種或一種以上其它試劑或治療劑，其是用于制備用于治療患有由PST調(diào)節(jié)的感染的動物的藥物。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一權(quán)利要求所述的pST多肽和任選存在的一種或一種以上其它試劑或治療劑，其是用于制備用于預防動物感染的藥物。
18.—種根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一權(quán)利要求所述的pST多肽和任選存在的一種或一種以上其它試劑或治療劑的用途，其是用于制備用于治療患有由PST調(diào)節(jié)的感染的動物或預防動物感染的藥物。
19.一種分離的核酸，其在嚴格條件下與編碼根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一權(quán)利要求所述的pST多肽的核酸雜交。
20.—種載體,其包含權(quán)利要求19的分離的多核苷酸。
21.權(quán)利要求20的載體，其中所述載體另外包含編碼對于將對乙?；奖彼岵⑷隤ST中特異的正交tRNA合成酶和正交tRNA的核酸。
22.—種宿主細胞，其包含權(quán)利要求19的核酸。
23.—種宿主細胞，其包含權(quán)利要求20的載體。
24.權(quán)利要求23的宿主細胞，其中所述宿主細胞進一步包含對于將對乙酰基苯丙氨酸并入pST中特異的正交tRNA合成酶和正交tRNA。
25.—種制備包含非天然編碼氨基酸的pST多肽的方法，其中所述方法包含: 在允許PST多肽表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求24的宿主細胞； 純化所述PST多肽；和 聚乙二醇化所述PST多肽。
【文檔編號】A61P5/06GK104017063SQ201410283106
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2009年12月21日
【發(fā)明者】尼克.克努森, 瓦汀.克藍諾娃 申請人:Ambrx公司