專(zhuān)利名稱(chēng)：經(jīng)過(guò)修飾的牛促生長(zhǎng)素多肽和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 任選用至少一個(gè)非天然編碼的氨基酸修飾的牛促生長(zhǎng)素(bST)多肽。
背景技術(shù)：
一些生物活性多肽只通過(guò)腸胃外投予極少劑量就能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的活性，而一些生物活性多肽則需要達(dá)到足夠血清濃度和/或在血清中的半衰期很短以致必須投予相當(dāng)大劑量才能在較長(zhǎng)時(shí)間(例如一周或更長(zhǎng)時(shí)間)內(nèi)提供所需的生物作用。促生長(zhǎng)素(生長(zhǎng)激素)是此類(lèi)多肽的一個(gè)實(shí)例。為了防止某些多肽不合需要地迅速釋放到動(dòng)物的血流中，已經(jīng)利用可任選含有水合作用阻滯劑(抗水合劑)的液體媒劑或結(jié)合進(jìn)一步降低多肽在體液中的溶解性的金屬或金屬化合物來(lái)腸胃外投予這些多肽。為避免對(duì)無(wú)法接受的大量此類(lèi)媒劑的需求，且出于包括優(yōu)良的長(zhǎng)期釋放性能在內(nèi)的其它原因，宜采用含相當(dāng)高濃度所述多肽的媒劑，例如，如頒予詹姆斯C.米奇爾(James C. Mitchell)的美國(guó)專(zhuān)利第5，739，108號(hào)、讓渡于艾利李莉(EliLilly)的美國(guó)專(zhuān)利第4，977，140號(hào)、讓渡于盧克有限公司(Lucky，Ltd.)的美國(guó)專(zhuān)利第5，520，927號(hào)和讓渡于LG化學(xué)品有限公司(LG Chemicals Ltd.)的美國(guó)專(zhuān)利第5，744，163號(hào)中所示。然而，仍需要改進(jìn)使這些多肽以生物活性形式釋放到動(dòng)物的血流中的效率(“生物利用率”)和/或在一些效用中其提供所需的動(dòng)物生理反應(yīng)的有效性(“功效”)。這些因素每一者都可實(shí)質(zhì)上影響實(shí)現(xiàn)所需生物作用而必須投予的多肽量，并由此實(shí)質(zhì)上影響每次投藥的成本。多肽(例如促生長(zhǎng)素)可在使用重組DNA轉(zhuǎn)化的原核生物體中產(chǎn)生，但仍然需要能提供改進(jìn)的促生長(zhǎng)素多肽(包括具有較長(zhǎng)血清半衰期的促生長(zhǎng)素多肽)的蛋白質(zhì)調(diào)配物。用于投予生物活性組合物的各種方法和裝置先前已經(jīng)揭示于公開(kāi)案中，且這些示范性公開(kāi)案中的一些包括克里斯特森(Christensen)等人，WO 97/03692，揭示一種生長(zhǎng)激素與鋅以及任選使用的賴(lài)氨酸或鈣離子的調(diào)配物。以此方式配制的生長(zhǎng)激素對(duì)脫酰胺作用顯示出抗性。董(Dong)等人，WO 00/13674，揭示一種定時(shí)釋放藥物的機(jī)構(gòu)。此機(jī)構(gòu)包含一種裝載膠囊的具有半透性壁的容器，所述膠囊包含藥物調(diào)配物、柱塞(piston)和滲透性組合物。這種給藥機(jī)構(gòu)以受控制的速率在長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)時(shí)間內(nèi)通過(guò)通路釋放藥物調(diào)配物。艾克雷博(Ekwuribe)，美國(guó)專(zhuān)利第5，359，030號(hào)、第5，438，040號(hào)和第5，681，811號(hào)，揭示一種穩(wěn)定的結(jié)合肽復(fù)合物，其包含以結(jié)合方式與包括親脂性部分和親水性部分的聚合物偶合的肽，適于腸胃外和非腸胃外投藥。福格森(Ferguson)等人，美國(guó)專(zhuān)利第4，977，140號(hào)，揭示一種持續(xù)釋放調(diào)配物，其包含在載劑中的牛促生長(zhǎng)素，所述載劑包含蠟(以重量計(jì)約1%到20%)和油(以重量計(jì)約80%到99%)。當(dāng)注射于乳牛中時(shí)，此調(diào)配物使產(chǎn)奶量增加，持續(xù)28天。鮑曼DE (Bauman DE)等人在其論文中揭示在泌乳時(shí)使用外源bST，“外源牛促生長(zhǎng)素對(duì)泌乳的影口向(Effects of exogenous bovine somatotropin on lactation)，，(鮑曼等人；營(yíng)養(yǎng)學(xué)年評(píng)(Annu rev Nutr. )1993; 13:437-61)。漢密爾頓(Hamilton)等人，美國(guó)專(zhuān)利第4，816，568號(hào)，揭示動(dòng)物生長(zhǎng)激素與穩(wěn)定劑的組合物。所述穩(wěn)定劑可溶于水溶液中，并且一般極性極高。教示的這些穩(wěn)定劑包括多元醇、氨基酸、在生理PH下具有帶電側(cè)基的氨基酸聚合物以及膽堿衍生物。此組合物的水性調(diào)配物可通過(guò)以下方式形成(i)將穩(wěn)定劑分散于水溶液中，和(ii)隨后添加生長(zhǎng)激素。固體調(diào)配物可通過(guò)以下方式形成(i)混合穩(wěn)定劑與生長(zhǎng)激素，(ii)任選添加佐劑、粘合劑等到組合物中，和(iii)壓縮組合物，形成片劑或丸粒。金(Kim)等人，美國(guó)專(zhuān)利第5，520，927號(hào)，揭示一種腸胃外投予的緩慢釋放生物活性藥物組合物，其包含促生長(zhǎng)素、至少一種生育酚化合物和延遲釋放劑。金等人，美國(guó)專(zhuān)利第5，744，163號(hào)，揭示一種供持續(xù)釋放動(dòng)物生長(zhǎng)激素的調(diào)配物。此調(diào)配物包含用生物可降解聚合物和泊洛沙姆(PoIoxamer )構(gòu)成的膜包覆含促生長(zhǎng)素的丸?！，敼诺?Magruder )等人，美國(guó)專(zhuān)利第5，034，229號(hào)，揭示一種用于向動(dòng)物遞送例如生長(zhǎng)激素等有益試劑的裝置。此裝置還可遞送多元醇作為一種粘度調(diào)節(jié)方式。馬汀(M artin)，EP 0216485，揭示一種制備生長(zhǎng)激素與過(guò)渡金屬的絡(luò)合物的方法。還描述通過(guò)用過(guò)渡金屬與生長(zhǎng)激素的絡(luò)合物處理動(dòng)物來(lái)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的方法。米奇爾(Mitchell)，美國(guó)專(zhuān)利第5，739，108號(hào)，揭示生物活性多肽的延長(zhǎng)釋放調(diào)配物，其包含以重量計(jì)約10%到以重量計(jì)約50%多肽于生物相容性油中的分散液。此多肽可與無(wú)毒金屬或金屬鹽締合。所述調(diào)配物還可包含抗水合劑，例如單硬脂酸鋁。皮卡(Pikal)等人，美國(guó)專(zhuān)利第5，612，315號(hào)，揭示用于腸胃外投予人生長(zhǎng)激素的調(diào)配物，其包含人生長(zhǎng)激素、甘氨酸和甘露糖醇。揭示的調(diào)配物被描述為提供針對(duì)蛋白質(zhì)聚集的穩(wěn)定作用。雷曼(Raman)等人，美國(guó)專(zhuān)利第5，356，635號(hào)，揭示一種持續(xù)釋放組合物，其包含生物活性劑，例如促生長(zhǎng)素；生物可降解的非晶形碳水化合物玻璃基質(zhì)，其內(nèi)例如分散有促生長(zhǎng)素；和疏水性物質(zhì)。所述非晶形碳水化合物玻璃基質(zhì)包含非晶形碳水化合物和再結(jié)晶延遲劑，并占組合物重量的約60%到組合物重量的90%。組合物在降到至少約18°C時(shí)為固體。雷曼等人，WO 93/13792，揭示一種植入式裝置，其包含過(guò)渡金屬-促生長(zhǎng)素絡(luò)合物與過(guò)渡金屬-增溶物質(zhì)的組合。過(guò)渡金屬可為鋅、錳或銅。金屬-增溶物質(zhì)可為氨基酸?？墒褂谜崽莵?lái)使促生長(zhǎng)素穩(wěn)定。此裝置可包含硅樹(shù)脂管或蠟。西里(Seely)等人，WO93/19773，揭示包含以下各物的水溶液(i)凍干的促生長(zhǎng)素組合物，其包含促生長(zhǎng)素和鹽酸精氨酸；和(ii)包含EDTA的稀釋劑、非離子型表面活性劑，和任選使用的緩沖液或非緩沖試劑，例如鹿糖或海藻糖。希瓦馬克西南(Sivaramakrishnan)等人，美國(guó)專(zhuān)利第5，219，572號(hào)，揭示一種用于控制釋放例如促生長(zhǎng)素等大分子蛋白質(zhì)的裝置。此裝置包含完全包圍含不均勻微型膠囊的內(nèi)室的水溶性外殼。這些微型膠囊包含蠟殼，其包圍核心基質(zhì)。核心基質(zhì)包含例如促生長(zhǎng)素和任選使用的賦形劑、穩(wěn)定劑、粘合劑等，例如硬脂酸鎂或蔗糖。當(dāng)外殼在動(dòng)物體內(nèi)的流體環(huán)境中溶解時(shí)，微型膠囊暴露于流體環(huán)境，并在暴露后各種時(shí)間時(shí)破裂。S. 0斯拉夏德.雷森(S. 0 slashed, rensen)等人，WO 93/12812,教示組氨酸或組氨酸衍生物的存在可使生長(zhǎng)激素穩(wěn)定。如果凍干生長(zhǎng)激素，那么組合物也可包含增積劑(bulking agent),即糖醇、二糖和其混合物。S. 0斯拉夏德.雷森等人，美國(guó)專(zhuān)利第5，849，704號(hào)，揭示一種藥物調(diào)配物，其包含生長(zhǎng)激素和組氨酸或組氨酸衍生物，所述組氨酸或組氨酸衍生物是作為添加劑或緩沖物質(zhì)添加以使生長(zhǎng)激素中的肽鍵對(duì)脫酰胺作用、氧化反應(yīng)或裂解具有穩(wěn)定性。還揭示與已知方法相比較，生長(zhǎng)激素在組氨酸或其衍生物存在下結(jié)晶會(huì)產(chǎn)生純度較高且產(chǎn)率較高的晶體。
斯特博(Steber)等人，EP 0523330A1，揭示一種壓實(shí)、帶刻痕、部分包覆的植入式組合物，其包含生物活性多肽(例如促生長(zhǎng)素)；脂肪、蠟或其混合物；和糖(例如單糖、二糖或三糖)。斯托斯(Storrs)等人，美國(guó)專(zhuān)利第5，986，073號(hào)，揭示一種用于純化和回收生物活性促生長(zhǎng)素單體的方法。這項(xiàng)工作是基于發(fā)現(xiàn)促生長(zhǎng)素單體與促生長(zhǎng)素寡聚物盡管具有重疊的等電點(diǎn)，但仍可通過(guò)在極窄PH范圍內(nèi)進(jìn)行選擇性沉淀來(lái)分離。不合需要的雜質(zhì)可借助此方法去除，并且回收的經(jīng)過(guò)純化的促生長(zhǎng)素單體不經(jīng)進(jìn)一步純化即適于腸胃外施用到目標(biāo)動(dòng)物。泰勒(Tyle)，美國(guó)專(zhuān)利第4，857，506號(hào)，揭示一種用于持續(xù)釋放生長(zhǎng)激素的水包油包水型多重乳液。生長(zhǎng)激素分散于內(nèi)部水相中；內(nèi)部水相分散于不與水混溶的液相或油相中；且不與水混溶相分散于外部水相中。內(nèi)部水相可包括以重量計(jì)高達(dá)40%的多元醇、二醇或糖。維斯瓦納安(Viswanathan)等人，美國(guó)專(zhuān)利第4，917，685號(hào),揭示一種用于穩(wěn)定動(dòng)物生長(zhǎng)激素的遞送裝置。此裝置包含包圍并界定儲(chǔ)槽的器壁。至少一部分器壁為多孔的，以允許生長(zhǎng)激素和穩(wěn)定劑通過(guò)。生長(zhǎng)激素與穩(wěn)定劑的調(diào)配物實(shí)質(zhì)上如上述漢密爾頓等人所揭示。盡管以上概述的公開(kāi)案中描述了眾多嘗試，但此項(xiàng)技術(shù)仍存在巨大改進(jìn)空間。本發(fā)明通過(guò)提供改進(jìn)的牛促生長(zhǎng)素(bST)多肽滿足此需求。本發(fā)明特別針對(duì)與bST多肽的活性和制備有關(guān)的問(wèn)題，并且還針對(duì)具有改進(jìn)的生物或藥理學(xué)特性和/或改進(jìn)的治療半衰期的bST多肽的制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的bST多肽。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含一種或一種以上翻譯后修飾。在一些實(shí)施例中，bST多肽與連接子、聚合物或生物活性分子連接。在一些實(shí)施例中，bST多肽與雙官能聚合物、雙官能連接子或至少另一種bST多肽連接。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。在一些實(shí)施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸通過(guò)連接子與水溶性聚合物連接或與水溶性聚合物鍵接。在一些實(shí)施例中，聚(乙二醇)分子是一種雙官能聚合物。在一些實(shí)施例中，雙官能聚合物與第二多肽連接。在一些實(shí)施例中，第二多肽是bST多肽。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含至少兩個(gè)連接到包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物的氨基酸。在一些實(shí)施例中，至少一個(gè)氨基酸是非天然編碼氨基酸。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST中的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置1 位前(即，N末端)、l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14 、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、
133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192 (即，蛋白質(zhì)的羧基末端)，以及其任何組合(SEQ ID NO:l)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST中的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置1位前(即，在 N 末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9， 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、 177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192 (即，蛋白質(zhì)的羧基末端)，以及其任何組合(SEQ ID NO:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST中的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置1位前(即，N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、I46、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、191 (即，具有190個(gè)氨基酸的牛生長(zhǎng)激素氨基酸蛋白的羧基末端)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸在以下一個(gè)或一個(gè)以上位置進(jìn)行取代29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、11I、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186 和 187 (SEQ ID NO: I)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸在以下一個(gè)或一個(gè)以上位置進(jìn)行取代29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187(SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸在具有190個(gè)氨基酸的牛生長(zhǎng)激素蛋白的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置進(jìn)行取代29、30、
33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、11I、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186 和 187。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸在以下一個(gè)或一個(gè)以上位置進(jìn)行取代29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、11I、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187 (SEQ ID N0:1)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸在以下一個(gè)或一個(gè)以上位置進(jìn)行取代:29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186 和 187 (SEQ ID NO:2)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸在具有190個(gè)氨基酸的牛生長(zhǎng)激素蛋白的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置進(jìn)行取代29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、11I、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186 和 187。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸在以下一個(gè)或一個(gè)以上位置進(jìn)行取代:35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155 (SEQ ID N0:1)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸在以下一個(gè)或一個(gè)以上位置進(jìn)行取代:35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155 (SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨 基酸在具有190個(gè)氨基酸的牛生長(zhǎng)激素蛋白的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置進(jìn)行取代35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145 和 155。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸在以下一個(gè)或一個(gè)以上位置進(jìn)行取代30、74、103(SEQ ID NO: I)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸在以下一個(gè)或一個(gè)以上位置進(jìn)行取代35、92、143、145(SEQ ID NO: I)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸在以下一個(gè)或一個(gè)以上位置進(jìn)行取代30、74、103(SEQ IDNO:2)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸在以下一個(gè)或一個(gè)以上位置進(jìn)行取代35、92、143、145 (SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸在具有190個(gè)氨基酸的牛生長(zhǎng)激素蛋白的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置進(jìn)行取代30、74、103。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸在具有190個(gè)氨基酸的牛生長(zhǎng)激素蛋白的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置進(jìn)行取代35、92、143、145。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST (例如bST)的親和力相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)bST對(duì)bST (例如bGH多肽)受體的親和力。在一些實(shí)施例中，bST (例如bST多肽)包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST的穩(wěn)定性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將增加bST多肽的穩(wěn)定性。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST的免疫原性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)bST多肽的免疫原性。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)bST多肽的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明包含bGH多肽，其包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH的親和力相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)bGH對(duì)bGH受體的親和力。在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH的穩(wěn)定性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將增加bGH多肽的穩(wěn)定性。在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH的免疫原性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)bGH多肽的免疫原性。在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)bGH多肽的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間。共價(jià)連接親水性聚合物聚(乙二醇)(縮寫(xiě)為PEG)是一種增加許多生物活性分子(包括蛋白質(zhì)、肽，尤其是疏水性分子)的水溶性、生物利用率；增加血清半衰期；增加治療半衰期；調(diào)節(jié)免疫原性；調(diào)節(jié)生物活性；或延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間的方法。PEG已被廣泛用于醫(yī)藥品或人工移植物以及生物相容性、無(wú)毒和無(wú)免疫原性極為重要的其它應(yīng)用中。為了使PEG的所需特性最大化，與生物活性分子連接的PEG聚合物的總分子量和水合狀態(tài)必須足夠高，以便賦予通常與PEG聚合物連接相關(guān)的有利特征，例如增加的水溶性和循環(huán)半衰期，同時(shí)不會(huì)不利地影響母體分子的生物活性。PEG衍生物常常是通過(guò)反應(yīng)性化學(xué)官能團(tuán)(例如賴(lài)氨酸、半胱氨酸和組氨酸殘基、N末端和碳水化合物部分)與生物活性分子連接。蛋白質(zhì)和其它分子通常具有少數(shù)反應(yīng)性位 點(diǎn)可供聚合物連接。通常，最適于經(jīng)由聚合物連接而修飾的位點(diǎn)在受體結(jié)合中起到重要作用，并且是保留分子的生物活性所必需的。因此，不加選擇地將聚合物鏈與生物活性分子上的這些反應(yīng)性位點(diǎn)連接，通常會(huì)使經(jīng)聚合物修飾的分子的生物活性顯著降低或甚至完全喪失。R.克拉克(R. Clark)等人，(1996),牛物化學(xué)雜志(T. Biol. Chem. ), 271:21969-21977。為了形成賦予目標(biāo)分子所需優(yōu)勢(shì)的具有足夠聚合物分子量的結(jié)合物，現(xiàn)有技術(shù)方法通常涉及將多個(gè)聚合物臂與分子隨機(jī)連接，由此增加了母體分子生物活性降低或甚至完全喪失的風(fēng)險(xiǎn)。形成用于連接PEG衍生物與蛋白質(zhì)的基因座的反應(yīng)性位點(diǎn)由蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)指示。蛋白質(zhì)(包括酶)是由各種a -氨基酸序列構(gòu)成，這些序列的一般結(jié)構(gòu)為H2N--CHR-C00H。一個(gè)氨基酸的a氨基部分(H2N-)與相鄰氨基酸的羧基部分(一C00H)接合形成酰胺鍵，其可表示為一(NH--CHR--CO)n--,其中下標(biāo)“n”可等于數(shù)百或數(shù)千。由R表示的片段可含有提供蛋白質(zhì)生物活性和連接PEG衍生物的反應(yīng)性位點(diǎn)。舉例來(lái)說(shuō)，在氨基酸賴(lài)氨酸的情況下，在e位以及a位中存在一NH2部分。e -NH2在堿性pH條件下自由反應(yīng)。用PEG使蛋白質(zhì)衍生化領(lǐng)域中的很多技術(shù)都是針對(duì)開(kāi)發(fā)用于連接蛋白質(zhì)中存在的賴(lài)氨酸殘基的S-NH2部分的PEG衍生物?！坝糜谙冗M(jìn)聚乙二醇化技術(shù)的聚乙二醇和衍生物(Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGylation)，，，奈克塔分子工程目錄(Nektar Molecular Engineering Catalog) , 2003,第1-17頁(yè)。然而，這些PEG衍生物都具有共同的局限性，S卩，無(wú)法將其選擇性地安裝到存在于蛋白質(zhì)表面上的常見(jiàn)的多個(gè)賴(lài)氨酸殘基上。在賴(lài)氨酸殘基對(duì)于蛋白質(zhì)活性極為重要(例如存在于酶活性位點(diǎn)中)的情況下，或在賴(lài)氨酸殘基對(duì)于介導(dǎo)蛋白質(zhì)與其它生物分子的相互作用起作用的情況下，如在受體結(jié)合位點(diǎn)的情況下，這可成為顯著的局限性。現(xiàn)有蛋白質(zhì)聚乙二醇化方法的另一同等重要的限制因素在于，PEG衍生物可與除所需殘基外的殘基發(fā)生不合需要的副反應(yīng)。組氨酸含有結(jié)構(gòu)以一N(H)--表示的反應(yīng)性亞氨基部分，而許多與e -NH2反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)性物質(zhì)也可與一N(H)--反應(yīng)。類(lèi)似地，氨基酸半胱氨酸的側(cè)鏈具有游離硫氫基，結(jié)構(gòu)以-SH表示。在一些情況下，針對(duì)賴(lài)氨酸￡--冊(cè)12基團(tuán)的PEG衍生物也與半胱氨酸、組氨酸或其它殘基反應(yīng)。這樣可產(chǎn)生經(jīng)PEG衍生化的生物活性分子的復(fù)雜不均勻混合物，并且有破壞目標(biāo)生物活性分子活性的風(fēng)險(xiǎn)。需要開(kāi)發(fā)出如下PEG衍生物，其允許在蛋白質(zhì)內(nèi)的單一位點(diǎn)引入化學(xué)官能團(tuán)，隨后使一種或一種以上PEG聚合物能夠在蛋白質(zhì)表面上明確界定且可預(yù)測(cè)的特定位點(diǎn)與生物活性分子選擇性偶合。
除賴(lài)氨酸殘基外，此項(xiàng)技術(shù)中還曾就開(kāi)發(fā)靶向其它氨基酸側(cè)鏈(包括半胱氨酸、組氨酸和N末端)的活性PEG試劑進(jìn)行了大量嘗試。例如參看美國(guó)專(zhuān)利第6，610，281號(hào)，以引用的方式并入本文中；和“用于先進(jìn)聚乙二醇化技術(shù)的聚乙二醇和衍生物”，奈克塔分子工程目錄，2003，第1-17頁(yè)。可以使用定點(diǎn)誘變和此項(xiàng)技術(shù)中已知的其它技術(shù)，將半胱氨酸殘基位點(diǎn)選擇性地引入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，并且由此得到的游離硫氫基部分可與具有硫醇反應(yīng)性官能團(tuán)的PEG衍生物反應(yīng)。但這種方法比較麻煩，因?yàn)橐胗坞x硫氫基會(huì)使所得蛋白質(zhì)的表達(dá)、折疊和穩(wěn)定性變得復(fù)雜。因此，本發(fā)明提供將化學(xué)官能團(tuán)引入bST和bGH中的合意方式，其能使一種或一種以上PEG聚合物與蛋白質(zhì)選擇性偶合，同時(shí)還與硫氫基以及蛋白質(zhì)中常見(jiàn)的其它化學(xué)官能團(tuán)相容(即，不會(huì)與之發(fā)生不合需要的副反應(yīng))。從此項(xiàng)技術(shù)的抽樣(sampling)中可以了解到,所開(kāi)發(fā)的用于連接蛋白質(zhì)側(cè)鏈,尤 其賴(lài)氨酸氨基酸側(cè)鏈上的一NH2部分和半胱氨酸側(cè)鏈上的-SH部分的許多此類(lèi)衍生物都證實(shí)在合成和使用方面存在問(wèn)題。一些衍生物與蛋白質(zhì)形成不穩(wěn)定鍵，這些鍵將經(jīng)歷水解，并因此分解、降解，或者以其它方式在水性環(huán)境(例如血流)中不穩(wěn)定。一些衍生物形成較為穩(wěn)定的鍵，但會(huì)在形成鍵之前經(jīng)歷水解，這意味著PEG衍生物上的反應(yīng)性基團(tuán)可能會(huì)在連接蛋白質(zhì)之前就失活。一些衍生物略帶毒性，因此不太適于體內(nèi)使用。一些衍生物反應(yīng)過(guò)慢而無(wú)法實(shí)際使用。一些衍生物會(huì)因連接到負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)活性的位點(diǎn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性喪失。一些衍生物對(duì)其將連接的位點(diǎn)不具特異性，這也會(huì)導(dǎo)致喪失所需活性以及缺乏結(jié)果的可再現(xiàn)性。為了克服用聚(乙二醇)部分修飾蛋白質(zhì)所帶來(lái)的問(wèn)題，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出更為穩(wěn)定(例如，美國(guó)專(zhuān)利6，602，498，以引用的方式并入)或與分子和表面上的硫醇部分選擇性反應(yīng)(例如，美國(guó)專(zhuān)利6，610，281，以引用的方式并入)的PEG衍生物。此項(xiàng)技術(shù)中無(wú)疑需要在生理環(huán)境中具化學(xué)惰性，而只有在需要的情況下才選擇性反應(yīng)形成穩(wěn)定化學(xué)鍵的PEG衍生物。已經(jīng)揭示了輕燒基淀粉,尤其是輕乙基淀粉(hydroxyethylstarch,HES)共價(jià)連接到多肽的結(jié)合物的使用，以便潛在地改變多肽的免疫原性和/或變應(yīng)原性。羥乙基淀粉化是一項(xiàng)替代性技術(shù)，其揭示于讓渡于費(fèi)森尤斯卡比公司(Fresenius Kabi AB)的一系列專(zhuān) 利申請(qǐng)案中，包括美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)案第20050063943號(hào)、第20060121073號(hào)、第20010100163號(hào)、第 20050234230 號(hào)、第 20050238723 號(hào)、第 20060019877 號(hào)、第 20070134197 號(hào)、第20070087961號(hào)，以及美國(guó)專(zhuān)利第7，285,661號(hào)，所有這些專(zhuān)利都以引用的方式并入本文中。HES是一種經(jīng)過(guò)修飾的天然聚合物，在臨床上用作血漿增量劑，而羥乙基淀粉化表示將原料藥與HES衍生物偶合以改變藥物特征(例如藥物動(dòng)力學(xué)或水溶性)的技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)還包括經(jīng)由增加分子穩(wěn)定性和降低腎清除率來(lái)延長(zhǎng)蛋白質(zhì)血漿循環(huán)，由此引起生物活性的增力口。此外，也可能降低免疫原性或變應(yīng)原性。通過(guò)改變不同的參數(shù)，例如HES的分子量，可以定制多種!ES結(jié)合物。盡管如此，羥乙基淀粉仍與所有其它當(dāng)前可用的聚合物共有共同的缺點(diǎn)其多分散性。聚合物結(jié)合物是分子量分布在平均值周?chē)姆肿拥幕旌衔?。此均質(zhì)性的缺乏會(huì)引起較低水平的化學(xué)和生物化學(xué)特性表征，并且可阻止醫(yī)藥活性組分到達(dá)其作用位點(diǎn)(受體、酶等)。在這些情況下，活性藥物需要以其原始的非結(jié)合形式遞送，由此需要借助代謝反應(yīng)使聚合物裂解以達(dá)到其醫(yī)藥功效。本發(fā)明的蛋白質(zhì)技術(shù)克服了與蛋白質(zhì)其它位點(diǎn)特異性修飾有關(guān)的許多缺點(diǎn)。具體點(diǎn)說(shuō)，已將新的組分添加到原核生物大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli)(例如L.王(L. Wang)等人，(2001)，科學(xué)(Science) 292:498-500)和真核生物釀酒酵母菌(Sacchromyces cerevisia, S. cerevisiae)(例如 J.秦(J. Chin)等人,科學(xué)301:964-7(2003))的蛋白質(zhì)生物合成機(jī)器中，使得所述機(jī)器能夠在體內(nèi)將非基因編碼氨基酸并入蛋白質(zhì)中。已使用這種方法響應(yīng)琥珀密碼子(TAG)以高保真度將多種具有新穎化學(xué)、物理或生物特性的新氨基酸有效地并入大腸桿菌和酵母的蛋白質(zhì)中，所述新氨基酸包括光親和性標(biāo)記和可光異構(gòu)化氨基酸、光交聯(lián)氨基酸(例如參看秦J.W. (Chin, J.W.)等人(2002)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. ScLU1 S. A. ) 99:11020-11024 ;和秦J. W.等人，(2002)美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(T. Am. Chem. Soc. ) 124:9026-9027)、酮某氡某酸、含有重原子的氨基酸和糖基化氨基酸。例如參看J.W.秦等人，(2002)，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(.Tournal of the American Chemical Society) 124:9026-9027 ；J. ff.秦和 P. G.查魯茲(P.G. Schultz)，(2002).化學(xué)與牛物化學(xué)(ChemBioChem) 3 (11) :1135-1137 ;J.W.秦等人，(2002)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(PNAS United States of America)99:11020-11024 ；以及L.王(L. Wang)和P.G.杳魯茲，(2002).化學(xué)通訊(Chem. Comm. ) , 1:1-11。所有參考文獻(xiàn)都以全文引用的方式并入本文中。這些研究已證實(shí)，有可能選擇性地以常規(guī)方式引入化學(xué)官能團(tuán)，例如酮基、炔基和疊氮部分，這些官能團(tuán)不存在于蛋白質(zhì)中，對(duì)20種常見(jiàn)的基因編碼氨基酸中所見(jiàn)的所有官能團(tuán)具化學(xué)惰性，并且可用于有效且選擇性地反應(yīng)形成穩(wěn)定共 價(jià)鍵。將非基因編碼的氨基酸并入蛋白質(zhì)中的能力允許引入可提供天然存在官能團(tuán)(例如賴(lài)氨酸的S-NH2、半胱氨酸的硫氫基-SH、組氨酸的亞氨基等)的有價(jià)值替代物的化學(xué)官能團(tuán)。已知某些化學(xué)官能團(tuán)對(duì)20種常見(jiàn)的基因編碼氨基酸中所見(jiàn)的官能團(tuán)呈惰性，但能干凈且有效地反應(yīng)形成穩(wěn)定鍵。舉例來(lái)說(shuō)，此項(xiàng)技術(shù)中已知，疊氮基和乙炔基在催化量的銅存在下，可在水性條件中進(jìn)行胡伊斯根(Huisgen) [3+2]環(huán)加成反應(yīng)。例如參見(jiàn)托尼諾(Tornoe)等人，(2002)有機(jī)化學(xué)雜志(.L Org. Chem. ) 67:3057-3064 ;和羅斯托瑟夫(Rostovtsev)等人，(2002)德國(guó)應(yīng)用化學(xué)(Angew. Chem. Int. Ed. ) 41:2596-2599。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)將疊氮部分引入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，就能夠并入對(duì)蛋白質(zhì)中所見(jiàn)的胺、硫氫基、羧酸、羥基具化學(xué)惰性，但也可與乙炔部分平穩(wěn)且有效地反應(yīng)形成環(huán)加成產(chǎn)物的官能團(tuán)。重要的是，在不存在乙炔部分的情況下，疊氮基仍保留化學(xué)惰性，而且在其它蛋白質(zhì)側(cè)鏈存在時(shí)在生理?xiàng)l件下不發(fā)生反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置SEQ ID N0:1 中的3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何組合。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置SEQ ID N0:2中的3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何組合。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何組合。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并AbST 的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置3、7、33、43、58、62、67、69、99、123、124、133、134、141、166，以及其任何組合(SEQ ID NO: I)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入 bST 的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置3、7、33、43、58、62、67、69、99、123、124、133、134、
141、166，以及其任何組合(SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置3、7、33、43、58、62、67、69、99、123、124、133、
134、141，166和其任何組合。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置SEQ ID勵(lì) 1中的3、7、62、133、166，以及其任何組合。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置SEQ ID N0:2中的3、7、62、133、166，以及其任何組合。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置3、7、62、133、166，以及其任何組合。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的62位(SEQ ID N0:1)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的62位(SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的62位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的133位(SEQ ID NO: I)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的133位(SEQ ID NO: 2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的133位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的92位(SEQ ID NO: I)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的92位(SEQ ID NO:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的92位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的35位(SEQ ID N0:1)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的35位(SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的35位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的40位(SEQ IDNO: I)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的40位(SEQ IDNO: 2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的40位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的95位(SEQ ID N0:1)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的95位(SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的95位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的96位(SEQ ID NO: I)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的96位(SEQ ID NO:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的96位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的98位(SEQ ID N0:1)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的98位(SEQ ID NO:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的98位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的99位(SEQ ID NO: I)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的99位(SEQ ID NO:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的99位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的103位(SEQ ID N0:1)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的103位(SEQ ID NO: 2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的103位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的105位(SEQ ID N0:1)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的105位(SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的105位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的137位(SEQ ID N0:1)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的137位(SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的137位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置:35、91、92、94、95、99、101、133、134、138、139、140、142、144、149、150、154，或其任何組合(SEQ ID NO: I)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置:35、91、92、94、95、99、101、133、134、138、139、140、142、144、149、150、154，或其任何組合(SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的以下一個(gè)或一個(gè)以上位置Tyr35、Gln91、Phe92、Ser94、Arg95、Asn99、Leul01、Argl33、Alal34、Leul38、Lysl39、Glnl40、Tyrl42、Lysl44、Leul49、Argl50、Alal54，或其任何組合。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的138位(SEQ ID N0:1)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的138位(SEQ ID NO: 2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的138位。 在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的142位(SEQ ID N0:1)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的142位(SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的142位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的143位(SEQ ID N0:1)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的143位(SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的143位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的144位(SEQ ID NO: I)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的144位(SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的144位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的146位(SEQ ID N0:1)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的146位(SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的146位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的148位(SEQ ID NO: I)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的148位(SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并A bGH 的 148 位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的153位(SEQ IDN0:1)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的153位(SEQ IDN0:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的153位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的154位(SEQ ID N0:1)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的154位(SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的154位。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的158位(SEQ ID NO: I)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bST的158位(SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸并入bGH的158位。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上天然氨基酸取代、添加或缺失。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸并入在SEQ ID NO: 1、2或者其它bST或bGH序列的N或C末端的前導(dǎo)序列或信號(hào)序列中。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上所述位置的非天然存在氨基酸與水溶性聚合物連接，這些位置包括(但不限于)以下位置1位前(即，N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192 (即，蛋白質(zhì)的羧基末端)，以及其任何組合(SEQID NO: I)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上所述位置的非天然存在氨基酸與水溶性聚合物連接，所述位置包括(但不限于)以下位置1位前(即，N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，蛋白質(zhì)的羧基末端)，以及其任何組合(SEQ IDNO: 2 )。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上所述位置的非天然存在氨基酸與水溶性聚合物連接，所述位置包括(但不限于)bGH蛋白的以下位置I位前(S卩，N末端)、I、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、
34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、61、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191 (即，蛋白質(zhì)的羧基末端)和其任何組合。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上所述位置的一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，這些位置包括(但不限于)以下位置35、91、92、94、95、99、101、133、134、138、139、140、142、144、149、150、154，或其任何組合(SEQ ID NO: I)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上所述位置的一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，這些位置包括(但不限于)以下位置35、91、92、94、95、99、101、133、134、138、139、140、142、144、149、150、154，或其任何組合(SEQ ID N0:2)。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上所述位置的一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，這些位置包括(但不限于)bGH 的以下位置Tyr35、Gln91、Phe92、Ser94、Arg95、Asn99、Leul01、Argl33、Alal34、Leul38、Lysl39、Glnl40、Tyrl42、Lysl44、Leul49、Argl50、Alal54，或其任何組合。在一些 實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上所述位置的一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，這些位置包括(但不限于)以下位置SEQ ID N0:1中的3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何組合。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上所述位置的一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，這些位置包括(但不限于)以下位置SEQ ID N0:2中的3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何組合。在一些實(shí)施例中，將一個(gè)或一個(gè)以上所述位置的一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接，這些位置包括(但不限于)bGH的以下位置3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何組合。在一些實(shí)施例中，非天然存在氨基酸是在bGH、SEQ ID NO: 1,2或者其它bST序列的N或C末端的信號(hào)序列或前導(dǎo)序列中，并與水溶性聚合物連接。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，其調(diào)節(jié)bST多肽對(duì)受體或結(jié)合搭配物(包括(但不限于)蛋白質(zhì)、多肽、小分子或核酸)的親和力。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST的穩(wěn)定性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失增加bST多肽的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性和/或溶解性可以使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種不同分析來(lái)測(cè)量。所述分析包括(但不限于)SE-HPLC和RP-HPLC。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST的免疫原性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)bST多肽的免疫原性。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)bST多肽的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST的水溶性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將增加bST多肽的水溶性。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST的溶解性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將增加宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的bST多肽的溶解性。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST在宿主細(xì)胞中的表達(dá)或在體外的合成相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將增加bST多肽的表達(dá)或增加其合成。包含此取代的bST多肽保留了激動(dòng)劑活性，并且保持或改進(jìn)在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST的蛋白酶抗性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將增加bST多肽的蛋白酶抗性。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)同受體與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST多肽相互作用時(shí)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST多肽與另一分子(例如受體)的結(jié)合相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)bST多肽的結(jié)合。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST多肽的造血作用相比較，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)造血作用。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST多肽的中性粒細(xì)胞增殖相比較，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的增殖。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST多肽的中性粒細(xì)胞成熟相比較，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的成熟。在一些實(shí)施例中，bST多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bST與醫(yī)藥用防腐劑(例如間甲酚、苯酚、苯甲醇)的相容性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將增加bST多肽的相容性。此增加的相容性將使保存的醫(yī)藥調(diào)配物制劑能夠在儲(chǔ)存期間保持蛋白質(zhì)的生理化學(xué)特性和生物活性。在一些實(shí)施例中，利用一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸產(chǎn)生一個(gè)或一個(gè)以上經(jīng)工程改造的鍵。分子內(nèi)鍵可以多種方式產(chǎn)生，包括(但不限于)在適合條件下，蛋白質(zhì)中的兩個(gè)氨基酸之間發(fā)生反應(yīng)(一個(gè)或兩個(gè)氨基酸可以為非天然氨基酸)；在適合條件下，兩個(gè)氨基酸與連接子、聚合物或其它分子發(fā)生反應(yīng)，這兩個(gè)氨基酸各自可為天然編碼或非天然編碼的，
坐坐 寸寸o在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，其調(diào)節(jié)bGH多肽對(duì)受體或結(jié)合搭配物(包括(但不限于)蛋白質(zhì)、多肽、小分子或核酸)的親和力。在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH的穩(wěn)定性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將增加bGH多肽的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性和/或溶解性可以使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種不同分析來(lái)測(cè)量。所述分析包括(但不限于)SE-HPLC和RP-HPLC。在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH的免疫原性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)bGH多肽的免疫原性。在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)bGH多肽的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間。在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH的水溶性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將增加bGH多肽的水溶性。在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH的溶解性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將增加宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的bGH多肽的溶解性。在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH在宿主細(xì)胞中的表達(dá)或在體外的合成相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將增加bGH多肽的表達(dá)或增加其合成。包含此取代的bGH多肽保留了激動(dòng)劑活性，并且保持或改進(jìn)在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平。在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH的蛋白酶抗性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將增加bGH多肽的蛋白酶抗性。在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)同受體與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH多肽相互作用時(shí)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH多肽與另一分子(例如受體)的結(jié)合相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)bGH多肽的結(jié)合。在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH多肽的造血作用相比較，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)造血作用。在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH多肽的中性粒細(xì)胞增殖相比較，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的增殖。在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH多肽的中性粒細(xì)胞成熟相比較，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的成熟。在一些實(shí)施例中，bGH多肽包含取代、添加或缺失，當(dāng)與無(wú)取代、添加或缺失的相應(yīng)bGH與醫(yī)藥用防腐劑(例如間甲酚、苯酚、苯甲醇)的相容性相比較時(shí)，所述取代、添加或缺失將增加bGH多肽的相容性。此增加的相容性將使保存的醫(yī)藥調(diào)配物制劑能夠在儲(chǔ)存期間保持蛋白質(zhì)的生理化學(xué)特性和生物活性。在一些實(shí)施例中，bST多肽中的一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸可以用一個(gè)或一個(gè)以上天然存在或非天然存在氨基酸取代。在一些實(shí)施例中，bST多肽中的氨基酸可以用天然存在或非天然存在氨基酸取代，只要至少一個(gè)取代是用非天然編碼氨基酸進(jìn)行即可。在一些實(shí)施例中，bST多肽中的一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸可以用一個(gè)或一個(gè)以上天然存在氨基酸取代，并且另外至少一個(gè)取代是用非天然編碼氨基酸進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，bGH多肽中的一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸可以用一個(gè)或一個(gè)以上天然存在或非天然存在氨基酸取代。在一些實(shí)施例中，bGH多肽中的氨基酸可以用天然存在或非天然存在氨基酸取代，只要至少一個(gè)取代是用非天然編碼氨基酸進(jìn)行即可。在一些實(shí)施例中，bGH多肽中的一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸可以用一個(gè)或一個(gè)以上天然存在氨基酸取代，并且另外至少一個(gè)取代是用非天然編碼氨基酸進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基、乙?；?、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基服基、置氣基或塊基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.一種bST多肽，其包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述bST多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上翻譯后修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述多肽與連接子、聚合物或生物活性分子連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的bST多肽，其中所述多肽與水溶性聚合物連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述多肽與雙官能聚合物、雙官能連接子或至少另一 bST多肽連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的bST多肽，其中所述雙官能連接子或聚合物與第二多肽連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的bST多肽，其中所述第二多肽為bST多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的bST多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的bST多肽，其中所述水溶性聚合物與所述b-GCSF多肽中存在的非天然編碼氨基酸連接。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的群組的位置進(jìn)行取代1位前(即，N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175 (即，所述蛋白質(zhì)的羧基末端)，以及其任何組合(SEQ IDNO: 1，或SEQ ID NO: 2中的相應(yīng)氨基酸)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的群組的位置進(jìn)行取代SEQ ID NO: I 中的 3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何組合，或者 SEQ ID NO:2 中的相應(yīng)氨基酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的群組的位置進(jìn)行取代3、7、33、43、58、62、67、69、99、123、124、133、134、141、166，以及其任何組合(SEQ ID NO:l，或SEQ ID NO:2中的相應(yīng)氨基酸)。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的群組的位置進(jìn)行取代3、7、62、133、166，以及其任何組合(SEQ ID NO:l，或SEQ IDNO:2中的相應(yīng)氨基酸)。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在62位(SEQIDNO: 1，或SEQ ID NO: 2中的相應(yīng)氨基酸)進(jìn)行取代。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在133位(SEQIDNO: 1，或SEQ ID NO: 2中的相應(yīng)氨基酸)進(jìn)行取代。
16.根據(jù)權(quán)利要求4所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的群組的位置進(jìn)行取代1位前(即，N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、·16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、·41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、·66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、·91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、I12、I13、I14、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、·131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、·150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、··169、170、171、172、173、174、175 (即，所述蛋白質(zhì)的羧基末端)，以及其任何組合(SEQ IDNO: 1，或SEQ ID NO: 2中的相應(yīng)氨基酸)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的群組的位置進(jìn)行取代SEQ ID NO: I 中的 3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何組合，或 SEQ ID NO:2 中的相應(yīng)氨基酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的群組的位置進(jìn)行取代3、7、33、43、58、62、67、69、99、123、124、133、134、141、166，以及其任何組合(SEQ ID NO:l，或SEQ ID NO:2中的相應(yīng)氨基酸)。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的群組的位置進(jìn)行取代3、7、62、133、166，以及其任何組合(SEQ ID NO:l，或SEQ IDNO:2中的相應(yīng)氨基酸)。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在62位(SEQIDNO:l，或SEQ ID NO:2中的相應(yīng)氨基酸)進(jìn)行取代。
21.根據(jù)權(quán)利要求4所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在133位(SEQIDNO:l，或SEQ ID NO:2中的相應(yīng)氨基酸)進(jìn)行取代。
22.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述bST多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)所述bST多肽對(duì)bST受體的親和力。
23.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述bST多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失將增加所述bST多肽的穩(wěn)定性或溶解性。
24.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述bST多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失將增加重組宿主細(xì)胞中所述bST多肽的表達(dá)或所述bST多肽的體外合成。
25.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述bST多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失將增加所述bST多肽的蛋白酶抗性。
26.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸對(duì)連接子、聚合物或生物活性分子具反應(yīng)性，而所述連接子、聚合物或生物活性分子另外對(duì)所述多肽中的20種常見(jiàn)氨基酸中的任一者均不具反應(yīng)性。
27.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酸餅基、氣基服基、置氣基或塊基。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu) (CHa)nR1COR2 其中n為0到10 ；R1為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；R2為H、烷基、芳基、經(jīng)取代烷基和經(jīng)取代芳基；且1 3為H、氨基酸、多肽，或氨基末端修飾基團(tuán)；且1 4為H、氨基酸、多肽，或羧基末端修飾基團(tuán)。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的bSTa多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含氨氧基。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含酰肼基。
32.根據(jù)權(quán)利要求27所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含肼基。
33.根據(jù)權(quán)利要求27所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸殘基包含氨基脲基。
34.根據(jù)權(quán)利要求27所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸殘基包含疊氮基。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu) (CH2)llRiXCCHtkNa R2HNix^COR3 其中n為0到10 ；R1為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基、經(jīng)取代芳基，或不存在；X為0、N、S，或不存在；111為0到10 ;R2為H、氨基酸、多肽，或氨基末端修飾基團(tuán)；且1 3為H、氨基酸、多肽，或羧基末端修飾基團(tuán)。
36.根據(jù)權(quán)利要求27所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含炔基。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸具有以下結(jié)構(gòu) (CH2)nR1X(CH2)rnCCH R2HN COR3 其中n為0到10 ；R1為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；X為0、N、S，或不存在；m為0到10 ；R2為H、氨基酸、多肽，或氨基末端修飾基團(tuán)；且1 3為H、氨基酸、多肽，或羧基末端修飾基團(tuán)。
38.根據(jù)權(quán)利要求4所述的bST多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量介于約0.IkDa與約IOOkDa之間。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的bST多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量介于約0.IkDa與約50kDa之間。
40.根據(jù)權(quán)利要求4所述的bST多肽，其是通過(guò)使包含含羰基氨基酸的bST多肽與包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的水溶性聚合物反應(yīng)而制成。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的bST多肽，其中所述氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基經(jīng)由酰胺鍵與所述水溶性聚合物連接。
42.根據(jù)權(quán)利要求4所述的bST多肽，其是通過(guò)使包含羰基的水溶性聚合物與包含非天然編碼氨基酸的多肽反應(yīng)而制成，所述非天然編碼氨基酸包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基服基。
43.根據(jù)權(quán)利要求4所述的bST多肽，其是通過(guò)使包含含炔氨基酸的bST多肽與包含疊氮部分的水溶性聚合物反應(yīng)而制成。
44.根據(jù)權(quán)利要求4所述的bST多肽，其是通過(guò)使包含含疊氮基氨基酸的bST多肽與包含炔部分的水溶性聚合物反應(yīng)而制成。
45.根據(jù)權(quán)利要求27所述的bST多肽，其中所述疊氮基或炔基經(jīng)由酰胺鍵與水溶性聚合物連接。
46.根據(jù)權(quán)利要求4所述的bST多肽，其中所述水溶性聚合物為分支或多臂聚合物。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的bST多肽，其中所述水溶性聚合物各分支的分子量介于約IkDa與約IOOkDa之間。
48.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述多肽為bST拮抗劑。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的bST多肽，其中所述多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上翻譯后修飾、連接子、聚合物或生物活性分子。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的bST多肽，其中所述聚合物包含選自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)組成的群組的部分。
51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的bST多肽，其中所述多肽阻止所述bST受體活化。
52.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含糖部分。
53.根據(jù)權(quán)利要求3所述的bST多肽，其中所述連接子、聚合物或生物活性分子經(jīng)由糖部分與所述多肽連接。
54.—種分離的核酸,其包含在嚴(yán)格條件下與編碼SEQ ID NO: I或2的聚核苷酸序列雜交的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包含至少一個(gè)選擇密碼子。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的分離的核酸，其中所述選擇密碼子選自由以下各密碼子組成的群組琥珀密碼子、赭石密碼子、蛋白石密碼子、獨(dú)特密碼子、稀有密碼子和四堿基密碼子。
56.一種制備根據(jù)權(quán)利要求3所述的bST多肽的方法，所述方法包含使包含非天然編碼氨基酸的分離的bST多肽與連接子、聚合物或生物活性分子接觸，所述連接子、聚合物或生物活性分子包含與所述非天然編碼氨基酸反應(yīng)的部分。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述聚合物包含選自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)組成的群組的部分。
58.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、餅基、氣基服基、置氣基或塊基。
59.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基部分，且所述連接子、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分經(jīng)由酰胺鍵與所述連接子、聚合物或生物活性分子連接。
61.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含炔部分，且所述連接子、聚合物或生物活性分子包含疊氮部分。
62.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述非天然編碼氨基酸包含疊氮部分，且所述連接子、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
63.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述疊氮或炔部分經(jīng)由酰胺鍵與連接子、聚合物或生物活性分子連接。
64.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分的平均分子量介于約.0.IkDa 與約 IOOkDa 之間。
65.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分為分支或多臂聚合物。
66.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的組合物，其中所述非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。
68.一種治療患有受bST調(diào)節(jié)的病癥的動(dòng)物的方法，其包含對(duì)所述動(dòng)物投予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求66所述的組合物。
69.—種細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求54所述的核酸。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含正交tRNA合成酶或正交tRNA。
71.一種制備包含非天然編碼氨基酸的bST多肽的方法，所述方法包含，在允許表達(dá)所述包含非天然編碼氨基酸的bST多肽的條件下，培養(yǎng)包含一個(gè)或一個(gè)以上編碼bST多肽且包含選擇密碼子的聚核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的細(xì)胞；以及純化所述bST多肽。
72.—種調(diào)節(jié)bST多肽的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間的方法，所述方法包含用一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸取代所述bST多肽中任一個(gè)或一個(gè)以上天然存在氨基酸。
73.—種bST多肽，其是由具有編碼SEQ ID NO: I或2所示多肽的序列的聚核苷酸所編碼，其中所述聚核苷酸包含選擇密碼子，且其中所述多肽包含至少一個(gè)非天然編碼氨基酸。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸與連接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子連接。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的bST多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
76.根據(jù)權(quán)利要求73所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的群組的位置進(jìn)行取代1位前(即，N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、I11、I12、I13、I14、I15、I16、I17、I18、I19、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、I49、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175(即，所述蛋白質(zhì)的羧基末端)，以及其任何組合(SEQ IDNO: 1，或SEQ ID NO: 2中的相應(yīng)氨基酸)。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的群組的位置進(jìn)行取代SEQ ID NO: I 中的 3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何組合，或 SEQ ID NO:2 中的相應(yīng)氨基酸。
78.根據(jù)權(quán)利要求76所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的群組的位置進(jìn)行取代3、7、33、43、58、62、67、69、99、123、124、133、134、141、166，以及其任何組合(SEQ ID NO:l，或SEQ ID NO:2中的相應(yīng)氨基酸)。
79.根據(jù)權(quán)利要求76所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在選自由以下殘基組成的群組的位置進(jìn)行取代3、7、62、133、166，以及其任何組合(SEQ ID NO:l，或SEQ IDNO :2中的相應(yīng)氨基酸)。
80.根據(jù)權(quán)利要求76所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在62位(SEQIDNO: 1，或SEQ ID NO: 2中的相應(yīng)氨基酸)進(jìn)行取代。
81.根據(jù)權(quán)利要求73所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸在133位(SEQIDNO: 1，或SEQ ID NO: 2中的相應(yīng)氨基酸)進(jìn)行取代。
82.根據(jù)權(quán)利要求73所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸包含羰基、氨氧基、酸餅基、餅基、氣基服基、置氣基或塊基。
83.根據(jù)權(quán)利要求75所述的bST多肽，其中所述聚(乙二醇)部分的分子量介于約.0.IkDa 與約 IOOkDa 之間。
84.根據(jù)權(quán)利要求75所述的bST多肽，其中所述聚(乙二醇)部分為分支或多臂聚合物。
85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的bST多肽，其中所述聚(乙二醇)部分的分子量介于約IkDa與約IOOkDa之間。
86.—種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求73所述的bST多肽和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。
87.—種bST多肽，其包含一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失將增加重組宿主細(xì)胞中所述bST多肽的表達(dá)。
88.—種bST多肽，其包含經(jīng)由共價(jià)鍵與所述bST多肽的單一氨基酸連接的水溶性聚合物。
89.根據(jù)權(quán)利要求88所述的bST多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
90.根據(jù)權(quán)利要求88所述的bST多肽，其中所述與所述水溶性聚合物共價(jià)連接的氨基酸為非天然編碼氨基酸。
91.根據(jù)權(quán)利要求10所述的bST多肽，其中所述非天然編碼氨基酸與聚(乙二醇)分子連接。
92.一種bST多肽，其包含至少一個(gè)連接子、聚合物或生物活性分子，其中所述連接子、聚合物或生物活性分子通過(guò)經(jīng)核糖體并入所述多肽中的非天然編碼氨基酸的官能團(tuán)與所述多肽連接。
93.根據(jù)權(quán)利要求92所述的bST多肽，其中所述bST多肽為單聚乙二醇化的。
94.一種bST多肽，其包含與一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸連接的連接子、聚合物或生物活性分子，其中所述非天然編碼氨基酸是經(jīng)核糖體并入所述多肽中預(yù)先選擇的位點(diǎn)。
95.根據(jù)權(quán)利要求94所述的bST多肽，其中所述bST多肽包含一個(gè)所述連接子、聚合物或生物活性分子。
96.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述bST多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失將在投予所述多肽后調(diào)節(jié)動(dòng)物的造血作用。
97.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述bST多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失將調(diào)節(jié)所述bST多肽的血清半衰期或循環(huán)時(shí)間。
98.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述bST多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失將在投予所述多肽后調(diào)節(jié)動(dòng)物的中性粒細(xì)胞增殖。
99.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述多肽還包含天然編碼氨基酸取代。
100.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述bST多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失將在投予所述多肽后調(diào)節(jié)動(dòng)物的中性粒細(xì)胞成熟。
101.根據(jù)權(quán)利要求I所述的bST多肽，其中所述bST多肽包含一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失將在投予所述多肽后調(diào)節(jié)動(dòng)物的中性粒細(xì)胞功倉(cāng)泛。
102.一種治療患有受bST調(diào)節(jié)的感染的動(dòng)物的方法，其包含對(duì)所述動(dòng)物投予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求66所述的組合物。
103.根據(jù)權(quán)利要求4所述的bST多肽，其中所述水溶性聚合物經(jīng)由肟鍵與所述多肽連接。
104.一種預(yù)防動(dòng)物感染的方法，其包含對(duì)所述動(dòng)物投予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求66所述的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供經(jīng)過(guò)修飾的牛促生長(zhǎng)素多肽和其用途。
文檔編號(hào)C07K14/475GK102753573SQ201080058893
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日
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