專利名稱：組織重現(xiàn)和圖像自動分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及光顯微術(shù)，尤其涉及細胞化學(xué)染色和免疫生物化學(xué)染色自動分析技術(shù)。
背景技術(shù)：
當(dāng)前的細胞成像系統(tǒng)中，由自動顯微系統(tǒng)掃描包含染色細胞試樣的染色玻片的區(qū)域。玻片的整個細胞試樣區(qū)成像為一系列視場圖像。為了進一步分析，必須分別分析各視場圖像，使全部感舉的候補對象位于視場圖像內(nèi)。此方法適合不大于觀察圖像寬度或長度范圍的細胞體或細胞簇。對自動分析和人工分析而言，形態(tài)特征往往僅分析一個視場，從而分析環(huán)境僅限于一塊玻片上的該視場。

發(fā)明內(nèi)容
揭示一種生物試樣圖像自動分析方法。將生物試樣染色或?qū)Ρ热旧蕴峁┨囟?biāo)記，或者在免疫組織化學(xué)或原位混成的情況下，以可檢測的方式對該標(biāo)記示蹤。這些標(biāo)記包含本領(lǐng)域公知的酶、放射性同位素、螢光物或其他標(biāo)記。然后，由光成像系統(tǒng)在多個位置掃描試樣，以獲取圖像。而且，用相鄰位置重現(xiàn)并提供整個試樣的全部圖像。又進一步處理重現(xiàn)的整個試樣圖像，以識別具有關(guān)注對象或關(guān)注區(qū)的坐標(biāo)。對關(guān)注的候補對象選擇這些坐標(biāo)。一較佳實施例中，自動取得所關(guān)注候補對象的低倍率圖像。最好該圖像是彩色數(shù)字圖像。對各試樣中所關(guān)注像素的候補對象自動進行形態(tài)處理，以識別假像素和其余不識別為假像素的所關(guān)注像素候補對象。將取得低倍率圖像的裝置調(diào)節(jié)到較高的倍率，以便在低倍率圖像對應(yīng)的位置坐標(biāo)，對每一候補對象或關(guān)注區(qū)獲取高倍率圖像。在第一彩色空間的高倍率圖像的像素自動變換到第二彩色空間，以區(qū)別所關(guān)注像素的高倍率候補對像和背景像素并且識別所關(guān)注高倍率對象和第二彩色空間的關(guān)注像素的候補對象。因此，病理學(xué)家或技術(shù)專家能識別所關(guān)注的候補對象是否已對關(guān)注的標(biāo)記特定染色，或?qū)Ρ热旧蛘呒忍囟ㄈ旧謱Ρ热旧?br> 又揭示一種細胞圖像自動形成方法，用于分析生物試樣，該試樣用蘇木精和曙紅(H/E)在一組織部分連續(xù)染色，并且借助一種或幾種免疫組織化學(xué)(IHC)法和/或原位混成(ISH)法在并行的組織部分連續(xù)染色。為了識別在單一視場圖像或用單一染色法不能獲取的組織中的結(jié)構(gòu)，本發(fā)明提供一種重現(xiàn)方法，以同時分析許多玻片上的許多視場。該方法用自動的方式將復(fù)合圖像配對，以進行處理和分析。在機動化鏡臺上支承裝有為識別結(jié)構(gòu)而染色的生物試樣的玻片。產(chǎn)生生物試樣的圖像，進行數(shù)字化并加以存儲。由于物鏡的視場小于整個生物試樣，形成組織重現(xiàn)。然后，按一種順序?qū)⑦@些存儲的整個組織部分的圖像放在一起，使H/E染色玻片與免疫組織化學(xué)玻片配對，以便病理學(xué)家可同時進行圖像分析?？莎B加該圖像，或?qū)⑵洚?dāng)作相鄰圖像觀察。
一實施例中，本發(fā)明提供一種生物試樣圖像自動分析方法，該方法提供要分析的生物試樣，在多個坐標(biāo)自動掃描該試樣，在每一坐標(biāo)自動取得圖像，從各圖像重現(xiàn)試樣的圖像以便重現(xiàn)圖像，并且處理該重現(xiàn)圖像以便識別候補對象或關(guān)注區(qū)。
另一實施例中，本發(fā)明提供一種組織重現(xiàn)方法。此方法中，將生物試樣的樣本分成許多子樣。用染色、對比染色、免疫組織化學(xué)法、原位混成法或其組合對每一子樣進行處理。然后，掃描每一樣本，從各樣本取得圖像。重現(xiàn)這些圖像，使第一圖像與對應(yīng)的連續(xù)樣本圖像配對，以識別對象或關(guān)注區(qū)。
又一實施例中，本發(fā)明提供一種計算機程序，駐留在計算機可讀媒體，用于進行生物試樣圖像自動分析。該計算機程序包含使計算機處理樣本用的指令，其處理方法是在多個坐標(biāo)掃描樣本，重現(xiàn)各圖像的樣本以便形成重現(xiàn)的樣本，識別重現(xiàn)圖像中的候補對象或關(guān)注區(qū)的坐標(biāo)，并且在從圖像得到的坐標(biāo)獲取圖像。


圖1是細胞圖像自動分析裝置的立體圖。
圖2是圖1所示裝置的框圖。
圖3是圖1所示裝置卸去封殼后的俯視圖。
圖4是圖1所示裝置中顯微鏡子系統(tǒng)的側(cè)視圖。
圖5示出玻片載體。圖5a是變化使用圖1所示裝置用的玻片載體的俯視圖。圖5b是圖5a所示玻片載體的仰視圖。
圖6示出自動玻片處理子系統(tǒng)。圖6a是圖1所示裝置中自動玻片處理子系統(tǒng)的俯視圖。圖6b是沿A-A線的圖6a自動玻片處理子系統(tǒng)部分剖視圖。
圖7a～7d說明自動玻片處理子系統(tǒng)的輸出操作。
圖8是自動決定掃描區(qū)的程序的流程圖。
圖9是圖2中顯微鏡控制器的框圖。
圖10示出組織重現(xiàn)的方法。
詳細說明綜述圖1和圖3示出分析細胞試樣用的自動顯微鏡，圖2示出其框圖?？捎脵C動化鏡臺38支承玻片70(圖5)。玻片裝有生物試樣，該試樣通常染色，以識別分析所關(guān)注的結(jié)構(gòu)。生物試樣定義為裝在顯微鏡玻片上的生物原體的細胞或非細胞樣本。生物試樣可以是例如組織部分、生物液試樣(如顯微鏡玻片上的零星血液細胞旋樣或直接種在玻片上的細胞懸浮液)。
至少一個光學(xué)傳感陣列(諸如物鏡)44a位于鏡臺上方，光源48則位于鏡臺下面。來自光源的光照射鏡臺和玻片，并且光學(xué)傳感陣列(例如物鏡)產(chǎn)生生物試樣的圖像。該圖像存放在存儲器中。最好圖像是數(shù)字化的，或者是數(shù)字圖像。由于光學(xué)陣列的視場小于整個生物試樣，使鏡臺在平面方向移動該方向視場長度所對應(yīng)的距離。于是，可捕捉該位置產(chǎn)生的圖像，并加以存儲。由于原圖像存在光翻動，所捕獲的圖像沿其中心線翻動。在同一方向繼續(xù)移動鏡臺并捕捉移動所得圖像，直到達到玻片試樣區(qū)的末端。這時，鏡臺在其他平面方向上移動該方向上視場長度所對應(yīng)的距離，并產(chǎn)生另一圖像加以存儲。玻片用這種方式橫向移動或掃描，直到通過物鏡觀察到玻上的整個試樣區(qū)。然后，用一種順序?qū)⑦@些存儲的圖像放在一起，該順序集合這些圖像以產(chǎn)生細胞試樣的復(fù)合圖像或重現(xiàn)圖像。于是，可分析此圖像，以檢測跨越一個以上像界或一個以上玻片延伸的結(jié)構(gòu)，同時作進一步分析。該分析的可識別視場中或疊蓋二個或多個視場的對象中的候補對象或關(guān)注區(qū)。這種情況下，此系統(tǒng)會自動決定這候補對象的坐標(biāo)，并可得到不同倍率的附加圖像。
現(xiàn)有細胞成像系統(tǒng)中由自動顯微系統(tǒng)掃描玻片區(qū)，用上述方式以系列視場圖像形成整個玻片試樣區(qū)的圖像。然而，這些系統(tǒng)要求分別分析各視場圖像，以便使關(guān)注的全部候補對象位于視場圖像內(nèi)，供進一步分析。這種方法可用于規(guī)模不超過圖像的視場寬度或長度的細胞物。為了識別一個視場圖像中不能捕獲的組織的結(jié)構(gòu)，本發(fā)明采用一種識別包含要分析的部分組織結(jié)構(gòu)的視場圖像的分析方法。首先識別相互鄰近的視場圖像，然后將這些視場圖像識別包含有染色、抗體或試樣要識別的組織結(jié)構(gòu)。接著，又在高倍率下觀察此組織圖像部分，以另外取得詳況。尚未揭示從視場圖像自動建立組合試樣圖像，并且處理該組合圖像或其構(gòu)成圖像，以識別超過一個視場的組織結(jié)構(gòu)。
此外，現(xiàn)有自動系統(tǒng)的問題是不斷需要操作者進行輸入，使細胞對象處于初始位置的以便分析。這種不斷依賴人工輸入會導(dǎo)致出錯，包括錯過關(guān)注對象。這些差錯會嚴重，尤其對所謂稀有事件的化驗，例如在百萬常規(guī)細胞繁殖的細胞中找出一個染色細胞。此外，人工方法非常費時，并且會要求進行高度訓(xùn)練，以正確識別或定量分析細胞。除了長時間厭煩人工檢驗會產(chǎn)生潛在差錯外，相關(guān)的人工勞動還導(dǎo)致這些過程成本高。因此，需要一種能快速準(zhǔn)確掃描玻片上大量生物物質(zhì)的改良的自動細胞圖像分析系統(tǒng)。
除非已定義，這是用的全部科技術(shù)語，其含義與本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域普通人員公知的相同。雖然本發(fā)明實踐或測試中可用類似或等同于這里說明的方法和材料，但下文說明適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧稀?br> 核染色劑、夾層染料和對比染色劑術(shù)語“核染色劑”指優(yōu)先染色真核細胞核的細胞化學(xué)染色劑。許多核染色劑為夾層染料。術(shù)語“夾層染料”指本身能插在核酸的相鄰核苷酸之間的化學(xué)化合物，用于提供可檢測的顏色。
本領(lǐng)域已公知許多核染色劑，其中最常用的一種是蘇木精。蘇木精染色劑常與各種金屬鹽(媒染劑)組合使用。蘇木精染色劑用于各種目的，依據(jù)所用的金屬，具有各種顏色。鋁色淀依據(jù)pH，為紫到藍。鐵色淀為深藍。鉻色淀也為深藍。銅色淀為藍綠到紫。鎳色淀為各種紫羅藍色調(diào)。錫色淀為紅。鉛色淀為深棕。鋨色淀為綠棕。其他核染色劑包括吉姆沙染色、甲基綠(結(jié)合到富AT的DNA區(qū))和核快紅。
熒光染色劑包括Hoechst 33342、Hoechst 33258(Calbiochem)、在近紫外(350nm)激勵并且在藍光區(qū)(450nm)發(fā)光的二苯并酰亞胺(bisbenzimide)DNA夾層染料、噻唑橙、在可見光譜的藍光區(qū)(515nm)激勵并在綠光區(qū)(530nm)發(fā)光的DNA的熒光團染色劑、ADPI、菲啶溴紅(即溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓)、普匹碘銨(即碘化3，8-二氨基-5-[3-(二乙基甲銨)丙基]-6-苯基菲啶)、TOTO、YOYO 1，本發(fā)明還包含SYTOX藍或綠染色劑。優(yōu)先結(jié)合富GC或富AT染色體區(qū)的幾種染料與這些區(qū)結(jié)合時顯示不同的熒光強度，造成熒光帶圖案。例如，7-氨基放線菌素D選擇性的結(jié)合富GC的DNA區(qū)和9-氨基-6-氯-2甲氧基吖啶則在富AT的DNA區(qū)熒光強度最大。吖啶均二聚物與富AT的DNA區(qū)結(jié)合時，熒光發(fā)射較優(yōu)。
術(shù)語“對比染色劑”與核染色劑組合使用時，指結(jié)合真核細胞區(qū)而不結(jié)合核的細胞化學(xué)染色劑。本領(lǐng)域已熟知許多對比染色劑。最常用的一種是曙紅，它將真核細胞的細胞質(zhì)染為不同的粉紅色調(diào)。其他對比染色劑專用于特定細胞器官或細胞中的蛋白質(zhì)。例如Kleihauer-Betke細胞化學(xué)染色專用于胎兒血紅蛋白(一種優(yōu)先體現(xiàn)于胎細胞中的血紅蛋白質(zhì))，因而能定義為胎紅血細胞的特定標(biāo)記。術(shù)語“坐標(biāo)”或“地址”用于表示試樣或樣本上的特定位置?？捎萌我鈹?shù)量的手段識別坐標(biāo)和地址，這些手段包括X-Y坐標(biāo)、r-P坐標(biāo)和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的手段。
一實施形態(tài)中，用自動細胞成像方法識別母體血試樣中的胎核紅細胞。首先，按照胎兒血紅蛋白的Kleihauer-Betke細胞化學(xué)染色識別胎細胞。自動細胞成像系統(tǒng)根據(jù)胎細胞比母體紅細胞鮮紅的顏色(胎兒血紅蛋白的表示)將胎細胞作為對象識別。為了確保識別適當(dāng)?shù)膶ο螅捎靡?guī)模和形狀的形態(tài)“濾器”，排除很小和很大的對象。
用另外的核酸的細胞化學(xué)染色劑將細胞加以對比染色，從而導(dǎo)致帶核紅血細胞(一般為胎紅血細胞)為藍色。自動圖像分析系統(tǒng)識別鮮紅對象中紅細胞核的適當(dāng)規(guī)模和形狀的染色對象，使該成像系統(tǒng)可識別帶核胎紅細胞并進行計數(shù)。可考慮篩選胎兒的唐氏綜合癥，對這些細胞計數(shù)，其中，與常規(guī)妊娠相比，唐氏綜合癥妊娠中，這種細胞出現(xiàn)的頻次通常較高。
一較佳實施例中，用蘇木精/曙紅(H/E)將玻片染色，并且將若干包含鄰近部分的并行玻片染色成一個或若干個特定標(biāo)記。
H/E染色的結(jié)果給細胞提供染成深藍的核、染成粉紅色調(diào)變化的細胞質(zhì)、染成深桃紅的肌纖維、染成深紅的血紅蛋白和染成桔紅的紅血細胞。
例如，按標(biāo)準(zhǔn)H/E規(guī)準(zhǔn)備蘇木精/曙紅(H/E)玻片。標(biāo)準(zhǔn)溶液包含如下成份(1)若干吉爾蘇木精(蘇木精6.0g、硫酸鋁4.2g、檸檬酸1.4g，碘化鈉0.6g、乙二醇269ml、蒸餾水680ml)，(2)曙紅(帶黃曙紅1.0g、蒸餾水00ml)；(3)碳酸鋰1％(碳酸鋰1g、蒸餾水100g)，(4)酸醇1％70％(濃酒精99ml、鹽酸1ml)，(5)斯科特自來水。在包含11蒸餾水的燒杯中加入20g碳酸氫鈉和3.5g硫酸鎂。放入磁攪拌器，進行徹底混合，將各種鹽溶解。利用過濾漏斗將該溶液倒入標(biāo)瓶。
染色過程如下(1)將組織或細胞部分放入水中，(2)將這些部分放入蘇木精內(nèi)5分鐘，(3)用自來水清洗，(4)在碳酸鋰或斯科特自來水中使這些部分變“藍”，(5)用自來水清洗，(6)將這些部分放入1％酸醇內(nèi)幾秒種，(7)用自來水清洗，(8)將這些部分放入曙紅內(nèi)5分鐘，(9)用自來水清洗，(10)用分品酒精溶液脫水。裝定這些部分。
特定標(biāo)記是僅在生物試樣成份子集中出現(xiàn)的分子或分子團，因而專門標(biāo)識具有該標(biāo)記的成份。特定標(biāo)記常定義為特定抗體(單克隆或多克隆)識別的抗原，能用免疫組織化學(xué)檢測。
另一組特定標(biāo)記由這些標(biāo)記專門與核酸試劑混成的容量規(guī)定。這些標(biāo)記常用原位混成檢測。
第三組特定標(biāo)記可用其活性規(guī)定，能用組織化學(xué)檢測。
第四組特定標(biāo)記可用特定染料以組織化學(xué)法直接染色。
第五組特定標(biāo)記可定義為專門結(jié)合一個或多個配體的受體。特定配體本身用于檢測受體一配體復(fù)合物，所用檢測方法包括組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)或原位混成。
免疫組織化學(xué)法和原位混成法這里用的免沒組織化學(xué)法包括采用檢測細胞特定標(biāo)記的試劑，諸如抗體和核酸試劑。包括單克隆抗體、多克隆抗體及其部分的抗體，常用于識別樣本中所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多酞。根據(jù)免疫組織化學(xué)法，利用許多技術(shù)對關(guān)注的對象示蹤?！斗肿由飳W(xué)當(dāng)前規(guī)約》(第14單元部分，Ausubel等著，John Wiley&Sons1995年出版)中討論這些技術(shù)，其內(nèi)容在此通過參考引入。例如，以下過程是采用抗體專門識別，尤其是HER2蛋白質(zhì)的免疫組織化學(xué)染色的例子。在大部分胸癌中，按照特定標(biāo)記描述HER2出現(xiàn)過份。此規(guī)約適用于對嵌入根據(jù)常規(guī)程序準(zhǔn)備的組織部分的石臘染色。
此部分利用2次二甲苯浴并且通過分品酒精浴脫水后，放入去離子水，去除石臘。然后，在95C的抗原回收緩沖液培育該部分40分鐘，該緩沖液包含檸檬酸鹽。又將玻片冷卻到室溫，在同一緩沖劑中保持20分鐘。然后，用去離子水沖洗玻片。
謹慎使組織部分周圍的面積干燥，并且用疏水定界筆圍繞玻片上試樣畫線。在該部分加入過氧物酶封閉液，并且在室溫下培育5分鐘。用洗滌緩沖液(一種平衡鹽溶液)洗2次，在室溫下用識別HER2蛋白質(zhì)的第一抗體培育該組織部分30分鐘。
用洗滌緩沖液洗3次后，用配合過氧物酶的第二抗體培育該組織部分。第二抗體專門識別第一抗體。然后，用洗滌緩沖液洗滌玻片3次。在具有DAB和雙氧水的環(huán)境中培育該組織部分10分鐘后，用水洗滌。
在蘇木精中對該組織部分進行對比染色2分鐘后，再次用水漂洗。采用含水固定媒體，以蓋漿固定玻片。
細胞分子的免疫組織化學(xué)定位利用抗體與特定抗源結(jié)合的性能，其例子有關(guān)注的蛋白質(zhì)，諸如高親和力的致癌蛋白質(zhì)和酶。這些抗體可用于對子細胞層或組織內(nèi)的個體細胞定位抗體。
原位混成法包括專門示蹤的核酸試劑，后者結(jié)合各細胞或組織部分中的細胞RNA或DNA。用標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)制備適當(dāng)?shù)暮怂嵩噭?，該技術(shù)包括對核酸試劑的子克隆、質(zhì)體制備和放射性示蹤或非放射性示蹤。
原位混成通常在石臘部分或凍結(jié)部分進行。這類技術(shù)常包含精選組織，以提供僅一個細胞層或少量細胞層后的樣本。例如供僅一個細胞層或少量細胞層后的樣本。例如包含組織樣本的石臘塊切割成約8um薄的組織部分，隨后固定在打底玻片上，以便原位混成中進一步處理?；蛘?，可用甲基丙烯酸鹽進行分割。低溫分割法尤其適用用于免疫組織化學(xué)和酶組織化學(xué)。
組織部分的免疫熒光示蹤通常采用夾層測定或第一抗體與第二抗體的熒光色配合。在磷酸鹽緩沖的鹽水中洗滌含所關(guān)注組織部分的玻片后，將其暴露給結(jié)合所關(guān)注蛋白質(zhì)對象的第一抗體，隨后，洗滌該玻片后，將其暴露給合第一抗體的第二抗體。該玻片經(jīng)洗滌后，進行顯影。免疫組織化學(xué)染色和原位混成領(lǐng)域中公知的許多其他技術(shù)都能方便地適應(yīng)用于這里揭示的免疫組織化學(xué)重現(xiàn)。
因此，本發(fā)明的方法中可用借助化學(xué)染色和/或免疫組織化學(xué)和/或原位混成技術(shù)的組合。例如可從單一組織試樣制備許多子取樣?？砂匆陨嫌懻搶Φ谝蛔訕颖具M行化學(xué)染色，并對后續(xù)的子樣本采樣免疫組織化學(xué)法和原位混成法。按以下討那樣對每一子樣本進行掃描和處理。然后，可疊蓋或處理重現(xiàn)的圖像，以進一步識別關(guān)注對象。
組織重現(xiàn)組織重現(xiàn)是具體在將生物試樣固定在玻片上時從分析的試樣片構(gòu)成整個試樣圖像的過程。通過以任何特定倍率拼合一個以上的視場產(chǎn)生該圖像。
參閱圖10，在玻片樣本301的第一具體坐標(biāo)捕獲代表對象視場的圖像302。玻片在X-Y鏡臺上自動重新定位，以取得對應(yīng)于第二具體坐標(biāo)303的第二(新)視場。此新視場最好緊鄰第一視場，但只要在成像系統(tǒng)保持每一視場的坐標(biāo)(地址/標(biāo)識)，就可完成組織重現(xiàn)。重復(fù)此過程，直到捕獲整個試樣的圖像。
根據(jù)每一圖像的X和Y坐標(biāo)，按數(shù)字方式重現(xiàn)試樣。作為重現(xiàn)的一部分，由于原圖像的光翻動，可將圖像翻到正確。
形成組織重現(xiàn)圖像的過程包括使裝置掃描關(guān)注的顯微鏡玻片，并且形成掃描期間所得圖像的重現(xiàn)圖像。所形成的圖像可以是整個掃描區(qū)或其部分的全色重現(xiàn)，例如識別關(guān)注對象或關(guān)注區(qū)的整個掃描區(qū)的重現(xiàn)。重現(xiàn)的數(shù)字圖像可用于進一步處理或分析，以識別先前未檢測到的關(guān)注對象和關(guān)注區(qū)。例如，在重現(xiàn)的數(shù)字圖像中可識別疊蓋一個或多個視場或玻片的關(guān)注對象或關(guān)注區(qū)。
參閱圖1和圖2，也稱為系統(tǒng)的裝置10包含顯微鏡32、機動化X、Y和Z鏡臺38、攝像機42適應(yīng)接收并處理視頻圖像信號的計算機22和控制本裝置并執(zhí)行本方法的一套軟件程序。用樣本特征的光特性測量形成玻片和掃描區(qū)的圖像，以尋找關(guān)注的子區(qū)，并分析這些區(qū)的特性。對樣本賦值以求出關(guān)注區(qū)的圖像處理方法采用24位彩色圖像信號中色調(diào)、飽和度或強度以及亮度的度量產(chǎn)生黑中顯白的關(guān)注目標(biāo)圖像。對該圖像進行處理，其方法為分別將全色圖像變換成色調(diào)、飽和度或強度以及亮度的分量，按門限值處理這些分量，在二個圖像之間進行邏輯“與”，然后對所得圖像進行門限處理，使任何零以上像位值成為255。參照下文說明的裝置，會進一步理解上述處理和圖像捕獲。
自動化系統(tǒng)本發(fā)明提供一種自動分析生物試樣的方法，不需要操作者進行輸入，來定位分析用的關(guān)注生物對象或關(guān)注區(qū)。
參閱圖1，帶生物試樣和試劑的已制備玻片放在玻片載體60(圖5)中，該載體最好保持4個玻片。將該玻片載體放入自動化系統(tǒng)10的輸入饋斗16。然后，操作者輸入識別設(shè)備規(guī)約的數(shù)據(jù)，該規(guī)約包含每一玻片的掃描區(qū)的規(guī)模、形狀和位置的信息，或者該系統(tǒng)最好在玻片處理時對每一玻片自動定位掃描區(qū)。于是，操作者啟動系統(tǒng)10進行玻片處理。系統(tǒng)動作時，玻片載體60位于光學(xué)系統(tǒng)(諸如顯微鏡子系統(tǒng)32)的X-Y鏡臺38上。對載體中各玻片讀取識別玻片用的任何條形碼并加以存儲。以通常為10X的低倍率快速掃描整個玻片。在每一掃描位置捕獲一低倍率圖像并進行處理，以檢測候補對象或關(guān)注區(qū)。最好用顏色、規(guī)模和形狀識別關(guān)注對象或關(guān)注區(qū)。各候補對象或關(guān)注區(qū)的位置可參照其坐標(biāo)或地址加以存儲。也存儲每一視場，作為較大復(fù)合圖像的部分(別處詳述)。
在對鏡臺上載體中每一玻片完成低電平掃描時，可將光學(xué)系統(tǒng)調(diào)節(jié)到諸如40X或60X的高放大倍率，以便另外處理試樣并捕獲圖像，而使X-Y鏡臺位于載體中各玻片上候補對象或關(guān)注區(qū)的存儲位置。對各候補對象或關(guān)注區(qū)捕獲高倍率圖像，并執(zhí)行一系列圖象處理步驟，確認低倍率下完成的分析。對每一連續(xù)的對象或關(guān)注區(qū)存儲高倍率圖像。然后，這些圖像可供病理學(xué)家或細胞技術(shù)專家檢索，以進行最后診斷評價的觀察。由于已存儲每一對象或關(guān)注區(qū)的位置，可產(chǎn)生包含玻片的候補對象或關(guān)注區(qū)拼合體，并加以存儲。病理學(xué)家或細胞技術(shù)專家可觀看該拼合體，也可直接觀看拼合體中對象或關(guān)注區(qū)位置上的玻片，以進一步評價。該拼合體可存儲在磁媒體或光媒體上，以便將來參考，或者可發(fā)送到遠端現(xiàn)場，供觀察或存儲。審查一塊玻片包含的全部處理需要約4-100分鐘，取決于掃描區(qū)規(guī)模和關(guān)注候補對象檢測的數(shù)量。
本發(fā)明用于胎細胞產(chǎn)前診斷、稀有事件檢測、快速細胞計數(shù)、組織評價和其他診斷。
自動掃描所捕獲圖像的處理，其步驟最好包括將圖像變換到不同的色區(qū)，該變換最好通過色調(diào)、飽和度和強度。濾波所得圖像的像素受到動態(tài)門限處理以抑制背景物，該處理包括執(zhí)行形態(tài)處理以去除門限內(nèi)圖像的假圖像，分析門限內(nèi)圖像以決定同色像素連接的一個或多個區(qū)域的存在，并將規(guī)模大于最小規(guī)模的各區(qū)歸類為候補對像或關(guān)注區(qū)。
根據(jù)另一方面，自動決定掃描區(qū)，其方法包括掃描玻片，在各玻片位置捕獲圖像，分析各圖像的紋理或彩色信息以檢測試樣的邊緣，并存儲所檢測邊緣對應(yīng)的位置以限定掃描區(qū)。
根據(jù)再一方面，通過從掃描區(qū)中的點陣或位置初始決定焦面，達到光學(xué)系統(tǒng)自動聚焦。導(dǎo)出的焦面使低功率掃描操作中能接著快速自動聚焦。一實施例中，通過決定位置陣列上的適當(dāng)聚焦位置，并執(zhí)行聚焦位置陣列的最小平方擬合以取得該陣列的焦面，從而決定上述焦面。最好通過使2臺的位置遞增粗細迭代的固定數(shù)，以決定每一位置的聚焦處。每次迭代，捕獲一圖像，并計算像素方差、形態(tài)梯度或其他有關(guān)捕獲圖像的像素均值的光學(xué)參數(shù)，以形成一組評價數(shù)據(jù)。選擇素均值的光參數(shù)，以形成一組評價數(shù)據(jù)。選擇最小平方擬合曲線的峰值作為最佳聚集處的估值。
另一方面中，高倍率聚焦定位方法圍繞低倍率圖像分析期間定位的玻片內(nèi)關(guān)注候補對象集中定位關(guān)注區(qū)。關(guān)注區(qū)最好是n列寬，n為2的冪。然后，用快速傅里葉變換處理該區(qū)的像素，以產(chǎn)生頻率分量的頻譜，和對應(yīng)于各頻率分量的復(fù)合幅值，最好是最大頻率分量的25％到75％的頻率分量的復(fù)合幅值進行平方并求和，從而取得關(guān)注區(qū)的總功率。對其他Z位置重變此過程，并將對應(yīng)于關(guān)注區(qū)最大總功率的Z位置選為最佳聚焦處。此方法可配合許多細胞試樣染色和類型使用。
根據(jù)又一方面，提供一種自動玻片操作方法。將一玻片和一些其他玻片并排地固定在玻片載體60上(圖5)。玻片載體60與其他玻片載體一起位于輸入饋斗16中，以便自動分析一批玻片。玻片載體裝到光學(xué)系統(tǒng)32的X-Y鏡臺38上，以便分析其上的玻片。隨后，在自動圖像分析后，將第一玻片載體卸入輸出饋斗18中，并自動裝上另一載體。
參閱附圖，如圖1的立體圖和圖2的框圖所示，用參考數(shù)10總體表示生物試樣細胞圖像自動分析裝置。裝置10包含裝在殼體12中的顯微鏡子系統(tǒng)32。殼體12包含玻片載體輸入饋斗16和玻片載體輸出饋斗18。殼體12中的門14使顯微鏡子系統(tǒng)對外界安全。計算機子系統(tǒng)包含計算機22，該計算機具有二個系統(tǒng)處理器23、一個圖像處理器25和一個通信調(diào)制解調(diào)器29。計算機子系統(tǒng)還包含計算機監(jiān)視器26、圖像監(jiān)視器27和其他外圍設(shè)備，后者包括存儲器21、指點器30、鍵盤28和彩色打印機35。還示出外部電源24，用于對系統(tǒng)供電。顯微鏡子系統(tǒng)的觀察目鏡20從殼體12伸出，以便操作者觀察。裝置10還包含3芯片CCD攝像機42，用于通過顯微鏡子系統(tǒng)32攝取圖像。計算機直接控制許多顯微鏡子系統(tǒng)的功能，后文將詳述。與X-Y鏡臺38結(jié)合的自動玻片饋給機構(gòu)37提供裝置10中的自動玻片操作處理。照明光源48將光投射在X-Y鏡臺38上，接著通過顯微鏡子系統(tǒng)32成像，并由3芯片CCD攝像機42攝取，供圖像處理器25進行處理。顯微鏡控制器31控制下的Z臺或聚焦臺46提供Z平面上顯微鏡子系統(tǒng)的位移，以便進行聚集。顯微鏡子系統(tǒng)32還包含機動化目標(biāo)轉(zhuǎn)盤44，用于選擇目標(biāo)。
裝置10用于對制備的顯微鏡波片進行無人值守自動掃描，以便對諸如染色細胞候補對象或關(guān)注區(qū)進行檢測和計數(shù)。本發(fā)明的一實施例中，可用于分析組織。另一實施例中，則用于稀有事件檢測，其中每幾十萬常規(guī)細胞僅有一個候補對象受到關(guān)注，例如每2平方厘米面積的玻片有1到5個關(guān)注的候補對象。裝置10根據(jù)例如顏色、規(guī)模和形狀特征自動定位到候補對象和關(guān)注區(qū)進行計數(shù)，并估計細胞試樣中存在的常規(guī)細胞?？捎迷噭┲苽渖镌嚇?，以取得帶色的不溶解沉淀物。一實施例中，用此裝置檢測該沉淀物作為候補對象或關(guān)注區(qū)。
操作裝置10時，病理學(xué)家或?qū)嶒炇壹夹g(shù)員將制備的玻片裝在玻片載體上。圖5中示出玻片載體60，下文將進一步說明。每一玻片載體保持多達4塊玻片。然后，將多達25個的玻片載體裝入輸入饋斗16。操作者可規(guī)定要掃描區(qū)域的尺寸、形狀和位置，或者該系統(tǒng)能自動對該區(qū)域定位。然后，操作者通過圖形用戶接口命令系統(tǒng)開始對玻片進行自動掃描。隨著將第一載體和玻片自動裝在機動化X-Y鏡臺38，無人值守的掃描開始進行。在該裝入操作期間，條形碼讀出器33讀出貼在玻片上的條形碼標(biāo)記。然后，按使用者選擇的低顯微鏡倍率(例如10X)對每一玻片進行掃描，以根據(jù)顏色、規(guī)模和形狀特征建立組織重現(xiàn)或識別候補對象。將候補對象或關(guān)注區(qū)的X-Y位置加以存儲，直到完成掃描。
完成低倍率掃描后，如果需要，裝置可自動返回各候補對象或關(guān)注區(qū)，以諸如40X的高倍率重新成像、重新聚集，并進行進一步分析，以確認生物候補對象。該裝置存儲關(guān)注對象或關(guān)注區(qū)的圖像，供以后病理學(xué)家觀察?？蓪⑷拷Y(jié)果和圖像存儲到諸如可移動硬驅(qū)，光盤或DAT帶之類的存儲裝置21，或者可發(fā)送到遠端現(xiàn)場供觀察或存儲。可按圖像拼合體觀看各玻片的存儲圖像，以便進一步觀察。此外，病理學(xué)家或操作者也可通過顯微鏡用其包含的目鏡20直接觀看或在圖像監(jiān)視器27上觀看檢測的對象或關(guān)注區(qū)。
二個系統(tǒng)處理器102還控制照明控制器106，后者用于控制子鏡臺照明48。從對系統(tǒng)照明的例如鹵素?zé)襞莅l(fā)出的光會由于燈泡老化，光校準(zhǔn)變化等因素而隨時變化。此外，“過度染色”的玻片會使攝像機曝光減少到不可接受的程度。為了補償這些影響，備有照明控制器106。此控制器配合光控制軟件，用于補償光的變化。光控制軟件在一些時間間隔(諸如裝入玻片載體之間)對攝像機的輸出取樣，并命令控制器把光調(diào)節(jié)到希望的程度。這樣，光控制對用戶是自動且透明的，不給系統(tǒng)操作增加額外的時間。
系統(tǒng)處理器23最好由2套并行的Intel公司的400mHz奔騰第六代設(shè)備組成，圖像處理器25最好是Makrox Gemesis板。一較佳實施例中，計算機按Windows NT工作。會知道結(jié)合本發(fā)明，在此方法中可用任何數(shù)量的處理器和操作系統(tǒng)。
現(xiàn)參閱圖3和圖4，說明裝置10的進一步詳況，圖3示出去除殼體12的裝置10的俯視圖。對顯微鏡子系統(tǒng)32的左面示出自動玻饋片鍋給機構(gòu)37的一部分，該部分包含載體取出裝置34和取出平臺36，結(jié)合玻片載體輸出饋斗18，起接收已分析的玻片載體的作用。
提供振動隔離架40(圖4中詳細示出)，使顯微鏡子系統(tǒng)32與通常實驗室環(huán)境中會出現(xiàn)的機械沖擊和振動隔離。除外界振動外，X-Y鏡臺38的高速操作也會在顯微鏡子系統(tǒng)32引起振動?？墒闺娮?光學(xué)子系統(tǒng)隔離該振動源，以免對圖像質(zhì)量產(chǎn)生不好的影響。隔離架40包含彈簧40a和柱塞406，埋在高粘度硅膠中，該硅膠封入與殼體結(jié)合的彈性膜片，從而阻尼因數(shù)達到約17％到20％。
自動玻片處理子系統(tǒng)每次操作一個玻片載體。圖5a圖5b示出玻片載體60，分別為俯視圖和仰視圖。玻片載體60包含用粘帶62固定的玻片70(多達4塊)。載體60包含掛耳64，用于將載體掛入輸出饋斗18。在玻片載體60的上緣形成槽66和節(jié)距齒條68，以便機械上操作玻片載體。載體60的一側(cè)形成鍵槽切口65，便于載體對齊。裝在玻片載體60上的所制備的玻片72包含樣本區(qū)72a和條形碼標(biāo)記區(qū)726。
圖6提供玻片處理子系統(tǒng)的俯視圖，該子系統(tǒng)包含玻片輸入組件15、玻片輸出組件17和X-Y鏡臺驅(qū)動帶50。圖6b提供圖6a中沿A-A線剖切的局部剖視圖。
玻片輸入組件15包含玻片載體輸入饋斗16、加載平臺52和玻片載體加載子裝置54。輸入饋斗16在加載平臺52的堆疊中接收一系列玻片載體60(圖5a和圖5b)。導(dǎo)鍵57從輸入饋斗16的一側(cè)伸出，與載體的鍵槽切口65(圖5a)配合，以達到正確對準(zhǔn)。
輸入組件15還包含裝在加載平臺52的旋轉(zhuǎn)分度凸輪56和開關(guān)90，下文進一步說明其操作。載體子裝置54包含電動機86驅(qū)動的饋入驅(qū)動帶59。饋入驅(qū)動帶59包含推進片58，用于帶59驅(qū)動時將玻片載體水平推進到X-Y鏡臺38。導(dǎo)引開關(guān)95在帶59旋轉(zhuǎn)期間感測推進片58。
具體參閱圖6a，所示出的X-Y鏡臺38具有X位置電動機96和y位置電動機97，它們由顯微鏡控制器31(圖9)控制，并且不考慮作為玻片處理子系統(tǒng)的部分。X-Y鏡臺38還包含孔55，使照明可達玻片載體。開關(guān)91裝在孔55附近，用于感測與載體接觸，從而啟動電動機87，以驅(qū)動鏡臺驅(qū)動帶50(圖6b)。驅(qū)動帶50是雙側(cè)定時帶，具有與載體60的節(jié)距齒條(圖5b)嚙合的齒。
玻片輸出組件17包含玻片載體輸出饋斗18、取出平臺6和玻片載體取出子裝置34。取出子裝置34是電動機89，用于取出操作(下文說明)期間使取出平臺36圍繞軸98旋轉(zhuǎn)。電動機88驅(qū)動的饋出齒輪93嚙合載體60的節(jié)距齒條68(圖5b)且可轉(zhuǎn)動，以便將載體傳送到對開關(guān)92靜止的位置。彈簧加載壓緊機構(gòu)將載體按位置保持在取出平臺36上。
現(xiàn)在說明玻片處理操作。參閱圖7，示出的一系列玻片載體60堆疊在輸入饋斗16中，并且其上緣60a對齊。玻片處理操作開始時，電動機85驅(qū)動的分度凸輪56前進一圈，使僅有一個玻片載體落到饋斗16的底部，并且落在加載平臺52上。
圖7a～7b較詳細示出凸輪的動作。分度凸輪56包含裝有上葉片56b和下葉片56c的殼56b。葉片56a和56c是半圓形部，相互對置并且在垂直方向上隔開。在圖8所示的第一位置，上葉片56b在槽部66支持位于底部的載體。在分度凸輪旋轉(zhuǎn)180度的位置(如圖7b所示)，上葉片56b不再支持該載體，而代之以該載體略為下落，并由下葉片56c支持。上葉片56b已充分旋轉(zhuǎn)，從而嚙合下一玻片載體的槽66，而對置的下葉片56c仍支持該底層載體。在如圖7d所示轉(zhuǎn)整個360度后，下葉片56c已對載體堆疊反向轉(zhuǎn)動，不再支持當(dāng)前已停留在加載平臺52上的底層載體。在該位置，上葉片56b支持下一載體，重復(fù)進行以上的循環(huán)。
再次參閱圖6a和圖6b，載體跌落到加載平臺52時，其接觸使啟動電動機86和87的開關(guān)90閉合。電動機86驅(qū)動饋入驅(qū)動帶59，直到推進片58與載體接觸，并將載體推到X-Y鏡臺驅(qū)動帶50上，該驅(qū)動帶50使載體前進，直到與開關(guān)91接觸，該開關(guān)的閉合啟動這里進一步說明的玻片掃描過程。完成掃描過程時，X-Y鏡臺38移到卸載位置，并且啟動電動機8和88，用鏡臺驅(qū)動帶50將載體輸送到取出平臺36。電動機88驅(qū)動饋出齒輪93，使其嚙合載體60的載體節(jié)距齒條68(圖5b)，直到接觸開關(guān)92。開關(guān)92的閉合啟動電動機89，使輸出平臺36轉(zhuǎn)動。
在輸出組件17的端視圖(圖7a～7d)較詳細示出下載操作。圖7a中，按支持玻片載體60的水平位置示出輸出平臺36。壓緊機構(gòu)94在一端固定載體60。圖7b示出電動機89使輸出平臺36轉(zhuǎn)動到垂直位置后的輸出組件17，在該位置彈簧加載壓緊機構(gòu)94將玻片載體60釋放到輸出饋到18。借助掛耳64(圖5a和圖5b)將載體60支持在輸出饋斗18中。圖7c示出轉(zhuǎn)回水平位置的輸出平臺16。平臺16向上轉(zhuǎn)動，與存放的載體60接觸。向上的移動將載體推到輸出饋斗18的前面。圖7d示出對輸出饋斗18輸出一系列玻片載體60后處于原水平位置的輸出平臺36。
專利申請08/758,436中進一步說明裝置10涉及掃描、聚焦和圖像處理的諸方面，該專利在此引入。
計算機的實施可在硬件或軟件或者二者組合中實現(xiàn)本發(fā)明的各方面。然而，本發(fā)明的算法和處理過程最好在可編程計算機執(zhí)行的一個或多個計算機程序中實現(xiàn)，每一計算機包含至少一個處理器、至少一個數(shù)據(jù)存儲系統(tǒng)(包括易失性和非易失性存儲器和/或存儲單元)、至少一個輸入裝置和至少一個輸出裝置。應(yīng)用程序碼輸入數(shù)據(jù)，以執(zhí)行這里說明的功能，并產(chǎn)生輸出信息。以公知方式將該輸出信息加到一個或多個輸出裝置。
各程序可用任何希望的語言(包括機器語言、匯編語言、高級過程評議或面向?qū)ο缶幊陶Z言)實現(xiàn)，以便與計算機系統(tǒng)通信。任何情況下，該語言可以是被編譯語言或解釋語言。
每一上述計算機程序最好存放在通用或?qū)Ｓ每删幊逃嬎銠C可讀的存儲媒體或器件(例如ROM、CD-ROM、磁帶或磁盤)，以便計算機讀取存儲媒體或存儲器件以執(zhí)行這里說明的程序時，配置并操作計算機。本發(fā)明的系統(tǒng)也可考慮作為用計算機程序配置的計算機可讀存儲媒體實現(xiàn)，這樣配置的存儲媒體使計算機按專門和預(yù)定的方式工作，以執(zhí)行這里說明的功能。
已經(jīng)說明本發(fā)明的一些實施例。然而，可作各種改進而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明不受具體說明的實施例限制，僅受所附權(quán)利要求書的范圍約束。
權(quán)利要求
1.一種生物試樣的圖像自動分析方法，其特征在于包含(a)提供要分析的生物樣本；(b)在多個坐標(biāo)自動掃描該樣本；(c)在每一所述坐標(biāo)自動取得圖像；(d)從每一個體圖像自動重現(xiàn)樣本的圖像以形成樣本的重現(xiàn)圖像；(e)處理該重現(xiàn)圖像以識別候補對象或關(guān)注區(qū)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于還包含(a)自動識別重現(xiàn)圖像中候補對象或關(guān)注區(qū)的坐標(biāo)；(b)在從重現(xiàn)圖像獲得的位置坐標(biāo)上自動捕獲關(guān)注對象或關(guān)注區(qū)的圖像。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用免疫組織化學(xué)檢測關(guān)注對象或關(guān)注區(qū)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用原位混成檢測關(guān)注對象或關(guān)注區(qū)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用染色劑檢測關(guān)注對象或關(guān)注區(qū)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，染色劑是從以下各項構(gòu)成的組選擇的核酸染料蘇木精、吉姆沙染色劑、甲基綠、核快紅、Hoechst 33342、Hoechst 33258、噻唑橙、DAPI、溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓、碘化3，8-二氨基-5-[3-(二乙基甲銨)丙基]-6-苯基菲啶、TOTO、YOYO-1、SYTOX藍、SYTOX綠、7-氨基放線菌素、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶、和吖啶均二聚物。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，用諸如曙紅或Kleihauer Betke細胞化學(xué)染色劑或其組合的細胞質(zhì)染料對關(guān)注對象和關(guān)注區(qū)進行染色。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，關(guān)注對象和關(guān)注區(qū)是細胞特定標(biāo)記。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，用核染色和對比染色檢測細胞特定標(biāo)記。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，用免疫組織化學(xué)、原位混成、染色或其組合檢測細胞特定標(biāo)記。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，重現(xiàn)圖像是數(shù)字圖像。
12.一種組織重現(xiàn)方法，其特征在于包含(a)在一系列玻片上提供生物試樣的樣本，其中連續(xù)樣本是(1)由諸如蘇木精和曙紅(H/E)之類的核染色劑進行染色，或(2)用免疫組織化學(xué)(IHC)法以可檢測方式進行示蹤并進行對比染色，或(3)用原位混成(ISH)法以可檢測的方式進行示蹤并進行對比染色，或(4)用IHC和ISH法的組合以可檢測的方式進行示蹤并進行對比染色；(b)從每一樣本自動取得圖像；(c)自動重現(xiàn)樣本圖像，使第一樣本圖像與具有相應(yīng)圖像的連續(xù)樣本配對；(d)自動執(zhí)行試樣的組織重現(xiàn)。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，第一樣本和連續(xù)樣本具有疊蓋的圖像。
14.一種計算機程序，駐留在計算機可讀媒體上，用于自動分析生物試樣，其特征在于，該計算機程序包含使計算機執(zhí)行以下操作的指令(a)處理樣本，其中用核酸染料和對比染色劑對該樣本染色；(b)在多個坐標(biāo)掃描該樣本；(c)在每一所述坐標(biāo)取得圖像；(d)從各個體圖像重現(xiàn)樣本以形成該樣本的重現(xiàn)圖像；(e)識別重現(xiàn)樣本中候補對象或關(guān)注區(qū)的坐標(biāo)；(f)在從重現(xiàn)樣本取得的位置坐標(biāo)上捕獲關(guān)注對象的圖像。
15.如權(quán)利要求14所述的計算機程序，其特征在于，樣本的重現(xiàn)圖像是數(shù)字圖像。
16.一種計算機程序，駐留在計算機可讀媒體上，用于組織重現(xiàn)，其特征在于，該計算機程序包含使計算機執(zhí)行以下操作的指令(a)從一系列玻片上的生物試樣產(chǎn)生圖像，加以數(shù)字化并且存入存儲器中，其中連續(xù)樣本是(1)由諸如蘇木精和曙紅之類的核染色劑進行染色，或者(2)用免疫組織化學(xué)(IHC)法以可檢測的方式進行示蹤以及進行對比染色，或者(3)用原位混成(ISH)法以可檢測的方式示蹤以及進行對比染色，或者(4)用IHC和ISH法的組合以可檢測的方式進行示蹤以及進行對比染色；(b)按一種順序安排存放的樣本圖像，使核酸染色和對比染色的樣本與連續(xù)IHC或ISH樣本配對；(c)自動執(zhí)行試樣的組織重現(xiàn)。
全文摘要
所提供的組織重現(xiàn)生物試樣圖像自動分析方法(圖2的42)是一種分析生物試樣的自動細胞成像方法,該試樣或是用原位混成(ISH)法或免疫組織化學(xué)(IHC)法或核酸染色加以連續(xù)染色,以及對比染色。該方法以自動方式配合復(fù)合圖像進行處理和分析,以識別單個視場圖像或單一染色技術(shù)不能捕獲的組織中的結(jié)構(gòu)(圖2的44)。所揭示的內(nèi)容提供一種同時分析許多玻片上的視場(圖2的37)的組織重現(xiàn)方法。
文檔編號G01N1/30GK1384949SQ00808767
公開日2002年12月11日 申請日期2000年4月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月13日
發(fā)明者B·埃利斯, W·德克爾, G·姆克拉朗 申請人:色品視覺醫(yī)學(xué)體系股份有限公司