專利名稱：核酸間差異的檢測方法
1.發(fā)明領域本發(fā)明涉及分子生物學領域，更具體而言是核酸雜交、霍利迪連結體形成和支鏈遷移。一方面，本發(fā)明提供了檢測兩相關核酸序列間的差異存在的方法和試劑。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，此差異是突變，例如點突變、缺失或插入。本發(fā)明的實際應用包括，但并不局限于基因型分析、單核苷酸多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)和檢測、多核苷酸定性和定量、突變率檢測、基因表達分析。此外，本發(fā)明能夠區(qū)別純合基因變異和雜合基因變異。
2.發(fā)明背景在開發(fā)多種核酸雜交技術時，利用了核酸與互補核酸進行選擇性和特異性結合的傾向。這些技術不僅在檢測核酸序列間的互補性和/或同一性(例如差別基因表達水平定量如RNA印記、DNA印記、以及基因表達芯片/微陣列)，并且在一些情況下，可利用它們來檢測相關核酸序列間的差異。
目前，低特異性使得基于等位基因特異性雜交之上的基因型測定技術的準確性較差。尤其是，目前基于多核苷酸雜交的基因型測定技術在區(qū)別或鑒定單核苷酸多態(tài)性方面經常表現(xiàn)出特異性不足。例如，含有特定SNP的一種形式的特定DNA鏈/寡核苷酸鏈不僅能與完全匹配的互補DNA進行雜交，也能與非完全匹配的特異性DNA鏈/寡核苷酸鏈，如含有特定SNP的另一種形式的特定DNA鏈或寡核苷酸鏈進行雜交。雖然兩條完全互補的DNA鏈的雜交較非完全互補DNA鏈(包括那些含有兩互補鏈間一或多堿基對錯配的DNA鏈)間的雜交要強，但一般來講，單堿基對差異太小而不能為SNP評分提供足夠的特異性。相反，基因表達芯片和/或微陣列常常具有較SNP芯片/微陣列更好的特異性/準確性，這是由于特定cDNA及它們固定化在芯片/微陣列上的相應的寡核苷酸/DNA片段之間的雜交是非常特異的。這樣的雜交不一定依賴于兩核酸間的單堿基對差異。此處公開的方法將高度特異的等位基因特異性霍利迪結構形成與核酸雜交技術(如基因芯片/微陣列)進行結合，從而解決了這個問題。因此，SNP芯片/微陣列能獲得與基因表達芯片/微陣列相同的高水平特異性/準確性。
在Panyutin IG等1993年發(fā)表的論文(Panyutin IG，Hsieh P，單堿基錯配的形成阻止了自發(fā)的DNA支鏈遷移(1993)J.MoI.BioL，230413-24.)中，將一個與單鏈M13mp18病毒DNA的特定部分完全(或部分)互補的單鏈寡核苷酸退火結合到此病毒DNA上，形成在每個末端具有1個(或2個)尾的部分雙鏈體。寡核苷酸與M13mp18病毒DNA形成的部分雙鏈體形成具有1個(或2個)互補尾的侵入的部分雙鏈體的十字型類霍利迪結構。隨后，十字型樣霍利迪結構以遠離尾的方向進行支鏈遷移(由于能量屏障的存在，也即破壞了現(xiàn)有的氫鍵而不能形成新的氫鍵情況的存在，使得支鏈遷移不能向尾方向進行)。對在含有單尾的部分雙鏈體間形成的霍利迪結構來講，不管存在還是不存在Mg++，寡核苷酸/M13mp18部分雙鏈體的雙鏈體部分與侵入的部分雙鏈體之間的單(或多)堿基對差異提供了足夠的能屏障(2氫鍵→0氫鍵)，以阻止支鏈遷移的進行并防止退火寡核苷酸的釋放。對于含有雙尾的部分雙鏈體間形成的霍利迪結構來講，只有在Mg++存在的情況下，寡核苷酸/M13mp18部分雙鏈體的雙鏈體部分與侵入的部分雙鏈體之間的單堿基對差異(取代，缺失或插入)才能提供足夠的能屏障來推動支鏈遷移來阻止退火寡核苷酸的釋放。
已經提出的一個檢測相關核酸序列間差異的方法包括在這些相關核酸序列間形成一個包含有霍利迪連結體的復合體。此方法在美國專利NO.6,013,439中有描述，在這個復合體中，至少對一對非互補核酸鏈的每個成員進行了標記。這兩個標記堿基對會產生信號，這要依賴于這兩個標記的堿基對間緊密接近。如果在此相關核酸間存在差異，霍利迪連結體就是穩(wěn)定的，從而對彼此緊密接近的標記進行定位，并產生信號。另一方面，如果兩序列間不存在差異，霍利迪連結體是不穩(wěn)定的，復合體就解離為雙鏈體，消除了兩個標記間的緊密接近，并削弱了信號。對穩(wěn)定的復合體是否形成進行確定，此穩(wěn)定復合體的存在表明兩相關序列間存在差異。
利用上述方法來檢測相關核酸序列間是否存在差異時存在一個問題，也就是這通常需要利用標記過的PCR引物來產生檢測霍利迪連結體復合體所需的標記核酸鏈。尤其是，當用于分析的靶核酸是基因組DNA時，利用標記引物就存在問題，這取決于必需采用的引物濃度以及由高水平標記引物的存在隨后產生的干擾。因為此方法的一個重要的應用就是對基因組DNA進行分析，所以這是一個重大的缺陷。此外，標記核酸的制備和利用成本高且不方便，因此，不需要利用標記的多核苷酸或引物就能確定核酸序列間差異的有效方法是理想的方法。
本發(fā)明通過提供用于快速高效檢測相關核酸序列間存在的差異的新穎方法和試劑解決了使用標記的多核苷酸和引物所引起的問題。同樣的，本發(fā)明包含了對包括分子生物學和醫(yī)學在內的相關領域的高度理想和實際的補充。
在Panyutin IG和Hsieh P的發(fā)現(xiàn)基礎之上，我們設計了一個基因型分析方法，利用它可進行基因型的多元分析(在一個分析反應中可同時分析上萬SNP/突變)并消除了對單個PCR反應的需求。因此，我們的方法具有顯著減低成本并提高基因圖譜分析結果的潛力。
3.發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了檢測兩相關核酸間存在或不存在差異的方法。這些方法具有足夠高的敏感性，可檢測到核酸間存在的任何差異，甚至可對單核苷酸多態(tài)性進行檢測。在這些方法中，靶核酸和參照核酸在特定條件下進行接觸，從而使它們形成具有能夠遷移的支鏈結構的十字型核酸復合體。在這樣的接觸條件下，如果靶核酸和參照核酸是完全相同的，那么支鏈遷移就能夠完成，從而完成完整的鏈交換。如果靶核酸和參照核酸是不同的，就不能完成支鏈遷移，從而形成穩(wěn)定的十字型復合體。檢測到穩(wěn)定的十字型復合體就能確定核酸間差異的存在?？梢岳门c這些復合體進行特異性結合的分子、利用凝膠電泳或通過對穩(wěn)定的十字型復合體進行特異性分離對此穩(wěn)定的十字型復合體進行檢測。
在一個示范性實施方案中，本發(fā)明提供了檢測兩相關核酸間差異存在的方法。此方法包括形成包含有以雙鏈體形式存在的兩核酸序列的十字型復合體，其中，此十字型復合體中的核酸或者是都沒有進行標記，或者是對形成十字型復合體的四核酸鏈中的一個進行了標記；將此十字型復合體置于能進行支鏈遷移的條件下，其中，如果兩相關核酸序列間存在差異，那么該十字型復合體中的支鏈遷移就停止，此十字型復合體繼續(xù)以穩(wěn)定的十字型復合體形式存在；如果兩相關核酸序列間不存在差異，十字型復合體中的支鏈遷移繼續(xù)進行，直至完成完整的鏈交換，并且此十字型復合體解離為兩雙鏈體核酸；支鏈遷移后，將十字型復合體或其解離后的雙鏈體產物置于特定條件下，使得該十字型復合體與試劑進行特異性結合，該十字型復合體與試劑進行的結合產生了可檢測到的信號，檢測到該十字型復合體與試劑特異性結合產生的信號就說明該十字型復合體的存在，也就說明兩相關核酸序列間存在差異，沒有檢測到此信號說明兩相關核酸序列間缺乏差異的存在。
在另一個示范性實施方案中，本發(fā)明提供了檢測兩相關核酸間差異存在的方法。此方法包括形成包含有以雙鏈體形式存在的兩核酸序列的十字型復合體，其中，此十字型復合體中的核酸或者是都沒有進行標記，或者是形成十字型復合體的四條核酸鏈中的一個或多個進行了標記；將此十字型復合體置于能進行支鏈遷移的條件下，其中，如果兩相關核酸序列間存在差異，那么該十字型復合體中的支鏈遷移就停止，此十字型復合體繼續(xù)以穩(wěn)定的十字型復合體形式存在；如果兩相關核酸序列間不存在差異，十字型復合體中的支鏈遷移繼續(xù)進行，直至完成完整的鏈交換，并且此十字型復合體解離為兩雙鏈體核酸；支鏈遷移后，將十字型復合體或其解離后的雙鏈體產物置于能從雙鏈體DNA中分離十字型DNA復合體(霍利迪結構)的條件下，并對該十字型復合體進行分離。通過與固定化在芯片/微陣列上的寡核苷酸/DNA片段進行雜交，包含有十字型復合體的DNA片段就可用做SNP評分的探針。
4.附圖簡述

圖1提供了一個按照本發(fā)明的實施方案示意圖，此實施方案利用PCR來檢測兩相關核酸序列間的差異，其中，兩相關序列間不存在任何差異可導致完整的支鏈遷移，并導致霍利迪連結體復合體解離；圖2提供了本發(fā)明的一個實施方案示意圖，此實施方案利用PCR來檢測兩相關核酸序列間的差異，其中，兩相關序列間存在的差異妨礙了支鏈的遷移，并導致穩(wěn)定的霍利迪連結體復合體形成；圖3提供了一個示意圖，此圖表示了一種利用與霍利迪連結體特異結合的蛋白來檢測兩相關核酸間差異的方法，其中兩相關序列中的一個序列上存在變異，支鏈遷移停止，形成了穩(wěn)定的霍利迪連結體復合體，而此復合體可利用標記的霍利迪連結體特異性結合蛋白來進行檢測；圖4提供了一個示意圖，此圖表示了另一種利用與霍利迪連結體特異結合的蛋白來檢測兩相關核酸間差異的方法，其中兩相關序列中的一個序列上存在變異，支鏈遷移停止，形成了穩(wěn)定的霍利迪連結體復合體，而此復合體是可利用標記的霍利迪連結體特異性結合蛋白來進行檢測的；圖5提供了靶DNA基因型分析方法的示意圖；圖6A提供了一個方法示意圖，此方法可利用解離固定化在固體基質上的十字型復合體來對兩核酸進行比較；圖6B提供了一個方法示意圖，此方法可通過對固定化在固體基質上的穩(wěn)定的霍利迪結構進行檢測來檢測兩核酸間差異的存在；圖7提供了本發(fā)明的一個實施方案示意圖，此實施方案利用PCR來確定在特定的SNP位置的二倍體基因組DNA樣品的基因型；圖8A提供了典型的凝膠電泳實驗結果，其中檢測到了穩(wěn)定的霍利迪結構；圖8B提供了典型的凝膠電泳實驗結果，其中檢測到了核苷酸的幾個堿基對差異；圖9A圖解了穩(wěn)定的霍利迪結構在蛋白結合條件下的遷移率變動；圖9B圖解了穩(wěn)定的霍利迪結構的特異性結合，這是通過RuvA來進行的；圖9C圖解了穩(wěn)定的霍利迪結構的特異性結合，它們分別是利用RuvA、突變RuvC、以及RuvA和突變RuvC混合物來進行的；以及圖10圖解了穩(wěn)定的霍利迪結構與RuvA和RuvC的特異性反應。
5.附表簡述表1圖解了一個示范性方法，此方法可利用PCR來確定二倍體基因組DNA樣品的基因型。
6.優(yōu)選實施方案的詳述正如在發(fā)明背景部分所述，以前用于檢測核酸序列間差異的方法具有不準確、低產量和高成本的缺陷。
正如下面的詳述，本發(fā)明通過提供新穎的核酸差異檢測方法克服了這些困難及其他的限制。與以前的兩核酸間差異的檢測方法相比，本發(fā)明中的方法具有提高的準確性和效率。
6.1縮寫在本專利說明書中，所提及的含有特定堿基序列的核酸的簡寫是傳統(tǒng)的單字母簡寫。因此，包含于核酸時，天然的編碼核酸堿基簡寫如下腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。此外，除非有特別說明，以系列單字母簡寫表示的核酸序列是按5′→3′方向排列的。
6.2定義此處所用的名詞“核酸”和“多核苷酸”是可以互換的，都指代任何核酸，不管此核酸是由脫氧核糖核苷還是由核糖核苷組成，也不管其連接方式是磷酸二酯鍵還是其他的修飾過的鍵，如磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲酯、乙酰胺、氨基甲酸酯、硫醚、橋聯(lián)氨基磷酸酯、橋聯(lián)亞甲基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、二硫代磷酸酯、橋聯(lián)硫代磷酸酯或砜鍵以及這些鍵的結合。
術語核酸、多核苷酸以及核苷酸也特別包含除由五種生物學上的堿基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶以及尿嘧啶)組成的核酸以外的核酸。例如，本發(fā)明中的多核苷酸可至少含有一種修飾的堿基，這些修飾的堿基是選自包括但并不局限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基鳥嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w以及2，6-二氨基嘌呤。
此外，本發(fā)明中的多核苷酸可含有至少一種修飾過的糖，它選自包括但不局限于由阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖以及己糖組成的組中。
本發(fā)明并沒有受到到多核苷酸來源的限制。此處的多核苷酸可取自人或非人哺乳動物，或其他生物體，或源自任何重組來源、通過體外合成或化學合成的多核苷酸。這些核苷酸可以是DNA、RNA、cDNA、DNA-RNA、雜交體或他們的混合物等，并且他們可以雙鏈、單鏈或部分雙鏈的形式存在。本發(fā)明中的核酸包括以純化或非純化形式存在的核酸和其片段，包括基因、染色體、質粒、生物物質如微生物，例如細菌、酵母、病毒、類病毒、霉菌、真菌、植物、動物、人等的基因組。
此處的核酸可以僅僅是復合體混合物如生物樣品的微小部分?？衫帽绢I域中熟知的方法從生物樣品中獲得這些核酸。
可對本發(fā)明中的核酸進行衍生和修飾，例如，為了便于檢測，可進行生物素化、胺修飾、烷基化、或其他類似的修飾。
在許多情況下，例如需要提高的核酸酶穩(wěn)定性時，本發(fā)明可應用具有修飾過的核苷間鍵的核酸。例如，用于合成含有硫代磷酸酯、二硫代氨基磷酸酯、磷阿米酮、甲氧乙基氨基磷酸酯、formacetal、thioformacetal、二異丙基甲硅烷基、乙酰胺、氨基甲酸酯、二亞甲基硫化物、二亞甲基亞砜、二亞甲基砜、2′-O-烷基以及2′-脫氧-2′-氟代硫代磷酸酯的核苷酸間鍵的方法在本領域中是眾所周知的(見Uhlman等.，1990，Chem.Rev 90543-584；Schneider等.1990，Tetrahedron Lett.31335，以及其中引用的參照文獻)。
術語“寡核苷酸”指相對較短的單鏈多核苷酸，一般來講是通過合成方式得到的。一般來講，寡核苷酸包含有8-100個核苷酸的序列，優(yōu)選的是20-80個核苷酸，更優(yōu)選的是30-60個核苷酸?？蓱枚喾N方法來制備本發(fā)明中使用的寡核苷酸。這些寡核苷酸可通過生物合成或化學合成的方法來獲得。對短序列(最多大約100個核苷酸)來講，一般化學合成相對于生物合成來講較為經濟一些。在經濟之外，在合成步驟中，化學合成提供了引入低分子量化合物和/或修飾過的堿基的適當方法。此外，化學合成在靶多核苷酸結合序列長度和區(qū)域選擇方面比較靈活?？赏ㄟ^標準方法，如商業(yè)用自動化核酸合成儀中使用的方法來合成寡核苷酸。在適當修飾的玻璃或樹脂上進行的化學合成可以使DNA共價連接到表面上。這在沖洗和樣品處理上有優(yōu)勢?？蛇x用分子生物學中的標準復制方法，得到更長的序列。如J.Messing(1983)Methods Enzymol，101，20-78中所描述的，選用M13來進行單鏈DNA合成。其他的寡核苷酸合成方法包括磷酸三酯和磷酸二酯法(Narang，等.(1979)Meth.Enzymol.6890)，以及在支持物上合成(Beaucage，等.(1.981)Tetrahedron I，etters 22；18591862)，以及氨基磷酸酯技術，Caruthers，M.H.，等.，＂Methods in Enzymology，＂VoL154，pp.287-314(1988)，以及在＂DNA和RNA的合成與應用，＂S.A.Narang，editor，Academic Press，New York，1987及其參照文獻中描述的其他方法。
寡核苷酸“引物”可用于在多核苷酸模板上進行的鏈延伸，如用于核酸擴增。寡核苷酸引物一般是合成的單鏈寡核苷酸，在3′末端含有可雜交序列，它能與靶多核苷酸或參照多核苷酸的指定序列進行雜交。一般來說，寡核苷酸引物的可雜交序列與指定的序列或引物結合位點含有至少90％，優(yōu)選95％，最優(yōu)選100％的互補性。寡核苷酸引物的可雜交序列中的核苷酸數(shù)目應該是嚴格的，這樣嚴格的寡核苷酸引物雜交條件可防止過度的隨機非特異性雜交。一般來講，寡核苷酸引物的雜交序列的核苷酸至少有10個，優(yōu)選的是至少15個，優(yōu)選20-50個核苷酸。此外，在引物的5′末端含有一個不與靶或參照多核苷酸雜交的序列，它含有1-60個核苷酸，5-30個核苷酸或，優(yōu)選的8-30個核苷酸。
術語“樣品”指預測含有目的核酸的物質。這樣的樣品包括生物流體，如血液、血清、血漿、痰、淋巴液、精液、陰道粘液、糞便、尿、腦脊液等；生物組織如毛發(fā)和皮膚；等等。其他樣品包括細胞培養(yǎng)物等、植物、食物、法醫(yī)學樣品如紙、織物和刮削下的碎屑、水、污物、藥品等。必要的時候，可利用試劑對樣品進行預處理以使樣品液化和/或從結合物質中釋放核酸。這些預處理方法在本領域中是熟知的。
術語“擴增”應用于核酸是指任何可形成一或多拷貝核酸的方法，其中優(yōu)選的擴增是指數(shù)擴增。如Saiki，等，(1986)Science，2301350-54描述的，可用于DNA特定序列酶擴增的一種方法是聚合酶鏈式反應(PCR)。PCR中選用的引物長度可為大約10-50個或更多核苷酸，一般是選用至少約15個核苷酸來保證充分的特異性。制備得到的雙鏈片段稱為“擴增子”，其長度可在30-20,000個或更多核苷酸間。
術語“鏈延伸”指通過增加核酸或堿基來延伸多核苷酸的3′末端。與本發(fā)明相關的鏈延伸一般是依賴于模板的，也就是，添加的核苷酸是由延伸鏈與之雜交的模板核酸序列決定的。制備的鏈延伸產物序列與模板序列是互補的。一般來講，鏈延伸是酶催化的，在本發(fā)明中優(yōu)選的選用熱穩(wěn)定DNA聚合酶，例如得自水生棲熱菌(Taq聚合酶)、Thermococcus lioralis以及激烈火球菌的聚合酶。
“霍利迪連結體”是兩相關(經常是相同的)核酸序列和他們的互補序列形成的復合體中的十字型連接體的分支點。此連接體能夠進行支鏈遷移，從而解離為兩雙鏈序列，其中序列同一性和互補性一直延伸到鏈末端?；衾线B結體、其形成和支鏈遷移都是本領域中的熟練技術人員熟悉的概念，并且有描述，例如，在Whitby等.，J.Mol.Biol.(1996)264878-90和Davies及West，Crarent Biology(1998)8727-27中的描述。
“支鏈遷移條件”是指在這些條件下，霍利迪連結體支鏈能夠沿組成多核苷酸鏈行進。一般來講，在本發(fā)明的實施中，選取的條件是使得僅僅在鏈交換不造成錯配的條件下遷移能夠進行的條件，其中形成單堿基錯配將會妨礙鏈遷移，從而形成穩(wěn)定的霍利迪連結體或霍利迪連結體復合體。在如Panyutin和Hsieh，(1993)J.MoL Biol.，230413-24中就能發(fā)現(xiàn)合適的條件。鑒于涉及的特定多核苷酸的性質不同，在特定應用中就不得不對條件進行變動。本領域技術人員不進行大量實驗就可輕易區(qū)分這些修飾。
“穩(wěn)定的”霍利迪連結體是指一個連接體，其中的錯配已使支鏈遷移延緩到足以從雙鏈體DNA中檢測和區(qū)別穩(wěn)定的霍利迪連結體的程度，而由于支鏈遷移，這些雙鏈體DNA將會從含有相同序列的霍利迪連結體中釋放出來。
含有“復合體”的霍利迪連結體指含有通過霍利迪連結體相連的四個核酸鏈的復合體，通過序列內和他們的互補成分中的差異可阻止其解離為兩個雙鏈序列。
當兩核酸序列(1)完全相同，或(2)除了序列中將兩核酸序列區(qū)分開來的一些差異外他們是完全相同的，那么這兩個核酸序列是“相關的”。此差異可以是在序列中取代、缺失、或插入任何單核苷酸或核苷酸系列。此處的這些差異指“兩相關核酸序列間的差異”。經常的，相關的核酸序列相互間具有單核苷酸的差異。一般來講，相關的核酸序列在每個末端至少含有15個相同的核苷酸，但是他們具有不同的鏈長或含有存在至少一個核苷酸差異的間插序列。
術語“突變”指正常的保守核酸序列的核苷酸序列中的改變，從而形成與正常(未改變的)或野生型序列不同的突變體。一般來講，可將突變分為兩類，也即堿基對取代和讀框移位突變。后者伴隨著一到多個核苷酸對的插入或缺失。對表型正常性和異常性來講，單個核酸差異可以是顯著的，例如鐮狀細胞性貧血。
“雙鏈體”是一含有相互退火的兩互補序列的雙鏈核酸序列?！安糠蛛p鏈體”是一雙鏈核酸序列，其中一個鏈的部分與另一鏈的部分相互補，并可退火形成部分雙鏈體，但鏈的所有長度并不完全互補，這樣就至少在部分雙鏈體的一個末端形成了一個單鏈多核苷酸尾。
在核酸序列中，此處的術語“雜交”、“結合”、和“退火”是可互換的。兩核苷酸序列相互雜交的能力是基于兩核苷酸序列的互補程度之上的，而互補程度是基于配對的互補核苷酸對比例之上的。在一給定序列中與另一序列互補的核苷酸越多，則雜交條件可越嚴格，則這兩序列的結合越特異。一般來講，提高的嚴格性是通過升高溫度、提高助溶劑比率、降低鹽濃度，以及本領域中熟知的其他方法來實現(xiàn)的。
當一個序列能與另一序列以相反方向結合時這兩個序列就是“互補”的，其中一個序列的3′末端結合到另一個序列的5′末端，并且隨后一個序列的每個A、T(U)、G、C與另一序列的T(U)、A、C和G分別配對。
“小有機分子”是分子量約小于1500，優(yōu)選100-1000，更優(yōu)選300-600的化合物，例如生物素、洋地黃毒甙、熒光素、羅丹明及其他染料、四環(huán)素和其他蛋白結合分子、以及半抗原等。小有機分子能為核酸序列與標記物或支持物提供結合方式。
6.3檢測核酸間差異的方法本發(fā)明是普遍適用的，能對兩相關核酸序列間的任何差異進行檢測，不管這些差異是否是已知的。這些差異包括核酸序列內的任何變異，如單或多堿基取代或多態(tài)性、缺失或插入。本發(fā)明中的方法是快速、方便并能進行自動化操作的，并且能夠以同源或異源形式進行。它理想地適用于快速的突變預篩選和基因型分析，尤其是包含有單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的鑒定。本發(fā)明公開的方法是靈敏的且可定量的，并尤其服從于聚合酶鏈式反應(PCR)的應用。
一般來講，本發(fā)明提供了可有效檢測兩相關核酸序列間差異的方法和試劑，而此差異是通過確定包含有能夠形成穩(wěn)定的霍利迪連結體的序列的構建體是否存在來確定的。本發(fā)明提供了方法和試劑以便為本發(fā)明中的實施制備這樣的構建體，本發(fā)明也提供了可用于有效穩(wěn)定和檢測霍利迪連結體的方法和試劑。例如，在本發(fā)明的一個示范性實施方案中，利用一或多種能夠與霍利迪連結體特異性結合的結合蛋白來檢測穩(wěn)定的霍利迪連結體。此處公開本發(fā)明的特定實施方案來例解本發(fā)明，從而使本領域中的熟練技術人員能實踐本發(fā)明，但并沒有限制本發(fā)明的范圍。
6.3.1核酸通過形成包括多核苷酸構建體在內的穩(wěn)定的霍利迪結構，本發(fā)明提供了用以檢測兩核苷酸序列間差異的新穎方法，其中的多核苷酸構建體包含有這兩個多核苷酸序列，如圖1所示。為了描述本發(fā)明，比較方便的是將這兩個核苷酸序列稱做靶序列和參照序列。一般來講，參照序列是序列基本已知的多核苷酸，靶序列是一相關序列，是我們要進行檢測以發(fā)現(xiàn)是否含有相對于參照序列的差異的序列。
兩序列是相關的是指這兩序列是完全相同的，或者是除了二者之間存在的一些差異外，這兩序列是相同的。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，這些差異是取代、缺失或插入變異或突變，例如但并不局限于單核苷酸多態(tài)性(SNP)。一般來說，靶序列和參照序列是以一對序列的形式制備的，按照下文詳述的方法，他們可形成部分雙鏈體。
圖1圖示了一個典型的部分雙鏈體A′。部分雙鏈體A′包含有一個互補雙鏈體區(qū)和一或多個尾區(qū)。互補雙鏈體區(qū)含有一個靶序列或退火到其互補序列上的參照序列。其他的部分雙鏈體示例圖解做A″、B′和B″。
在部分雙鏈體A′中，一個尾區(qū)含有寡核苷酸尾T1和T2′。同樣的，第二個尾區(qū)含有寡核苷酸尾T3′和T4。通過多核苷酸連接領域中技術人員熟知的那些已知連接方式就可將尾T1、T2′、T3′和/或T4連接到靶序列上?？赏ㄟ^共價鍵或連接體來對他們進行直接連接。連接體可以是多核苷酸或本領域中熟練技術人員已知的其他任何連接體。優(yōu)選的，尾T1和/或T3′是通過磷酸二酯鍵直接與靶序列連接的。以類似的方式，將尾T1、T2、T3、T4、T1′、T2′、T3′和/或T4′連接到靶序列或參照序列上。
在本發(fā)明的一些實施方案中，部分雙鏈體含有一個尾區(qū)。例如，當T1和T2′為0bp大小、而T3′＞0bp、T4＞0bp大小(或者，當T1＞0bp、T2′＞0bp大小、而T3′和T4為0bp大小)時，部分雙鏈體A′含有一個尾區(qū)。在本發(fā)明的另外一些實施方案中，部分雙鏈體具有兩個尾區(qū)。例如，當T1、T2′、T3′和T4都大于0bp大小時，圖1所示的部分雙鏈體含有兩個尾區(qū)。尾T1、T2′、T3′和T4優(yōu)選為5-500bp，更優(yōu)選為5-55bp。
所有的四個尾都包含相互間沒有關聯(lián)且都與模板DNA沒有關聯(lián)的序列，或者，部分雙鏈體每個末端的多核苷酸尾對之一(T1/T2′或T3′/T4)是模板DNA序列。優(yōu)選的，在沒有來自靶序列、參照序列或其他尾的干涉的情況下，尾能與另一與尾互補的序列雜交。
為了形成十字型結構，利用相同的靶序列和其相應的參照序列制備了兩或多個部分雙鏈體。例如，在適當條件下，圖1例示的部分雙鏈體A′和B″能形成十字型結構。在圖1中，部分雙鏈體A′包含尾T1、T2′、T3′和T4。另一種部分雙鏈體B″含有尾T1′、T2、T3和T4′。在部分雙鏈體每個末端的每對多核苷酸尾，如T1/T2′，T2/T1′，T3′/T4，T3/T4′是不相互補的，并且在應用條件下他們不會相互退火。然而，部分雙鏈體A′右端的尾T3′與部分雙鏈體B″右端的尾T3相互補，因此能與其進行雜交。部分雙鏈體A′右端的尾T4與部分雙鏈體B″右端的尾T4′相互補，因此能與其進行雜交。部分雙鏈體A′左端的尾T1與部分雙鏈體B″左端的尾T1″相互補，因此能與其進行雜交。部分雙鏈體A′左端的尾T2′與部分雙鏈體B″左端的尾T2相互補，因此能與其進行雜交。
6.3.2核酸的制備可利用本領域中的技術人員熟知的多核苷酸或核酸制備方法來制備上述的部分雙鏈體。例如，可利用標準重組、合成或PCR技術、或他們結合實用來制備部分雙鏈體。此外，可從天然來源中分離部分雙鏈體或其部分，如靶序列或參照序列。在美國專利NO.6,013,439中對能形成部分雙鏈體的序列的示范性制備方法有描述，此專利在此處全文引用作為參照。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，利用PCR技術來制備部分雙鏈體。圖1例示了通過PCR來制備部分雙鏈體A′、A″、B′、B″。部分雙鏈體，如A′和B″可用于檢測靶序列和參照序列間的差異。可將A作為靶序列而B作為參照序列，或者相反。
為了確定兩相關DNA序列間是否存在差異，需利用標準PCR，以分別進行或二者結合的方式對雙鏈體A和B進行擴增，此PCR是選用由一或多個正向引物和兩反向引物R1&R2組成的普通引物組來進行的。R1和R2可分享同一個與模板DNA上的相同部分雜交的3′末端(r′＝r1′＝r2′)，或者R1和R2的3′末端與模板DNA的不同部分雜交。如圖1所示，正向引物F1或正向引物F2可用于PCR反應中。如果選用的是正向引物F1，就可制備得到具有T1/T1′尾的雙鏈體，如A1。如果選用的是正向引物F2，就可制備得到具有T2/T2′尾的雙鏈體，如A2。這兩個正向引物也可用來制備位于與正向引物相對應的末端的部分雙鏈體。例如，在同一PCR反應中選用正向引物F1和F2產生可以用來制備用于部分雙鏈體A′和A″的序列。此外，不含尾區(qū)的正向引物可用于制備在相應于正向引物的末端不含尾區(qū)的雙鏈體。
雖然在一般情況下引物不需要進行標記，但在特定應用中對一或多個引物進行標記是有必要的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，正向引物和反向引物間的距離至少是1bp，優(yōu)選的尾1-600bp或5-600bp，更優(yōu)選的是5-100bp，這要取決于此應用的理想意圖和目的多核苷酸的性質。
按照本發(fā)明，PCR擴增包括溫度循環(huán)到變性雙鏈體、寡核苷酸引物退火，以及通過依賴于熱穩(wěn)定模板的核苷酸聚合酶進行引物延伸。利用PCR進行的擴增方法采用的溫度一般為大約50-100℃，更經常的是大約60-95℃。在雜交階段選用50-80℃的相對低溫，而變性階段是在大約80-100℃下進行的，延伸階段是在大約70-80℃下進行的，一般為大約72-74℃。一般來講，本方法中的時間段為大約10秒-10分/循環(huán)，循環(huán)數(shù)目高達60或更多，一般為10-50次，經常為20-45次。在本領域中，合適的PCR規(guī)程是已知的，并可從如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manuai，2nded.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York(1989)中查閱到，或由熟練的技術人員通過適當?shù)膶嶒灥玫健?br> 選用聚合寡核苷酸引物來進行PCR擴增，此聚合寡核苷酸引物是設計來與待擴增的核酸的側翼區(qū)域序列進行互補且退火雜交的。此引物的3′區(qū)至少有90％，優(yōu)選95％，最優(yōu)選100％與待擴增鏈序列的一部分互補的。在反應選用的引物的退火條件下，引物的互補部分應該足夠長以便與靶序列或參照序列進行選擇性雜交。一般來說，引物中可雜交序列的核苷酸數(shù)目至少為10個，優(yōu)選至少15個，更優(yōu)選20-50個核苷酸的長度。在一些情況下，基本上所有的引物是與靶序列互補的，例如圖1中的F引物。在其他的情況下，引物的5′末端不與靶序列互補，在此情況下非互補序列將被摻入所復制子的末端。此非互補末端可含有1-60個或更多核苷酸、5-30個核苷酸、或優(yōu)選的8-30個核苷酸。正是利用這些引物來產生位于部分雙鏈體末端的寡核苷酸尾。這些引物也可用于制備復制子中間體，而這些復制子中間體能夠被用于本發(fā)明中產生部分雙鏈體制備的通用引物所識別。
PCR擴增中選用的寡核苷酸引物的濃度至少要與需要的拷貝數(shù)相同，一般為1nM-1mM，優(yōu)選100nM-110uM。對基因組DNA擴增來講，優(yōu)選正向引物為大約500-1000nM、兩反向引物分別為大約250-500uM，也即與STS(序列標記位點)擴增的條件相似。當對克隆過的DNA片段進行擴增時，低引物濃度就足夠了，例如約25-250nM。
正向引物F的整個序列與模板DNA也即A和B進行雜交。正向引物F1和F2的3′末端可以相同(f1＝f2)，并與模板DNA(參照DNA和靶DNA)上的同一部分進行雜交，或者引物F1和F2具有不同的3′末端，從而與模板DNA上的不同部位進行雜交(f1≠f2)。此外，F(xiàn)1含有與或不與模板DNA雜交的5′末端區(qū)域(T1)。同樣的，F(xiàn)2含有與或不與模板DNA雜交的5′末端區(qū)域(T2)。反向引物R1和R2可分享一共同的3′末端(r′＝r1′＝r2′)，并與模板DNA上的同一部分進行雜交，或者引物R1和R2具有不同的3′末端，它與模板DNA上的不同部位進行雜交。此外，R1含有不與模板DNA雜交的5′末端區(qū)域(T3)。同樣的，R2含有不與模板DNA互補，從而不與其雜交的5′末端區(qū)域(T4)。T3與T4沒有關聯(lián)，也即T3的互補鏈(T3′)不與T4互補，并且T4的互補鏈(T4′)不與T3互補。因此，在本方法中選用的條件下T4′不會與T3雜交。多個循環(huán)的PCR擴增會形成多個DNA產物，包括具有四個尾的部分雙鏈體A′、A″、B′、B″(圖1)的組成鏈。具有尾的部分雙鏈體是通過調整溶液的溫度以使組成鏈進行雜交來形成所需部分雙鏈體的方式來制備得到的。我們注意到也形成了許多其他的雙鏈體。一般來講，這些非必需的產物不會造成問題，因為在上述條件下有形成了足夠量的部分雙鏈體。
每個含尾的部分雙鏈體A′由雙鏈體A的兩互補核苷酸鏈的雙鏈體，以及在雙鏈體的一端的兩個非互補寡核苷酸尾T3′和T4組成。依賴于對正向引物的選擇，部分雙鏈體A′可在其部分雙鏈體的另一端含有0、1或2個尾(如果T1＝0且T2＝0，那么制備的部分雙鏈體的左端可不含尾；如果T1＝0或T2＝0，那么制備的部分雙鏈體可在其左端含有一個尾；如果T1≠T2≠0，那么在制備的部分雙鏈體左端可含有兩個非互補尾)。每個含尾的部分雙鏈體A″由雙鏈體A的兩互補核苷酸鏈的雙鏈體，以及在雙鏈體的一端的兩個非互補寡核苷酸尾T4′和T3組成。依賴于對正向引物的選擇，部分雙鏈體A″可在其部分雙鏈體的另一端含有0、1或2個尾(見上文)。每個含尾的部分雙鏈體B′由雙鏈體B的兩互補核苷酸鏈的雙鏈體，以及在雙鏈體的一端含有的兩個非互補寡核苷酸尾T3′和T4組成。依賴于對正向引物的選擇，部分雙鏈體B′可在其部分雙鏈體的另一端含有0、1或2個尾(見上文)。每個含尾的部分雙鏈體B″由雙鏈體B的兩互補核苷酸鏈的雙鏈體，以及在含尾雙鏈體B′的一端的兩個非互補寡核苷酸尾T4′和T3組成。依賴于對正向引物的選擇，部分雙鏈體B″可在其部分雙鏈體的另一端含有0、1或2個尾(見上文)。
當引物F1、F2、R1和R2用于制備部分雙鏈體A′、B′、A″、B″，而T1≠T2≠T3≠T4、f1＝f2、r1＝r2′或r1′≠r2′時，通常是利于進行PCR擴增的，選用引物F1/R1和F2/R2，同時進行反應A和B(靶DNA和參照DNA)，這樣就可以同時制備得到部分雙鏈體A′、A″、B′和B″。然而，必需指出的是，如果需要，這些復制和擴增也可分別進行。例如，如圖1所示，選用引物F1/R1和F2/R2，A和B擴增可單獨完成。隨后，在適當?shù)臈l件下，將制備得到的含尾的擴增產物進行結合以得到部分雙鏈體A′、A″、B′和B″(圖1)。
當引物F1、F2、R1和R2用于制備部分雙鏈體A′、B′、A″、B″，而T1≠T2≠T3≠T4、f1≠f2、r1′≠r2′時，重要的是，在模板的左端和右端，PCR擴增產物A1&B1(選用F1/R1，見圖1)較A2&B2(選用F2/R2，見圖1)覆蓋了更多的模板DNA(換言之，f1較f2更在上游，r1′較r2′更在下游)；或者，在模板的左端和右端，PCR擴增產物A1&B1(選用F1/R1，見圖1)較A2&B2(選用F2/R2，見圖1)覆蓋了更少的模板DNA(換言之，f1較f2在更下游，r1′較r2′在更上游)。請注意，雖然PCR擴增產物A1&B1(選用F1/R1，見圖I)較A2&B2(選用F2/R2，見圖1)覆蓋了模板DNA左端和右端更大的部分，但含有尾T1和T3是無用的或這與含有尾T1和T3無關(因此，優(yōu)選T1＝T3＝0bp)。相同，雖然PCR擴增產物A1&B1(選用F1/R1，見圖1)較A2&B2(選用F2/R2，見圖1)覆蓋了模板DNA左端和右端更少的部分，但含有尾T2和T4是無用的或這與含有尾T2和T4無關(因此，優(yōu)選T2＝T4＝0bp)。如上所述，這通常利于進行PCR擴增，選用引物F1/R1和F2/R2，同時進行反應A和B(靶DNA和參照DNA)，這樣就可以同時制備得到部分雙鏈體A′、A″、B′和B″。然而，必需指出的是，如果需要，這些復制和擴增也可分別進行。例如，如圖1所示，選用引物F1/R1或F2/R2，A和B擴增可單獨完成。隨后，在適當?shù)臈l件下，將制備得到的含尾擴增產物進行結合以得到部分雙鏈體A′、A″、B′和B″(圖1)。
當引物F、R1和R2用于制備部分雙鏈體A′、B′、A″、B″、而T1＝T2(優(yōu)選T1＝T2＝0bp)、T3≠T4、f1＝f2＝f、r1′＝r2′或r1′≠r2′時，通常是利于進行PCR擴增的，選用引物F、R1和R2，同時進行反應A和B(靶DNA和參照DNA)，這樣就可以同時制備得到部分雙鏈體A′、A″、B′和B″。然而，必需指出的是，如果需要，這些復制和擴增也可分別進行。例如，選用引物F、R1和R2，A和B擴增可單獨完成。隨后，在適當?shù)臈l件下，將制備得到的含尾擴增產物進行結合以得到部分雙鏈體A′、A″、B′和B″?；蛘撸贏和B起始擴增的時候選用F和僅僅一種R引物(R1或R2)，隨后將另外的一個R引物加入，并在開始時使用過的R引物存在或不存在的條件下進行額外的擴增循環(huán)。
對于本領域技術人員而言，所有的這些以及其他能夠制備得到所需的含尾部分雙鏈體A′、A″、B′和B″的其他的方案改變都是顯而易見的，也都在本發(fā)明的范圍之內。
6.3.3十字型結構的形成為了檢測序列A和B間的差異，將包含有序列A和B的部分雙鏈體(A′、A″、B′、B″)在適當?shù)臈l件下進行接觸，這樣互補尾就能相互退火，從而啟動形成四鏈復合體(霍利迪連結體)，如圖1所示。將形成的復合體C1、C2、C3、C4置于能進行支鏈遷移的條件下。限定了支鏈遷移不能以朝向尾的方向進行，因為在給定部分雙鏈體上的尾相互間是不互補的，例如，T1與T2′不互補。然而，在靶序列和參照序列完全相同的情況下，支鏈遷移可按其他方向進行。如果兩序列相同的，支鏈遷移就能進行到鏈的末端，造成復合體解離為兩雙鏈體，每個雙鏈體含有源自最開始的部分雙鏈體的一條鏈。另一方面，如果靶序列和參照序列不同，越過差異點后的支鏈遷移將會在新形成的雙鏈體上造成錯配。在本發(fā)明的操作條件下，這樣的差異的出現(xiàn)實際上會阻斷支鏈遷移，從而形成一個穩(wěn)定的霍利迪連結體復合體。因此，穩(wěn)定的霍利迪連結體的形成就表明兩序列間差異的出現(xiàn)，因為在沒有差異的條件下，此霍利迪連結體會解離為兩雙鏈體。
在含尾的部分雙鏈體A′的右端，也即每條鏈的末端部分，分別含有序列T4和T3′，他們分別與T4′和T3′互補，而T4′和T3′是位于B″右端的尾，他們之間不具互補性，這些對于熟練的技術人員來講是顯而易見的。當在適當?shù)臈l件下，將四尾的部分雙鏈體A′、A″、B′、B″置于同一溶液中，就可形成兩個含有部分雙鏈體A′和B″的十字型霍利迪連結體(復合體C1和C2)。A′的T1尾與B″的T1′尾雜交和A′的T2′尾與B″的T2尾雜交可形成一個十字型霍利迪連結體。另一個十字型霍利迪連結體是A′的T3′尾與B″的T3尾雜交和A′的T4尾與B″的T4′尾雜交的結果。此外，另外的兩個十字型霍利迪連結體復合了來自部分雙鏈體A″和B′的C3和C4。一個是當A″的T1′尾與B′的T1尾雜交及A″的T2尾與B′的T2′尾雜交時形成的。另一個是當A″的T3尾與B′的T3′尾雜交及A″的T4′尾與B′的T4尾雜交時形成的。
此外，四尾的部分雙鏈體A′、A″、B′和B″可形成多聯(lián)體。例如，三個部分多聯(lián)體B″、A′與另一個部分雙鏈體B″可形成具有兩個霍利迪連結體的多聯(lián)體。然而，多聯(lián)體的存在并不妨礙對序列A和序列B間差異的檢測。如果序列A和序列B是相同的，這兩個霍利迪連結體的支鏈遷移將按B″-A′-B″方向進行完全，最終整個多聯(lián)體解離為兩個雙鏈體。如果在序列A和B間存在差異，這兩個霍利迪連結體將會是穩(wěn)定的。對穩(wěn)定的霍利迪連結體的檢測將會表明序列A和B間的差異。
本領域技術人員利用此處提供的內容和本領域技術人員所掌握的一般知識就能確定合適的尾雜交條件，從而形成含有特定雙鏈體的霍利迪連結體。例如，可參見上文提及的Sambrook等、上文提及的Panyutin等的論文、以及美國專利No.6,013,439的內容。
將霍利迪連結體復合體C1、C2、C3、C4置于支鏈遷移條件下，其中，由于尾T1和T2及尾T3和T4是不同的，所以支鏈遷移只能沿遠離尾端的方向進行，但正是這些尾的雜交啟動了十字型霍利迪連結體的形成。如果在A和B間沒有錯配，那么復合體C1、C2、C3、C4的支鏈遷移就沿遠離尾端的方向進行，直至部分雙鏈體的另一端。因此，霍利迪復合體C1、C2、C3、C4都解離為雙鏈體(圖1)?；蛘?，如果在A和B間存在錯配，復合體C1、C2、C3、C4沿遠離尾端進行的支鏈遷移就由于錯配而停止，就形成穩(wěn)定的霍利迪連結體復合體C1、C2、C3、C4(圖2)。在本發(fā)明的一個實施方案中，支鏈遷移是在離子如Mg++存在的情況下進行的，而Mg++可增強錯配的趨勢，從而阻止自發(fā)的DNA遷移，因此就穩(wěn)定了含有這樣的錯配的霍利迪連結體。Mg++的優(yōu)選濃度為1-10mM。應該指出，通過其他離子，尤其是二價陽離子如Mn++或Ca++，或者適當?shù)碾x子組合也可穩(wěn)定霍利迪連結體復合體。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，在65℃下、PH8.3，含有4mM MgCl2、50mM KCl、10mM Tris-HCl的緩沖液中溫育20-120分鐘可完成支鏈遷移。單堿基錯配可導致穩(wěn)定的霍利迪連結體的形成，對此種情況下的支鏈遷移條件的描述可參見如Panyutin and Hsieh，(1993)J.Mol.BioL，230413-24，此處全部引用作為參照。
6.3.4霍利迪結構的檢測檢測到穩(wěn)定的十字型霍利迪連結體復合體(C1、C2、C3或C4)可用來指示DNA序列A和B間差異的存在。另一方面，不存在穩(wěn)定的十字型霍利迪復合體可用于指示DNA序列A和B間差異的缺乏。按照本發(fā)明，可利用下述方法來檢測指示核酸序列間差異的穩(wěn)定的霍利迪連結體。例如，可通過能夠與霍利迪連結體特異性識別和結合的分子來檢測穩(wěn)定的霍利迪連結體的存在。
6.3.4.1利用對十字型核酸復合體特異的分子來進行檢測在一個實施方案中，對霍利迪結構具有特異性的1或多個分子可用于檢測穩(wěn)定的霍利迪結構的存在，從而檢測多核苷酸序列A和多核苷酸序列B間的差異。
可利用本領域技術人員熟知的與霍利迪結構特異性結合的一或多個分子來檢測霍利迪結構的存在。在一個優(yōu)選的實施方案中，可利用一或多種蛋白來結合與檢測穩(wěn)定的霍利迪連結體的形成。源自多種生物體的許多蛋白表現(xiàn)出與霍利迪連結體特異性結合的能力。這些蛋白包括但并不局限于大腸桿菌的RuvA、RuvC、RuvB、RusA、RuvG；源自RuvA、RuvC、RuvB、RusA、RuvG的蛋白/突變體。此外，這些蛋白包括源自多種其他生物體的RuvA、RuvC、RuvB、RusA、RuvG的同系物(包括功能性同系物)，例如源自哺乳動物的RuvA、RuvC、RuvB、RusA和RuvG的同系物，源自酵母的Ccel和spCcel，源自Pyrococcus furiosusa的Hjc，以及其他多種可與霍利迪連結體特異性結合的解離酶和重組酶。
在本發(fā)明中的尤其實用的實施方案中，利用熱穩(wěn)定蛋白來檢測霍利迪結構的存在。這些熱穩(wěn)定蛋白包括源自嗜熱生物體的RuvA、RuvC、RuvB、RusA和RuvG的熱穩(wěn)定同系物，而這些嗜熱生物體是選自水生棲熱菌、黃棲熱菌、Thermus thermophilus和本領域中的熟練技術人員熟知的其他嗜熱生物體。源自激烈火球菌的Hjc是與霍利迪結構具特異性結合的適當?shù)臒岱€(wěn)定蛋白的良好示例。
已經對在本發(fā)明的示例中有益的多種蛋白的制備和性質進行了描述，例如在下面列出的參照文獻中，而所有列出的這些文獻在此處全部引用作為參照Davies and West，supra；Whitby et al.，supra；Iwasaki H，.et al.1992.E.coli RuvA and RuvC proteins specificallyinteract with Holliday Junctions and promote branch migration.Genes Dev.62214-20；Parsons CA，et al.1992.Interaction of E.Coli RuvA and RuvB proteins with syntheticHolliday junctions.Proc.Natl.Acad.USA 895452-56；Traneva IR，et al.1992.Purification and properties of the RuvA and RuvB proteins of E.coli.Mol.Gen.Genet.2351-10；Rafferty JB，et al.1996.Crystal structure of the DNA recombination proteinRuvA and a model for its binding to the Holliday junction.Science 274415-21；Hargreaves D.，et al.1999.Crystalizaion of E.coli RuvA complexed with a syntheticHolliday junction.Acta Crystallogr D.Biol Crystallogr 55Pt 1)263-5；Hargreaves D.，etal.1998.Crystal structure of E.coli RuvA with bound DNA Holliday junction at 6Aresolution.Nature Struct Biol.5(6)441-6；Dunderdale HJ，et al.1994.Cloning，overexpression，purification，and characterization of the E.coli RuvC Holliday junctionresolvase.J Biol Chem 267(7)5187-94；Ariyoshi M，et al.1994.Atomic structure of theRuvC resolvasea Holliday junction specific endo nuclease from E.coli.Cell 78(6)1063-72；Sharples GJ，et al.1994.Processing of intermediates in recombination and DNA repairidentification of a new endonuclease that specifically cleaves Holliday junction.EMBO13(24)6133-42；Rice P，et al.1995.Structure of the bacteriophage Mu transposase coreacommon structural motif for DNA transposition and retroviral integration.Cell 82(2)209-20；Bujacz G.，et al.1995.High-resolution structure of the cataltic domain of aviansarcoma virus integrase.J Mol Biol 253(2)333-46；Rice P.et al.1996.Retroviralintegrases and their cousins.Curr Opin Struct Biol 6(1)76-83；Suek D.1997.DNArecognition by structure-selective nucleases.Biopolymer 44(4)405-21；White MF，et al.1997.The resolving enzyme CCE1 of yeast opens the structure of the four-way junction.JMol Biol 266(1)122-34；Whitby MC，et al.1997.A new Holliday junction resolvingenzyme from S.pombe that is homologous to CCE1 from S.cerevisiae.J Mol Biol271(4)509-22；Bidnenko E，et al.1998.Lactococcus lactis phage operon coding for anendonuclease homologous to RuvC.Mol Microbiol 28(4)823-34；Raaijmakers H，et al.1999.X-ray structure of T4 endonuclease VIIa DNA junction resolvase with a novel foldand unusual domain-swapped dimer achitecture.EMBO.18(6)1447-58；Komori K，et al.1999.A Holliday junction resolvase from Pyrococcus furiosusfunctional similarity to E.coli RuvC provides evidence for conserved mechanism of homologous recombination inBacteria，Eukarya，and Archaea.Proc Natl Acad Sci USA.96(16)8873-8；Komori K，etal.2000.Mutational analysis of the Pyrococcus furiosus Holliday junction resolvase Hjcrevealed functionally important residues for dimer formation，junction DNA binding andcleavage activities.J Biol Chem.(September/2000 issue)；Sharples GJ，etal.1999.Holliday junction processing in bacteriainsight from the evolutionary conservation ofRuvABC，RecG，and RusA.J bacteriol 181(8)；5543-50；Sharples GJ，et al.1993.An E.coli RuvC mutant defective in cleavage of synthetic Holliday junctions.Nucleic AcidResearch，21(15)3359-64.
可利用檢測和/或蛋白顯現(xiàn)領域中的技術人員熟知的方法來檢測特異性結合到霍利迪結構上的蛋白。實際上，本發(fā)明的一個優(yōu)點就是它可在不使用標記核酸的情況下來檢測穩(wěn)定的霍利迪連結體。在一優(yōu)選的實施方案中，至少用一種標記物標記了至少一種霍利迪連結體特異性結合蛋白，也即能夠選擇性識別并結合霍利迪連結體的蛋白，并將標記后的蛋白置于可使該蛋白與穩(wěn)定的霍利迪連結體如復合體C1、C2、C3和/或C4結合的條件下。該蛋白與霍利迪連結體的結合能產生一些能夠檢測到的信號，優(yōu)選的的檢測方式是定量檢測。該信號可用作穩(wěn)定的霍利迪連結體存在和其定量的指示劑，反過來，它也可作為DNA多態(tài)性分子中錯配DNA的存在和量/比率的指示劑。
在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明選用了至少一種標記過的蛋白來檢測霍利迪連結體。對蛋白來講，這些標記可以是內源的，如由于氨基酸如色氨酸、酪氨酸、或苯丙氨酸、或能夠以一種可檢測的方式進行反應的蛋白側鏈的熒光得到的天然蛋白熒光。在翻譯過程中或翻譯后，這些標記能結合到蛋白上。適當?shù)臉擞洶?，但并不局限于熒光分?包括，如熒光素、羅丹明及熒光蛋白和肽，如GFP和GFP變體及類似物)、放射性基團、固體表面、寡核苷酸、酶、染料、化學發(fā)光基團、輔酶、酶底物、配體、受體和有機小分子。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，兩或多種蛋白可用于檢測穩(wěn)定的霍利迪連結體。這兩種蛋白可以是相同的，也可是不同的，或是同一個蛋白的域或亞基。在一些實施方案中，可將這兩或多種蛋白結合形成二聚體或更高程度的寡聚體，在一些實施方案中寡聚化作用要依賴于與霍利迪連結體的結合。在一優(yōu)選實施方案中，這兩種蛋白是用不同的標記物來標記的，并且這兩種蛋白間的霍利迪連結體依賴型復合體形成導致了這兩種標記物的締合。這兩種標記物的締合可用作穩(wěn)定的霍利迪連結體存在的指示劑(圖3)。
例如，在霍利迪連結體不存在的情況下，RuvA和RuvC不能自發(fā)形成RuvC-RuvA復合體。然而，RuvA和RuvC能同時結合到霍利迪連結體上并形成RuvA-RuvC-霍利迪連結體復合體。已經對RuvA和RuvC以及多種RuvC突變體進行了克隆、過度表達和純化。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，RuvA和RuvC分別與不同的、可用作分子間熒光共振能量轉移(FRET)供體/受體對的熒光載體相融合。分子間FRET可用來檢測供體/受體對的締合，也可用來對這些分子間的關系進行定性。在分子生物學領域中，F(xiàn)RET這類應用的原則是眾所周知的。對利用FRET來檢測兩分子締合進行描述的文獻包括，如Heim R.1999.Green FluorescentProtein Forms for Energy Transfer.Methods in Enzymology 302408-23；Foerster T.1948.Ann Phys 255；Mitra RD，et al.1996.Fluorescence resonance energy transfer betweenblue-emitting and red-shifted excitation derivatives of green fluorescente protein.Gene17313-7；and Furey WS，et al.1998.Use offluorescence energy transfer to investigate theconformation of DNA substrates to the Klenow fragment.Biochemistry 37(9)2979-90，所有這些都在此處引用作為參照。只有在霍利迪連結體存在的情況下，RuvA和RuvC融合蛋白才相互締合并產生特異的FRET信號。對FRET信號進行檢測和/或定量可用于對穩(wěn)定的霍利迪連結體的存在或其量進行檢測和/或定量。一般來說，這兩種蛋白與穩(wěn)定的霍利迪連結體的結合導致了供體和受體對的緊密接近，并且受體在最大發(fā)射波長時的發(fā)射比率(在最大發(fā)射波長時，供體與受體的發(fā)射比)改變和發(fā)射強度改變可用來對霍利迪連結體的存在進行檢測/定量。
本發(fā)明優(yōu)選使用RuvC突變體，它缺乏酶的霍利迪連結體特異性核酸內切酶活力的野生型形式，但卻保留了與霍利迪連結體特異性結合的能力。這些突變體包括D7N、E66Q、D138N、D141N、D7N、E66D、D138E和ruvC51，并在如SaitoA，等.1995.對組成RuvC霍利迪連結體解離酶催化中心的四個酸性氨基酸進行鑒定.Proc Natl AcadSci USA 927470-4；及Sharples GJ，等1993.在對合成的霍利迪連結體進行的切割中存在缺陷的大腸桿菌RuvC突變體.NucleicAcid Research，21(15)3359-64中有描述。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)RET受體和供體對包含有蛋白質。特別適合的蛋白包括綠色熒光蛋白(GFPVs)和具有適當激發(fā)和發(fā)射頻率的GFP突變體，其中許多在前述的文獻中都有描述，如Heim R.，見上文；Foerster T.，見上文；Mitra RD，等.，見上文以及FureyWS，等.，見上文。
在本發(fā)明的一個實施方案中是利用了一個單霍利迪連結體結合蛋白來進行檢測的，其中，分子內FRET可用于檢測霍利迪連結體的存在/量(圖4)。可利用兩個熒光團，如兩個用作分子內供體/受體FRET對的GFP突變體，對單霍利迪連結體蛋白進行雙重標記。在一優(yōu)選實施方案中，選用的單個蛋白為RuvC，更優(yōu)選的是前述的一種RuvC突變體。當結合到霍利迪連結體上時，雙標記蛋白進行了構象改變，這引起了兩熒光團間物理關系的改變，因此也引起了FRET信號的改變。FRET的改變可以檢測到，并且可用作穩(wěn)定的霍利迪連結體的存在和其量的指示劑，這在上述的選用兩霍利迪連結體結合蛋白的示例中有描述。
當選用了單個結合蛋白時，如果選用的蛋白可形成同源或異源寡聚體，那么分子間FRET也可用于檢測霍利迪連結體的存在/量(圖3)。例如，大腸桿菌RuvA在溶液中是以四聚體形式存在，而當與霍利迪連結體結合時就能形成八聚體。八聚體RuvA的形成是依賴于與霍利迪連結體的結合。因此，單獨的RuvA可用于通過分子間FRET來檢測霍利迪連結體。例如，可利用熒光團如GFPs或GFP變體對RuvA四聚體進行標記，第二個RuvA四聚體可利用第二個熒光團進行標記，這樣這兩個熒光團就可作為分子間供體/受體FRET對。在本發(fā)明的一個實施方案中，在霍利迪結構存在下，兩個差別標記的RuvA四聚體形成了一個八聚體。
在本發(fā)明的一個實施方案中，固體表面可作為標記物，例如光學生物傳感器，如Biacore或Iasys的表面。例如，光學生物傳感器在Canziani G，等.1999.對利用光學生物傳感器進行生物分子識別的研究.Methods 19(2)253-69中有描述。一般來講，將能夠與霍利迪連結體結合的分子，優(yōu)選包括上文討論的蛋白的分子，固定化在生物傳感器的表面。在此實施方案中，霍利迪連結體與固定化蛋白的結合能夠產生可檢測到的光學信號。生物傳感器可將此信號記錄下來并作為穩(wěn)定的霍利迪連結體存在和其存在量的指示。在此實施方案中，單標記，也即生物傳感器表面足以用來檢測霍利迪連結體。本發(fā)明的這一實施方案的優(yōu)點是多核苷酸沒有形成霍利迪連結體，霍利迪連結體結合分子也無需進行標記。
在本發(fā)明的另一實施方案中，LOCI(發(fā)光氧通道免疫測定)可用于檢測霍利迪連結體結合蛋白與霍利迪連結體的結合。在如Ullman EF，等.1994.發(fā)光氧通道免疫測定利用化學發(fā)光來測定微粒結合的動力學.Proc Natl Acad Sci USA 915426-30中有對LOCI的描述。
在另外一個實施方案中，可以利用ELISA檢驗的方式來檢測霍利迪連結體結合蛋白與霍利迪連結體的結合。ELISA檢驗在本領域中是眾所周知的，并在如上文提及的美國專利NO.6,013,439和Sambrook等的論文中有描述。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，可用質譜分析法來檢測穩(wěn)定的霍利迪連結體。本發(fā)明的這一實施方案的一個優(yōu)點是不僅多核苷酸不形成霍利迪連結體，而且霍利迪連結體結合分子也無需進行標記。通過利用兩雙鏈體DNA形成十字型霍利迪連結體，或通過霍利迪連結體特異性結合蛋白與霍利迪連結體結合形成的霍利迪連結體/蛋白復合體就可得到高分子量的分子。利用質譜分析法來檢測具有不同分子量的分子的存在/比率就可對霍利迪連結體進行檢測/定量，反過來，也就能指示兩DNA片段間的差異存在與否。應用質譜分析法來對大分子復合體進行定性在如KelleherNL.2000.從初級結構到功能從大分子質樸分析法得來的生物學啟發(fā).Chem Biol.7(2)R37-45中有描述。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，SIGNATUREBIO公司的phenodynamic profiling system可用于檢測霍利迪連結體誘導的蛋白-蛋白相互作用。本發(fā)明的這一實施方案的一個優(yōu)點是不僅多核苷酸不形成霍利迪連結體，而且霍利迪連結體結合分子也無需進行標記。
6.3.4.2利用凝膠電泳來檢測穩(wěn)定的霍利迪結構在本發(fā)明的一個實施方案中，將十字型復合體置于支鏈遷移條件下得到的混合物是利用凝膠電泳來分離的。另人驚訝的是，在適當?shù)臈l件下，可通過凝膠電泳來檢測穩(wěn)定的霍利迪結構。利用凝膠電泳檢測到的穩(wěn)定的霍利迪結構的存在表明靶序列和參照序列間的差異存在。
需要對凝膠電泳條件進行選擇，這樣，穩(wěn)定的霍利迪結構就能從混合物中的其他復合體，如雙鏈體、部分雙鏈體和單鏈多核苷酸中分辨出來。凝膠電泳的實際操作條件要取決于多核苷酸序列和部分雙鏈體的大小和性質。這些條件對本領域中的熟練技術人員來講是顯而易見的。例如，當靶序列和參照序列為大約35-300bp，并且相應的部分雙鏈體為大約50-300bp時，穩(wěn)定的霍利迪結構可在4-6％TBE-PAGE凝膠中、160V下電泳30分鐘時分辨出來。
6.3.4.3通過分離穩(wěn)定的霍利迪結構來檢測在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過將穩(wěn)定的霍利迪連結體從混合物中的其他分子如雙鏈體和單鏈多核苷酸中分離出來，從而完成對穩(wěn)定的霍利迪連結體的檢測?？蓮碾p鏈體DNA中分離穩(wěn)定的霍利迪連結體，分離方式可為凝膠電泳、毛細管電泳、層析(包括利用包被有上文詳述的霍利迪結構特異性結合蛋白的柱進行親和層析)。
有多種方法可從雙鏈體DNA中分離十字型霍利迪結構。為了確定多個SNP位置的單個的基因型，我們?yōu)槊總€SNP位置設計了一組PCR引物(F1、F2、R1和R2)?？蓪⒗脝蝹€的基因組DNA進行PCR得到的DNA片段(部分雙鏈體)作為靶DNA。將利用同一組引物得到的已知基因型的DNA片段(部分雙鏈體)作為參照DNA。因此，每個SNP就有兩個參照DNA(部分雙鏈體)。將每個SNP位點的靶DNA(部分雙鏈體)混合，并通過進行霍利迪連結體形成過程/支鏈遷移過程，逐個的將它們分別與相應的兩個參照DNA(部分雙鏈體)進行比較。PCR/支鏈遷移后，將在多個(1-數(shù)百萬)SNP位點得到的混合物收集到一起。然后將收集的DNA置于分離/純化霍利迪結構的條件(如凝膠/毛細管電泳、層析)下。利用多種方式對靶DNA和相應的多SNP參照DNA形成的這些霍利迪結構進行分離/純化。
可利用凝膠電泳或毛細管電泳從雙鏈體DNA中分離霍利迪連結體。隨后對含有霍利迪連結體DNA的條帶進行檢測和純化。然后，從含有霍利迪連結體的凝膠條帶中洗脫/純化DNA。
另外，作為另一個例示而不是限制，可通過層析法來分離包含有霍利迪連結體的收集物。在一優(yōu)選實施方案中，與霍利迪結構特異性結合蛋白包被/綴合的固體表面(如柱、過濾器、塑料等)可用于分離/純化霍利迪連結體。在包含有霍利迪連結體的純化收集物中存在具有特異性SNP的DNA片段就表明此SNP的靶DNA與它曾對比過的參照DNA不同。或者，換言之，在此特異性SNP位置上用于產生靶DNA的二倍體基因組DNA至少有一個SNP版本拷貝與所用的參照DNA版本不同。因此，能夠檢測含有分離的/純化的霍利迪連結體收集物的DNA片段的性質的方法都可用于SNP評分。源自多種生物體的多種蛋白表現(xiàn)出與霍利迪連結體特異性結合的能力，這在上文有詳述。
作為一示例而不是一限制，DNA雜交可用于確定含有分離/純化的霍利迪連結體收集物的DNA片段的性質。在一優(yōu)選的實施方案中，可對含有已分離的霍利迪結構的DNA進行標記，并用作探針與固定化在SNP-芯片/微陣列上的DNA片段/寡核苷酸進行雜交，從而進行SNP評分。對芯片/微陣列上的特異性SNP來講，陽性雜交信號表示用于產生在特異性SNP位置上的靶DNA的二倍體基因組DNA至少含有一個拷貝與選用的參照DNA不同。選取SNP位置上所有可能的版本作為參照DNA，將他們逐個的與相應的靶DNA進行比較(形成霍利迪結構/進行支鏈遷移)，隨后利用芯片/微陣列進行雜交來分離/純化和鑒定霍利迪結構，我們就能同時高特異性/準確性地確定多(1-數(shù)百萬)SNP位置處的二倍體基因組DNA樣品的基因型。
例如，圖5圖解了多個多態(tài)性位點基因型分析方法。在圖5中，利用4個正向引物(F/R1，F(xiàn)/R2，F(xiàn)/R3和F/R4)和一個反向引物來對靶DNA進行擴增。這四個正向引物F/R1、F/R2、F/R3和F/R4包含有一個多核苷酸序列F，此序列可與靶DNA和四條尾序列T1、T2、T3和T4中的一個序列互補。反向引物包含有與靶DNA和任選的通用尾UT互補的多核苷酸序列。如上文所述進行PCR來制備靶部分雙鏈體。對正向和反向引物要進行一定的選擇，這就可使得生成的部分雙鏈體包含有靶序列中的目的多態(tài)性。利用相同的引物，對與靶DNA相對應并含有該多態(tài)性的已知序列的參照DNA進行擴增就可得到參照部分雙鏈體。在能夠形成十字型結構和進行支鏈遷移的條件下，將靶雙鏈體和參照雙鏈體混合在一起。按照前述的方法對穩(wěn)定的霍利迪結構進行分離?；衾辖Y構的分離表示著靶序列和參照序列間差異的存在。
值得注意的是可對多個靶DNA同時進行檢測。利用一組獨特的PCR引物來制備每個獨特靶DNA的部分雙鏈體。例如，就兩個靶DNA來講，與第一個靶DNA對應的部分雙鏈體可用與尾T1、T2、T3和T4對應的引物來制備。與第二個靶DNA對應的部分雙鏈體可用與尾T5、T6、T7和T8對應的引物來制備。尾T1、T2、T3和T4不能與尾T5、T6、T7和T8對應。每個參照DNA的參照部分雙鏈體可利用與制備相應的靶DNA時所用的引物相對應的引物來制備。在相同的混合物中，所有的靶部分雙鏈體能與相應的參照部分雙鏈體進行接觸，并且穩(wěn)定的霍利迪結構能夠一步回收。利用如任選的通用尾UT就可進行PCR來對回收的多核苷酸進行隨意的擴增。然后，利用本領域中的熟練技術人員熟知的技術來鑒定回收的多核苷酸。例如，可通過與對尾T1、T2、T3和T4或尾T5、T6、T7和T8特異的寡核苷酸雜交來鑒定回收的多核苷酸。這些雜交可通過如基因芯片、寡核苷酸陣列或包被有寡核苷酸的標記珠來進行?？蓹z測的雜交信號的存在表明一個特定的靶DNA與其相應的參照DNA不同。例如，回收的多核苷酸與相應于尾T5、T6、T7和T8的寡核苷酸雜交表明第二個DNA與它對應的參照DNA不同。
值得注意的是，相同的檢測儀器(如基因芯片、寡核苷酸陣列或包被有寡核苷酸的標記珠)可用于任何多態(tài)性的基因型分析。這些檢測儀器是特異于與上述方法中應用的PCR引物相應的尾，而不是特異于靶DNA。
6.4通過對固體基質上的穩(wěn)定的霍利迪結構進行檢測來檢測兩核酸間差異的方法另一方面，本發(fā)明提供了方法和試劑來解離固體基質上的十字型復合體。將相應于一個多核苷酸序列的部分雙鏈體的一個多核苷酸固定化在固體支持物上，并在能形成十字型復合體和進行支鏈遷移的條件下與其他多核苷酸接觸。此多核苷酸序列可以是，如一與相應于參照序列的核酸形成十字型復合體的靶序列，或與相應于靶序列的核酸形成十字型復合體的參照序列。如果靶序列和參照序列是完全相同的，那么支鏈遷移就能完成，并且一個雙鏈體從固體表面上釋放出來。如果靶序列和參照序列間存在差異，支鏈遷移將會停止，霍利迪連結體結構就穩(wěn)定在固體基質上。對固定化的霍利迪連結體結構的檢測就表明在靶序列和參照序列間存在差異。
此處的固體基質可以是本領域中的熟練技術人員熟知的任何固體基質。此處的固體基質包括本領域中的熟練技術人員熟知的那些可在其上固定化多核苷酸的任何物質。合適的物質包括，如金屬、聚合物、玻璃、多糖、硝酸纖維素等。這些固體基質也可以任何形式，如珠、盤、板、條或其他能夠負載多核苷酸的形式存在。這些多核苷酸可以通過本領域技術人員熟知的方式結合到固體基質上。這些多核苷酸可，如非共價結合到固體基質上，或直接共價結合到固體基質上，或通過連接體來結合到固體基質上。在一個優(yōu)選實施方案中，多核苷酸通過紫外線交聯(lián)固定化到硝酸纖維素上。
為了確定兩DNA片段A和B間是否存在差異/變異，選用一個正向引物(F)和兩個反向引物(R1和R2)中的任一個(A或B)，進行PCR擴增(圖6A和6B)，使得該兩DNA片段中的每個DNA片段(A或B)首先與尾/標記#1或與尾/標記#2相連接。形成的四個DNA雙鏈體為A1(A+尾/標記#1)；A2(A+尾/標記#2)；B1(B+尾/標記#1)；及B2(B+尾/標記#2)。
將一個雙鏈體，如A1，固定化在固體基質上。將雙鏈體A2/B1/B2混合物添加到固定化的雙鏈體A1中，在隨后的支鏈遷移條件下，部分雙鏈體A′、A″、B′、B″就形成了瞬時霍利迪結構(圖6A和6B)。如果A和B間有錯配，那么瞬時霍利迪結構就會成為穩(wěn)定的霍利迪結構/連接體(圖6B)。當A和B間不存在差異時，瞬時霍利迪結構將會解離為雙鏈體(圖6A)另外，也可將其中的一個雙鏈體如A1固定化在固體基質上。然后A1變性，并與A2形成固定化在固體基質上的部分雙鏈體A′和A″(圖6A和6B)。然后，將B1和B2的混合物，優(yōu)選1∶1的比例，置于煮沸/變性條件下，隨后置于重新退火條件下，在混合物中形成部分雙鏈體B′和B″(圖6A和6B)。然后，將含有B′和B″部分雙鏈體的B1/B2混合物添加到已固定化有A′和A″部分雙鏈體的固體基質上。然后將得到的混合物置于支鏈遷移條件下，這樣部分雙鏈體A′、A″、B′、B″就能形成瞬時霍利迪結構(圖6A和6B)。當A和B間不存在差異時，瞬時霍利迪結構/連接體就迅速的解離為雙鏈體(圖6A)。
利用PCR/支鏈遷移緩沖液或任何不破壞霍利迪結構的緩沖液任意的沖洗固體基質上未結合的物質。只有當A和B間有錯配/差異的時候，才不會將玻璃表面上的穩(wěn)定的十字型霍利迪結構沖洗下來(圖6B)。
隨后，將試劑添加到不僅能與霍利迪結構特異性結合，而且能進行直接或間接檢測的固體基質上。該試劑包括，但并不局限于GFP(或其他熒光)標記的霍利迪連結體特異性結合蛋白，如RuvC、RuvA、RusA和它們的同系物，及上文詳述的其他試劑。隨后，沖洗掉任何不能與固體表面特異性結合的試劑。然后，利用對這些試劑來說適當?shù)姆椒▉韺@些特異性結合的試劑進行檢測和/或定量。這些方法在上文都有詳述。試劑的特異性結合表明固體基質上存在穩(wěn)定的霍利迪結構，從而表明A和B間存在差異。
6.5 SNP鑒定方法任何基因變異，包括SNP在內，對DNA序列內每個可變位置來講，至少包含有兩種可能的版本。為了確定在一個特定的可變位置靶DNA樣品(二倍體或單倍體)含有哪種版本，就要將靶DNA序列與代表可變位置處所有可能的變異版本的參照DNA序列進行比較。眾所周知，DNA變異是以不同于SNP的多種形式存在。本發(fā)明不僅能夠檢測SNP，而且能檢測涉及多堿基的多態(tài)性、多堿基對缺失、插入和錯義突變。然而，通過SNP進行的基因型分析將用于例示，而并不局限，本發(fā)明在確定二倍體個體，如人的多種基因變異的基因型方面的應用。
為了確定特定SNP位置上的基因組DNA樣品(X/X)的基因型，對所討論的DNA進行擴增得到靶DNA。此外，兩參照DNA(A或B)是由兩參照基因組DNA樣品(A/A或B/B)或由含有兩參照DNA序列(A或B)的克隆DNA片段擴增而來的。所有三個DNA樣品是利用兩普通的未標記引物組、在標準PCR條件下進行PCR擴增得到的?；蚪MDNA的PCR條件與STS(利用基因組DNA進行的PCR中，正向引物的濃度為～500nM-1000nM，兩反向引物的濃度為大約～250uM-500uM的PCR條件類似，利用克隆的DNA片段進行的PCR能耐受較低的引物濃度(～250nM)。每組引物含有3個引物一個正向引物(LF或RF)及兩個反向引物(LR1，LR2或RR1，RR2)。LF與所討論的SNP位置的左側靶序列雜交。只要考慮到PCR擴增的可能性，LF就要與所討論的SNP位置保持最短的距離，LF就是以這種方式設計的。LF優(yōu)選與SNP位置保持＜10bp的距離。LR1和LR2分享同一個3′-末端部分(LR)，此3′-末端部分與所討論的SNP位置的右側靶序列進行了雜交。只要考慮到PCR擴增的可行性，LR1/LR2就要與所討論的SNP位置保持最短的距離，LR1/LR2就是以這種方式設計的。LR1/LR2的3′端優(yōu)選與所討論的SNP位置相鄰的堿基對相對應。RF與所討論的SNP位置的左側靶序列雜交。只要考慮到PCR擴增的可能性，RF就要與所討論的SNP位置保持最短的距離，RF就是以這種方式設計的。RF的3′端優(yōu)選與所討論的SNP位置相鄰的堿基對相對應。LR1和LR2分享同一個3′-末端部分(RR)，此3′-末端部分與所討論的SNP位置的右側靶序列進行了雜交。只要考慮到PCR擴增的可行性，RR1/RR2就要與所討論的SNP位置保持最短的距離，RR1/RR2就是以這種方式設計的。RR1/RR2的3′末端一般應為5-500bp，優(yōu)選小于10bp。
利用兩組引物(LF/LR1/LR2和RF/RR1/RR2)，由靶基因組DNA樣品擴增得到了兩個靶DNA復制子L(X/X)和R(X/X)。復制子L(X/X)是利用引物組LF/LR1/LR2得到的。復制子R(X/X)是利用引物組RF/RR1/RR2得到的。利用兩組引物(LF/LR1/LR2和RF/RR1/RR2)，由兩參照DNA樣品(A/A和BB)擴增得到了四個參照DNA復制子L(A/A)、R(A/A)、L(B/B)、R(B/B)。復制子L(X/X)分別與復制子L(A/A)和L(B/B)以1∶1的比例混合形成了混合物L(X/X)/(A/A)和L(X/X)/(B/B)。復制子R(X/X)分別與復制子R(A/A)和R(B/B)以1∶1的比例混合形成了混合物R(X/X)/(A/A)和R(X/X)/(B/B)。隨后，將生成的這四種混合物L(X/X)/(A/A)、L(X/X)/(B/B)、R(X/X)/(A/A)和R(X/X)/(B/B)變性/重退火，并置于支鏈遷移條件下(在含有Mg++的PCR緩沖液中，先在95℃下持續(xù)2min，隨后在65℃下持續(xù)30min)。隨后利用前述的霍利迪連結體特異性結合蛋白來檢測穩(wěn)定的霍利迪連結體的存在和存在的量。記錄檢測到的四種混合物的信號，并與所有可能的基因型的條形碼(圖7和表1)進行比較來確定所討論的SNP位置上的靶基因組DNA樣品的基因型。本發(fā)明不僅能確定所討論的SNP位置上的靶基因組DNA樣品的基因型，而且能確定所討論的SNP位置附近的其他突變的存在和位置。
7.實施例1 利用凝膠電泳來檢測兩序列間的差異本實施例證明了穩(wěn)定的霍利迪結構可由含有不同序列的多核苷酸來形成。按照本發(fā)明中的方法，可利用凝膠電泳來檢測穩(wěn)定的霍利迪結構。利用含尾反向引物，對含有已知的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的人基因組DNA的5個區(qū)進行PCR擴增，以便形成霍利迪連結體。從國家生物技術信息中心(NCBI)的SNP數(shù)據庫就能查到這些區(qū)的序列、在這些序列中各自的SNP的性質和位置、以及引物的序列。所用的SNP的NCBI檢測ID如下4215、4217、4213、4141和4212。
源自M08PDR系列(含有8個個體DNA樣品的Human PolymorphismDiscovery Resource系列的最小的亞型)的基因組DNA樣品購自Coriell Cell Repository(Camden，NJ)。對每個SNP，擴增兩個基因組DNA樣品，一個為純合體，一個為雜合體。這些樣品的基因型在Lishansld，2000，Clinical Chemistry 46(9)，1464-1470中有描述。用于擴增基因組DNA的引物序列如下所示。SNP4215F5’-CTGTGTTATTTGCTGATCCTG-3’(SEQ ID NO1)Rt15’-ACCATGCTCGAGATTACGAGGTAAACTTTCTGAGCCTCTGG-3’(SEQ ID NO2)Rt25’-GATCCTAGGCCTCACGTATTGTAAACTTTCTGAGCCTCTGG-3’(SEQ ID NO3)SNP4217F5’-CATTAGCTTAAAAGCTGTCTTTTGC-3’(SEQ ID NO4)Rt15’-ACCATGCTCGAGATTACGAGGGTTTGCTGGAAGAAAGCAG-3’(SEQ ID NO5)Rt25’-GATCCTAGGCCTCACGTATTGGTTTGCTGGAAGAAAGCAG-3’(sEQ ID NO6)SNP4213F5’-AAAACCCTGTTGATATTGGCC-3’(SEQ ID NO7)Rt15’-ACCATGCTCGAGATTACGAGCTGAATACTCTCCATCCTTGCC-3’(SEQ ID NO8)Rt25’-GATCCTAGGCCTCACGTATTCTGAATACTCTCCATCCTTGCC-3’(SEQ ID NO9)SNP4141F5’-ACCACATCCTCTCATTCGTTG-3’(SEQ ID NO10)Rt15’-ACCATGCTCGAGATTACGAGGGGGTCTCTGCAGTTAACCA-3’(SEQ ID NO11)Rt25’-GATCCTAGGCCTCACGTATTGGGGTCTCTGCAGTTAACCA-3’(SEQ ID NO12)SNP4212F5’-TGATGTCAAAATAGCTCCATGC-3’(SEQ ID NO13)Rt15’-ACCATGCTCGAGATTACGAGAATATGCAAAGTAATTTTCTGGCC-3’(sEQ ID NO14)Rt25’-GATCCTAGGCCTCACGTATTAATATGCAAAGTAATTTTCTGGCC-3’(SEQ ID NO15)其中F是正向PCR引物，R是反向PCR引物，t1和t2是5個復制子共有的“尾”序列(下面劃線的)。正向和反向序列在NCBI SNP數(shù)據庫中有公布。
利用PTC-200 DNA Engine thermocycler (MJ ResearchInc.，Waltham，MA)來進行PCR擴增。94℃下變性10s、62℃下重退火15s、72℃下延伸45s，這樣進行35個PCR循環(huán)。在進行循環(huán)之前要在95℃下溫育10分鐘來活化AmpliTaq GoldTMDNA聚合酶(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，隨后在95℃下變性2min，在65℃下溫育30min(重退火和支鏈遷移)。反應混合物(100ul)中含有100ng基因組DNA、2.5U AmpliTaq GoldTMDNA聚合酶、每種dNTP各200nM及溶解在商業(yè)AmpliTaq緩沖液(10mM Tris-HCl，ph8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％明膠)中的每種引物各250nM。
將進行支鏈遷移的5ul PCR產物與1ul 6X TBE加樣緩沖液(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)混合，并填充到4-12％的梯度TBE預制聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)。利用Xcell SurelockTMMini-Cell電泳儀(Invitrogen Corp.，SanDiego，CA)，在1X TBE緩沖液中、165V下進行30分鐘的凝膠電泳。用SYBR Gold熒光染料(Molecular Probes，Eugene，OR)對凝膠進行染色，并在DR-45M Dark ReaderTM透射儀(Clare Chemical Research，Denver，CO)上觀察。
圖8A展示了一個典型的凝膠圖片。在1X TBE緩沖液中、165V下在4-12％梯度預制凝膠中電泳30分鐘，并用SYBR Gold進行染色。在凝膠的底部展示了NCBI檢測ID、各自的多態(tài)性和擴增子長度。條帶3、6和13含有一個大小標記物-100bp的DNA序列梯(InvitrogenCorp.，San Diego；CA)。箭頭指示未解離的霍利迪連結體帶。
對于圖8A中的每個SNP來說有兩條條帶一個是純合體(左)，另一個是雜合體(右)。擴增子的長度為122-245bp。當兩等位基因存在單堿基序列差異時，僅僅在每個SNP的雜合體樣品中出現(xiàn)相對較弱并緩慢移動的條帶(箭頭所示)。移動越慢的條帶相應于較長的擴增子。系列稀釋實驗(未給出)證明，這些帶中的DNA的量與未解離的霍利迪連結體的預期量大體相同(總量的1/16)。當用霍利迪連結體特異性核酸內切酶即野生型大腸桿菌RuvC進行消化時，緩慢移動的條帶消失(未給出)。基于這些事實，緩慢移動的條帶顯然表示未解離的霍利迪連結體，因此也指示著基因組DNA中的兩選擇性等位基因的存在。
因此，正如圖8B中的實驗證明的那樣，對未標記的PCR產物進行快速電泳足以進行SNP基因型分析。在此實驗中，利用特異于SNP 4215的引物組對源自M08PDR系列的8個基因組DNA樣品進行擴增，并進行支鏈遷移。165V下，在1X TBE緩沖液中，利用6％TBE凝膠電泳30min，并用SYBR Green染色。對6％TBE凝膠進行SYBRGreen(Molecular Probes，Eugene，OR)染色后，只有以前鑒定為雜合體A/G SNP(Lishanski，2000，上文)的五個樣品(1，3，5，6和8)展示出由于支鏈遷移終止而產生的未解離的霍利迪連結體帶(箭頭所指)。
8.實施例2 RuvA和突變體RnvC蛋白與穩(wěn)定的霍利迪連結體的特異性結合如本發(fā)明中的方法所述，本實施例證明了能夠利用蛋白來特異性結合和檢測穩(wěn)定的霍利迪連結體。尤其是，利用RuvA和RuvC來特異性結合和檢測穩(wěn)定的霍利迪連結體。
在大腸桿菌中，RuvA和RuvC蛋白是多亞基RuvABC復合體的組成部分，多亞基RuvABC復合體可通過解離霍利迪連結體來促進同源基因重組。Shinagawa and Iwasaki，1996 Trends In BiologicalSciences21，107-111；Eggleston and West，2000，J.Biol.Chem.275，26467-26476.對它們在體外與合成的霍利迪連結體的結合進行了很好的研究。Davies and West，1998，Current Biology 8，725-727；Whitby et al.，1996，J.Mol.Biol.264，878-890.在溶液中，22kDaRuvA蛋白是以同型四聚體的形式存在的，并以四聚體或八聚體的形式與合成的霍利迪連結體特異性結合，以四聚體還是八聚體形式結合是要依賴于蛋白的濃度。19kDa RuvC蛋白是一個霍利迪連結體特異性內切核酸酶或解離酶，它可以二聚體的形式與霍利迪連結體結合、對其進行切割，并導致其解離。已經對幾個保留有特異性結合活性但缺乏內切酶活性的RuvC蛋白突變體進行了分離。Saito et al.，1995，Biochemistry 92，7470-7474.
從大腸桿菌中表達和純化的重組Ruv A和RuvC(D7N突變體)蛋白是由Dr.Hideo Shinagawa(Osaka University，Japan)提供的。按照實施例1中的描述，對選自M08PDR系列的多個樣品進行PCR擴增和支鏈遷移。除實施例1中的SNP4215、4212、4213和4141外，這些實驗中還包括了另兩個SNPSNP3989和4216。選用的是下列引物組SNP 3989F5’-TGAGAGTAGCTTGGCTGGGT-3’(SEQ ID NO16)Rt15’-ACCATGCTCGAGATTACGAGTTTGGCTTTCATCTTCCCC-3’(SEQ ID NO17)Rt25’-GATCCTAGGCCTCACGTATTTTTGGCTTTCATCTTCCCC-3’(SEQ ID NO18)SNP 4216F5’-GCCATTGTAAGATCTGAATGAGG-3’(sEQ ID NO19)Rt15’-ACCATGCTCGAGATTACGAGATGTTTTATGTGGAGAGGTATCTGC-3’(SEQ ID NO20)Rt25’-GATCCTAGGCCTCACGTATTATGTTTTATGTGGAGAGGTATCTGC-3’(SEQ ID NO21)利用下文描述的條帶移位實驗對蛋白結合進行檢測。室溫下，將5ul進行支鏈遷移的PCR產物與1ul 0.25uM RuvA蛋白或1ul 0.5uM突變RuvC蛋白(在1X AmpliTaq緩沖液中稀釋，見實施例1)混合，溫育5-10min。加入1ul 6X樣品加樣緩沖液，然后將此樣品加入到預制的聚丙烯酰胺凝膠中，如實施例1所述進行電泳并染色。
圖9A例示了RuvA和RuvC與純合體(左)或雜合體(右)SNP 4215樣品的結合的對比實驗。樣品(A＝RuvA；C＝突變體RuvC)是在置于1X TBE緩沖液中的4-12％梯度聚丙烯酰胺凝膠中、在165V電壓下電泳30min，并用SYBR Green染色的。白點指示相當灰白的霍利迪連結體條帶的位置。在純合體樣品中沒有觀察到結合(沒有移位的條帶)，而當?shù)鞍捉Y合時，雜合體樣品中的霍利迪連結體條帶的遷移率就發(fā)生了變動。
圖9B展示了RuvA與霍利迪連結體的結合，其反應條件是能夠保證RuvA對四種PCR產物的霍利迪連結體的特異性，而此四種PCR產物是與四種不同的SNP相對應的。實驗條件與上文的圖9A的實驗條件相同。只是雜合體樣品是用于結合實驗中。對所有的SNP來講，當與RuvA結合時，霍利迪連結體條帶在電泳遷移率上有改變(-表示沒有添加RuvA，+表示添加了RuvA)。
圖9C提供了另一個RuvA、突變體RuvC及這兩種蛋白的混合物與三種PCR產物的霍利迪連結體結合的例子，而此三種PCR產物是相應于以雜合體形式存在的三種不同的SNP的。除了凝膠電泳時間為75min和用SYBR Gold染色外，實驗條件與上文圖9A的實驗條件相同的。A＝RuvA；C＝突變RuvC；A+C＝RuvA+RuvC(預混合蛋白中添加有PCR產物)。
本實施例中實驗表明，在特定的條件(相對較低的蛋白濃度)下，RuvA和突變體RuvC能特異性結合到進行支鏈遷移的DNA PCR擴增形成的未解離的霍利迪連結體上。因此，這些結合反應可用于對含有給定多態(tài)性的兩個等位基因的樣品和那些含有一個等位基因的樣品進行區(qū)分，或換言之，就是進行SNP基因型分析。
9.實施例3 利用RuvA和RuvC對穩(wěn)定的霍利迪連結體進行特異性結合如本發(fā)明中的方法所述，本實施例證明了兩蛋白的復合體能有穩(wěn)定的霍利迪連結體特異性結合。以抗Ruv A和突變體RuvC(由Dr.Hideo Shinagawa，Osaka University，Japan提供)的抗血清為探針，與霍利迪結構進行雜交，證明了這兩種蛋白與或結構的特異性結合。
按照實施例2中的方法進行蛋白結合。實驗選用了SNP 4216的雜合體樣品。當RuvA和突變體RuvC都包括在結合反應中時，需要在添加PCR產物前對它們進行預混合。凝膠電泳條件與圖9C中的相同。用SYBR Gold染色后，將凝膠暫時在含有0.1％SDS的1X Tris-甘氨酸電泳緩沖液(25mM Tris堿，192mM甘氨酸，pH8.3，InvitrogenCorp.，San Diego，CA)中溫育。利用Xcell IITMBlot Module(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)，將蛋白從凝膠轉移到硝酸纖維素膜(0.2um孔徑)，在20V電壓下進行2hr。緩沖液包括12mMTris堿-96mM甘氨酸(pH8.3)和20％甲醇。在含有50mMTris-HCl、pH7.5、150mM NaCl、0.05％Tween 20的1X TBST緩沖液(RocheMolecular Biochemicals，Mannheim，Germany)中對硝酸纖維素膜進行短暫漂洗。然后，將硝酸纖維素膜在含有1％封閉試劑(RocheMolecular Biochemicals，Mannheim，Germany)的1X TBST中溫育1hr。此步溫育和所有的其他沖洗和溫育步驟都是在4℃下持續(xù)震蕩進行的。在完成封閉步驟后，將膜在含有10ml 1∶1000稀釋的兔抗RuvC抗體的1％封閉溶液中溫育1hr。將膜在20ml 1X TBST中沖洗四次，每次更換緩沖液，每次沖洗時間為5-10min。然后，將膜在含有10ml1∶1000稀釋的1mmunoPureTM山羊抗兔IgG(與堿性磷酸酶綴合)的1％封閉溶液中溫育30min。然后，將膜在20ml 1X TBST中沖洗四次，每次更換緩沖液，每次沖洗時間為5-10min。堿性磷酸酶的底物溶液是通過向10ml 0.1MTris-HCl、pH9.5、0.1 MNaCl、50mM MgCl2中添加44ul 75mg/ml氮藍四唑氯化物(NBT)和33ul 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸p-甲苯胺鹽(BCIP)制得的。NBT和BCIP購自LifeTechnologies，Rockville，MD。在5-10min內就可顯色。
用鉛筆對含有并顯示RuvC蛋白的條帶(圖10的II中的2和3泳道)進行了標記。如上所述，對硝酸纖維素膜進行重阻斷，并與進行1∶2000稀釋的兔抗RuvA抗體探針雜交。
在1和3泳道中可見含有RuvA蛋白的條帶(圖10，III)。在第3泳道中，先后分別利用抗RuvC抗體和抗RuvA抗體顯示出的條帶的位置完全相同?；蛟S是由于RuvAC復合體具有提高的緊密性，其電泳遷移率要略高于RuvA(泳道1)和RuvC(泳道2)的遷移率。
在圖10的每個系列中，泳道1表示雜合體PCR產物+RuvA，泳道2表示雜合體PCR產物+RuvC(突變體)，泳道3表示雜合體PCR產物+(RuvA+RuvC)。系列I表示用SYBR Gold染色的凝膠，系列II表示與抗RuvC抗體探針雜交的膜，系列III表示與抗RuvC抗體探針重雜交的膜。利用抗RuvC抗體對系列III的第2泳道進行的染色仍然可見。
10.實施例4 利用LOCI檢測穩(wěn)定的霍利迪連結體本實施例描述了檢測穩(wěn)定的霍利迪結構的方法，這個方法是通過對特異于霍利迪結構的兩分子的分子間相互作用進行檢測來進行的。
本實施例應用了均質化學發(fā)光檢測法LOCI(Ullman et al.，1994，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91，5426-5430；Packard BioScience，Meriden，CT)。它們利用了一個事實當兩個顆粒，一個受體和一個供體，緊密接觸時，由于生物學上的相互作用就產生了化學發(fā)光。如實施例1-3中描述的，利用一個參照序列和一個靶序列就制備得到了PCR產物。PCR產物在能形成四鏈復合體和進行支鏈遷移的條件下進行接觸。
支鏈遷移后，如果存在，穩(wěn)定的霍利迪結構，就會與生物素化的RuvA(b-RuvA)和未標記的突變體RuvC進行接觸。隨后，此復合體與特異于RuvC的抗血清(如鼠或兔的抗血清)進行接觸。在適當?shù)臈l件下，形成的復合體與包被有鏈霉抗生物素的供體珠及包被有抗鼠或抗兔IgG的受體珠進行接觸。
利用680nm的激光對此混合物進行照射，供體珠中的光敏劑就產生單電子氧。單電子氧誘導了受體串珠中的化合物的化學發(fā)光。如果由于靶多核苷酸和參照多核苷酸間存在差異而形成穩(wěn)定的霍利迪結構，那么就能觀測到信號。在霍利迪連結體不存在(支鏈遷移沒有收到抑制)的情況下不能觀測到信號。
11.實施例5利用RuvA來檢測穩(wěn)定的霍利迪結構本實施例證明了含有相同蛋白的兩個分子可用不同的標記物進行單獨標記，并用于檢測靶多核苷酸和參照多核苷酸間的差異。
RuvA蛋白在溶液中時以四聚體的形式存在，并且兩個這樣的四聚體與霍利迪連結體結合形成八聚體。在體外，對一個RuvA四聚體用生物素標記(b-RuvA)，對另一個四聚體用熒光素標記(f RuvA)。標記的RuvA分子可用于檢測穩(wěn)定的霍利迪結構。
如實施例1-4所述來制備PCR產物，并將其置于支鏈遷移條件下。穩(wěn)定的霍利迪結構，如果存在，就會與b-RuvA和f-RuvA進行接觸。隨后，形成的復合體與包被有鏈霉抗生物素的供體珠及包被有抗熒光素抗體的受體珠進行接觸。
如實施例4中所述對供體珠和受體珠的相互作用進行檢測。供體-受體信號存在表示靶序列和參照序列間存在差異。
12.實施例6通過FRET來對穩(wěn)定的霍利迪結構進行檢測本實施例描述了一個基于熒光共振能量轉移(FRET)之上的、高效且敏感的方法來檢測兩多核苷酸間的差異。
已公布的含有合成的霍利迪連結體的RuvA復合體的晶體結構(Rafferty et al，1996，Science 274，415-421；Hargreaves et al，1998，Nature Struct.BioL 6，441-446；Ariyoshi et al，2000，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 97，8257-8262；Roe et al.，1998，Mol.Cell 2，361-372)表明，兩RuvA四聚體間的距離在10-100的FRET區(qū)域之內。
在穩(wěn)定的霍利迪結構存在的情況下，為了產生FRET信號，就要將一個四聚體上的RuvA用FRET對的一個供體，如熒光素來標記，將第二個四聚體用相應的受體，如四甲基羅丹明或QSY7染料(MolecularProbes，Eugene Oregon)來標記。
如實施例1-4所述來制備PCR產物，并將其置于支鏈遷移條件下。穩(wěn)定的霍利迪結構，如果存在，就會與兩標記的RuvA四聚體進行接觸。結合后，利用熒光分光光度計在合適的波長下對供體熒光球進行激發(fā)，通過受體熒光出現(xiàn)來檢測FRET。
沒有霍利迪連結體存在(PCR產物的支鏈遷移沒有受到抑制)的情況下，檢測不到FRET。FRET信號出現(xiàn)表明兩多核苷酸序列間存在差異，并且有霍利迪連結體形成。
另外，用相同的方法，將與霍利迪結構特異性反應的其他分子對用FRET對進行標記。例如，用兩含有FRET對的不同的熒光染料對RuvA和突變體RuvC進行標記，并在霍利迪連結體上檢測到了它們的集合。
另外，將RuvA分子與兩不同的GFP突變體進行融合，從而將供體和受體熒光球導入RuvA中(Heim，1999，in Methods in.Enzymology302，408-423；Green Fluorescent Protein)?？寺『捅磉_這些融合體時用的載體是得自Aurora Bioscience(San Diego，CA)。這種方法避免了對蛋白進行必需的化學修飾。另外，將RuvA和突變體RuvC與兩不同的GFP突變體融合，并在霍利迪連結體上檢測到了它們的集合。
13.實施例7通過BRET對穩(wěn)定的霍利迪結構進行檢測本實施例提供了另一個高效且敏感的方法來檢測多核苷酸間的差異。本示例中的方法是基于生物發(fā)光共振能量轉移(BRET；PackatdBioScience，Meriden CT)之上的。在BRBT方法中，可檢測到從生物發(fā)光供體熒光素酶到受體GFP的能量轉移。
如實施例1-6所述來制備PCR產物，并將其置于支鏈遷移條件下。穩(wěn)定的霍利迪結構，如果存在，就會與和熒光素酶融合的RuvA及和GFP融合的RuvA進行接觸。利用商業(yè)可得的克隆和表達載體來制備RuvA與熒光素和GFP的融合體。
結合后，利用熒光分光光度計在合適的波長下對供體熒光載體進行激發(fā)，并通過受體的熒光出現(xiàn)來檢測BRET。BRET信號的檢測不需要任何激發(fā)光源。BRET信號出現(xiàn)表明多核苷酸序列間存在差異。
另外，RuvA和突變體RuvC可分別與熒光素酶和GFP(或反過來)進行融合，利用BRET可在霍利迪連結體上檢測到它們的集合。
上述討論包括關于本發(fā)明中的一些機理的特定理論。我們沒有意圖要用這些理論來限制本發(fā)明，也不應認為這些理論以任何方式限制本發(fā)明。
此處描述的特定實施方案沒有限制本發(fā)明的范圍。實際上，通過前面的描述和附圖，對于本領域中的熟練技術人員來講，除了此處的描述之外，本發(fā)明的多種變化是顯而易見的。這些變化是在附加的權利要求范圍之內的。
此處引用了多種文獻，因此，它們公開的部分在本發(fā)明中全部引用作為參照。
權利要求
1.檢測兩個相關多核苷酸序列間是否存在差異的方法，該方法包括(a)形成包含有以雙鏈體形式存在的所述兩個多核苷酸序列的十字型復合體；(b)將該十字型復合體置于支鏈遷移條件下，其中，如果所述兩個相關核酸序列間存在差異，該十字型復合體的支鏈遷移就停止，此十字型復合體就穩(wěn)定存在；如果所述兩個相關核酸序列間不存在任何差異，該十字型復合體的支鏈遷移就會繼續(xù)，直至完成完整的鏈交換，并且該十字型復合體解離為兩個雙鏈體核酸，從而形成一穩(wěn)定的十字型復合體；(c)將所述穩(wěn)定的復合體或支鏈遷移后的其解離的雙鏈體產物置于特定的條件下，在此條件下，可選擇性識別十字型復合體的第一種試劑與十字型復合體能夠進行特異性結合，其中，該試劑與該十字型復合體的結合產生了可檢測的信號；及(d)對該第一種試劑與該十字型復合體特異性結合時產生的信號進行檢測，以此來指示該十字型復合體的存在，此信號與所述核酸序列間差異的存在相關，該信號不能檢測到則與所述核酸序列間缺乏差異相關。
2.權利要求1中的方法，其中的差異為突變。
3.權利要求1中的方法，其中的核酸序列為DNA。
4.權利要求1中的方法，其中的十字型復合體含有霍利迪連結體。
5.權利要求1中的方法，其中的第一種試劑是與霍利迪連結體結合的化學物質，當此化學物質與霍利迪連結體結合時產生了特異的、可檢測到的信號。
6.權利要求5中的方法，其中的第一種試劑是染料。
7.權利要求1中的方法，其中的第一種試劑是霍利迪連結體結合蛋白。
8.權利要求7中的方法，其中的霍利迪連結體結合蛋白是重組酶或解離酶。
9.權利要求7中的方法，其中的霍利迪連結體結合蛋白是熱穩(wěn)定的。
10.權利要求7中的方法，其中的霍利迪連結體結合蛋白選自RuvA、RuvC、RuvB、RusA、RuvG、Ccel和spCcel、Hjc。
11.權利要求5中的方法，其中可檢測信號的產生涉及霍利迪連結體結合蛋白中的構象改變。
12.權利要求1中的方法，其中可檢測信號的產生涉及霍利迪連結體誘導的、發(fā)生在霍利迪連結體特異性結合蛋白和形成霍利迪連結體復合體的核酸間的締合。
13.權利要求1中的方法，其中可檢測信號的產生涉及所述第一種試劑的特異性霍利迪連結體結合誘導的熒光。
14.權利要求1中的方法，其中至少一種相關的多核苷酸序列沒有進行可檢測到的標記。
15.權利要求14中的方法，其中沒有一種相關的多核苷酸序列進行了可檢測到的標記。
16.權利要求1中的方法，其中a.將穩(wěn)定的復合體置于特定條件下，在此條件下，可選擇性識別十字型復合體的第二種試劑與十字型復合體能夠進行特異性結合，其中，第一種試劑和第二種試劑與十字型復合體的同時結合產生了可檢測的信號；及b.對第一種試劑和第二種試劑與十字型復合體特異性結合時產生的信號進行檢測，以此來指示該十字型復合體的存在，此信號與所述核酸序列間差異的存在相關，該信號不能檢測到則與所述核酸序列間缺乏差異相關。
17.權利要求9中的方法，其中第一種和第二種試劑是霍利迪連結體結合蛋白。
18.權利要求9中的方法，其中信號的產生是通過霍利迪連結體誘導的、第一和第二種試劑的緊密締合來實現(xiàn)的。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測兩相關核酸序列間存在或不存在差異的方法。在這些方法中，靶核酸和參照核酸在特定條件下進行接觸，從而形成具有能夠遷移的支鏈的十字型核酸復合體。在這樣的接觸條件下，如果靶核酸和參照核酸是完全相同的，那么支鏈遷移就能夠完成，從而完成完整的鏈交換。如果靶核酸和參照核酸是不同的，就不能完成支鏈遷移，從而形成穩(wěn)定的十字型復合體。檢測到穩(wěn)定的十字型復合體就能確定核酸間差異的存在?？梢岳门c這些復合體進行特異性結合的分子、利用凝膠電泳或通過對穩(wěn)定的十字型復合體進行特異性分離對此穩(wěn)定的十字型復合體進行檢測。
文檔編號G01N33/566GK1429277SQ01809310
公開日2003年7月9日 申請日期2001年3月12日 優(yōu)先權日2000年3月11日
發(fā)明者Q·楊, W·楊, A·利尚斯基 申請人:弗雷什基因公司