專利名稱：以酶聯(lián)免疫測定為基礎(chǔ)的hla補體依賴性細胞毒性抗體檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明以免疫酶學反應為方法學基礎(chǔ)，通過測定CFAbs固定補體量實現(xiàn)對樣品中CFAbs測量的一種CDC效應評估方法。特別涉及器官移植免疫中HLA血清方法學的基本測定原理。
二、技術(shù)背景組織器官移植中排斥反應是生物機體免疫系統(tǒng)對外來移植物(非已)產(chǎn)生的免疫應答反應。當移植物細胞表面的蛋白成分(非已抗原)與受者免疫系統(tǒng)接觸時，通過免疫識別這些非已抗原成分并激發(fā)受者體液免疫系統(tǒng)、細胞免疫系統(tǒng)對移植物發(fā)動免疫攻擊，破壞、排斥非已移植物，導致組織器官移植失敗。
組織器官移植中，受者免疫系統(tǒng)通過MHC(組織相溶性復合物)識別機制對移植物MHC表型及短肽復合物進行雙重免疫識別。在人類MHC稱為人類白細胞抗原(HLA)，如果移植供者與受者HLA型別不相符合，則受者免疫系統(tǒng)將移植物識別為非已并對其發(fā)生免疫應答，導致“免疫排斥反應”。
在這種免疫排斥反應中，超急性免疫排斥反應主要由受者體液免疫成分即受者體內(nèi)在移植前已經(jīng)存在的，針對供者HLA的抗體分子所介導。這些抗體由受者懷孕、接受輸血、器官移植等使其免疫系統(tǒng)接觸非已HLA分子而產(chǎn)生。這類抗體的特征是能迅速與供者HLA結(jié)合并通過固定補體，激活補體系統(tǒng)發(fā)生級聯(lián)反應，誘發(fā)CDC效應。這種超急性免疫排斥反應發(fā)生異常迅速，通常為幾分鐘到數(shù)小時；而急性、慢性免疫排斥反應則由受者的體液免疫及細胞免疫系統(tǒng)同時介入。因此，為了預防器官移植中免疫排斥反應的發(fā)生，除盡量選擇HLA型別與受者HLA型別相匹配的供者外，在移植前利用供者淋巴細胞與受者血清進行交叉配型，以鑒別受者體內(nèi)是否存在針對供者HLA的抗體是預防超急性排斥反應發(fā)生的關(guān)鍵。同時，在器官移植后，對受者體內(nèi)HLA抗體的檢測，包括PRA(群體反應性HLA抗體)動態(tài)測定對急性、慢性排斥反應發(fā)生的監(jiān)測以及移植后受者生存期限的預測具有極其重要價值。
根據(jù)抗體是否能夠固定激活補體，誘發(fā)CDC效應與否，人類HLA抗體主要可分為兩類一類為與相應的HLA結(jié)合后可固定補體并激活補體系統(tǒng)誘發(fā)CDC效應，該類HLA抗體稱為補體依賴性細胞毒性抗體(Complement-dependent Cytotoxic Antibodies；CDC-Abs)或補體固定性HLA抗體(CFAbsComplement Fixing Antibodies)；其在誘發(fā)免疫排斥反應中的作用已十分明確，是直接導致免疫排斥反應尤其是超急性免疫排斥反應的體液免疫成分；而另一類HLA抗體，雖能與HLA發(fā)生特異性結(jié)合，但并不固定補體，不激發(fā)CDC效應，稱為非補體固定抗體(Non-CFAbs；Non-Complement Fixing Antibodies)。此類抗體甚至在機體免疫系統(tǒng)沒有接觸任何非已HLA的情況下，以天然形式存在于人類身體內(nèi)；并可與自身(Autologous)或外來(Allogeneic)非已HLA分子結(jié)合，但并不激活補體，誘發(fā)免疫CDC攻擊效應。迄今，人們對這類抗體的作用并不十分明了。但多數(shù)學者認為，這些抗體屬于一種天然抗體(Natural Antibody)成分，對生物體具有保護作用。美國、法國等曾對此作過較為深入的研究，體外、體內(nèi)大量實驗以及臨床實驗結(jié)果都獲得完全一致結(jié)論即正常人體內(nèi)存在天然抗體，由于其具有免疫調(diào)節(jié)功能，對維持正常生物機體健康發(fā)揮著某種有益的保護作用(Protective Effects)并可有效地應用于抑制器官移植中的免疫排斥反應。
目前，國際上對HLA抗體測定的方法分為兩類一類為Terasaki’s微量淋巴細胞毒性試驗，簡稱為CDC血清學方法，是一種普遍認為經(jīng)典的標準CDC測定方法。該方法以CDC誘發(fā)的淋巴細胞死亡率作為評判標準，其主要特征是直接測定由CFAbs誘發(fā)的CDC最終效應-細胞死亡，為一種CDC生物效應測定方法。該方法已廣泛應用于臨床器官移植的交叉配型以及PRA測定；但其存在費時長、技術(shù)復雜、實驗條件不易控制等很多缺點。另一類方法可同時測定CFAbs和Non-CFAbs；包括流式細胞儀測定結(jié)合于細胞表面的IgG抗體測定法，或以純化的HLA包被固相顆粒的抗HLA抗體測定法；以及使用純化HLA包被96孔微孔板測定與HLA結(jié)合的IgG抗體ELISA方法等。這些方法最大的缺點是忽略了天然HLA抗體的存在(Non-CFAbs)，它們并不引起CDC效應；相反，這些抗體與相應的HLA結(jié)合后，可封閉該HLA抗原位點，阻止HLA毒性抗體-CFAbs與相應HLA結(jié)合，從而阻斷隨之發(fā)生的CDC效應，使受者產(chǎn)生對移植物的免疫耐受。因此，上述這類方法在檢測方法學原理上存在明顯缺陷，不能區(qū)別作用完全不相同的以上兩類抗體。這就是為什么許多實驗室經(jīng)常得出令人難以解釋或與CDC血清學相互矛盾的結(jié)果，甚至與受者臨床轉(zhuǎn)歸完全相反結(jié)果如接受正常人免疫丙種球蛋白(Intravenous Immunoglobulin Gamma；IVIG)免疫抑制治療的器官移植受者，上述方法結(jié)果持續(xù)陽性，而臨床病人病情正?；蜣D(zhuǎn)好。另外，在臨床器官移植中，該類方法結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)假陽性引起對供者選擇的誤導，致使某些急待器官移植的患者錯過移植機會而病情惡化甚至死亡。
目前所有測定HLA抗體的方法另一明顯不足是所需時間較長，這在尸體供者器官移植中是導致移植失敗的首要原因。
綜上所述，組織交叉配型在器官移植前，對受者體內(nèi)已經(jīng)存在的CFAbs測定，是決定器官移植成敗的關(guān)鍵因素之一；在器官移植后，是監(jiān)測受者有無免疫排斥的重要指標；同時，對接受移植后受者的病情轉(zhuǎn)歸具有預測作用。
目前，國際上普遍使用的上述測定HLA抗體的各種方法，均不能充分滿足以上要求。因此，建立一種簡便快速、準確、靈敏、特異、穩(wěn)定的CFAbs測定的標準化方法成為器官移植中的迫切需要。
本發(fā)明根據(jù)CDC效應的基本原理，在免疫酶學反應方法學基礎(chǔ)上，建立了一種通過測定CFAbs固定補體量實現(xiàn)對CDC效應評估的測量方法。由于CFAbs結(jié)合相應細胞HLA抗原和固定補體為CDC效應的最初始階段，而CFAbs固定補體的量與CDC效應強度(細胞死亡)具有直接正相關(guān)關(guān)系；因此，測定CFAbs的補體固定量可直接用于CDC效應的評估。同時，本方法在反應系統(tǒng)中引入針對細胞表面特征性抗原的固相抗體，用于識別、分離特定的細胞群，可選擇性地在多種細胞混合反應體系中對發(fā)生在某種特定細胞群體的CDC效應進行測定。這種CFAbs測定方法摒棄了現(xiàn)存各種HLA抗體測定方法的多種缺陷，具有高靈敏度，高特異性以及經(jīng)濟、簡便、快速等獨到特點。
*相關(guān)文獻1、Patel R，Terasaki PI.，N Engl J Med 1969；280735-92、Garovoy MR，et al.，Transplant Proc 1983；151939-413、Christiaans MH，et al.，Transplantation 1996；151341-13474、Karuppan ss，et al.，Transplantation 1992；53666-6735、Chia D，et al.，Tissue Antigens 1991；3749-556、(lgA)Koka P.，Transplantation 1993；56207-211*相關(guān)專利


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)CDC效應的基本原理，在免疫酶學反應方法學基礎(chǔ)上，建立了一種通過測定CFAbs固定補體量實現(xiàn)對CDC效應評估的測量方法。由于CFAbs結(jié)合相應細胞HLA抗原和固定補體為CDC效應的最初始階段，而CFAbs固定補體的量與CDC效應強度(細胞死亡)具有直接正相關(guān)關(guān)系；因此，測定CFAbs的補體固定量可直接用于CDC效應的評估。同時，本方法在反應系統(tǒng)中引入針對細胞表面特征性抗原的固相抗體，用于識別、分離特定的細胞群，可選擇性地在多種細胞混合反應體系中對發(fā)生在某種特定細胞群體的CDC效應進行測定。這種CFAbs測定方法摒棄了現(xiàn)存各種HLA抗體測定方法的多種缺陷，具有高靈敏度，高特異性以及經(jīng)濟、簡便、快速等獨到特點。本發(fā)明所建立CFAbs免疫測定方法及試劑盒包括以下主要組成部分(一)固相成分根據(jù)固相方式及成分不同可有如下選擇1、固相抗體可直接將針對細胞表面抗原(如CD抗原系列等)受體或結(jié)合在細胞表面的其它成分(如抗體、補體等)連接在微孔板表面，借以捕獲分離特定細胞。對該細胞表面的CFAbs進行測定。亦可將上述成分連接在磁珠表面，以磁鐵吸附磁珠達到對特定細胞的選擇性分離。
2、固相抗原主要是指經(jīng)純化的HLA抗原；將已知型別(如HLA-A、B、C、D(DR、DQ、DP)及其亞型等)或HLAI型或/和II型的混合HLA抗原連接在微孔板或固相顆粒(如塑料、多聚化合物、磁顆粒等)表面，作為CFAbs結(jié)合的靶物質(zhì)成分。(二)信號放大檢測系統(tǒng)1、示蹤標記物通常為各種標記的配體、抗體或補體成分，尤其是指酶學標記(HRP、AP等氧化酶)。
2、酶學底物或化學發(fā)光劑通常為HRP，AP等氧化酶的相應底物，如OPD，4-CN，ABTS，PNPP，TMB等；或可利用上述酶作為化學發(fā)光(魯米諾及其衍生物)、生物發(fā)光的催化劑和其它發(fā)光增強劑共同催化、增強化學發(fā)光信號，以獲得CFAbs檢測的高靈敏度。(三)對照樣品1、陽性對照根據(jù)具體檢測要求設(shè)定，通常為含已知HLA型別CFAbs的單份血清或混合血清；該血清也可根據(jù)需要進行適當稀釋。陽性對照一般設(shè)3個劑量點，分別位于標準曲線的高、中、低三個劑量區(qū)。
2、陰性對照通常為正常人男性，AB血型，從未接受過輸血、器官移植的個體血清；該血清來源可為同一個體或多個個體的混合血清。(四)標準品由一系列(一般為5-6個)已知含量的CFAbs血清制成。在完成檢測后；以該系列的檢測信號值(如OD值；發(fā)光單位等)為縱坐標對CFAbs劑量值(橫座標)制作標準曲線；作為樣品CFAbs含量定量計算依據(jù)，給出更為精確的結(jié)果。(五)其它包括洗滌緩沖液、樣品稀釋液、反應容器(如試管、微孔板等)、檢測藥盒說明書等其它與檢測有關(guān)的材料、物品。
本發(fā)明根據(jù)免疫學CDC的發(fā)生原理，即CDC發(fā)生必須由HLA抗體結(jié)合于相應的靶細胞，繼而固定第一種補體成分激活補體的經(jīng)典途徑或/和旁路途徑，在一系列酶和多種因子的參與下，發(fā)生補體激活的級聯(lián)反應，直至形成膜攻擊物(MAC)，使生物細胞膜受損，形成小孔導致細胞內(nèi)滲透壓降低，細胞溶解、死亡。由于CFAbs固定補體的相對數(shù)量與樣品中CFAbs濃度及CDC效應程度成直接正相關(guān)關(guān)系，因此，測定HLA-CFAbs固定補體的水平或測量補體活化途徑中任一因子或補體本身及其復合物，一方面可直接反映HLA-CFAbs的有無或相對濃度；另一方面可間接反映CDC效應或細胞損傷、死亡的相對程度及數(shù)量。
由于本發(fā)明測定的對象為CDC發(fā)生最初始階段的HLA-CFAbs-補體復合物成分，因此該方法需要的反應時間相對現(xiàn)存的方法為最短。
由于本發(fā)明方法學中的信號檢測可根據(jù)實際應用需要，采用酶學、熒光、化學發(fā)光、時間分辨發(fā)光、電致發(fā)光、生物發(fā)光甚至發(fā)射性同位素等作為示蹤信號放大檢測手段，因此具有極高的靈敏度。
由于本發(fā)明利用受者自身血清中存在的補體作為反應測量對象，且反應系統(tǒng)主要組成部分為受者血清成分和供者細胞；因此，最能真實地模擬受者體內(nèi)的生理內(nèi)環(huán)境。
由于血清中CFAbs及補體成分在低溫狀態(tài)下，活性能得以長期保存(至少數(shù)年)，因此本方法具有方法學上的穩(wěn)定性以及很好的可重復性。
由于本方法采用“雙識別系統(tǒng)”；即可利用針對同一靶細胞上兩種不同抗原成分的特異性抗體；同時達到對特定靶細胞的鑒別選擇和示蹤作用如利用針對靶細胞抗原1(細胞特征性CD抗原)的固相抗體達到對靶細胞的鑒別、分離；利用針對靶細胞抗原2(HLA抗原或補體)的標記抗體作為CFAbs的示蹤信號檢測手段，實現(xiàn)了對特定靶細胞鑒別、分離和CFAbs信號檢測的同步進行，從而簡化了實驗步驟和縮短了實驗周期，提高了方法學的檢測特異性。
由于本發(fā)明的CFAbs測定法可利用最為常見的ELISA方法作為檢測“技術(shù)平臺”，不需要其他復雜昂貴的儀器設(shè)備(如流式細胞儀等)，方法學簡便容易掌握，故具有其成本低廉，實用性強的特點且能在短時間內(nèi)完成大樣本的同時測定。
本發(fā)明根據(jù)CDC效應的發(fā)生原理，以免疫反應方法學為基礎(chǔ)，結(jié)合酶學顯色或發(fā)光信號的高靈敏度檢測特點，建立了通過測定靶細胞表面或固相靶物質(zhì)表面補體固定量的CFAbs測定法。由于CDC發(fā)生過程中從CFAbs結(jié)合細胞表面HLA抗原、補體固定、激活到可被體外測量的CDC終末效應-細胞死亡出現(xiàn)，需要較長時間，而本發(fā)明通過測定CDC最早期(初始誘發(fā)效應)階段所形成的HLA-CFAbs-補體復合作為評價樣品中CFAbs水平以及CDC效應程度的指標；因此縮短了檢測周期，顯著提高了方法學的穩(wěn)定性和靈敏度。由于本方法以最為普通應用的酶聯(lián)免疫方法學作為基礎(chǔ)，具有操作簡便，不需特殊儀器設(shè)備和專門培訓技術(shù)人員的優(yōu)點；本發(fā)明的另一顯著特點是能利用樣品本身含有的補體成分，模擬生物體內(nèi)生理微環(huán)境，通過測定HLA CFAbs固定補體的早期免疫學結(jié)合效應反映CDC免疫生物學的終末效應，并能同步對多種細胞混合樣品中的某一特定細胞群進行選擇性分離，達到對發(fā)生在該特定細胞群體CDC效應的測量。同時，該方法可在短時間內(nèi)完成大樣本CFAbs的同時測定。發(fā)明中所建立的CFAbs測定方法或試劑盒具有國際上現(xiàn)存所有其它方法所不具有的獨特優(yōu)點。因此，以上方法及其試劑盒可廣泛應用于取代HLA傳統(tǒng)血清學細胞毒性反應測定，如血清學HLA分型(Serology HLA Typing)；HLA交叉配體(HLA Cross Match)，群體反應性HLA抗體測定(Panel Reactive Antibodies，PRA)以及ABO血型配型等多種血清學方法；同時，也可直接應用于對樣品中CFAbs的水平測定，為生物醫(yī)學中CDC免疫學效應的評估以及補體生物活性、補體激活機制研究提供一種經(jīng)濟、快速、簡便、靈敏的特異性方法。
具體實施例方式
例一T淋巴細胞HLA交叉配型細胞酶聯(lián)免疫學方法(Cellular ELISA；CELISA)(一)在反應系統(tǒng)中加入一定量抗CD3抗體包被的免疫磁珠、供者的有核細胞、受者的血清或血漿混勻。(二)在一定溫度條件下溫育一定時間(30分鐘-3小時)，此時如受者血清或血漿中存在CFAbs，可與供者有核細胞表面的HLA結(jié)合繼而固定受者樣品中自身的補體C1q或C3分子；形成HLA-CFAbs-C1q三聯(lián)復合物，與此同時，磁珠固相的抗人CD3抗體特異性地與T淋巴細胞表面的CD3分子結(jié)合。(三)以磁鐵與反應容器外部接觸，形成一有效磁場通過吸附免疫磁珠對T淋巴細胞進行吸附分離，吸棄未被吸附的其它細胞成分和液相成分。(四)以含一定量蛋白的緩沖液如含2％BSA的磷酸緩沖液對分離的T淋巴細胞進行洗滌，進一步去除殘留的其它細胞成分和非特異蛋白成分。(五)移去磁鐵，將分離的T淋巴細胞混懸于含有一定量HRP標記的抗C1q或C3抗體(HRP-C1qAb或HRP-C3Ab)的緩沖液中，繼續(xù)溫育(條件同步驟二)；此時HRP-C1qAb與步驟(二)中“三聯(lián)復合物”的C1q或C3結(jié)合形成“四聯(lián)復合物”。(六)重復步驟(三)(四)，去除游離的HRP-C1qAb或HRP-C3Ab；并將細胞小心懸浮在小量緩沖液中。(七)在上述細胞懸液中加入一定量的HRP底物，由四聯(lián)復合物中的HRP催化顯色反應。(八)以酶標儀(ELISA Reader)對上述樣品進行光密度吸收值測量，獲得OD值(OpticalDensity)。(九)將樣品OD值與正常對照OD值進行比較；高出正常對照樣品上限OD值定義為T淋巴細胞HLA交叉配型陽性；反之定義為陰性。例二、B淋巴細胞HLA交叉配型CELISA方法(一)將例一步驟(一)中的抗CD3抗體包被的免疫磁珠改為抗人CD19或CD20抗體包被的免疫磁珠。其它成分相同。(二)同例一步驟(二)，但不同的是，磁珠固相的抗CD19或CD20抗體與B淋巴細胞表面的CD19或CD20分子結(jié)合。(三)同例一步驟(三-九)，但上述步驟中的T淋巴細胞均改為B淋巴細胞。說明1上述例一和例二以連接有不同CD抗體的免疫磁珠分離相應的T或B淋巴細胞，也可采用以CD抗體直接連接在微孔板上實現(xiàn)對T或B淋巴細胞的識別分離并對其細胞膜表面的CFAbs進行測定。說明2上述例一、例二中的HRP-C1qAb或HRP-C3Ab可替換為HRP-hlgGAb，對結(jié)合在T或B淋巴細胞表面的總lgG進行測量，達到對CFAbs和Non-CFAbs的同時測定。例三、HLA Class I/IICFAbs的ELISA測定方法(一)以一定濃度純化的HLA Class I或/和Class II抗原包被微孔板37℃溫育1-4小時或4℃過夜，吸棄包被液。(二)以含有一定量非特異性蛋白(如BSA，脫脂奶粉、小牛血清等)的緩沖液(封閉液)對微孔板進行封閉，時間、溫度同步驟(一)，然后吸棄剩余封閉液。(三)在相應微孔板內(nèi)分別加入陰性對照血清、陽性對照血清、本底緩沖液和受檢血清各50微升(也可為經(jīng)緩沖液稀釋后的血清)。(四)將上述微孔板置37℃或4℃溫育30分鐘-3小時或4℃過夜。(五)吸棄反應液，以含有一定濃度去垢劑(如吐溫-20；NP-40等)的洗滌液對微孔板各孔進行洗滌，通常洗滌3次，然后吸棄最后一次洗滌液。(六)在各孔里加入含有一定濃度HRP標記的抗人C1q抗體，繼續(xù)溫育，條件同步驟(四)。(七)重復步驟(五)。(八)在各孔內(nèi)加入一定量HRP的底物(如PNPP等)。(九) 以酶標儀對各孔的OD值進行測量，并收集、記錄結(jié)果。(十)結(jié)果判定如OD值大于正常值上限；則結(jié)果表示為HLA-Class I或/和Class II CFAbs檢測結(jié)果陽性；反之為檢測結(jié)果陰性。例四HLA-I或/和HLA-II免疫磁珠ELISA方法(一)在微孔板各孔中加入包被(或連接)有HLA-I或/和HLA-II抗原的磁珠。(二)同例三中步驟(三)、(四)(三)將微孔板置于一磁板上數(shù)分鐘；使免疫磁珠吸附在微孔底部或一側(cè)。然后吸棄液體部分；在各孔中加入洗滌液，然后重復上述磁板吸附和吸棄步驟2-3次，吸棄最后一次洗滌液。(四)同例三步驟(八)、(九)、(十)。例五群體反應性HLA CFAbs測定方法(CFAbs-PRA)(一)PRA板制備選擇已知多種HLA型別的細胞，按一定數(shù)目(0.01-3×106/孔)分別加入微孔板各孔；作為CELISA反應的靶細胞；或以純化的HLA各型別抗原分別包被微孔板或免疫磁珠作為固相反應材料。(二)在以上PRA板各孔里分別加入一定量的同一受檢樣品血清，與相應的靶細胞或固相靶抗原溫育；溫育條件同例三步驟(四)。(三)對上述細胞孔或固相HLA抗原孔進行洗滌；如細胞可采用離心；磁珠采用磁場分離；微孔板可直接洗滌等。(四)在上述各反應孔內(nèi)加入HRP-C1qAb或HRP-C3Ab繼續(xù)溫育(條件同上)，然后進一步洗滌(條件同上)。(五)在上述各反應中加入一定量HRP底物，然后對各孔進行OD值測定。(六)結(jié)果判定OD值高于正常值上限者判定為CFAbs陽性；然后計算陽性反應孔占總PRA反應孔數(shù)的百分率；計算公式如下CFAbs陽性孔數(shù)÷總PRA孔數(shù)×100＝(PRA％)例CFAbs陽性孔數(shù)為25；而總PRA孔數(shù)為50；則PRA％為50％。例六總HLA-I和HLA-II的CFAbs測定(一)以純化混合的HLA-I或/和HLA-II抗原包被微孔板或磁珠，然后依照上述舉例中的相應條件，可實現(xiàn)對總HLA-I或/和II的CFAbs測定。(二)HLA-I的CFAbs測定也可利用混合的人血小板作為固相HLA-I來源。(三)以上HLA-I或II抗原應包括在統(tǒng)計學上＞95％以上的HLA型別。例七HLA-B27的CFAbs測定(一)以純化的B27抗原包被微孔板或磁珠，然后依照上述舉例中相應條件，實現(xiàn)對B27的CFAbs測定。(二)已知B27型別的細胞亦可作為B27抗原的靶細胞來源，直接用于CFAbs的測定。
上述舉例僅為部分CFAbs測定方法的實際應用實例；因此，根據(jù)本發(fā)明的基本測定原理衍生出的其它方法應包含在發(fā)明所述及范圍之內(nèi)。
五

圖一檢測固定補體抗體的細胞ELISA方法，Tc/Bc HLA交叉配型法。圖二檢測固定補體抗體的免疫磁珠細胞ELISA方法，Tc/Bc HLA交叉配型法。圖三檢測固定補體抗體的ELISA方法，群體反應性抗體ELISA法。圖四檢測固定補體抗體的免疫磁珠ELISA方法，群體反應性抗體ELISA法。圖五細胞毒性抗體(CFAbs)和非細胞毒性抗體(Non-CFAbs)在CDC效應發(fā)生中的作用機制。
權(quán)利要求
權(quán)利要求
1、一種通過測定補體結(jié)合率達到對樣品CFAbs或CDC效應測定的免疫學方法及試劑盒。該方法或試劑盒包括以下內(nèi)容
2.在受檢樣品與相應的靶細胞或靶抗原的反應系統(tǒng)中，至少加入一種或一種以上與CDC效應過程有關(guān)或/和具有和靶細胞其它表面特性蛋白分子結(jié)合的標記配體或抗體成分。
3.權(quán)利要求1中CFAbs解釋為任何來源的具有固定或結(jié)合補體能力的抗體成分。
4.權(quán)利要求2中的標記配體或標記抗體解釋為以下兩類第一類直接或間接參與CDC反應的各種成分或/和其相應的抗體，其能反映CDC效應過程的任一階段或狀態(tài)。第二類能夠反映或鑒定靶細胞特征，或具有對靶細胞進行鑒別分類的各種配體或抗體成分。
5.權(quán)利要求4中的所述及的兩類配體或抗體可同時或單獨使用；但在反應測量系統(tǒng)中，必須包括至少一種標記配體或抗體，借以反映CDC的發(fā)生過程。
6.權(quán)利要求2中的CDC效應過程解釋為由具有固定補體作用的抗體和第一個補體成分結(jié)合于靶細胞或靶抗原開始到形成最終免疫復合物，或補體膜攻擊復合物(MAC；C5b-9)至細胞死亡的全過程。
7.權(quán)利要求2中，受檢樣品包括任何一種可能含有CFAbs的生物樣品；包括人、動物的所有體液成分；例血清、血漿、腦脊液、脊髓液、羊水、唾液、尿液等。
8.權(quán)利要求2中，靶細胞解釋為任何一種能與CFAbs結(jié)合的經(jīng)人工處理或天然存在的真核或原核生物細胞以及血液有形成分例人類細胞(紅細胞、白細胞、各種組織細胞、各種干細胞等)、血小板、動物細胞、昆蟲細胞、微生物、細菌等。
9.權(quán)利要求8中的“人工處理”進一步解釋為經(jīng)分子生物學方法改變細胞遺傳特征或細胞生物學方法改造的細胞(如基因重組、轉(zhuǎn)基因、細胞融合、體外培養(yǎng)的細胞系等)。
10.權(quán)利要求4中的“人工處理”進一步解釋為包括經(jīng)化學、生物和物理方法處理的無生物活性的靶細胞(如化學試劑固定、物理冷凍干燥等)。
11.權(quán)利要求2中，靶抗原成份解釋為任何能與CFAbs結(jié)合的生物抗原成份；尤其是指以固相形式存在的抗原。例通過化學方法連接或直接通過物理吸附包被在固相顆粒表面的多種HLA成分或其它抗原成分等。
12.權(quán)利要求2中的靶抗原成分進一步解釋為通過化學、生物物理方法合成、生物合成、分子生物學方法重組、修飾或經(jīng)純化天然存在的任何生物抗原成分及其多肽、多肽片段、蛋白分子等。
13.權(quán)利要求2中的標記抗體解釋為抗CDC效應過程中所有參與成分(如抗HLA抗體、補體及其復合物、各種因子、受體等)的抗體；以及特異性抗靶細胞抗體和抗固相顆粒表面HLA靶抗原的抗體。
14.權(quán)利要求2中標記抗體或標記配體的標記解釋為能被相應儀器所測定的任何酶學顯色反應、化學發(fā)光反應、生物發(fā)光反應、時間延遲發(fā)光反應、電致發(fā)光反應、多種熒光物質(zhì)以及放射性同位素標記等。
15.權(quán)利要求2中的細胞表面特性蛋白解釋為任何能夠反映該類細胞特性的蛋白成分如細胞表面的各種受體和抗原成分(如血型抗原ABO系統(tǒng)等)、淋巴細胞表面抗原、白細胞表面抗原、各種CD抗原、HLA抗原等。
16.權(quán)利要求2中的靶抗原、配體以及抗體成分進一步解釋為以液相形式或固相形式存在于反應系統(tǒng)之中如配體或抗體通過直接(或間接)物理吸附或化學連接到固相材料上；如微孔板、膜、固相顆粒等任何有形材料。
17.權(quán)利要求2中的標記配體進一步解釋為C1(C1q、C1r、C1s、)、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9；C1qrs、C1qrs、C2a、C2b、C3a、C3b、C4a、C4b、C4b2、iC3b、C4b2b、C4b2b3b、C3bBb、C3bnBb、C5a、C5b、C5b67、C5b∽8、C5b∽9；C1-抑制因子、C4-結(jié)合蛋白、D因子、B因子、P因子(備解素)、I-因子、H-因子、S-蛋白；Ba、Bb、MBP、MCP、DAF(CD55)、CR1、CR2、CR3、CR4、CR5、C3aR、C2aR、C4aR、C1qR、CD59等。
18.權(quán)利要求2中的標記配體來源解釋為人源性、動物源性以及天然存在的經(jīng)純化或未經(jīng)純化的或通過化學合成、分子生物學方法獲得的各種直接或間接參與CDC反應的各種成分。
19.權(quán)利要求2中的標記抗體解釋為任何來源的單克隆和多克隆抗體的完整分子及其片段，包括人源性、動物源性、植物源性或通過基因工程方法獲得的完整抗體分子、嵌合抗體分子(Chimeric Abs)、單鏈抗體分子及其片段如F(ab’)2、Fab、Fv、Facb、F(abc’)2、ScFv等。
全文摘要
本發(fā)明根據(jù)免疫學中補體依賴性細胞毒性(Complement－dependent Cytotoxcity，CDC)反應原理，建立了一種測定HLA補體依賴性細胞毒性抗體(Complement Fixing Antibodies；CFAbs)測定的體外酶聯(lián)免疫反應方法及試劑盒。該反應系統(tǒng)由固相的HLA抗原或具有HLA抗原的靶細胞以及液相酶標配體組成。受檢樣品中的CFAbs與固相HLA抗原或靶細胞的HLA抗原結(jié)合并同時固定存在于反應系統(tǒng)中的酶標記補體或以酶標抗補體抗體與固定于HLA抗原－CFAbs復合物中的補體結(jié)合，然后加入相應的酶底物產(chǎn)生酶學顯色反應；由于該顯色信號的強度與樣品中的CFAbs濃度呈正比關(guān)系，因此通過測定這種酶學顯色的光密度吸光值(Optical Density；OD)即可達到對樣品CFAbs有無及其相對含量的測量。在以細胞為基礎(chǔ)的反應系統(tǒng)中，引入針對細胞表面特征性標記(如CD等)的抗體，用以識別分離特定細胞群體，可實現(xiàn)對發(fā)生在該細胞群體CDC效應的特異性測量。
文檔編號G01N33/53GK1444044SQ0212407
公開日2003年9月24日 申請日期2002年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月18日
發(fā)明者陳格 申請人:帕弗瑞生物技術(shù)(北京)有限公司