專利名稱：衍生自免疫球蛋白的不觸發(fā)補體介導(dǎo)的裂解的結(jié)合分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有衍生自修飾的免疫球蛋白G(IgG)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列的結(jié)合多肽。本發(fā)明進一步涉及產(chǎn)生這樣的多肽的方法和材料，以及使用這些多肽的方法和材料。
先有技術(shù)免疫球蛋白免疫球蛋白是有助于保護宿主抵抗感染的糖蛋白。它們通常由重鏈和輕鏈組成，重鏈和輕鏈的N端區(qū)形成能夠結(jié)合抗原的可變區(qū)或V區(qū)。V區(qū)與確定免疫球蛋白類型(有時為亞類[同種型]和同種異型[異種型(isoallotype)])的恒定區(qū)或C端區(qū)相締合。
這樣在哺乳動物物種中免疫球蛋白以IgD、IgG、IgA、IgM和IgE存在。在人類中IgG類依次以四個亞類存在(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。IgG的C區(qū)包含三個區(qū)Cγ1、Cγ2和Cγ3，它們在這些亞類之間都非常相似(超過90％同源性)。Cγ1和Cγ2區(qū)通過鉸鏈區(qū)連接。所述亞類的作用在物種之間似乎有變化。
已知C區(qū)決定著所述免疫球蛋白的各種效應(yīng)子功能(參見Clark(1997)“Antibody Engineering”中的“IgG效應(yīng)子機制”的詳細論述，Capra編輯，Chem Immunol，Basel，Kurger出版，第65卷，88-110頁)。
簡而言之，IgG功能一般通過Ig的Fc區(qū)和往往在效應(yīng)細胞上的Fcγ受體(FcγR)或其它結(jié)合分子的相互作用實現(xiàn)。這可以觸發(fā)所述效應(yīng)細胞殺傷所述靶細胞，所述抗體通過其可變(V)區(qū)結(jié)合所述靶細胞。此外，抗可溶性抗原的抗體可以形成為針對FcγR的免疫復(fù)合物，導(dǎo)致吸收(調(diào)理)所述免疫復(fù)合物，或?qū)е掠|發(fā)所述效應(yīng)細胞和釋放細胞因子。
盡管由于存在多種受體形式使情況更復(fù)雜，但已經(jīng)特征鑒定了人類的三類FcγR。這三類是(i)FcγRI(CD64)，它以高親和力結(jié)合單體IgG，并在巨噬細胞、單核細胞中以及有時在嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞上表達。
(ii)FcγRII(CD32)，它以中至低親和力結(jié)合復(fù)合IgG并廣泛被表達。這些受體可以分為兩個重要型FcγRIIa和FcγRIIb。
在許多涉及殺傷作用的細胞(例如巨噬細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞)中發(fā)現(xiàn)了所述受體的‘a(chǎn)’形式，它似乎能夠激活殺傷過程，并以兩個可選擇的等位基因的形式出現(xiàn)。
所述‘b’形式似乎在抑制過程中起作用，并在B細胞、巨噬細胞中和在肥大細胞和嗜酸性粒細胞上發(fā)現(xiàn)。在B細胞上它似乎起抑制更多的免疫球蛋白產(chǎn)生和向估計例如為IgE類的同種型轉(zhuǎn)換的作用。在巨噬細胞上，所述b形式起抑制由FcγRIIa介導(dǎo)的吞噬作用。在嗜酸性粒細胞和肥大細胞上，所述b形式可能通過IgE結(jié)合其單獨的受體有助于抑制這些細胞的活化。
(iii)FcγRIII(CD16)，它以中至低親和力結(jié)合IgG并以兩個型存在。FcγRIIIa發(fā)現(xiàn)于NK細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和某些單核細胞以及T細胞，并介導(dǎo)ADCC。FcγRIIIb高度表達于嗜中性粒細胞。這兩個型都具有不同的同種異型形式。
除了結(jié)合FcγR之外，IgG抗體還可以激活補體，而這還可以導(dǎo)致細胞裂解、調(diào)理或?qū)е录毎蜃俞尫藕脱装Y。所述Fc區(qū)還介導(dǎo)諸如運送IgG至新生兒(通過所謂的‘FcRn’)；增加半壽期(據(jù)認為也是通過FcRn型受體實現(xiàn)-參見Ghetie和Ward(1 997)Immunology Today 18，592-598)和自聚集的特性。所述Fc區(qū)還是A蛋白和G蛋白相互作用(所述相互作用似乎與FcRn的結(jié)合類似)的原因。工程免疫球蛋白上文論述的許多Fc介導(dǎo)的特性可能需要天然產(chǎn)生或人工構(gòu)建的抗體。然而，存在不適宜和不良的情況，特別是細胞殺傷或細胞因子釋放以及產(chǎn)生的炎癥。
然而，同樣地可能需要保留某些Fc介導(dǎo)的功能，例如長血漿半壽期。
已知例如人IgG4不激活補體，而人IgG2不結(jié)合高親和性的FcγRI受體，所以以前在某些情況下已經(jīng)使用這些免疫球蛋白(用IgG4 Fc制備TNF受體融合蛋白)。
然而，沒有人類亞類在所有情況下缺乏所有的Fc相關(guān)效應(yīng)子觸發(fā)功能或補體激活，可能是由于存在幾種形式的FcγR。因此，例如IgG4可以在某些人中觸發(fā)依賴抗體的細胞毒性(ADCC)，而IgG2結(jié)合一種等位基因型FcγRIIa受體且也激活補體。
突變Fc序列的一個可選方法是置換決定功能的殘基。已經(jīng)鑒定和公開了某些靶殘基(參見上述的Clark 1997的論述)。這些靶殘基包括連接在N端的附著于CH2域保守位點的糖類、在鉸鏈區(qū)下位(例如序列ELLGGP)的某些殘基和在位置331的脯氨酸殘基以及在位置318-322的序列E-x-K-x-K。Cole等(1997)Journal of Immunology 159，3613-3621公開了一個最新的例子。在其公開內(nèi)容中殘基234、235和237突變?yōu)楸彼?或235有時突變?yōu)楣劝彼?。然而，這些殘基都是在人IgG中的這些位置上罕見的殘基，因此這些不適宜的氨基酸的存在可能使Fc免疫原性或抗原性更強，并還可能導(dǎo)致某些需要的Fc功能喪失。
再者，此策略已經(jīng)用于構(gòu)建治療性非糖基化(aglycosylated)CD3抗體(參見Routledge等人，1993 Eur J Immunol 23403-411；也參見UKPA 9206422.9)和用于抑制性CD18抗體。然而，關(guān)于該策略的一個缺點是新的重組構(gòu)建物具有與眾不同的序列，可能被免疫系統(tǒng)識別為異源物質(zhì)并排斥。非糖基化抗體也不能結(jié)合抑制性受體FcγRIIb，然而保留這種結(jié)合可能有利于某些用途。
在WO 92/16562(Lynxvale Ltd)中公開了修飾免疫球蛋白的其它方法，該專利論述了對與抗原CD52具有結(jié)合親和性的人源化IgG1抗體CAMPATH1H的同種異型的修飾。CD52抗原發(fā)現(xiàn)于人淋巴細胞和單核細胞，并已經(jīng)用作治療T和B細胞淋巴瘤和白血病、器官和骨髓移植受體的免疫抑制以及治療諸如類風濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)結(jié)節(jié)性脈管炎的某些自身免疫和相關(guān)疾病的治療靶。
WO 95/05468(Lynxvale Ltd)還公開了對具有需要的結(jié)合或其它效應(yīng)子功能的Ig(或衍生物)中的同種異型決定簇的修飾。
由前述可以看出，提供可能使Fc區(qū)的工程改造(諸如減少不需要的作用，同時保留或增強需要的特性)易化的方法和材料，應(yīng)是對本領(lǐng)域的一種貢獻。
發(fā)明公開本發(fā)明人已使用新組合的人IgG亞類序列產(chǎn)生包含模擬人的非天然Fc序列的嵌合多肽，不過它不激活補體或通過FcγR觸發(fā)細胞毒性活性。同時保留了某些需要的IgG特性。例如所述多肽不包含‘非人類’氨基酸，并很可能因此降低了免疫原性。此外，它們?nèi)匀唤Y(jié)合A蛋白，這與它們能夠通過與FcRn(新生兒Fc受體)的相互作用穿越人胎盤一致。
下文將更詳細論述研制出所述序列的方法和某些證明了的特性。但簡而言之，本發(fā)明人基于三種不同的IgG序列(1、2和4)制備了眾多構(gòu)建物。盡管這些抗體的相關(guān)區(qū)具有同源性，但它們不是精確地按照長度對應(yīng)，從而使產(chǎn)生保留天然序列活性的衍生序列的過程復(fù)雜化。將構(gòu)建的抗體和親代對照抗體進行典型抗原系統(tǒng)RhD(Fog1)和CD52(CAMPATH-1H)方面的比較。令人驚訝的是，研究出的許多序列具有在所述親代分子中沒有發(fā)現(xiàn)的所需活性組合。一般來說，這些序列包含一個或多個含有修飾(一般為2、3或4個氨基酸)的區(qū)或區(qū)段，所述修飾與不同亞類的相應(yīng)區(qū)一致。兩個具體的目的區(qū)或區(qū)段是233-236和327，330，331。
因此在本發(fā)明的第一個方面公開了一種多肽結(jié)合分子，它包含(i)能夠結(jié)合靶分子的結(jié)合域，和(ii)具有與人免疫球蛋白重鏈的全部或部分恒定區(qū)大致同源的氨基酸序列的效應(yīng)子域；它的特征在于所述結(jié)合分子能夠結(jié)合所述靶分子，而不觸發(fā)明顯依賴于補體的裂解或細胞介導(dǎo)的對所述靶的破壞，因此所述效應(yīng)子域優(yōu)選能夠特異性結(jié)合FcRn或FcγRIIb，更優(yōu)選能夠特異性結(jié)合FcRn和FcγRIIb。
能夠特異性結(jié)合A蛋白可以證明特異性結(jié)合FcRn。
因此按照本發(fā)明的結(jié)合分子已提高了臨床特性(例如在‘封閉’抗體方面)。這可以通過提供衍生自Fc區(qū)的效應(yīng)子域?qū)崿F(xiàn)，所述效應(yīng)子域?qū)cγRI、FcγRIIa和FcγRIII的親和性降低，但保留了結(jié)合A蛋白(并因此結(jié)合FcRn，從而允許新生兒性轉(zhuǎn)運和高半壽期)和/或FcγRIIb的能力。因此在本發(fā)明所述分子中，不需要修飾IgG中相對于天然Fc區(qū)的決定結(jié)合FcRn的殘基。
在優(yōu)選的實施方案中，所述效應(yīng)子域?qū)κ荏wFcγRI的親和力一般降低(與由其衍生的一個Fc區(qū)比較)約100倍或更高倍數(shù)。對于以上論述的某些較低親和力的受體而言，所述親和力的降低可以少于例如2-10倍左右，盡管在最優(yōu)選的實施方案中它可以高達500倍。一般而言，在化學(xué)發(fā)光測定(在下文更詳細描述)中活性的相應(yīng)降低可以有30-300倍高。補體活性可降低約50倍。ADCC的相應(yīng)值可以更高，例如10,000倍。然而本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將意識到，組合這些(降低的)活性仍可以對某些用途有益，而不管降低的精確水平。
盡管在過去已經(jīng)制備了IgG1/IgG2和IgG1/IgG4嵌合體(參見例如Morgan等(1995)Immunology 86319-324，或Chappel等(1991)ProcNtal Acad Sci美國889036-9040，或Greenwood等(1993)Eur JImmunol 231098-1104)，但它們之中沒有一個顯示具有本發(fā)明所述結(jié)合分子具有的組合特性。
例如使用下文公開的方法或與其類似的方法可以評價所述結(jié)合分子的各種功能，這對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言不是問題。例如，可以直接或例如通過不能觸發(fā)單核細胞化學(xué)發(fā)光間接評價FcγR結(jié)合特性。
具體而言，在所述補體組分例如以血清形式(如下文所述)存在的情況下，通過由靶細胞釋放的CR-51可以檢測不觸發(fā)明顯依賴于補體的裂解的能力(它一般是通過降低C1q分子的親和力)，由此所述結(jié)合分子引起少于5％最好少于2％的特異性靶細胞裂解。
同樣，在合適的細胞毒性細胞例如血液單核效應(yīng)細胞(如下文所述)存在的情況下，通過由靶細胞釋放的CR-51可以評價細胞介導(dǎo)的對所述靶的破壞，由此所述結(jié)合分子引起少于5％最好少于2％的靶細胞裂解。
作為可選的直接檢測，可以通過抑制功能性免疫球蛋白的這些特性的能力推斷功能性。例如通過提供抗補體裂解細胞或殺傷細胞(例如通過ADCC)的保護性作用或通過抑制單核細胞對致敏細胞的應(yīng)答來推斷。
在本發(fā)明這方面的一個優(yōu)選實施方案中，所述效應(yīng)子域包含與人IgG1、G2或G4的CH2序列大致同源的氨基酸序列，所述序列在指出的位置包含一個或多個以下修飾(氨基酸置換或缺失)，所述位置根據(jù)EU編號系統(tǒng)編號(參見Kabat等“Sequence of proteins ofimmunological interest”.Bethesda，US Department of Health and HumanServices，NIH，1991)位置氨基酸233 P234 V235 A236 (無殘基)或G327 G330 S
331 S在優(yōu)選的實施方案中，這些置換在‘區(qū)段’233-236和/或327，330，331中產(chǎn)生。因此在所述CH2域中的突變區(qū)將與為置換的殘基來源的亞類100％同源，從而減少了所述區(qū)代表免疫系統(tǒng)的B細胞或T細胞表位的可能性。
已經(jīng)制備了幾個基于IgG1、IgG2或IgG4的具有所述特征的突變免疫球蛋白，并已經(jīng)顯示它們具有需要的特征。盡管在先有技術(shù)的結(jié)合分子中已經(jīng)制備了一些單個殘基突變，但具體的組合是新的，同時實現(xiàn)了新的功能性。
現(xiàn)在將更詳細論述所述結(jié)合分子的優(yōu)選形式效應(yīng)子域所述肽包含具有與人免疫球蛋白恒定區(qū)(優(yōu)選IgG的C區(qū))的全部或部分大致同源的氨基酸序列的效應(yīng)子域。
已經(jīng)公開了人C區(qū)的許多序列；參見例如上文所述的Clark(1997)。使用Lasergene軟件(DNAStar Limited，倫敦，英國)，根據(jù)人Igγ-1鏈C區(qū)的登記號A93433、B90563、A90564、B91668、A91723和A02146，人Igγ-2鏈C區(qū)的登記號A93906、A92809、A90752、A93132、A02148，人Igγ-4鏈C區(qū)的登記號A90933、A90249、A02150和人Igγ-3鏈C區(qū)的登記號A23511，可由SwissProt和PIR數(shù)據(jù)庫中獲得人免疫球蛋白重鏈的其它序列。
可以通過任何常規(guī)方法評價同源性(或同一性，或相似性)。同源性可以是編碼核苷酸序列水平或編碼的氨基酸序列水平?！按笾峦础笔侵杆陌被嵝蛄信c參照免疫球蛋白具有至少約50％、或60％、或70％、或80％同源性，最優(yōu)選至少約90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性。
可以由Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的TBLASTN程序定義和測定相似性或同源性，該程序是本領(lǐng)域的標準用法，或者可優(yōu)選標準程序BestFit，它是Wisconsin Package，版本8，1994年9月，(Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，美國，Wisconsin 53711)的一部分。BestFit使兩個序列之間相似性最好的節(jié)段最適宜排列。使用Smith和Waterman的局部同源性算法，通過插入間隙使匹配數(shù)最大獲得最適宜排列。
為了識別本發(fā)明的分子，可以進行該評價和評價需要的組合活性，這對本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員而言不是問題。
除了對FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和FcγRIIIb的親和力降低之外，還可能需要通過所述效應(yīng)分子保留或具有結(jié)合所述‘抑制性’受體FcγRIIb的能力至某種程度，優(yōu)選高于其對FcγRIIa受體的親和力，更優(yōu)選與衍生其的親代Ig域的結(jié)合能力一樣。本發(fā)明人獲得的結(jié)果表明，他們已經(jīng)研究出的結(jié)合分子確實具有這種特性。至今本領(lǐng)域仍未認識到Fc區(qū)與FcγRIIa和FcγRIIb的結(jié)合可以單獨操作。這種能力可以補充在增加所述結(jié)合分子的治療可能性方面的其它需要的功能(如結(jié)合A的能力所表明)。
尤其是許多出版物強調(diào)，F(xiàn)cγRIIb在抑制細胞進程中可能起重要作用(參見Daeron等，1995 Immunity 3(5)635-46；Van den Herik等，1995 Blood 85(8)2201-11；Sarmay等，1996 Immunol Lett 54(2-3)93-100；Fong等，1996 Immunol Lett 54(2-3)83-91；Sarmay等，1996 J BiolChem 271(48)30499-504；Unkeless和Jin，1997 Curr Opin Immunol9(3)338-43；Isakov，1997 Immunol Res 16(1)85-100；Hunter等，1998Blood 91(5)1762-8；Malbec等，1998 J Immunol 160(4)1647-58；Clynes等，1999 J Exp Med 189(1)179-85)。這些研究者表明，F(xiàn)cγRIIb當與其它受體交聯(lián)時，可以抑制來自它們的信號，從而抑制諸如B細胞活化、肥大細胞脫顆?；蚓奘杉毎淌傻倪^程。
因此保留該活性的本發(fā)明的結(jié)合分子不僅可用于競爭和競爭性抑制不需要的抗體-抗原(諸如自身抗原或同種抗原)相互作用，而且例如通過抑制B細胞活化防止生產(chǎn)更多的自身抗原或同種抗原，用于非競爭性抑制所述過程。下文論述了涉及變態(tài)反應(yīng)和哮喘治療(抑制肥大細胞脫顆粒)和抗-RhD分子(抑制吞噬)的所述抑制性作用的其它應(yīng)用實例。
所述效應(yīng)子域本身優(yōu)選衍生自人免疫球蛋白恒定區(qū)，更優(yōu)選衍生自IgG的C區(qū)。
所包含的氨基酸序列最好與人IgG1、G2或G4的具有以上論述的修飾的氨基酸的CH2序列(即大約殘基231-340)大致同源。
最優(yōu)選的CH2序列示于

圖17，特別是那些分別稱為G1Δab、G2Δa或G1Δac的序列。
這些序列中的任一個都可與天然或修飾的CH3和天然或修飾的鉸鏈區(qū)加上可選的CH1、本發(fā)明所述分子中的序列組合(例如連續(xù)連接)。
然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到，所述效應(yīng)子域的其它部分(或所述分子的其它域)不需要包含天然序列，特別是其可能需要組合本文公開的修飾序列和例如選自文獻的其它序列，只要保留需要的活性。所述技術(shù)人員將意識到，包含這種另外修飾(例如通過氨基酸添加、插入、缺失或置換)的效應(yīng)子域的結(jié)合分子屬于本發(fā)明的范圍。
特別優(yōu)選的可是“無效同種異型”序列，諸如衍生自IgG重鏈的序列(參見WO 92/16562)，其中同種異型殘基突變?yōu)樵谄渌薎gG亞類分子中發(fā)現(xiàn)的匹配殘基。這可使任何個體將所述序列看作外源的可能性減至最低。結(jié)合域和靶分子所述肽分子包含能夠結(jié)合靶分子的結(jié)合域。
所述結(jié)合域具有與靶分子相互作用的能力，所述靶分子最好為另一種多肽，但可以是任何靶(例如碳水化合物、脂質(zhì)(諸如磷脂)或核酸)。所述相互作用最好是特異性的。所述結(jié)合域可以與所述效應(yīng)子域衍生自相同的源或不同的源。
例如，盡管所述效應(yīng)子域通常衍生自抗體，但所述結(jié)合域可以衍生自對另一分子具有特異性的任何分子，例如酶、激素、受體(結(jié)合細胞或循環(huán))、細胞因子或抗原(其特異性結(jié)合抗體)。
所述結(jié)合域最好包含抗體或其衍生物的全部或部分，尤其是天然或修飾的抗體的可變區(qū)。因此，按照本發(fā)明的結(jié)合分子可以提供產(chǎn)生于嚙齒動物或camelidae(參見WO 94/25591)的抗體結(jié)合域和如上所論述的人免疫球蛋白重鏈。
還優(yōu)選具有超過一種類型的結(jié)合域的分子，諸如雙特異性抗體(參見例如PCT/US92/09965)。在這些情況下，一個‘臂’結(jié)合靶細胞，而另一個結(jié)合第二個細胞，以觸發(fā)對所述靶的殺傷作用。在這樣的情況下，可能需要對所述效應(yīng)子部分的影響減至最小，所述效應(yīng)子部分可能以另外的方式激活更多的細胞干擾所需的結(jié)果。所述‘臂’自身(即所述結(jié)合域)可以基于Ig域(例如Fab)或來自于其他蛋白，如在下文將更詳細論述的融合蛋白中。
所述結(jié)合分子可以包含一個以上的多肽鏈，所述多肽鏈例如以共價鍵或其它方式(例如疏水作用、離子相互作用或經(jīng)硫化橋連接)連接。例如它可以包含輕鏈連同含有所述效應(yīng)子域的重鏈?？梢允褂萌魏魏线m的輕鏈，例如在一般群體中為Km(3)的最普通的κ輕鏈同種異型。因此最好是可以使用該普通κ輕鏈同種異型，因為所述群體中相對較少的成員將其視為外源。
典型的所述靶是存在于細胞上的抗原，或所述抗體和可溶性配體競爭的受體。
可以選擇這些靶作為治療性靶，從而希望其與具有以上論述的特性的分子結(jié)合，例如與其競爭或從其中替換不需要的抗體。另一方面，最好其自身可以結(jié)合所述靶分子，而不引起細胞介導(dǎo)的破壞、抗體觸發(fā)的炎癥或補體裂解。同樣，所述效應(yīng)子域可主要在介導(dǎo)轉(zhuǎn)運和/或提高血清半壽期中起作用，在此情況下，所述結(jié)合域和靶分子可以是任何應(yīng)當受益于這些性質(zhì)的系統(tǒng)。
以下陳述了選擇性用途，其中本發(fā)明的結(jié)合分子可以用作具有惰性(在某些方面)Fc區(qū)的治療性抗體1)與母體IgG同種抗體競爭在胎兒/新生兒血細胞上的抗原表位胎兒血細胞的同種異體免疫失調(diào)具有共同的發(fā)病機理。由母親合成針對在胎兒紅細胞、粒細胞或血小板上的父性遺傳抗原的IgG同種抗體。接著經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運所述同種抗體。在胎兒或新生兒中，存在包被抗體的胎兒血細胞破壞，這可能導(dǎo)致臨床上明顯下降的相關(guān)細胞的循環(huán)水平。針對所述相關(guān)表位但具有不觸發(fā)破壞的Fc的治療性抗體可以與母體抗體競爭結(jié)合胎兒細胞，因此抑制它們的破壞。針對紅細胞同種抗原的抗體導(dǎo)致胎兒和新生兒溶血癥最重要的紅細胞同種抗原是Rh和Kell血型系統(tǒng)。因為引入了出生后預(yù)防，所以歸因于RhD抗原的溶血癥的發(fā)生率已經(jīng)顯著下降，但由于在初次妊娠期間母體敏化的病例仍有發(fā)生。其它的Rh抗原(C、c、E、e)也可以引起溶血癥，針對Kell(K1)抗原的抗體也可以，該抗體還損害胎兒骨髓中的紅細胞生成(erythopoiesis)。
目前對于嚴重受影響的胎兒的治療包括定時子宮內(nèi)輸入抗原陰性紅細胞。在此病癥中已經(jīng)表明輸注非特異性免疫球蛋白是無效的。在新生兒中的貧血和血膽紅素過高可能需要交換輸血法和/或光照療法。
使用具有RhD特異性的惰性Fc構(gòu)建物(稱為Fog-1)的實驗已經(jīng)證實它們不能觸發(fā)效應(yīng)子機制(通過化學(xué)發(fā)光和ADCC檢測單核細胞活化)，更重要的是也已經(jīng)表明抑制由包含多克隆抗-D的人血清觸發(fā)的化學(xué)發(fā)光和ADCC。先前已經(jīng)表明ADCC和化學(xué)發(fā)光預(yù)示體內(nèi)紅細胞破壞。先前出版的著作也已經(jīng)證實Fog-1能夠與大多數(shù)人抗-D血清競爭在RhD蛋白上的表位。針對血小板同種抗原的抗體導(dǎo)致胎兒和新生兒同種異體免疫性血小板減少最相關(guān)的抗原是人血小板抗原(HPA)-1a。HPA-1a抗體在350個正常妊娠者中使一個發(fā)病，并在1200個胎兒中導(dǎo)致1個胎兒發(fā)生嚴重血小板減少。影響最嚴重的病例造成顱內(nèi)出血或死亡。目前的治療選擇是每周輸入HPA-1a陰性血小板(該方法每一次都具有0.5％的胎兒死亡風險)和靜脈內(nèi)給予母親高劑量的免疫球蛋白，后一療法的功效變異性大且不可預(yù)測。HPA-1a的定義是在血小板糖蛋白IIIa(GPIIIa)上的單一表位，可由University of Cambridge Division ofTransfusion Medicine獲得識別此表位的單鏈FV(Griffin HM，OuwehandWH.對來自V基因噬菌體展示文庫的血小板糖蛋白IIIa的亮氨酸-33(PAA1，HPA-1a)形式特異性的人單克隆抗體.Blood 1995；864430-4436)。已經(jīng)表明人抗HPA-1a血清抑制基于所述構(gòu)建物的抗體與人血小板的結(jié)合。所述血清抑制與最嚴重疾病有關(guān)的最高效價特異性抗體的血清極其一致。這表明所述重組抗體和血清抗體結(jié)合在血小板上的相同表位。
在以上和下文的應(yīng)用中，除了競爭結(jié)合作用之外，本發(fā)明的治療性抗體還可以通過FcγRIIb引起有益的抑制性作用。2)與自身抗體競爭在自身抗原上的表位自身抗體介導(dǎo)的血細胞破壞熱型IgG自身抗體的溶血性貧血和自身抗體的血小板減少都具有共同的血細胞破壞機制。在這二者中，自身抗體以選定的自身抗原的所有組成部分(紅細胞上的Rh和K，以及在血小板上的GPIIb/IIIa、GPIb/IX/V)為靶。所述自身抗體的結(jié)合縮短了分別導(dǎo)致貧血或血細胞減少的血細胞的壽命。紅細胞和血小板自身抗體不大可能以在其各自自身抗原上的有限數(shù)量的B細胞表位為靶。采用V基因噬菌體展示技術(shù)可以產(chǎn)生抗這些表位的重組可變區(qū)抗體。針對相關(guān)表位但具有惰性Fc的治療性抗體可以和患者的血細胞自身抗體競爭結(jié)合所述自身抗原，由此抑制所述血細胞的破壞。Goodpasture綜合征(抗腎小球基底膜[GBM]疾病)該病是腎小球性腎炎快速發(fā)展的主要原因，在發(fā)病后的幾周或幾個月內(nèi)導(dǎo)致肺出血和末期腎衰竭。常規(guī)治療依賴于透析連同增強的血漿交換和免疫抑制療法，而免疫抑制治療本身可能并發(fā)威脅生命的機會真菌感染和病毒感染。有確鑿證據(jù)表明該疾病由自身抗體介導(dǎo)，已經(jīng)確定所述自身抗原位于GBM的主要組分IV型膠原蛋白中。已經(jīng)表明在GBM疾病中的自身抗體結(jié)合α3(IV)鏈的非膠原(NC1)域。編碼此序列的基因(COL4A3)已經(jīng)被克隆和測序。我們推測單克隆IgG競爭分子可以中和有害的抗-GBM自身抗體的作用，所述單克隆IgG競爭分子以在α3(IV)NC1上的免疫顯性表位為靶并已設(shè)計具有生物學(xué)上失活的Fc域。我們將研究出重組的嵌合IgG抗體，它結(jié)合所述免疫顯性α3(IV)NC1表位但沒有標準的效應(yīng)子功能。我們能夠?qū)崿F(xiàn)這一目標，因為已經(jīng)研究出并特征鑒定了編碼鼠抗-α3(IV)NC1可變區(qū)的基因(Pusey CD等，Lab Invest 1987，56；23-31和Ross CN等，Lab Invest 1996，74；1051-1059)。
再說一次，除了競爭結(jié)合作用之外，本發(fā)明的治療性抗體還可以通過FcγRIIb引起有益的抑制性作用。3)變態(tài)反應(yīng)和哮喘變態(tài)反應(yīng)和哮喘都是由對共同的環(huán)境抗原的不適當免疫應(yīng)答引起，所述環(huán)境抗原諸如來自禾本科植物花粉、房間塵螨和許多其它的普通抗原來源的蛋白，一個實例是房間塵螨表皮螨屬pteronyssinus(Dermatophagoides pteronyssinus)的Der P 1蛋白。受侵襲的個體產(chǎn)生高水平的免疫球蛋白，尤其是IgE類。這些IgE類抗體能夠結(jié)合在肥大細胞和嗜酸性粒細胞上的高親和性的FcεRI受體。所述結(jié)合受體的IgE與所述變應(yīng)原交聯(lián)導(dǎo)致所述細胞的活化和脫顆粒。這樣就釋放許多可以引起歸因于過敏性反應(yīng)的嚴重綜合征乃至死亡的炎癥介質(zhì)。可以設(shè)想兩種活化封閉抗體的機制。首先具有惰性Fc區(qū)的IgG抗體可以與IgE競爭結(jié)合變應(yīng)原。這應(yīng)當防止IgE的交聯(lián)并因此防止所述細胞的活化。關(guān)于此機制，所述具有惰性Fc的IgG抗體可能不得不直接和IgE競爭結(jié)合所述變應(yīng)原。
第二個重要機制應(yīng)包括憑借FcγRIIb受體的陰性信號的作用。已經(jīng)表明，F(xiàn)cγRIIB和FcεRI的交聯(lián)導(dǎo)致對活化信號的抑制，該活化信號通常只有當FcεRI受體為交聯(lián)時才可觀察到。因此，引入具有針對FcγRIIb的Fc結(jié)合能力的IgG抗體和變應(yīng)原抗原特異性可以導(dǎo)致對包被IgE的肥大細胞和嗜酸性粒細胞活化的抑制。關(guān)于這一點，如果所述IgG抗體通過與IgE不同的部位結(jié)合所述變應(yīng)原，以使二者可以同時結(jié)合所述變應(yīng)原，則所述IgG抗體還介導(dǎo)其強烈的負效應(yīng)。4)炎癥性疾病例如Crohn疾病有許多免疫系統(tǒng)疾病似乎引起歸因于免疫細胞(白細胞)的慢性活化狀態(tài)的病變，所述免疫細胞包括T淋巴細胞、嗜中性粒細胞和NK細胞。通常觀察到的這種慢性活化為活化的細胞連續(xù)移行到受感染組織中的炎癥。為了移行到所述組織中，所述細胞必須接受和響應(yīng)炎癥介質(zhì)，然后調(diào)節(jié)粘附分子，使它們能夠首先粘附到被覆在血管壁上的細胞，然后在血管壁的細胞之間移行并移行至所述組織中。通過封閉在所述白細胞表面上的粘附分子或在被覆血管壁的活化上皮細胞上的相應(yīng)配體，應(yīng)可終止這種炎癥的循環(huán)。這種活化抗原是VAP-1，而結(jié)合此分子的具有惰性Fc的抗體應(yīng)當防止淋巴細胞在所述炎癥部位粘附和移行，因此切斷慢性活化的循環(huán)。5)抑制配體/受體的相互作用鐮狀細胞貧血病以纈氨酸置換谷氨酸為特征的人血紅蛋白變異體的純合性(HbSS)導(dǎo)致慢性溶血和引起所述分子在脫氧狀態(tài)形成類晶團聚體的趨勢。這導(dǎo)致紅細胞在微循環(huán)中呈鐮狀外形，從而導(dǎo)致在局部區(qū)域中的鐮狀‘危象’。這些可能是血栓形成(在骨、肺、腦或腹部)、再生障礙、溶血，或伴隨脾和肝中的大量紅細胞匯集。在這些危象期的過程中，紅細胞粘附至內(nèi)皮細胞是先決條件。此粘附過程是基于幾種受體與其各自配體的相互作用。兩個主要粘附途徑是Lutheran與層粘連蛋白之間的相互作用和血小板反應(yīng)蛋白與至今尚未明確的紅細胞膜脂之間的相互作用。在動物試驗中，我們已經(jīng)獲得了抗血小板反應(yīng)蛋白的重組人可變區(qū)抗體減少鐮狀紅細胞與內(nèi)皮細胞粘附的證據(jù)。我們假定可以通過V基因噬菌體展示研究出抗lutheran的層粘連蛋白結(jié)合域(膜近側(cè)域)的相似的重組可變區(qū)抗體，所述抗體封閉了與層粘連蛋白的相互作用。這些可變區(qū)抗體片段可以具有惰性Fc區(qū)，以產(chǎn)生能夠干擾鐮狀紅細胞粘附內(nèi)皮細胞而不引起紅細胞破壞的治療性抗體?？贵w介導(dǎo)的對血小板膠原蛋白受體的封閉我們已基本證實，兩個受體決定著為血栓形成起源事件的內(nèi)皮下細胞膠原蛋白對血小板的活化；一個是我們認為主要起粘附作用的整合蛋白α2β1(血小板糖蛋白Ia/IIa)，而另一個是活化、前期分泌和聚集必需的非整合蛋白糖蛋白VI(GpVI)。可以通過識別各個受體中不同域的V基因噬菌體展示，產(chǎn)生重組人抗體，這些抗體可以用于產(chǎn)生用于基于膠原蛋白的抗血栓形成治療的具有惰性Fc區(qū)的引導(dǎo)抗體(lead-antibody)。這些引導(dǎo)抗體可以用于減輕冠狀動脈血栓形成、血管成形術(shù)后的再狹窄和與旁路移植相關(guān)的血栓形成并發(fā)癥。6)單克隆抗體往往用于封閉細胞功能，例如OKT3通過封閉T細胞受體用于免疫抑制T細胞，CD18抗體通過所述整合蛋白分子用于防止細胞-細胞粘附。然而，F(xiàn)c與Fc受體的結(jié)合可以通過刺激細胞因子釋放和炎癥，引發(fā)嚴重的副作用。7)抗體Fc區(qū)有時附著于其它的重組蛋白，以產(chǎn)生具有延長的生物學(xué)半壽期的融合分子。由此TNF受體已附著于人IgG4 Fc，形成抑制可溶性TNF作用的分子，而CTLA4已和IgG Fc制備成融合蛋白，并通過在細胞表面上的B7共受體(CTLA4的配體)分子用于阻斷信號。然而不理想的是所述融合蛋白的Fc也觸發(fā)細胞因子。
適合于在上文具體論述之處論述的應(yīng)用類型的V區(qū)或其它的結(jié)合區(qū)，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是眾所周知的。例如Routledge等(1991)Eur J Immunol 21，2717-2725和Bolt等(1993)Eur J Immunol 23，403-411公開的CD3結(jié)合域(例如YTH12.5)。Riechmann等(1988)Nature 332，323-327公開的CD52結(jié)合域(例如CAMPATH-1)。Salmi等(1993)J Exp Med 1782250-60和Smith等(1998)J Exp Med 18817-27公開的VAP-1結(jié)合域。McElveen等(1998)Clin Exp Allergy 28，1427-1434公開的Der p I域(例如2C7)。
因此，不結(jié)合Fc受體和觸發(fā)殺傷作用并不激活補體、但確實結(jié)合靶分子的結(jié)合分子可以用于上述所有的實施例，以將任何副作用降至最低程度。具體而言，以上的1-5情況可以采用這種‘封閉’抗體，防止天然產(chǎn)生抗體的不良破壞。上述封閉型Fc區(qū)應(yīng)是選擇用于在以上6中的諸如CD3或CD18抗體的重組抗體的Fc區(qū)，或作為在以上7中的融合蛋白的Fc區(qū)。
可以通過任何合適的方法組合所述結(jié)合域和效應(yīng)子域。例如可以通過側(cè)鏈共價連接域。在另一方面，化學(xué)還原半胱氨酸殘基產(chǎn)生的巰基已經(jīng)用于交聯(lián)抗體域(Rhind，S K(1990)EP 0385601交聯(lián)抗體和其制備方法)。最后，化學(xué)修飾的糖基已經(jīng)用于產(chǎn)生用于交聯(lián)目的的活性基團。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用的標準技術(shù)。它們尤其可以用于其中所述結(jié)合多肽包含非蛋白部分或基團的實施方案。
一般來說，使用重組技術(shù)表達融合蛋白形式的結(jié)合分子可能更合適。下文陳述的用于本發(fā)明的方法和材料構(gòu)成了本發(fā)明其它方面。核酸在本發(fā)明的一個方面，公開了編碼如上所述的結(jié)合分子的核酸。
按照本發(fā)明的核酸可以包括cDNA、RNA、基因組DNA(包括內(nèi)含子)和修飾的核酸或核酸類似物(例如肽核酸)。其中DNA序列是例如附圖指定的，除非文章需要另外的RNA等價物，它包括在其中發(fā)生U置換T。
可以提供按照本發(fā)明的核酸分子，它們由其天然環(huán)境分離和/或純化，為大致純或均一形式，或者沒有或基本沒有其它物種來源的核酸。本文使用的術(shù)語“分離的”包括所有這些可能性。
所述核酸分子可以整個合成或部分合成。具體的說，它們可以是重組體，其中已經(jīng)將發(fā)現(xiàn)實際上不連續(xù)(不連續(xù)連接)的核酸序列連接或人工組合。另一方面，例如使用自動化合成儀，已可以直接合成所述核酸分子。
另一個方面，公開了包含所述核酸序列的核構(gòu)建物，例如可復(fù)制載體。
包括按照本發(fā)明的核酸的載體不需要包括啟動子或其它的調(diào)節(jié)序列，尤其是如果準備使用所述載體將所述核酸引入細胞以重組至基因組中。
在所述載體中的核酸最好是處于宿主細胞中的合適啟動子或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的控制之下，并與它們可操作地連接，所述宿主細胞諸如微生物(例如細菌、酵母、絲狀真菌)細胞或真核生物(例如昆蟲、植物、哺乳動物)細胞。
具體地說，所述載體可以包含允許在宿主中選擇或選擇宿主細胞的基因(例如gpt)，以及一個或多個適于所述宿主的增強子。
所述載體可以是在多個宿主中起作用的雙功能表達載體。在基因組DNA的情況下，所述載體可以包含所述基因組DNA自身的啟動子或其它的調(diào)節(jié)元件，而在cDNA的情況下，所述載體可以處于在所述宿主細胞中表達的合適啟動子或其它調(diào)節(jié)元件控制之下。
所述“啟動子”是指可操作地連接的DNA下游(即在雙鏈DNA的有義鏈上的3′方向)的核苷酸序列，由該核苷酸序列可以開始轉(zhuǎn)錄。所述啟動子可選地是誘導(dǎo)型啟動子。
“可操作地連接”是指作為所述核酸分子的部分，以適于由所述啟動子開始的轉(zhuǎn)錄的位置和方向連接?？刹僮餍赃B接至啟動子的DNA是在所述啟動子的“轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)之下”。
因此本發(fā)明在此方面提供基因構(gòu)建物，最好是可復(fù)制載體，它包含操作性連接至本發(fā)明提供的核苷酸序列的啟動子。
一般來說，本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員完全能夠構(gòu)建質(zhì)粒和設(shè)計用于重組基因表達的方法?？梢赃x擇或構(gòu)建包含合適的調(diào)節(jié)序列的合適載體，所述調(diào)節(jié)序列包括啟動子序列、終止子片段、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因和其它合適序列。更多的細節(jié)參見例如Molecular Cloninga Laboratory Manual第二版，Sambrook等，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press。
在Molecular Biology，第二版，Ausubel等編輯，John Wiley & Sons，1992的Current Protocols中詳細描述了許多已知用于操作核酸的技術(shù)和方法，例如在制備核酸構(gòu)建物、誘變、測序、引入DNA到細胞中和基因表達以及蛋白分析中的技術(shù)和方法。Sambrook等和Ausubel等公開的內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。宿主細胞和方法采用以上確定的表達載體轉(zhuǎn)化細胞也包含在本發(fā)明中。還提供細胞培養(yǎng)物(最好是嚙齒動物)和包含所述結(jié)合分子的細胞培養(yǎng)產(chǎn)物。
還提供制備按照本發(fā)明的結(jié)合分子的方法，該方法包括(i)組合編碼結(jié)合域的核酸和編碼效應(yīng)子域的核酸，以形成核酸構(gòu)建物；(ii)在合適的宿主細胞中引起或使所述構(gòu)建物表達。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何常規(guī)方法進行組合，例如通過連接片段(例如限制性內(nèi)切酶酶切片段)或在一個或幾個擴增步驟中使用不同的模板(例如使用PCR)，以產(chǎn)生構(gòu)建物。
產(chǎn)生抗體(和由此而來的結(jié)合域)的方法包括用合適的目的蛋白或其片段免疫哺乳動物(例如人、小鼠、大鼠、兔、馬、山羊、綿羊、駱駝或猴)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的眾多技術(shù)中的任一種，由免疫動物中獲得抗體，并可篩選，最好使用抗體與目的抗原結(jié)合。
例如，可以使用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)或免疫沉淀(Armitage等，1992，Nature 35780-82)。
在EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述了嵌合抗體的克隆和表達。
可以通過定點誘變，例如通過本文公開的方法或在公開技術(shù)中的方法(參見例如Lynxvale Ltd的WO 92/16562或WO 95/05468)，產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的編碼所述效應(yīng)子域的核酸。其它方面還提供本發(fā)明的結(jié)合分子的用途，即防止、抑制或干擾第二個結(jié)合分子與靶分子結(jié)合。該用途可以包括與治療相關(guān)的靶抗原或細胞的抗體競爭或替換該抗體。
本發(fā)明還提供包含如上所述的結(jié)合分子的試劑，無論該結(jié)合分子是是否重組產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供包含如上所述的結(jié)合分子加上藥學(xué)上可接受的載體的藥用制劑。
本發(fā)明還提供治療患者的方法，該方法包括將如上所述的藥用制劑給予所述患者，或給予取自該患者的樣品(例如血液樣品)，該樣品隨后返回給所述患者。治療方法特別用于以下疾病移植物抗宿主疾病；宿主抗移植物疾病；器官移植排斥；骨髓移植排斥；自身免疫；同種異體免疫；變態(tài)反應(yīng)；慢性或急性炎癥疾病。
本發(fā)明還提供治療患者的方法，該方法包括引起或使編碼如上所述的結(jié)合分子的核酸表達，從而使所述結(jié)合分子在患者體內(nèi)發(fā)揮其作用。通常所述表達在患者中發(fā)生，或在所述患者為未出生嬰兒的某些特別情況下在所述患者的母親中發(fā)生。
還提供如上所述的結(jié)合分子用于制備改進免疫應(yīng)答的藥物，特別是治療以上論及的疾病的藥物當中的用途。
為了更充分地理解本發(fā)明，現(xiàn)在將更詳細地描述實施方案，所述實施方案僅作為實施例，并沒有限制作用。根據(jù)這些實施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計屬于本發(fā)明范圍的其它實施方案。
附1用Fog-1抗體包被的RBC使FcγRI細胞形成花結(jié)。用一系列抗體濃度的Fog-1抗體包被R2R2RBC，將其與在96孔板中培養(yǎng)的B2KA細胞溫育，并測定和RBC形成花結(jié)的B2KA細胞的百分率。誤差線表示一式三份孔的標準差值。對于突變體Fog-1 G1Δb、G1Δc、G1Δab、G1Δac、G2Δa、G4Δb和G4Δc，如同G2(顯示)一樣，在B2KA細胞和任何包被濃度的RBC之間沒有形成花結(jié)。圖2熒光染色FcγRI細胞。FcγRI轉(zhuǎn)染細胞系、B2KA(a和b)和3T3+FcγRI+γ鏈(c和d)循序與CAMPATH-1(a和c)或Fog-1(b和d)系抗體、生物素酰化抗人κ抗體和ExtrAvidin-FITC溫育。對10000個細胞檢測熒光強度，并標繪熒光頻道(channel)的幾何平均數(shù)。圖3表示熒光染色的FcγRI細胞的頻率分布圖。如在圖2中一樣使用100μg/ml的CAMPATH-1系抗體染色B2KA細胞。疊加顯示代表抗體的符合每個熒光頻道的細胞數(shù)目的頻率分布圖。圖4人單核細胞對用Fog-1系抗體致敏的RBC的CL應(yīng)答。用在各種濃度抗體包被R1R1RBC。對每個所述樣品測定結(jié)合每個細胞的抗體分子數(shù)和單核細胞對所述RBC的CL應(yīng)答。圖5用其它的Fog-1抗體抑制Fog-1 G1引起的CL。用2μg/ml Fog-1 G1和標明的不同濃度Fog-1抗體敏化RBC。在圖4中這些抗體產(chǎn)生低CL應(yīng)答。檢測單核細胞的CL應(yīng)答。把單獨的2μg/ml G1產(chǎn)生的應(yīng)答作為100％。圖6用Fog-1 G2Δa抑制對臨床血清的CL應(yīng)答。用常量的Fog-1 G1(20μg/ml)或臨床相關(guān)血清和不同量的Fog-1 G2Δa敏化RBC。用標準量的BRAD 5獲得100％應(yīng)答。在沒有Fog-1 G2Δa的情況下，所述應(yīng)答的百分率為G1150％、血清A142％、血清B265％、血清C200％、血清D163％、血清E94％、抗C+D血清259％以及抗K血清119％。圖7由CAMPATH-1系抗體介導(dǎo)的補體裂解。用51Cr標記人PBMC，并在作為補體源的血清存在下與所述抗體溫育。標繪特定Cr釋放的百分率，作為裂解發(fā)生的量。圖8用CAMPATH-1 G2Δa抑制CAMPATH-1 G1介導(dǎo)的補體裂解。如在圖7中一樣進行補體裂解，但所述樣品包含常量(6.25μg/ml終濃度)的CAMPATH-1 G1和不斷增加量的CAMPATH-1 G2Δa。圖9由CAMPATH-1系抗體介導(dǎo)的ADCC。用51Cr標記人PBMC并與抗體溫育。清洗后，所述細胞作為效應(yīng)細胞以20∶1的效應(yīng)物靶比值和另外的PBMC溫育。標繪特定Cr釋放的百分率，作為裂解發(fā)生的量。圖10a由Fog-1系抗體介導(dǎo)的對RhD+RBC的ADCC。圖10b由Fog-1系抗體介導(dǎo)的對RhD+RBC的ADCC。圖11a用Fog-1抗體抑制由2ng/mg Fog-1 G1介導(dǎo)的對RhD+RBC的ADCC。圖11b用Fog-1抗體抑制由Fog-1 G1介導(dǎo)的對RhD+RBC的ADCC。在由常量Fog-1 G1(2ng/mg)和不同濃度的所述抑制劑抗體組成的抗體混合物中敏化RBC。圖12用Fog-1抗體抑制由3 ng/mg多克隆抗RhD介導(dǎo)的對RhD+RBC的ADCC。圖13a熒光染色FcγRIIa 131H/H細胞。將轉(zhuǎn)染子系3T6+FcγRIIa131H/H細胞和與山羊F(ab′)2抗人κ、接著和結(jié)合FITC的驢抗山羊IgG復(fù)合的Fog-1抗體溫育。對10000個細胞檢測熒光強度，并標繪熒光頻道的幾何平均數(shù)。圖13b熒光染色FcγRIIa 131R/R細胞。將轉(zhuǎn)染子系3T6+FcγRIIa 131R/R細胞和與結(jié)合FITC的山羊F(ab′)2抗人κ復(fù)合的所述Fog-1抗體溫育。對10000個細胞檢測熒光強度，并標繪熒光頻道的幾何平均數(shù)。圖14a熒光染色FcγRIIb1★細胞。使用轉(zhuǎn)染子系3T6+FcγRIIb1★以及使用結(jié)合FITC的山羊F(ab′)2抗人κ與未標記的山羊F(ab′)2抗人κ的混合物復(fù)合的Fog-1抗體，如在圖13b中一樣進行該試驗。圖14b熒光染色FcγRIIIb NA1細胞。使用轉(zhuǎn)染子系CHO+FcγRIIIbNA1，如在圖13中一樣進行該試驗。圖14c熒光染色FcγRIIIb NA2細胞。使用轉(zhuǎn)染子系CHO+FcγRIIIbNA2，如在圖13中一樣進行該試驗。圖15顯示表1，它對比了野生型G1、G2和G4序列產(chǎn)生的突變。圖16顯示表2，它概括了抗體活性。圖17顯示了某些修飾型和野生型CH2序列的序列，包括稱為G1Δab、G2Δa、G1Δac的序列。
實施例一般材料和方法構(gòu)建表達載體IgG1恒定區(qū)的起始點是為包含修飾的多位點接頭的載體M13tg131形式的同種異型人IgG1恒定區(qū)基因G1m(1，17)(Clark，M.R.WO 92/16562)。2.3kb的IgG1插入片段因此在其5′末端具有BamHI位點，并包含相鄰于所述BamHI位點的HindIII位點。在3′末端聚腺苷酸化信號的下游，按5′至3′順序依次存在的位點是SphI、NotI、BglII、BamHI。已經(jīng)獲得為在M13tg131中的HindIII-SphI片段的人IgG2恒定區(qū)基因，并已通過用HindIII消化，補平突出末端以及再將所述末端連接在一起，破壞所述HindIII位點?？寺∷鲚d體的SalI-SphI片段，以替換在上述IgG1載體中的等同片段。獲得為在M13tg131中的HindIII-SmaI片段的人IgG4恒定區(qū)基因并破壞所述HindIII位點。所述SmaI位點存在于CH3外顯子的3′末端和聚腺苷酸化位點之間，所以通過加入來自所述IgG1載體的SmaI片段破壞所述聚腺苷酸化位點，所述IgG1載體包含在IgG1基因中的等同SmaI位點和在所述基因下游多位點接頭中的SmaI位點之間的DNA。
為了易于交換突變外顯子序列，第一個步驟是在CH1和鉸鏈外顯子之間引入XbaI限制位點，在鉸鏈和CH2外顯子之間引入XhoI位點，以及在CH2和CH3外顯子之間引入KpnI位點。這類似于先前進行的對IgG1和IgG4基因的操作(Greenwood，J.，Clark，M.和Waldmann，H.(1993)Structural motifs involved in human IgG antibodyeffector functions.Eur.J.Immunol.23，1098-1104)。
為提供模板DNA，用上述的M13感染大腸桿菌(E.coli)RZ1032并制備單鏈DNA(ssDNA)。因為所述菌株是dut- ung-，所以生產(chǎn)的單鏈DNA應(yīng)包含一些替代了胸苷的尿苷。
用于引入所述突變的寡核苷酸是位于鉸鏈區(qū)和CH2外顯子之間的MO10(5′GGA TGC AGG CTACTC GAGGGC ACC TG 3′)，位于CH2和CH3外顯子之間的MO11(5′TGT CCA TGT GGC CCTGGTACCCCA CGG GT 3′)，位于CH1和鉸鏈區(qū)外顯子之間的MO12(5′GAG CCT GCT TCCTCT AGACAC CCT CCC T 3′)，限制位點標以下劃線。
在50μl包含25pmol寡核苷酸和5u T4多核苷酸激酶(nbl)的70mM Tris HCl pH 7.6溶液、10mM MgCl2、100mM KCl、5mM DTT、0.5mg/ml BSA、1mM ATP的反應(yīng)物中磷酸化所述寡核苷酸。于37℃溫育反應(yīng)物1小時并于70℃加熱5分鐘。
為了使誘變的寡核苷酸對所述模板DNA退火，在20μl的40mMTris HCl pH 7.5、20mM MgCl2、50mM NaCl中于80℃溫育500ng包含尿苷的DNA和1pmol每種磷酸化寡核苷酸，并使其緩慢冷卻至37℃。用上述緩沖液增加體積至30μl，DTT加入到7mM，ATP加入到1mM，而dATP、dCTP、dGTP和dTTP每種都加入到250μM。加入5u T7 DNA聚合酶(未修飾，United States Biochemical)和0.5u T4DNA連接酶(Gibco BRL)，于室溫溫育所述反應(yīng)物16小時，以合成突變鏈。用乙醇沉淀所述DNA，將其溶解在50μl的20mM Tris HCl pH8.0、1mM EDTA、1mM DTT、0.1mg/ml BSA中，并加入1u尿嘧啶DNA糖基化酶(New England Biolab)。于37℃溫育2小時后，加入50μl的400mM NaOH，置所述反應(yīng)物于室溫5分鐘以使DNA的模板鏈片段化。用乙醇沉淀所述DNA，將其溶解在水中并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1中。生產(chǎn)用于選擇產(chǎn)生的M13克隆的復(fù)制型(RF)DNA，并消化得到包含需要的XbaI、XhoI和KpnI限制位點的克隆。獲得IgG1和4個載體的合適的克隆，但在IgG2載體中的MO12似乎錯誤退火，所以對沒有此寡核苷酸的IgG2重復(fù)誘變，因為在CH1和鉸鏈區(qū)外顯子之間的所述位點對于這些試驗不是必須的。對于每個載體，通過測序證實所述外顯子的DNA序列。
使用寡核苷酸MO22BACK(編碼鏈)5′TCT CCA ACA AAGGCC TCC CGT CCT CCA TCG AGA AAA 3′，MO22(互補鏈)5′TTTTCT CGA TGG AGG ACG GGA GGC CTT TGT TGG AGA 3′，在CH2中于氨基酸位置327、330和331(Δa突變)引入變化；使用寡核苷酸MO7BACK(編碼鏈和編碼Δc突變)5′TCC TCA GCA CCT CCA GTCGCG GGG GGA CCG TCA GTC 3′，MO21(互補鏈和編碼Δb突變)5′GAC TGA CGG TCC CGC GAC TGG AGG TGC TGA GGA 3′，在CH2中于氨基酸位置233至236(Δb和Δc突變)引入變化；通過還需要所述寡核苷酸MO11和MO10BACK5′CAG GTG CCC TCG AGT AGCCTG CAT CC 3′的重疊延伸PCR引入突變，XhoI限制位點標以下劃線。
對于所述Δa突變，第一組PCR使用由MO22和MO10BACK以及由MO22BACK和MO11擴增的IgG1和IgG2模板。對于所述Δb和Δc突變，第一組PCR使用由MO21和MO10BACK以及由MO7BACK和MO11擴增的IgG1和IgG4模板。在終產(chǎn)物中，源自用MO21引導(dǎo)的鏈的DNA應(yīng)具有所述Δb突變，而源自MO22BACK的DNA應(yīng)具有所述Δc突變。每個PCR包含在50μl的10mM Tris HClpH 8.85、25mM KCl、5mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4和250μM每種dATG、dCTP、dGTP和dTTP中的約30ng M13tg131+恒定區(qū)單鏈DNA、25pmol每種寡核苷酸和1u Pwo DNA聚合酶(BoehringerMannheim)。將所述反應(yīng)進行14個循環(huán)至結(jié)束，每個循環(huán)為94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，60秒，然后72℃，5分鐘。由低熔點瓊脂糖中切除代表預(yù)期大小的產(chǎn)物DNA的條帶，并將其融化在100μl水中。對于每種突變，通過重疊延伸PCR將兩個初始PCR產(chǎn)物連接在一起。將總共約4μl的融化的凝膠片和每個25pmol的MO10BACK和MO11以及如上所述的其它組分混合，以使所述初始的PCR產(chǎn)物為等摩爾量。如上所述進行超過18個循環(huán)的PCR，只是退火溫度由50℃降至48℃。純化所獲得的包含整個CH2外顯子的產(chǎn)物，并用XhoI和KpnI對其消化。用XhoI和KpnI消化包含如上所述的特別限制位點的突變M13tg131+恒定區(qū)載體的復(fù)制型DNA，以去除存在的CH2DNA和連接CH2區(qū)的突變體。將所述DNA樣品轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1中。對各個典型克隆的DNA測序，以鑒定正確突變的恒定區(qū)。
為了獲得具有Δa和Δb或Δc的IgG1載體，使用代表Δa突變體的DNA作為模板，用于第二輪PCR，以引入如上所述的Δb和Δc突變。
由復(fù)制型DNA中除去每一個為BamHI-NotI片段的IgG1、2和4野生型基因和突變的恒定區(qū)基因，并將它們克隆到修飾的CAMPATH Hu4VH HuIgG1 pSVgpt載體(Clark，M.R.LynxvaleBinding Molecules，同上)中，以替換存在的恒定區(qū)。產(chǎn)生的載體命名為pSVgptCAMPATHHu4VHHuIgG1Δa等。該載體還包含允許在哺乳動物細胞中選擇的gpt基因、鼠免疫球蛋白重鏈增強子和CAMPATH-1 Hu4VH可變區(qū)DNA，以便其具有可在哺乳動物細胞中表達的完全重鏈基因。CAMPAYH-1人源化輕鏈基因存在于表達載體CAMPATH HuVL pSVneo(Reichmann，L.，Clark，M.R.，Waldmann，H.和Winter，G.(1988)Nature 332，323-327)中。
在載體pHEN1中獲得Fog1可變區(qū)DNA(Bye，J.M.，Carter，C.，Cui，Y.，Gorick，B.D.，Songsivilai，S.，Winter，G.，Hughes-Jones，N.C.和Marks，J.D.(1992)人單克隆抗Rh(D)抗體的種系可變區(qū)基因節(jié)段J.Clin.Invest.90，2481-2490)。通過PCR擴增它們，所用寡核苷酸為FOG1VHBACK5′TCC ACA GGT GTC CAC TCC CAG GTG CATCTA CAG CAG 3′FOG1VHFOR 5′GAG GTT GTA AGG ACT CAC CTG AGGAGA CGG TGA CCG T 3′FOG1VKBACK5′TCC ACA GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAGATG ACC CAG 3′FOG1VKFOR 5′GAG GTT GTA AGG ACT CAC GTT TGA TCTCCA GCT TGG T 3′在載體M13VHPCR1(Orlandi，R.，Gussow，D.H.，Jones，P.T.和Winter，G.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.美國86，3833)中的插入片段的5′部分包含所述啟動子和編碼所述信號肽的DNA，使用通用的M13反向引物和VO35′GGA GTG GAC ACC TGT GGA GA 3′對該5′部分擴增。使用通用的M13-40引物和VO45′GTG AGT CCT TAC AAC CTC TC3′經(jīng)PCR獲得在M13VHPCR1中的VH的3′和相當于VH-CH內(nèi)含子的5′末端的DNA。將這兩個DNA節(jié)段依次連接至通過如上所述的重疊延伸PCR擴增的DNA Fog-1 VH和Fog-1 VK。使用去除識別位點但沒有改變編碼氨基酸的寡核苷酸，通過上述方法除去Fog-1 VH內(nèi)部的BamHI限制位點。將為HindIII-BamHI片段的全部PCR產(chǎn)物克隆到M13mp19中，并確認它們的DNA序列。
包含所述Fog-1 VH的HindIII-BamHI片段用于替換包含上述pSVgpt載體中的CAMPATH-1 VH的片段，產(chǎn)生的表達載體命名為pSVgptFog1VHHuIgG2等。對于所述IgG1載體，在所述恒定區(qū)DNA的5′末端的特別的HindIII限制位點是指不可能簡單交換HindIII-BamHI可變區(qū)片段。而是用HindIII消化相關(guān)的pSVgptCAMPATHHu4VHHuIgG1載體。將用來刪除HindIII位點并加入BamHI位點的連接體連接在切割端上。然后用BamHI和NotI消化所述DNA，以便能夠分離所述恒定區(qū)并將其克隆到pSVgptFog1VHHuIgG2中，以替換所述IgG2恒定區(qū)。
將包含所述Fog-1 VK的HindIII-BamHI片段轉(zhuǎn)移至已包含鼠免疫球蛋白重鏈增強子和人κ恒定區(qū)基因的載體pSVhyg-HuCK(Orlandi等，1989)中。產(chǎn)生的表達載體叫做pSVhygFog1VKHuCK。產(chǎn)生抗體通過用PvuI消化使10μg每個重鏈表達載體和20μg相關(guān)輕鏈表達載體線性化，并將它們混合在50μl水中。在具有5％胎牛血清(FBS)的Iscove改良型Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)中培養(yǎng)非分泌性大鼠骨髓瘤系細胞YB2/0至半融合(semi-confluency)。通過離心收集107細胞，在0.5ml培養(yǎng)基中重懸浮并轉(zhuǎn)移至GenePulser小杯(BioRad)。加入所述DNA并將混合物冰浴5分鐘。給予所述細胞一個960μF/170V的脈沖，并再度冰浴15分鐘，之后置于20ml IMDM+10％FBS的培養(yǎng)瓶中。將它們于37℃、5％CO2的潮濕氣氛中溫育。24小時后，體積增加一倍，通過加入霉酚酸至0.8μg/ml和加入黃嘌呤至250μg/ml使所述培養(yǎng)基成為選擇性培養(yǎng)基。等分所述細胞于兩個96孔平板上培養(yǎng)。進行選擇之后約18天，可觀察到菌落，用ELISA分析上清液中存在的IgG。簡單地說，用山羊抗人IgG、Fc特異性抗體(Sigma)包被微量滴定板孔，然后將其與稀釋5倍的所述上清液溫育。通過與結(jié)合HRPO的山羊抗人κ抗體(Seralab)溫育并用鄰苯二胺底物進行顯色，檢測結(jié)合抗體。擴大培養(yǎng)包含最高量抗體的孔的細胞，并超低溫保藏原種。
將分泌最高量抗體的細胞系擴展到500ml的IMDM+2％FBS中，以提供飽和上清液用于抗體純化。通過離心澄清所述上清液，并將其制成0.1M Tris HCl pH 8.0溶液。加入A蛋白-瓊脂糖(Sigma)，于4℃攪拌該混合物16小時。收集瓊脂微珠上柱，用0.1M Tris HCl pH8.0溶液繼之以10 mM Tris HCl pH 8.0溶液流洗。用每份1ml的0.1M甘氨酸pH 3.0將所述抗體洗脫到每份100μl的1M Tris HCl pH 8.0樣品中，并由A280nm讀數(shù)鑒定包含顯著量蛋白的流分。將這些流分對PBS透析，除菌過濾，A280nm重復(fù)檢測獲得合適的抗體濃度(濃度＝A280nm×0.714mg/ml)。
使用12.5％丙烯酰胺通過還原SDS-PAGA確定所述抗體的純度和完整性。在ELISA中檢驗所述濃度，所述ELISA使用山羊抗人κ抗體(Seralab)作為捕獲制劑，使用生物素?；窖蚩谷甩士贵w(Sigma)繼之以ExtrAvidin-HRPO(Sigma)用于檢測。這表明，所述重鏈的性質(zhì)不大可能影響所獲得的結(jié)合水平。FcγRI轉(zhuǎn)染子形成花結(jié)將清洗的R2R2RBC和在100ml PBS中的抗體樣品在96孔平板中于室溫溫育1小時。清洗所述RBC三次，在PBS重懸浮，并于37℃和在96孔平板中培養(yǎng)的表達FcγRI cDNA、B2KA(S.Gorman和G.Hale，未公開)的轉(zhuǎn)染子溫育40分鐘。廢棄上清液，將所述孔清洗一次，以去除過量的RBC。對于每個孔，檢測200個B2KA細胞，并記錄RBC花結(jié)的數(shù)目。標繪一式三份的孔中的平均百分率和標準偏差。另一方面，在微量離心管中混合敏化的RBC和B2KA細胞，使其沉淀并溫和重懸浮，之后轉(zhuǎn)移到顯微鏡載玻片上。熒光染色FcγR轉(zhuǎn)染子在用細胞解離緩沖液(Gibco BRL)處理后獲得表達FcγRI cDNA、B2KA和3T3+FcγRI+γ-鏈(van Urgt，M.J.，Heijnen，I.A.F.M.，Capel，P.J.A.，Park，S.Y.，Ra，C.，Saito，T.，Verbeek，J.S.和van de Winkel，J.G.J.(1996)FcR γ-鏈是體內(nèi)人FcγRI(CD64)的表面表達和功能必需的，Blood 87，3593-3599)的轉(zhuǎn)染子，所述轉(zhuǎn)染子為在包含0.1％(w/v)NaN3、0.1％(w/v)BSA(清洗緩沖液)的磷酸緩沖鹽水中的單細胞懸浮液。在96孔板中以每孔105沉淀細胞，在100μl CAMPATH-1或Fog-1抗體的稀釋液中重懸浮并冰浴30分鐘。以每孔150ml清洗緩沖液清洗細胞三次，同樣地和20μg/ml結(jié)合生物素的山羊抗人κ鏈抗體(Sigma)繼之以20μg/ml ExtrAvidin-FITC(Sigma)溫育。最后清洗之后，在100μl包含1％(v/v)甲醛的清洗緩沖液固定細胞。通過用CD64單克隆抗體(Serotec)和結(jié)合FITC的山羊和小鼠IgG抗體(Sigma)染色證實FcγRI的表面表達。在FACcan(Becton Dickinson)上檢測熒光強度。
對于帶有FcγRII、3T6+FcγRIIa 131H/H、3T6+FcγRIIa 131R/R(Warmerdam，P.A.M.，van de Winkel，J.G.J.，Gosselin，E.J.，和Capel，P.J.A.(1990)人類Fcγ受體II(CD32)多態(tài)性的分子基礎(chǔ)J.Exp.Med.172，19-25；Warmerdam，P.A.M.，van de Winkel，J.G.J.，Vlug，A.，Westerdaal，N.A.C.和Capel，P.J.A.(1991)，在人類Fcγ受體II的第二個Ig樣域中的單個氨基酸是人IgG2結(jié)合的關(guān)鍵，J.Immunol.147，1338-1343)和3T6+FcγRIIb1★(Warmerdam，P.A.M.，van den Herik-Oudijk，I.E.，Parren，P.W.H.I.，Westerdaal，N.A.C.，van de Winkel，J.G.J.和Capel，P.J.A.(1993)，Int.Immunol.5，239-247)的轉(zhuǎn)染子，復(fù)合所述抗體，然后與所述細胞溫育。對于FcγRIIa 131H/H，將所述抗體與等摩爾量的山羊F(ab′)2抗人κ(Seralab)混合，并于37℃溫育1小時。然后將所述復(fù)合物與所述細胞混合，如上所述繼續(xù)分析，只是檢測抗體為結(jié)合FITC的驢抗山羊IgG(Serotec)。對于FcγRIIa 131R/R，使用等摩爾量的結(jié)合FITC的山羊F(ab′)2抗人κ(Seralab)制備所述復(fù)合物，而對于FcγRIIb1★，使用等摩爾量的結(jié)合FITC的山羊F(ab′)2抗人κ和未標記的山羊F(ab′)2抗人κ的1∶1混合物制備所述復(fù)合物。因此對于這些受體來說，只需要一個溫育步驟。
對于帶有FcγIIIb、CHO+FcγIIIb NA1或NA2(Bux，J.，Kissel，K.，Hofmann，C.和Santoso，S.(1999)，使用等位基因特異性重組FcγRIIIb抗原檢測粒細胞抗體，Blood 93，357-362)的轉(zhuǎn)染子，如以上對3T6+FcγRIIa 131H/H細胞的描述進行染色。紅細胞致敏在PBS中清洗O型(Group O)R1R1RBC，并在RPMI+10％FBS中重懸浮，終濃度為5％v/v。將10μl細胞加入到在V形底孔平板中的50μl單克隆抗體或RPMI/FBS中，并于37℃溫育60分鐘。在一些試驗中，所述單克隆抗體在RPMI/FBS中連續(xù)稀釋，以獲得一系列結(jié)合紅細胞的IgG。在競爭試驗中，在25μl競爭性單克隆抗體和25μl野生型單克隆抗體或25μl含同種抗體的血清的混合物中敏化所述紅細胞。致敏之后，用200μl體積的PBS清洗細胞4次，并在50μlRPMI/FBS中重懸浮(終濃度＝1％v/v)。在所有的試驗中，在化學(xué)發(fā)光(CL)測定中使用等分細胞試樣(E-IgG)，通過流式細胞儀分析等分試樣，以測定結(jié)合紅細胞的IgG的水平?；瘜W(xué)發(fā)光測定通過密度梯度離心由混合自6個正常供體的EDTA-抗凝血血液中分離PBMC。用含1％無球蛋白的BSA的PBS清洗PBMC四次，并以2×106/ml在包含25％RPMI和2.5％FBS的Hank平衡鹽溶液(HBSS)中重懸浮。將等份試樣(100μl)分配在96孔平底白色不透明平板中，并于37℃在5％CO2的潮濕空氣氛圍中溫育2小時。然后將所述平板置于發(fā)光計(Anthos Lucy 1，Labtech International，Uckfield，英國)中，并向每孔中加入100μl含4×10-4M魯米諾(Sigma)的HBSS和20μl E-IgG。然后于37℃監(jiān)測所述CL反應(yīng)60分鐘。測定紅細胞結(jié)合的IgG將25μl等份E-IgG轉(zhuǎn)移到V形底孔平板，用PBS清洗一次，離心至沉淀為止并在50μl F(ab)2FITC-抗-IgG(在PBS/1％BSA中稀釋30倍)中重懸浮。于室溫30分鐘后，用200μl PBS/BSA清洗所述細胞一次，冰上保持直至用流式細胞儀(EPICS XL-MCL，CoulterElectronics，Luton，英國)分析。記錄熒光頻道的平均數(shù)。
通過使用標準曲線將熒光頻道的平均數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG分子/細胞，所述標準曲線通過向900μl的連續(xù)稀釋2倍的人單克隆IgG1抗-D(BRAD-5)中加入100μl 5％v/v R1R1細胞制備。用PBS/BSA清洗敏化的紅細胞3次，并在PBS/BSA中重懸浮至1％v/v。取出25μl的等份試樣，如上所述通過流式細胞儀分析。對余下的紅細胞計數(shù)，離心至沉淀為止，在包含Triton X-100的緩沖液中裂解，如Kumpel所述(Kumpel，B.M.(1990)，定量結(jié)合紅細胞的免疫球蛋白的簡易非同位素法，Vox Sanguinis，59，34-39)用ELISA測定裂解物中的IgG。由IgG濃度和紅細胞數(shù)量推斷結(jié)合每個紅細胞的IgG分子的數(shù)目，每個裂解物都根據(jù)所述紅細胞數(shù)量制備。然后繪制熒光強度對結(jié)合每個紅細胞的IgG分子數(shù)目的標準曲線。CAMPATH-1系抗體介導(dǎo)的補體裂解對100ml健康志愿者的靜脈血去纖維蛋白，并使用Ficoll-PaquePlus(Pharmacia)經(jīng)密度梯度離心分離組分。將血清和單核細胞層取出到干凈管(fresh tube)中。將所述細胞稀釋到Iscove改良型Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)中并通過離心收集。在IMDM中清洗所述細胞兩次，同時將其混合為一份沉淀，該沉淀在200μlIMDM中重懸浮。加入900μCi的[51Cr]鉻酸鈉并于37℃溫育所述細胞40分鐘。加入10ml IMDM并使所述細胞沉淀。清洗所述細胞兩次并以約6×106細胞/ml在IMDM中重懸浮。將50μl等份的標記細胞加入到在96孔平板孔中的50μlIMDM中的抗體樣品中。將100μl與IMDM 1∶1稀釋的保留血清加入到每個孔中，所述平板于37℃溫育1小時。離心所述平板，對上清液取樣，并在γ計數(shù)器中檢測釋放的51Cr的相對量。由未加入抗體的樣品獲得自發(fā)釋放的水平，并由重懸浮所述細胞后取出的相似樣品中獲得釋放的51Cr的總量的大小。由下式計算特定51Cr釋放的百分率 繪制一式三份樣品的平均數(shù)和標準差。
為抑制補體裂解，抗體樣品包含常量(6.25μg/ml終濃度)的CAMPATH-1 G1和增加量的CAMPATH-1 G2Δa。CAMPATH-1系抗體介導(dǎo)的ADCC如上所述制備外周血單核細胞。清洗后，在補加5％FBS的IMDM中重懸浮所述細胞，并將其轉(zhuǎn)移至已包被CD3抗體的燒瓶中。于37℃、5％CO2中培養(yǎng)所述細胞三天。用51Cr標記5％的所述細胞作為靶細胞，對其清洗并以6×105細胞/ml在IMDM+5％FBS中重懸浮。向包含50μl在IMDM+5％FBS中的抗體樣品的96孔平板的孔中加入50μl等份樣品。所述靶細胞和抗體在37℃溫育1小時，加入作為載體的RBC并使所述細胞沉淀。在IMDM中清洗所述細胞兩次。通過離心收集余下的單核細胞，并以4×106細胞/ml在IMDM+5％FBS中重懸浮，將其中150μl加入到在所述過程中重懸浮所述靶細胞的每個孔中。這產(chǎn)生20∶1的效應(yīng)物-靶比值。溫和離心所述細胞，并置于組織培養(yǎng)培養(yǎng)箱中6小時。對上清液取樣，并如上所述測定特定51Cr釋放。相對于抗體終濃度繪制一式兩份樣品的特定釋放的平均值。實施例1-抗體的產(chǎn)生和基本特征在表1(圖15)中顯示了選擇消除效應(yīng)子功能的突變。在IgG1和IgG2基因中產(chǎn)生的所述Δa突變引入了在位置327、330和331的IgG4殘基。同樣，將在位置233-236的IgG2殘基引入到IgG1和IgG4中，但因為IgG2在236具有缺失，而其它亞類在此具有甘氨酸殘基，所以產(chǎn)生省略(Δb)或包括(Δc)G236的突變。
用合適的輕鏈表達載體將允許表達CAMPATH-1或Fog-1 VHDNA的載體和野生型或突變體恒定區(qū)基因共轉(zhuǎn)染到大鼠骨髓瘤細胞中。
分離穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子，擴展培養(yǎng)并由在A蛋白-瓊脂糖上的上清液中純化抗體。
選擇CAMPATH-1H，因為它提供了體外研究補體和細胞介導(dǎo)的裂解的良好靶系統(tǒng)。
對于所述Fog-1抗體，在純化后形成的沉淀一旦經(jīng)除菌過濾去除，就觀察不到進一步的沉淀。根據(jù)280nm的吸光度確定抗體濃度，必要時可在ELISA檢測κ鏈存在的相對量后調(diào)節(jié)所述抗體濃度。所述抗體進行還原SDS-PAGE。每個樣品都顯示表觀分子量約25和55 kDa的兩條帶，這代表所述輕鏈和重鏈的預(yù)計大小。各種抗體系的重鏈大小之間沒有可見不同，但Fog-1抗體的兩條鏈似乎稍小于它們的CAMPATH-1相應(yīng)物。每個系的重鏈似乎具有相同的表觀分子量，這一事實表明所述突變在所述蛋白的糖基化中未產(chǎn)生任何重大差異。對于具有CAMPATH-1特異性的抗體，純化后的產(chǎn)量在每ml上清液0.6-9μg之間變化，而可溶性Fog-1抗體的產(chǎn)量在3-20μg/ml之間。兩個抗體系的純化產(chǎn)量在排序上沒有相關(guān)性表明，說明所述突變沒有一個影響了所述抗體生產(chǎn)或它們結(jié)合A蛋白的能力。
然后測試兩個抗體系的特異性。所述CAMPATH-1抗體顯示與臨床級CAMPATH-1H競爭結(jié)合抗CAMPATH-1獨特型單克隆抗體YID13.9。在作為交聯(lián)試劑的抗人IgG抗體存在下Fog-1抗體能夠凝集RhD+RBC。同樣，通過用不同抗體包被RhD+RBC并使用抗G1m(a)、抗IgG2或抗IgG4抗體作為交聯(lián)抗體觀察凝集形式檢定Fog-1抗體的IgG亞類。結(jié)果表明所述抗體是正確的亞類。然后在過量的CAMPATH-1系抗體存在下，使用Fog-1 IgG1和抗G1m(a)、Fog-1 IgG2和抗IgG2以及Fog-1 IgG4和抗IgG4對RhD+RBC進行凝集。所述CAMPATH-1抗體僅在它們?yōu)榕cFog-1抗體相同的亞類時，才能通過競爭所述交聯(lián)試劑抑制凝集，由此證實它們的亞類。實施例2-FcγRI結(jié)合用在濃度范圍內(nèi)的11種Fog-1抗體的每一種包被每個細胞具有約30000 RhD位點的RBC(R2R2)，并加入到在孔中培養(yǎng)的表達人FcγRI的轉(zhuǎn)染子B2KA中。溫育后，洗出過量的RBC，記錄通過RBC形成花結(jié)的B2KA細胞的百分率(圖1)。對于G1和G1Δa，當在位置327、330和331包括IgG4殘基時，獲得的花結(jié)水平相似，當用約0.1μg/ml的抗體包被RBC時，出現(xiàn)半最大(half-maximal)花結(jié)，F(xiàn)og-1抗體在此濃度預(yù)計應(yīng)占據(jù)約三分之一的RhD位點。G4需要稍高一些的濃度獲得同樣的花結(jié)水平。當使用由包含Δb和Δc突變的G1和G4抗體或G2抗體包被的RBC時，沒有形成花結(jié)。在圖1顯示的試驗中，試驗的最高包被濃度為10mg/ml，這預(yù)示相當于占據(jù)約90％的RhD位點。使用最高至80mg/ml的包被濃度重復(fù)所述試驗，該濃度基本飽和了所述RhD位點，但對于G2和包含Db或Dc突變并由此在鉸鏈區(qū)下部加入IgG2殘基的抗體仍沒有觀察到花結(jié)。這表明即使當用這些抗體于對RBC最大密度包被此抗原時，IgG/FcγgRI的相互作用也不足以形成花結(jié)。
將敏化的RBC和B2KA細胞一起離心，之后在顯微鏡載玻片上觀察花結(jié)，發(fā)現(xiàn)比在孔中溫育所述細胞產(chǎn)生的花結(jié)比例高，所以使用此方法研究對花結(jié)形成的抑制。用1mg/ml Fog-1 G1和不同量的Fog-1 G2Da或Fog-1 G4Db的混合物包被R2R2RBC，之后與B2KA細胞混合。當單獨使用1μg/ml的Fog-1G1時，包被的RBC在95％的B2KA細胞上形成花結(jié)，而在64 mg/ml G2Δa或G4Δb存在下致敏完全消除了花結(jié)形成(未列出數(shù)據(jù))。
通過熒光染色檢測兩個抗體系與在其表面上表達FcγRI cDNA的兩種不同細胞系的結(jié)合。圖2顯示了代表性的試驗。使用CD64抗體檢測，3T3轉(zhuǎn)染子表面表達FcγRI的水平高于B2KA系，這反映出當通過Fc檢測結(jié)合時獲得較高的信號。對于這兩個系，G1和G1Δa抗體以相同的表觀親和力結(jié)合所述受體，這表明在位置327、330和331的突變沒有明顯影響所述相互作用。G4抗體的結(jié)合大約比G1和G1Δa抗體的結(jié)合低3倍。對于G2抗體或任何其它突變抗體幾乎未觀察到結(jié)合，這表明在IgG1和IgG4中的Δb和Δc突變足以將與FcγRI的結(jié)合降低至少104倍。如果和本底或和具有Δb突變的同等抗體比較熒光水平，則在最高試驗濃度的包含Δc突變尤其是G1Δc突變的抗體顯示與FcγRI結(jié)合的程度低。如果如在圖3中所見，最高濃度的CAMPATH-1抗體和B2KA細胞的熒光強度頻率分布圖重疊，則對G1和G1Δa的標繪一致。G1Δb和G1Δc抗體的頻率分布圖明顯不同。實施例3-通過化學(xué)發(fā)光檢測FcγRI觸發(fā)為了通過FcγRI/II檢測機能活動，檢測單核細胞對用Fog-1系抗體致敏的RBC的化學(xué)發(fā)光(CL)應(yīng)答，并相對于每個RBC結(jié)合的抗體分子數(shù)繪圖(圖4)。觀察具有較高量抗體的G1和G1Δa抗體之間的差異，但二者都產(chǎn)生高于抗體濃度范圍的G4抗體的應(yīng)答。G1Δc抗體獲得顯著的觸發(fā)，G1Δac和G4Δc獲得較小程度的觸發(fā)，但其它抗體未產(chǎn)生任何應(yīng)答。
由先前章節(jié)已知缺乏FcγRI觸發(fā)的抗體以增加的濃度和常量的Fog-1 G1混合，并用于致敏RBC。在圖5中顯示了針對RBC的CL應(yīng)答。通過比較所述CL應(yīng)答和G1單獨測定時獲得的CL應(yīng)答，如果假定所述突變體與其相對濃度成比例地替換RBC中的活性G1，則似乎8個抗體中的6個抑制所述反應(yīng)至預(yù)測的程度。對于G2，抑制性作用被延遲，因為產(chǎn)生相同量的抑制需要約3倍多的G2。G1Δc抑制到和其它突變體大約相同的程度，只是所述應(yīng)答未降至零。
有兩篇論文論述了使用化學(xué)發(fā)光預(yù)測體內(nèi)病理學(xué)的嚴重程度，這兩篇論文是Hadley(1995)Transfusion Medicine Reviews 9302-313和Hadley等(1998)Br J Obstet Gynaecol 105231-234。
在這些測定中，超出由BRAD-5單克隆抗體對照產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光30％的結(jié)果應(yīng)可預(yù)示體內(nèi)HDN病狀。因此這些可以封閉至低于30％水平的抗體應(yīng)適用于治療。
測試一個突變抗體Fog-1 G2Δa抑制針對血清的CL應(yīng)答的能力，所述血清包含臨床上顯著的抗體。所述血清包含抗RhD抗體或抗C+D，并在沒有抑制劑的情況下，產(chǎn)生高出以下規(guī)模30％的CL應(yīng)答即表示新生兒嚴重溶血癥和需要子宮內(nèi)輸血的規(guī)模。所述血清與不同濃度的G2Δa混合，混合物用于敏化RBC并檢測單核細胞的應(yīng)答(圖6)。由于所有5種抗RhD血清都封閉在30％以下，所以加入G2Δa抗體降低CL信號。實現(xiàn)此目標需要的抗體量在16-260μg/ml之間變化，所述范圍大概反映出所述血清中抗RhD抗體的不同量和親和力。有兩種對照血清。G2Δa根本不能封閉抗κ血清，因為其反應(yīng)性涉及RBC上的不同抗原。G2Δa只能抑制抗C+D血清的部分活性。實施例4-在補體裂解中的作用圖7顯示了針對G1和G2 CAMPATH-1抗體產(chǎn)生的所有突變顯著降低了它們介導(dǎo)補體裂解的能力。當使用常量的G1和不同量的G2Δa(圖8)進行測定時，所述G2Δa抗體能夠通過CAMPATH-1 G1封閉對PBMC的殺傷作用。實施例5-在ADCC中的作用使用人PBMC作為靶細胞(圖9)檢測CAMPATH-1抗體介導(dǎo)ADCC的能力，使用RhD+RBC作為靶細胞(圖10和10b)檢測Fog-1抗體介導(dǎo)ADCC的能力。圖9顯示CAMPATH-1抗體和一些具有很低活性的突變體在ADCC中的聯(lián)合的能力。圖10和10b顯示Fog-1抗體突變體G1Δab、G1Δac、G2Δa、G4Δb和G4Δc不能支持任何對RBC的殺傷作用。在圖10中，可見到用G2或G4致敏的RBC的一些裂解，但這些抗體在圖10b的分析中沒有明顯活性。這證明了以下觀察即裂解程度可能取決于效應(yīng)細胞的供體，甚至當使用在不同時間取自同一供體的效應(yīng)細胞時裂解程度可能改變。然而，對于以上列出的突變體，沒有觀察到在本底水平以上的活性，盡管已經(jīng)對一系列效應(yīng)細胞供體進行了試驗。
使用一些Fog-1抗體嘗試抑制Fog-1 G1(圖11和11b)和抗RhD血清的臨床樣品(圖12)介導(dǎo)的對RhD+RBC的ADCC。所述圖顯示所有的試驗抗體當在RBC敏化之前與活性抗體混合時，都能夠抑制ADCC。Fog-1突變抗體G1Δb、G1Δab、G1Δac、G4Δb和G4Δc對于封閉ADCC特別有效。實施例6-FcγRII結(jié)合圖13、13b和14分別顯示Fog-1系抗體的復(fù)合物與帶有FcγRIIa131H/H、FcγRIIa 131R/R和FcγRIIb1★的細胞結(jié)合。當檢測與這些受體的結(jié)合時，由于它們對各個抗體分子的低親和性，所以必須形成抗體復(fù)合體。FcγRIIa 131H/H是FcγRIIa的同種異型，IgG2抗體應(yīng)與其強有力結(jié)合，實際上，G1和G2顯示強結(jié)合性(圖13)。向這兩種抗體中加入所述突變似乎逐漸降低結(jié)合水平，而G1Δc和G1Δac抗體僅具有G4抗體所顯示的本底結(jié)合水平。圖13b顯示所述抗體當與FcγRIIa的131R同種異型結(jié)合時具有不同的相對活性，但對野生型G1抗體產(chǎn)生的突變又降低了與所述受體的結(jié)合。所有的所述抗體都顯示與所述抑制性受體FcγRIIb1★的結(jié)合明顯高于陰性對照樣品—單獨的交聯(lián)F(ab′)2或與F(ab′)2復(fù)合的無糖基IgG1抗體(圖14)。盡管大多數(shù)突變體的結(jié)合相對于相應(yīng)的野生型抗體降低，但一些突變體顯示不超出野生型G1抗體具有的結(jié)合兩倍的結(jié)合。實施例6b-FcgRIII結(jié)合圖14b和14c分別顯示Fog-1系抗體的復(fù)合物與帶有FcγRIIIb的同種異型NA1和NA2的細胞結(jié)合。對于這兩種同種異型，觀察到與G1抗體結(jié)合，而與G1Δa和G1Δc抗體的結(jié)合度小。未觀察到結(jié)合其它突變抗體，因為它們顯示與陰性對照樣品—單獨的交聯(lián)F(ab′)2或與F(ab′)2復(fù)合的無糖基IgG1抗體相似的熒光水平。實施例7-產(chǎn)生抗HPA-1a抗體擴增抗HPA-1a ScFv(Griffin，H.M.和Ouwehand，W.H.(1995)對來自V基因噬菌體展示文庫的血小板糖蛋白IIIa的亮氨酸-33形式特異性的人單克隆抗體Blood 86，4430-4436)的VH和Vλ，并通過先前描述的重疊延伸PCR將每種都連接至載體M13VHPCR1(Orlandi等，1989)的前導(dǎo)序列。同樣地將M13VHPCR1中VH的3′和相當于VH-CH內(nèi)含子的5′末端的DNA連接到所述前導(dǎo)序列/VHDNA。將所述產(chǎn)物以HindIII-BamHI片段克隆到IgG1和IgG2表達載體中，以替換存在的可變區(qū)片段和產(chǎn)生載體pSVgptB2VHHuIgG1和pSVgptB2VHHuIgG2。
將在讀框內(nèi)的所述前導(dǎo)序列/VλDNA連接到取自已知表達載體(Routledge，E.G.，Lloyd，I，Gorman，S.D.，Clark，M.和Waldman，H.1991，Eur.J. Immunol.212717)的Kern-Oz-同種異型人λ鏈恒定區(qū)DNA(Rabbitts，T.H.Forster，H.和Matthews，J.G.1983.Mol.Biol.Med.111)。將整個λ基因作為HindIII-BamHI片段克隆到M13中，而pSVhyg-HuCK的鼠重鏈增強子(Orlandi等，1989)使用連接物添加所述基因的5′，以使整個插入片段可以作為BamHI片段轉(zhuǎn)移到pSV2neo(Southern，P.J.和Berg.P.1982.J.Mol.Appl.Genet.1327)中。所述載體命名為pSVneoB2VλHuCλ。
將所述表達載體轉(zhuǎn)染到大鼠骨髓瘤細胞系YB2/0中，選擇轉(zhuǎn)染子并如前所述純化抗體。這些B2IgG1和B2IgG2抗體可以用作對照抗體。
一旦選擇了最好的無效恒定區(qū)，則可以將B2 VH HindIII-BamHI片段引入到具有合適的恒定區(qū)基因的表達載體中，替換存在的可變區(qū)片段。然后可以用pSVneoB2VλHuCλ將所述重鏈表達載體共轉(zhuǎn)染到骨髓瘤細胞中，并純化所述抗體備用。實施例8-結(jié)合分子的治療用途按照本發(fā)明的治療性分子例如可以通過靜脈內(nèi)給予母親，從而依賴胎盤轉(zhuǎn)移(例如經(jīng)FcRn)向胎兒提供治療劑量，用于治療并發(fā)HPA-1a同種異型免疫的妊娠。
另一個選擇是通過經(jīng)皮膚的臍血管加樣直接給予胎兒。此方法目前在FAIT中進行，以輸送匹配的血小板。因為輸入的血小板的存活期短，所以在妊娠過程中該方法可能不得不重復(fù)多次。然而危險的是該方法每一次都具有0.5％的胎兒死亡風險。
但是，胎兒給予治療性抗體應(yīng)當具有以下優(yōu)點即需要的劑量低得多，并由此可以認為使用本發(fā)明所述分子連同血小板輸注的組合方法是治療的第一步。此方法可以在分娩前降低或消除對血小板輸注的進一步需要。結(jié)束語在表2(圖16)中概括了所述抗體的活性。由此可以看出，已經(jīng)產(chǎn)生降低結(jié)合FcγRI、FcγRIIa 131H/H、FcγRIIa 131R/R、FcγRIIIb NA1和FcγRIIIb NA2能力的結(jié)合分子；它們不能引起單核細胞發(fā)光；不能介導(dǎo)補體裂解和沒有ADCC活性。然而，所述結(jié)合分子保留了對抑制性受體FcγRIIb的結(jié)合。先前用于剔除效應(yīng)子功能的其它突變，諸如除去在CH2域中的糖基化位點以產(chǎn)生無糖基抗體，也可以用于消除與可能不需要的受體的結(jié)合。
選擇的突變體已經(jīng)顯示能夠完全抑制FcγRI細胞通過Fog-1 G1形成花結(jié)；抑制單核細胞對Fog-1 G1致敏的RBC的應(yīng)答；抑制單核細胞對多克隆抗RhD致敏的RBC的應(yīng)答；抑制通過由CAMPATH-1G1介導(dǎo)的補體裂解殺傷PMBC；抑制通過由Fog-1 G1介導(dǎo)的ADCC殺傷RBC；抑制通過由多克隆抗RhD血清介導(dǎo)的ADCC殺傷RBC。
本文的結(jié)果證明，改變IgG CH2域中對應(yīng)于不同亞類的即使單一的殘基也可以導(dǎo)致不同的活性。因此考慮三對Db和Dc突變體G1Δb和G1Δc、G1Δab和G1Δac、G4Δb和G4Δc。在每一對中，所述抗體的差別僅是沒有G236的(Δb)或存在G236的(Δc)。然而，就本文檢測的大多數(shù)功能而言，所述Δb和Δc抗體具有不同的活性。所述Db突變體在結(jié)合FcγRIIa 131H/H方面更活躍，而所述Dc突變體在FcγRI結(jié)合、FcγRIIIb NA1和NA2結(jié)合、單核細胞活化和ADCC方面更活躍。產(chǎn)生Δb和Δc突變的區(qū)已知為鉸鏈區(qū)下部或為鉸鏈連接區(qū)，并似乎具有延長的結(jié)構(gòu)，連接所述鉸鏈區(qū)和其余的CH2域。此區(qū)殘基的添加和缺失估計可能改變了鉸鏈區(qū)下部殘基相對于在其余的CH2域中的受體相互作用部位的排列。
然而應(yīng)當強調(diào)的是，不能總是根據(jù)野生型抗體活性推測突變的作用，但所述突變將取決于其中存在所述突變的新情況(基于‘混合的’IgG亞類)。一個實例是在補體裂解測定中，其中IgG2抗體的活性僅有IgG1抗體活性的約三分之一，但將IgG2殘基引入到IgG1中(G1Δb和G1Δc)消除了裂解。同樣地，IgG1和IgG2顯示同等結(jié)合FcγRIIa 131H，但G1Δb和G1Δc的活性分別低50和10倍。在圖9和10的ADCC分析中，IgG2和IgG4產(chǎn)生同樣低但可檢測水平的裂解。在IgG2和IgG4之間置換殘基以及置換殘基到IgG1中降低活性。這些情況表明，不同人IgG亞類的野生型抗體和突變抗體估計可以在結(jié)合其它分子時使用不同的殘基，以觸發(fā)活性。
權(quán)利要求
1.為重組多肽的結(jié)合分子，它包含(i)能夠結(jié)合靶分子的結(jié)合域，和(ii)具有與人免疫球蛋白重鏈的全部或部分恒定區(qū)大致同源的氨基酸序列的效應(yīng)子域；它的特征在于所述結(jié)合分子能夠結(jié)合所述靶分子而不觸發(fā)明顯的依賴于補體的裂解或細胞介導(dǎo)的對所述靶的破壞。
2.在權(quán)利要求1中要求保護的結(jié)合分子，其中所述效應(yīng)子域能夠特異性結(jié)合FcRn和/或FcγRIIb。
3.在權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中要求保護的結(jié)合分子，其中所述效應(yīng)子域是衍生自兩個或兩個以上人免疫球蛋白重鏈CH2域的嵌合域。
4.在權(quán)利要求3中要求保護的結(jié)合分子，其中所述人免疫球蛋白選自IgG1、IgG2和IgG4。
5.在權(quán)利要求3或權(quán)利要求4中要求保護的結(jié)合分子，其中所述效應(yīng)子域衍生自第一個人免疫球蛋白重鏈CH2域，其中所述CH2域的至少1個區(qū)中的至少1個氨基酸已被修飾為第二個不同的人免疫球蛋白重鏈CH2域中的對應(yīng)氨基酸。
6.在權(quán)利要求5中要求保護的結(jié)合分子，其中所述第一個人免疫球蛋白選自IgG1、IgG2和IgG4，而所述第二個人免疫球蛋白選自IgG2和IgG4。
7.在權(quán)利要求3至6的任一項中要求保護的結(jié)合分子，其中所述CH2域的2個不連續(xù)的區(qū)的每一個中的至少2個氨基酸分別被修飾為在第二個和第三個人免疫球蛋白重鏈CH2域的對應(yīng)區(qū)中的對應(yīng)氨基酸。
8.在權(quán)利要求7中要求保護的結(jié)合分子，其中所述2個不連續(xù)的區(qū)是殘基233-236和327-331。
9.在權(quán)利要求3至8的任一項中要求保護的結(jié)合分子，其中所述效應(yīng)子域與所述第一個人免疫球蛋白重鏈CH2域具有至少約90％的序列同一性。
10.在權(quán)利要求3至9的任一項中要求保護的結(jié)合分子，它包含在所述位置具有一個或多個以下氨基酸或缺失的人免疫球蛋白重鏈CH2域位置氨基酸233 P234 V235 A236 (無殘基)或G327 G330 S331 S 。
11.在權(quán)利要求3至10的任一項中要求保護的結(jié)合分子，它包含在所述位置具有一個或多個以下氨基酸區(qū)段或缺失的人免疫球蛋白重鏈CH2域233P、234V、235A和236無殘基；或233P、234V、235A和236G；和/或327G、330S和331S。
12.在權(quán)利要求9至11的任一項中要求保護的結(jié)合分子，其中所述效應(yīng)子域選自G1Δab、G2Δa或G1Δac。
13.在權(quán)利要求3至12的任一項中要求保護的結(jié)合分子，它進一步包含使所述分子為大致無效同種異型的修飾。
14.在權(quán)利要求5至13的任一項中要求保護的結(jié)合分子，其中所述效應(yīng)子域與所述第一個或第二個人免疫球蛋白重鏈CH2域相比，對FcγRI、FcγRIIa或FcγRIII的親和力下降以及介導(dǎo)補體裂解的能力下降。
15.在權(quán)利要求14中要求保護的結(jié)合分子，其中所述效應(yīng)子域保留對FcγRIIb的親和力。
16.在前述的權(quán)利要求的任一項中要求保護的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合域衍生自與所述效應(yīng)子域不同的來源。
17.在前述的權(quán)利要求的任一項中要求保護的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合域選自抗體；酶；激素；受體；細胞因子或抗原；配體和粘附分子的結(jié)合部位。
18.在前述的權(quán)利要求的任一項中要求保護的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合域能夠結(jié)合以下任一種分子紅細胞的RhD抗原；血小板的HPA同種抗原；嗜中性粒細胞抗原；T細胞受體；整合蛋白；GBM膠原蛋白；DerP1；HPA-1a；VAP-1；層粘連蛋白；lutheran；血小板糖蛋白VI；血小板糖蛋白Ia/IIa 。
19.在權(quán)利要求18中要求保護的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合域選自CAMPATH-1和FOG-1；OKT3；B2(抗HPA-1a)；VAP-1；鼠抗α3(IV)NC1；YTH12.5(CD3)；2C7(抗Der p I)；抗層粘連蛋白；抗lutheran的結(jié)合域。
20.包含核苷酸序列的分離的核酸，所述核苷酸序列編碼在前述權(quán)利要求的任一項中要求保護的所述結(jié)合分子的效應(yīng)子域。
21.在權(quán)利要求20中要求保護的核酸，其中所述核苷酸序列編碼在前述權(quán)利要求的任一項中要求保護的結(jié)合分子。
22.在權(quán)利要求20或權(quán)利要求21中要求保護的為可復(fù)制載體的核酸。
23.在權(quán)利要求22中要求保護的核酸，其中所述核苷酸序列可操作地連接至啟動子。
24.包含權(quán)利要求22或權(quán)利要求23的載體或用它們轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
25.產(chǎn)生在權(quán)利要求1至19的任一項中要求保護的結(jié)合分子的方法，該方法包括以下步驟修飾編碼第一個人免疫球蛋白重鏈CH2的核苷酸序列，以使所述CH2域的至少1個區(qū)中的至少1個氨基酸對應(yīng)于第二個人免疫球蛋白重鏈CH2域的氨基酸。
26.在權(quán)利要求1至19或21至23的任一項中要求保護的結(jié)合分子或核酸的用途，它用于結(jié)合靶分子和所述結(jié)合分子。
27.在權(quán)利要求26中要求保護的用途，其中所述靶分子是FcγRIIb，所述結(jié)合引起對以下一種或多種作用的抑制B細胞活化；肥大細胞脫顆粒；吞噬。
28.在權(quán)利要求26中要求保護的用途，用于防止、抑制或相反干擾第二個結(jié)合分子與所述靶分子結(jié)合。
29.在權(quán)利要求28中要求保護的用途，其中所述第二個結(jié)合分子是抗體。
30.在權(quán)利要求28或權(quán)利要求29中要求保護的用途，其中所述靶分子選自紅細胞的RhD抗原；血小板的HPA同種抗原；嗜中性粒細胞抗原；T細胞受體；整合蛋白；GBM膠原蛋白；Der P1；HPA-1a；VAP-1；層粘連蛋白；lutheran；血小板糖蛋白VI；血小板糖蛋白Ia/IIa。
31.在權(quán)利要求27至30的任一項中要求保護的用途，用于治療患以下疾病的患者移植物抗宿主疾病；宿主抗移植物疾病；器官移植排斥；骨髓移植排斥；自身免疫，諸如結(jié)節(jié)性脈管炎、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少和關(guān)節(jié)炎；同種異體免疫，諸如胎兒/新生兒同種異體免疫性血小板減少；哮喘和變態(tài)反應(yīng)；慢性或急性炎癥性疾病，諸如Chrohn病；HDN；Goodpasture，鐮狀細胞性貧血，冠狀動脈閉塞。
32.在權(quán)利要求26至31的任一項中要求保護的用途，其中所述結(jié)合分子給予患者，或可選地在所述患者是未出生嬰兒的情況下，給予所述患者的母親。
33.包含在權(quán)利要求1至19的任一項中要求保護的結(jié)合分子或在權(quán)利要求21至23的任一項中要求保護的核酸加上藥學(xué)上可接受載體的藥用制劑。
34.一種寡核苷酸，它選自MO22BACK 5′TCT CCA ACA AAG GCC TCC CGT CCT CCATCG AGA AAA 3′，MO225′TTT TCT CGA TGG AGG ACG GGA GGC CTT TGTTGG AGA 3′，MO7BACK5′TCC TCA GCA CCT CCA GTC GCG GGG GGACCG TCA GTC 3′，MO215′GAC TGA CGG TCC CGC GAC TGG AGG TGC TGAGGA 3′。
全文摘要
公開了為重組多肽的結(jié)合分子,它包含:(ⅰ)能夠結(jié)合靶分子的結(jié)合域,和(ⅱ)具有與人免疫球蛋白重鏈的全部或部分恒定區(qū)大致同源的氨基酸序列的效應(yīng)子域;它的特征在于所述結(jié)合分子能夠結(jié)合所述靶分子而不觸發(fā)明顯的依賴于補體的裂解或細胞介導(dǎo)的對所述靶的破壞,更優(yōu)選其中所述效應(yīng)子域能夠特異性結(jié)合FcRn和/或FcγRⅡb。所述結(jié)合分子通常基于衍生自兩個或兩個以上人免疫球蛋白重鏈C
文檔編號A61K48/00GK1308637SQ9980816
公開日2001年8月15日 申請日期1999年5月7日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月8日
發(fā)明者K·L·阿穆爾, M·R·克拉克, L·M·威廉森 申請人:劍橋大學(xué)技術(shù)服務(wù)有限公司