專利名稱：Dna固相擴增與流式檢測分析技術(shù)與試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高通量DNA固相擴增與流式檢測分析技術(shù)及試劑盒的制備方法。該技術(shù)準(zhǔn)確、靈敏、快速、信息量大，制備方法簡便、成本低，能同時檢測樣品中多種不同的蛋白、核酸分子、生物化學(xué)分子、微生物或細(xì)胞等成分，可廣泛地用于生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、動植物學(xué)、農(nóng)牧業(yè)、食品與衛(wèi)生、能源與化工、環(huán)境監(jiān)測以及醫(yī)學(xué)診斷與檢測等領(lǐng)域。
固相吸附、分離與合成技術(shù)在樣品或樣品溶液、生物體液(如血液、血清、血漿、腦脊液、尿液等，淚液、汗液、消化液和精液等分泌液，組織液、滲出液、嘔吐物、糞便、組織/細(xì)胞勻漿液等)、微生物或細(xì)胞中的蛋白、核酸等生物、化學(xué)分子的檢測、分析、分離、純化以及蛋白多肽、寡核苷酸、先導(dǎo)化合物和藥物的合成等方面已被廣為應(yīng)用。
生物固相技術(shù)主要是利用不溶的固相基質(zhì)材料，通過表面吸附或結(jié)合以捕獲液相被分析物和被純化物中的靶分子或固定新合成的靶分子，借助重力、壓力、離心、過濾、磁力、流體等，經(jīng)過一步或多步操作很方便的將未結(jié)合的分子(液相、游離相或流動相)與結(jié)合分子(固相)分離，以便獲得純的目的分子，或?qū)蟹肿訌膹?fù)雜的樣品混合物或懸液中分離出來，用于進一步的分析研究。
在樣品的檢測分析、分離純化、合成等實驗中，大部分情況下需要在同一個容器里、同時進行兩項或多項實驗，以便對樣品中多種不同成分的有無、含量和來源等做出平行的比對以及定性、定量、定位等檢測分析；或?qū)我环N分子的多種不同特性(如單核苷酸多樣性)進行平行檢測與分析；或?qū)Χ喾N物質(zhì)同時進行分離純化，或同時進行多種不同分子的合成。在此情況下，傳統(tǒng)的固相吸附試驗所存在的問題是對超過3種以上的不同被檢測物，被純化物或合成物由于難以區(qū)分，很難同時進行。也就是說，用傳統(tǒng)的固相技術(shù)或方法，在一個容器或試驗中被檢測物、合成物或分離物的數(shù)量受固相系統(tǒng)的限制或制約，更無法同時或連續(xù)進行合成、分離與檢測等操作。
在現(xiàn)代基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、功能組學(xué)、組合化學(xué)的分析研究和生物醫(yī)學(xué)診斷和新藥研究開發(fā)中，需要同時對同一樣品中大量的、多種不同生物、化學(xué)物質(zhì)進行快速、靈敏的高通量合成、分離、純化與檢測，以分析生物、化學(xué)物資的種類、數(shù)量、組成、變異以及多態(tài)性、翻譯后修飾、序列結(jié)構(gòu)、不同生物分子間的相互作用，個體健康、感染狀態(tài)與用藥特性，個體免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)、遺傳差異等。傳統(tǒng)解決辦法是首先通過分離提取、純化或人工合成等技術(shù)和工藝，分別進行大量制備，以獲得各種不同的生物或化學(xué)分子(如核酸或寡核苷酸、蛋白與多肽、生長因子與受體、抗原與抗體等各種不同特性的生物分子)；然后，再分別將生物分子探針固相化在不同的固相基質(zhì)(如載玻片、微孔板或?qū)游龌|(zhì))的表面，與樣品中對應(yīng)的抗原抗體或核酸等化學(xué)物質(zhì)分別反應(yīng)，分別進行檢測分析。由于合成與制備、分離與純化同檢測與分析等各個操作環(huán)節(jié)彼此互無聯(lián)系、相互脫節(jié)，因此如要檢測十幾種成分就需進行十幾次不同的合成、分離純化與檢測分析實驗，異常繁瑣復(fù)雜。特別是在抗體、單克隆抗體、基因工程抗體、生物藥等的大規(guī)模制備中，需要對大量的細(xì)胞、細(xì)菌、真菌、支原體、立克次氏體和病毒等微生物體，尤其是帶有大量特定的重組基于、蛋白、酶類、抗體、抗原表位，展示肽等生物分子的基因工程菌、生物工程細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)菌、轉(zhuǎn)染和感染的真菌和動植物細(xì)胞以及重組質(zhì)?；虿《镜冗M行高通量篩選與分析。這些工程微生物體除帶有與自身生物學(xué)特性相關(guān)的生物分子外還帶有插入基因、感染或轉(zhuǎn)染病毒等所賦予的特殊生物分子，是生物、醫(yī)學(xué)檢測和分析及基礎(chǔ)研究的重要生物材料。而現(xiàn)有的技術(shù)方法只能通過免疫細(xì)胞化學(xué)等方法逐一培養(yǎng)、固定以及篩選與檢測分析，操作異常復(fù)雜、繁瑣。如在組合化學(xué)等分子文庫的研究中，Kits Lam等提出的一珠一物法，雖然可以很便捷地進行高通量篩選，但因必須對篩選出的陽性微珠所吸附的多肽或寡核苷酸逐一進行測序分析，費時費力；此后他們又提出了在一個微珠上同時進行寡核苷酸與多肽合成的方法，用寡核苷酸序列對氨基酸序列進行編碼，或用氨基酸序列對寡核苷酸序列進行編碼。該方法不僅沒有減少對后續(xù)測序分析等的操作，而且還增加了前期的合成制造的成本與復(fù)雜性，不便進行產(chǎn)業(yè)化。本發(fā)明的目的就是要通過幾種簡單有效的位序編碼方法和DNA固相合成與擴增技術(shù)為多種不同物質(zhì)成分、特別是核酸、蛋白分子以及藥物及其前體等的合成、分離與純化、檢測和篩選等提供一種制造成本低，便于產(chǎn)業(yè)化，而技術(shù)和工藝更為簡便靈敏、快速準(zhǔn)確；同時又可將三者有機結(jié)合，貫通一起的新的高通量篩選與檢測分析技術(shù)。
本發(fā)明的主要技術(shù)特征是，對固相自動合成、DNA固相擴增、以及固相分離純化和微載體懸浮培養(yǎng)等所獲得的保留在固相微粒表面的活性分子的結(jié)構(gòu)、特性等運用不同的位序編碼技術(shù)進行編碼，配合高通量流式檢測分析技術(shù)用于樣品中的核酸、蛋白、多糖、脂類，多肽和寡核苷酸及其衍生物以及天然與仿生藥物、藥物前體與先導(dǎo)化合物等化學(xué)分子的大規(guī)模、高通量檢測、分析與篩選。
本項發(fā)明同時還提供了基于本項技術(shù)發(fā)明制備試劑盒的方法，其主要技術(shù)特征在于試劑盒由裝有一定數(shù)量的、表面分別帶有某種特定序列或結(jié)構(gòu)的生物或化學(xué)分子的可編碼固相微粒與各種相關(guān)的配套試劑共同或分別組成，以實現(xiàn)對同一樣品或不同樣品中同一成分或多種不同成分同時進行比對分析；同時利用試劑盒中所提供的試劑還可對各陽性微粒所捕獲的樣品成分，做分子克隆、分子結(jié)構(gòu)、親和力、分子量、等電點、序列測定等進一步分析。該試劑盒不僅大大簡化了樣品檢測分析的操作步驟，縮短了操作時間，降低了工作強度，更增加了檢測結(jié)果的精確性、靈敏度、重現(xiàn)性和可比性，而且還可同時對檢測樣品中不同的物質(zhì)成分做各種進一步的分析，使用更方便，操作快捷，可廣泛地應(yīng)用于環(huán)境檢測、疾病診斷、新藥開發(fā)與篩選、疫苗研究、生物分子相互作用、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和功能組學(xué)等技術(shù)、研究領(lǐng)域。
為了達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案其基本特征在于DNA固相擴增與流式檢測分析技術(shù)及試劑盒的制備方法，至少包括下述成分或步驟①一定數(shù)量的可編碼固相微粒，由可編碼裝置、基質(zhì)、連接分子層以及位于表面的活性分子組成；可編碼裝置分內(nèi)置式和外置式；內(nèi)置式可編碼裝置由基質(zhì)包裹，位于可編碼固相微粒的核心；基質(zhì)表面為連接分子層，可將相同或不同的表面活性分子連接在固相顆粒的表面；表面活性分子可與樣品中的生物、化學(xué)分子特異結(jié)合或雜交在一個微粒表面通常只連接一種表面活性分子；②封閉為減少后續(xù)操作中可能存在的非特異性結(jié)合，用封閉液(如含添加劑的PBS、或HEPES等緩沖液)處理固相微粒，以封閉和去除其表面可能存在的非特異性結(jié)合位點；③編碼根據(jù)可編碼固相顆粒的數(shù)量、實驗操作流程和位序等，按一定的方式將固相顆粒表面活性分子的結(jié)構(gòu)、特性等生物、化學(xué)信息進行編碼并存入可編碼裝置中；④樣品固/液體標(biāo)本、樣品溶液、生物體液、微生物或細(xì)胞中的蛋白、核酸、各種組合化學(xué)庫、分子庫及展示系統(tǒng)中的蛋白多肽、寡核苷酸、先導(dǎo)化合物與合成藥物分子庫等的生物、化學(xué)分子，經(jīng)過處理，如溶解、稀釋、濃縮、裂解或勻漿、分離與純化、去除顆粒和不溶成分、提取有效成分(如DNA，RNA，mRNA，蛋白和多肽、脂和脂類、糖和多糖等)，反轉(zhuǎn)錄以及延長或擴增與標(biāo)記等；或不經(jīng)處理直接與各固相微粒表面的各種相同或不同生物、化學(xué)分子相互作用，樣品中的被檢分子或靶分子與各固相分子特異性雜交或結(jié)合；⑤標(biāo)記被檢樣品用標(biāo)記分子，如熒光素、同位素、生物素或半抗原，膠體金、酶、稀土離子及其螯合物等物質(zhì)或其衍生物(如Cy5-dCTP，32P-dCTP等)直接標(biāo)記；或用標(biāo)記分子的不同標(biāo)記物，如熒光抗體等標(biāo)記被檢樣品；⑥漂洗借助重力、壓力、離心、過濾、磁力、流體等，用不同特性的洗液，經(jīng)過一步或多步操作，將未結(jié)合的分子(在液相、游離相或流動相中)與結(jié)合分子(固相)分離，去除固相微粒表面非特異性結(jié)合的或殘留的樣品、標(biāo)記樣品或標(biāo)記物等；或用洗脫液經(jīng)連續(xù)或不連續(xù)的梯度和非梯度洗脫，將特異性結(jié)合在固相微粒表面的樣品成分解吸附；⑦檢測與分析對固相基質(zhì)表面保留的標(biāo)記分子或標(biāo)記物的有無、強弱以及含量用流式細(xì)胞儀、掃描儀等進行檢測和分析；⑧解碼識別可編碼裝置中存儲的編碼信號，將編碼信號轉(zhuǎn)換為反映固相微粒表面所結(jié)合的生物、化學(xué)分子結(jié)構(gòu)等信息的可讀數(shù)據(jù)；本發(fā)明的特征還在于可編碼固相微粒是由可編碼裝置及包裹在其外表面的固相基質(zhì)組成；固相基質(zhì)為任何可加工成型、透光的、不透光的或反光的硬質(zhì)或軟質(zhì)、單體或復(fù)合材料，如玻璃、塑料、葡聚糖、聚蔗糖、瓊脂糖、高分子合成材料、纖維素、乳膠、硅膠、層析基質(zhì)、陶瓷、磁性材料、金屬或非金屬或復(fù)合材料，經(jīng)加工而成的，大小均一、具有不同外觀形狀的空心體、多孔或?qū)嵭捏w；微粒經(jīng)表面處理可獲得具有不同活性基團的連接分子層，并通過活性基團進一步與不同的核酸或寡核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽等生物分子或化學(xué)分子連接，獲得具有不同結(jié)合特性的表面活性分子。
本發(fā)明的特征還在于可編碼裝置是可存儲或記憶固相微粒所攜帶的表面活性分子的結(jié)構(gòu)與特性等信息的，內(nèi)置式微型元器件與結(jié)構(gòu)或外置的微型結(jié)構(gòu)或設(shè)備；可編碼裝置對固相微粒所攜帶的表面活性分子的結(jié)構(gòu)與特性等信息的存儲或記憶可用下述方法之一或組合予以實現(xiàn)①可編碼裝置由內(nèi)置的微型能量轉(zhuǎn)換器、存儲器、信號發(fā)生器、信號放大器、發(fā)射裝置等結(jié)構(gòu)組成，通過光電、聲電、電磁波、磁性介質(zhì)等信息載體，存儲、記憶和傳遞分子結(jié)構(gòu)信息；實驗前或?qū)嶒炛心芰哭D(zhuǎn)換器接收編碼器(外置)的控制信號，自啟動，將分子結(jié)構(gòu)等編碼信息通過能量轉(zhuǎn)換器存入存儲器；分析檢測時能量轉(zhuǎn)換器接收解碼器的控制信號，自啟動，發(fā)射存儲信息給解碼器，實現(xiàn)對固相微粒表面活性分子的結(jié)構(gòu)、特性等信息的編碼、存儲和識別；通過編碼、存儲編碼信息、接收外來編碼信號和控制信號，自啟動，發(fā)射存儲信息給解碼器，實現(xiàn)對固相微粒表面活性分子結(jié)構(gòu)信息的編碼、存儲和識別；②可編碼裝置由內(nèi)置的微型存儲介質(zhì)、條形碼或數(shù)碼、光斑、凹斑等組成，通過存儲介質(zhì)上的條形碼、數(shù)碼、光斑或凹斑等信息載體存儲、記憶和傳遞分子信息；存儲介質(zhì)為任何可加工成型的，透光或不透光、反光或不反光、硬質(zhì)或軟質(zhì)、金屬或非金屬、硅及其氧化物、導(dǎo)體或半導(dǎo)體、塑料、陶瓷、玻璃等，能記錄條形碼等的單體或復(fù)合基質(zhì)材料；實驗前或?qū)嶒炛型ㄟ^光刻或蝕刻將分子結(jié)構(gòu)與特性等信息以條形碼等形式刻錄在存儲介質(zhì)上；分析檢測時由讀碼器讀取并識別條形碼或數(shù)碼等，解讀分子結(jié)構(gòu)信息，以實現(xiàn)對分子結(jié)構(gòu)與特性等信息的編碼、存儲和識別；③位序編碼裝置由自動進樣器和樣品盤等結(jié)構(gòu)組成，通過樣品在樣品盤中的位置和進樣順序?qū)崿F(xiàn)對分子結(jié)構(gòu)等信息的編碼、存儲與傳遞；④可編碼裝置為具有微流路的微孔板，利用微孔在微孔板上的位置和排列順序，對鑲嵌在微孔中固相微粒的表面活性分子的結(jié)構(gòu)與特性等信息進行編碼、存儲和識別；本發(fā)明的特征還在于連接分子層可分別由具有親水、疏水、長臂、短臂，直鏈或支鏈等分子特性的連接分子所形成的單分子層結(jié)構(gòu)組成；連接分子一端連接在固相基質(zhì)分子上，其游離端具有活性基團可連接各種化學(xué)或生物分子；本發(fā)明的特征還在于表面活性分子是指通過連接分子層上的活性基團連接的不同的蛋白質(zhì)、多肽、糖、多糖、脂和脂類、核酸或寡核苷酸及其衍生物、藥物分子及其前體或先導(dǎo)化合物等大分子或小分子化合物，在固相微粒表面形成的具有一定結(jié)合特性的活性分子；在一個微粒表面通常只有一種表面活性分子，其種類和制備方法至少包括①通過多肽合成儀、DNA合成儀或其它固相合成技術(shù)，直接在固相微粒的基質(zhì)表面合成各種多肽、糖、寡糖、酯、類脂、寡核苷酸分子及其衍生物、藥物分子及其前體或先導(dǎo)化合物等活性分子，并保留在固相微粒表面；②通過連接分子上的活性基團，連接各種不同的多肽、蛋白質(zhì)、糖、寡糖、多糖、脂、類脂、核酸或寡核苷酸及其衍生物、藥物分子及其前體或先導(dǎo)化合物等活性分子；③以微粒表面的特異性寡核苷酸分子為固相化引物，與游離的寡核苷酸引物配對，以已知序列的核酸分子為模板，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)延長寡核苷酸鏈并擴增獲得表面活性分子；PCR循環(huán)反應(yīng)包括a)加熱變性使雙鏈或環(huán)化的單鏈核酸分子解鏈；b)退火，引物與模板核酸分子雜交；c)在DNA聚合酶的作用下，引物沿5’→3’方向延長靶核苷酸鏈。
④以微粒表面的特異性寡核苷酸分子為固相化引物，與游離的寡核苷酸引物配對，以已知序列的核酸分子為模板，在微粒表面通過鏈接酶鏈反應(yīng)(LCR)延長寡核苷酸鏈并擴增獲得表面活性分子；LCR循環(huán)反應(yīng)包括a)加熱變性；b)退火，引物與模板核酸雜交；c)在DNA鏈接酶的催化下引物核酸分子連接；⑤以微粒表面的特異性寡核苷酸分子為固相化引物，與游離的寡核苷酸分子引物配對，以已知序列的核酸分子為模板，在微粒表面通過鉚接聚合酶鏈反應(yīng)(RCR)延長寡核苷酸鏈并擴增獲得表面活性分子；RCR循環(huán)反應(yīng)包括a)加熱變性；b)退火，引物與模板核酸雜交；c)DNA聚合酶延長靶核苷酸鏈序列；d)DNA鏈接酶連接。
⑥以親合、吸附層析材料為固相基質(zhì)，通過配基配體、抗原抗體等結(jié)合反應(yīng)將生物分子吸附在固相微粒表面，為避免解吸附可用交聯(lián)劑進一步交聯(lián)；⑦將微粒與細(xì)菌、細(xì)胞等微生物體共育或共培養(yǎng)，使微生物體附著在微粒表面；本發(fā)明的特征還在于樣品核酸分子可用PCR反應(yīng)，進行至少一個循環(huán)的延長或擴增以提高靈敏度；延長或擴增反應(yīng)可通過下述方式進行①反應(yīng)在液相中進行，引物全部溶于液相中；②反應(yīng)在固-液相界面上進行，其中有一條引物固相化在微粒的固相基質(zhì)表面，用至少一個循環(huán)的PCR反應(yīng)進行擴增或延長；③反應(yīng)在固-液相界面上進行，其中有一條引物固相化在微粒的固相基質(zhì)表面，用至少一個循環(huán)的LCR反應(yīng)進行延長和擴增；④反應(yīng)在固-液相界面上進行，其中有一條引物固相化在微粒的固相基質(zhì)表面，用至少一個循環(huán)的RCR反應(yīng)進行延長和擴增；本發(fā)明的特征還在于以熒光染料(如FITC，Cy3，Cy5，Texas Red等熒光素)、同位素(125I，32P，35S，3H等)、生物素和半抗原，膠體金、酶(HRP，AP，半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，尿素梅和熒光素酶等)、稀土離子(如Eu，Sm，Tb和Dy等)及其螯合物(如Eu3+-DTPA)等標(biāo)記分子或其衍生物(如Cy5-dCTP，32P-dCTP等)通過摻入法、化學(xué)修飾、末端標(biāo)記、缺口平移等標(biāo)記方法直接標(biāo)記被檢樣品；或用標(biāo)記分子的不同標(biāo)記產(chǎn)物，如熒光抗體、酶標(biāo)抗體、生物素化抗體、生物素化酶、Eu3+-DTPA-抗體等能與樣品中的被檢物特異性結(jié)合的標(biāo)記物標(biāo)記被檢樣品(間接標(biāo)記)。
本發(fā)明的特征還在于固相化引物是指①DNA固相合成儀合成的，仍保留在固相基質(zhì)上的合成產(chǎn)物；②由5’端與固相基質(zhì)連接的寡核苷酸分子；③通過3’端第1-5位任意一個堿基上的側(cè)鏈基團與固相基質(zhì)連接，保留游離的3’末端堿基的寡核苷酸分子；④以表面帶有游離的3’末端堿基的微粒為固相基質(zhì)，該種固相基質(zhì)由3’端第1-5位任意一個堿基上的側(cè)鏈基團與固相基質(zhì)連接，經(jīng)固相合成延長獲得的寡核苷酸分子產(chǎn)物；本發(fā)明的特征還在于試劑盒中至少有一管裝有一定數(shù)量的可編碼固相基質(zhì)微粒，微粒表面可分別連接某種特定序列或結(jié)構(gòu)的多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、核酸分子，糖、寡糖、多糖，酯或類脂等以及藥物前體、前體化合物等表面活性分子，并與下述成分分別或共同組成不同的試劑盒①至少有一管為樣品處理液；用于組織/細(xì)胞或微生物樣品的裂解和DNA，RNA，mRNA或蛋白質(zhì)、多糖等的提?。惶幚硪嚎煞謩e含有適量的去垢劑(如Triton X-100，NP40，Chaps等)、核酸酶抑制劑(如DNA酶和RNA酶抑制劑)、蛋白酶抑制劑，如PMSF，EDTA，TPCK，TLCK，aprotinin，leupeptin，antipain等，以保證顆粒樣品充分裂解和溶解，同時保證DNA、RNA或蛋白分子等不被降解；②至少有一管分別為dNTP(三磷酸脫氧核苷)，引物和熱穩(wěn)定DNA聚合酶、耐熱或不耐熱的DNA鏈接酶(Ligase)等用于樣品的擴增或捕獲的樣品核酸成分的基因克??；③至少有一管分別為dNTP和反轉(zhuǎn)錄酶，用于互補DNA的合成；④至少有一管為含標(biāo)記分子及其衍生物(如FITC，Cy3，Cy5，Texas Red，地高辛和生物素、Cy5-dCTP，32P-dCTP等)或標(biāo)記物(如熒光抗體、酶標(biāo)抗體等)用于對樣品進行直接或間接標(biāo)記的標(biāo)記試劑；⑤在標(biāo)記分子或標(biāo)記物為酶類時，至少有一種顯色底物或發(fā)光底物，如OPD或DAB與過氧化氫/脲、魯米諾，甲基傘形酮磷酸酯，ATP等；⑥至少有一管洗滌液或其濃縮液，如含有適量BSA或小牛血清、鮭精DNA，脫脂奶粉、去垢劑等的緩沖液，用于漂洗或流洗，以去除反應(yīng)中的各種非特異性結(jié)合物；⑦至少有一管為蛋白質(zhì)濃度檢測分析試劑，如Folin-酚試劑，Bradford試劑等；⑧至少有一管分別為核酸內(nèi)切酶(如EcoRI等)、蛋白水解酶(如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，羧肽酶等)、磷酸酶(如細(xì)菌堿性磷酸酶，馬鈴薯磷酸酶等)和蛋白質(zhì)糖基化試劑(如PNGaseF)，用于核酸或蛋白的消解，以便對被捕獲分子進行質(zhì)譜、核苷酸或氨基酸序列、蛋白質(zhì)的糖基化或磷酸化等進行分析；⑨至少有一管為染色液，如革蘭氏染液、H-E染液、姬姆薩染液等，用于細(xì)菌或細(xì)胞等微生物體的染色或復(fù)染；⑩至少有一管為電泳樣品緩沖液，如含適量SDS或尿素等不同蛋白質(zhì)變性劑的SDS-PAGE電泳樣品緩沖液或含有尿素或Chaps等的IEF電泳樣品緩沖液及核酸電泳樣品緩沖液等用于電泳分析。
本發(fā)明的特征還在于可以用試劑盒中的試劑通過下述不同的方法對可編碼固相微粒表面所結(jié)合的樣品成分分別做基因克隆、質(zhì)譜分析、序列測定、蛋白質(zhì)磷酸化、糖基化或電泳等進一步分析前的處理(1)在微孔板上感興趣的陽性微孔中直接加入PCR、LCR、RCR試劑或核酸內(nèi)切酶、蛋白水解酶、磷酸酶或電泳樣品緩沖液、蛋白質(zhì)糖基化等分析試劑，對結(jié)合物在原位做進一步分析前的樣品處理；(2)將分選的陽性微粒在微量反應(yīng)器中加入PCR、LCR、RCR試劑或核酸內(nèi)切酶、蛋白水解酶、磷酸酶或電泳樣品緩沖液或蛋白質(zhì)糖基化分析等試劑做進一步分析前的樣品處理；(3)將新鮮樣品分別與感興趣陽性微孔或微粒的復(fù)本微粒共育，以同樣的條件重復(fù)微孔板的操作步驟，將樣品中感興趣的物質(zhì)成分吸附在微粒上，充分漂洗去除非特異結(jié)合的樣品混合物，分裝并加入PCR、LCR、RCR試劑、核酸內(nèi)切酶或蛋白水解酶、磷酸酶或電泳樣品緩沖液或蛋白質(zhì)糖基化分析等試劑，對結(jié)合物做進一步分析前的樣品處理。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點1效率高、信息量大。固相微粒的大小可從毫米到納米，目前各種商售的固相基質(zhì)顆粒和細(xì)胞培養(yǎng)專用微載體一般均可在幾十納米到毫米之間，如以20微米顆粒計算，則每毫升中約有1億枚左右。FACS的檢測分析速度有數(shù)萬枚/秒，因此只需數(shù)分鐘就可完成近千萬種不同生物或化學(xué)分子的檢測分析與分選。2.易于制備、成本低。本發(fā)明所述的固相微粒易于加工更有各種商售產(chǎn)品可選用，如固相合成用多孔玻璃珠、聚苯乙烯珠、各種層析基質(zhì)、硅膠和細(xì)胞培養(yǎng)微載體等；本發(fā)明將固相合成、固相分離純化等技術(shù)與流式分析技術(shù)融為一體，省略了繁雜的生物分離純化過程，大大簡化了制造工藝；而簡單靈活的編碼方式，解決了高通量篩選后對固相微粒表面活性分子的序列等結(jié)構(gòu)進行大量分析的問題，易于實現(xiàn)；3.自由組合，靈活易變。本發(fā)明提供的各種可編碼裝置其編碼信息量大，而且還可以依照使用目的的不同，多種編碼方式聯(lián)合使用，可滿足大庫容的組合化學(xué)、抗體庫、隨機多肽庫等分子文庫的構(gòu)建與篩選中對編碼與解碼過程要求靈活、簡便、易行的需求；4.吸附容量大，靈敏度高。球形或多面體的固相微粒，與現(xiàn)有生物芯片技術(shù)相比，有更大的比表面積和比結(jié)合容量。為提高反應(yīng)靈敏度，還可采用大孔微粒(如納米級孔徑)，使比表面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過現(xiàn)有技術(shù)和方法，故更加靈敏；5.操作簡便，節(jié)省樣品與試劑。實施中所有固相微粒表面活性分子與樣品的結(jié)合、漂洗、分離以及標(biāo)記等反應(yīng)均可在同一個容器中同時進行，改變了傳統(tǒng)和現(xiàn)有技術(shù)分別反應(yīng)、清洗或在較大的容器中反應(yīng)和浸洗的操作方式，因此，不僅可大量節(jié)約試劑，并且易于實現(xiàn)全自動化操作；6.定量分析更準(zhǔn)確。將成千上萬種化學(xué)物質(zhì)和生物分子的檢測分析集中在同一個容器中同時進行，不僅可避免操作誤差，同時又便于不同樣品間和同一樣品不同成份間的平行比對。此外，固相微粒表面活性分子的包被、連接或微生物體的附著等可同時在同一容器中一次性大量制備，因而可保證各微粒之間的檢測結(jié)果的平行一致。采用微孔板編碼方式時，通過增加復(fù)孔數(shù)配合微流路可實現(xiàn)對結(jié)合成分的精確定量分析，解決了定量分析的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和不同實驗室及不同批次檢測分析結(jié)果的可比對性問題；7.保留了傳統(tǒng)和現(xiàn)有檢測方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高、可靠性強等優(yōu)特點。8.結(jié)果易于分析。由于微粒的編碼和解碼由不同的儀器設(shè)備分別進行，即編碼可以在實驗前、實驗中或?qū)嶒灪筮M行；而在解碼識別時可與檢測同時并行，使得檢測結(jié)果的分析可以完全自動化，并且簡便易行。9.用途更廣泛。本發(fā)明不僅可用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、功能組學(xué)等現(xiàn)代生命科學(xué)的研究；而且還可直接用于新藥的研究開發(fā)和疾病的診斷；對感興趣的陽性微粒還可直接進行基因克隆、核苷酸序列分析、結(jié)合物的分子量、等電點、結(jié)構(gòu)、功能、親和力、組織/細(xì)胞及亞微或超微結(jié)構(gòu)定位等進一步分析，對結(jié)合物的不同解吸附條件的研究還可直接用于后續(xù)的靶分子的分離純化。
下面結(jié)合附圖作進一步的說明

圖1.可編碼固相微粒的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖中顯示內(nèi)置式可編碼裝置1、基質(zhì)2，連接分子層3和表面活性分子4；圖2.幾種固相微粒的外觀形狀和結(jié)構(gòu)示意中顯示內(nèi)置式可編碼裝置1、基質(zhì)2，連接分子層3；圖中2A，2B，2C，2D，2E分別顯示部分具有不同外觀形狀與結(jié)構(gòu)的固相微粒。圖3.固相微粒與連接分子及表面活性分子的結(jié)構(gòu)關(guān)系示意中顯示基質(zhì)2，連接分子層3和表面活性分子4；圖中3A顯示帶有氰酸酯活性基團的連接分子層3；圖中3B顯示帶有巰基活性基團的連接分子層3’；圖中3C顯示帶有氨基活性基團的連接分子層3”；圖中3D，3E，3F分別顯示在固相顆粒表面經(jīng)連接分子層3所帶有的活性基團連接的表面活性分子，半抗原4*，蛋白分子4’和附著細(xì)胞4”。圖4.內(nèi)置式微型可編碼裝置組成結(jié)構(gòu)示意中顯示內(nèi)置式微型可編碼裝置1的能量轉(zhuǎn)換器5、存儲器6、信號發(fā)生器7、信號放大器8、發(fā)射裝置9等組成結(jié)構(gòu)和固相基質(zhì)2、連接分子層3等結(jié)構(gòu)；能量轉(zhuǎn)換器5可將聲、光、電、磁、電磁波等轉(zhuǎn)換成電能(如能量轉(zhuǎn)換器上的光敏電池接受編碼器發(fā)出的激光，將光能轉(zhuǎn)換為電能)為微型可編碼裝置提供電源；能量轉(zhuǎn)換器5得到供電后自啟動，接收并識別編碼器的控制信號，將分子結(jié)構(gòu)與特性等編碼信息存入存儲器6；在分析檢測時能量轉(zhuǎn)換器5上的光敏電池接受流式細(xì)胞儀或掃描儀發(fā)出的激光，將光能轉(zhuǎn)換為電能自啟動，同時接收并識別解碼器的控制信號，將存儲器6存儲的分子結(jié)構(gòu)與特性等信息給信號發(fā)生器7，由信號放大器8放大后，通過發(fā)射裝置9將存儲信息發(fā)送給解碼器，實現(xiàn)對固相微粒表面活性分子結(jié)構(gòu)與特性等信息的編碼、存儲和識別；存儲器存儲的信息可以是分子結(jié)構(gòu)、合成方法、工藝操作流程、序列編號、材料來源、樣品編號等。圖5.內(nèi)置式條形碼微型可編碼裝置結(jié)構(gòu)示意中顯示內(nèi)置式微型條形碼編碼裝置1’的存儲介質(zhì)10、條形碼11、固相基質(zhì)2、連接分子層3等結(jié)構(gòu)；條形碼10采用光刻或蝕刻技術(shù)在存儲介質(zhì)11上雕刻而成；分析檢測時同時用讀碼器讀取條形碼信息，從而實現(xiàn)對分子結(jié)構(gòu)信息的編碼、存儲與識別；圖6.內(nèi)置式條形碼微型可編碼裝置與外置式位序編碼裝置組合使用原理示意中顯示帶有內(nèi)置式微型條形碼編碼裝置的固相微粒12隨機鑲嵌入微孔板13的微孔14中，微孔間由微槽16將進液孔15和出液孔17連接形成微流路，并通過蠕動管18構(gòu)成閉合環(huán)路；掃描儀檢測各孔標(biāo)記分子的信號并自動編碼；加入不同的洗脫液，每次洗脫完成后，通過掃描儀檢測各孔標(biāo)記分子信號的變化并記錄；檢測結(jié)束后讀碼器讀取固相微粒12的條形碼信息，并將條形碼轉(zhuǎn)換為固相微粒在微孔板中的位序碼，并自動給出可讀的分子結(jié)構(gòu)與特性、洗脫與解吸附以及親和力等存儲信息和分析結(jié)果。圖7.DNA固相PCR擴增反應(yīng)原理示意中固相微粒2通過連接分子層3上的活性基團與寡核苷酸分子19的5’端連接；寡核苷酸19與模板20退火，在DNA聚合酶的催化下延長，獲得與模板20堿基序列互補的核酸分子21(擴增產(chǎn)物22與寡核苷酸分子19的嵌合分子)；變性后再以21等為模板與游離的寡核苷酸引物23退火，在DNA聚合酶的催化下延長，獲得與模板21堿基序列互補的核酸分子24(擴增產(chǎn)物與寡核苷酸分子23的嵌合分子)；通過幾個循環(huán)的PCR擴增反應(yīng)，最終在固相微粒表面獲得足量的長鏈單股核酸分子21及其互補核酸分子24。如寡核苷酸分子23末端用熒光分子25標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測標(biāo)記分子25即可獲得對模板20的檢測分析結(jié)果。圖8.DNA固相LCR擴增反應(yīng)原理示意中在固相微粒2表面經(jīng)固相合成獲得的寡核苷酸分子26和游離寡核苷酸分子27與模板20雜交；寡核苷酸分子26的游離端(為磷酸化5’末端)，在DNA鏈接酶的催化下與寡核苷酸分子27鏈接，獲得與模板20堿基序列互補的長鏈核酸分子28(寡核苷酸分子26與27的嵌合分子)；再以28為模板，與寡核苷酸分子29和30退火，在DNA鏈接酶的催化下，寡核苷酸分子29與30(5’端磷酸化)鏈接，擴增，最終在固相微粒表面獲得足量的長鏈核酸分子28與31。如寡核苷酸分子29末端用熒光分子25標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測標(biāo)記分子25即可獲得對模板20的檢測分析結(jié)果。圖9.DNA固相RCR擴增反應(yīng)原理示意中在固相微粒2表面經(jīng)固相合成獲得的寡核苷酸分子26(5’末端磷酸化)和游離寡核苷酸分子27(引物)與模板20雜交；寡核苷酸引物27在DNA聚合酶的催化下，向3’端延長，獲得與模板20堿基序列互補的長鏈核酸分子21(擴增產(chǎn)物與寡核苷酸引物27的嵌合分子)；在DNA鏈接酶的催化下，長鏈核酸分子21的3’末端與寡核苷酸分子26的磷酸化游離末端鏈接，獲得與模板20堿基序列互補的長鏈核酸分子32(寡核苷酸分子26與核酸分子21的嵌合分子)；再以長鏈核酸分子32為模板與寡核苷酸引物分子33退火，通過聚合酶鏈反應(yīng)，寡核苷酸分子33被延長獲得長鏈核酸分子34；經(jīng)過幾輪循環(huán)最終在固相微粒表面獲得足量的長鏈核酸分子32與34；如寡核苷酸引物分子33的末端用熒光分子25標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀檢測標(biāo)記分子25即可獲得對模板20的檢測分析結(jié)果。圖10.DNA固相擴增流式檢測分析技術(shù)工作原理示意圖。
圖10A，樣品核酸分子35在試管中經(jīng)標(biāo)記分子25標(biāo)記，與固相微粒2表面連接的核酸分子探針36雜交，未雜交的樣品核酸分子經(jīng)漂洗去除，檢測標(biāo)記分子25獲得檢測分析結(jié)果。
圖10B，樣品核酸分子用5’端帶有標(biāo)記分子25的引物，在試管中進行PCR擴增，擴增后的樣品37與微珠2表面連接的核酸分子36雜交，未雜交的樣品核酸分子經(jīng)漂洗去除，檢測標(biāo)記分子25獲得檢測分析結(jié)果。
圖10C，樣品核酸分子35在試管中經(jīng)標(biāo)記分子25標(biāo)記后，與固相微粒2表面連接的寡核苷酸分子38雜交，未雜交的樣品核酸分子35經(jīng)漂洗去除，檢測標(biāo)記分子25獲得結(jié)果。
圖10D，樣品中的核酸分子用5’端帶有標(biāo)記分子25的引物，在試管中進行PCR擴增，擴增的樣品37與微珠2表面的寡核苷酸分子38雜交，未雜交的樣品核酸分子可經(jīng)漂洗去除，檢測標(biāo)記分子25獲得分析結(jié)果。
圖10E，樣品核酸分子35與固相微粒2表面的寡核苷酸分子38雜交；以樣品核酸分子35為模板，微珠2表面的寡核苷酸分子38和5’端帶有標(biāo)記分子25的游離寡核苷酸39為引物，經(jīng)PCR擴增后，擴增產(chǎn)物與微珠2表面連接的寡核苷酸分子38和游離的寡核苷酸引物39形成嵌合分子40和41，徹底漂洗后，檢測標(biāo)記分子25獲得檢測分析結(jié)果。
圖10F和圖10G中長鏈核酸分子43，是以微珠2表面的寡核苷酸分子42為引物，以已知序列的核酸分子為模板，經(jīng)PCR延長、擴增獲得的，被固定在固相微粒2表面的嵌合分子；樣品核酸分子35經(jīng)熒光分子25標(biāo)記，與微珠2表面的長鏈核酸分子43雜交(圖10F)；或樣品核酸分子35的PCR擴增標(biāo)記產(chǎn)物44與核酸分子43雜交(圖10G)；經(jīng)徹底漂洗后，檢測標(biāo)記分子25獲得分析結(jié)果。圖11酶標(biāo)記法固相DNA流式檢測分析技術(shù)工作原理示意11A，樣品核酸分子35經(jīng)生物素分子46標(biāo)記后，與固相微粒2表面的核酸分子45雜交，未雜交的樣品核酸分子經(jīng)漂洗可去除，加入過氧化物酶48標(biāo)記的鏈親合素47與生物素46結(jié)合，未結(jié)合的酶標(biāo)記物經(jīng)漂洗去除；在酶48的催化下，加入的底物49生成有色產(chǎn)物或發(fā)光產(chǎn)物50，檢測有色產(chǎn)物或發(fā)光產(chǎn)物的有無及顏色的深淺或發(fā)光的強弱，獲得分析結(jié)果；圖11B，長鏈核酸分子52和54，是以固相微粒2固相表面的寡核苷酸分子51和游離寡核苷酸分子53為引物，以樣品核酸分子為模板，經(jīng)PCR延長、擴增獲得的、序列特異的，被固定在固相微粒2表面的序列互補的嵌合分子；經(jīng)漂洗去除殘留物和非特異結(jié)合寡核苷酸引物53，加入酶48標(biāo)記的抗生物素抗體55與引物53的標(biāo)記分子半抗原生物素46結(jié)合，未結(jié)合的酶標(biāo)記物經(jīng)漂洗去除；在酶48的催化下，加入的底物49生成有色產(chǎn)物或發(fā)光產(chǎn)物50，檢測有色產(chǎn)物或發(fā)光產(chǎn)物的有無及顏色的深淺或發(fā)光的強弱，獲得分析結(jié)果。圖12核酸—蛋白質(zhì)相互作用流式檢測分析原理示意12A，樣品蛋白分子57經(jīng)熒光素分子25標(biāo)記后，與固相微粒2表面的核酸分子56結(jié)合，未結(jié)合的樣品蛋白經(jīng)漂洗去除，檢測熒光素分子25的有無及強弱，獲得分析結(jié)果。
圖12B，樣品蛋白分子57經(jīng)生物素46標(biāo)記后，與固相微粒2表面的核酸分子56結(jié)合，未結(jié)合的樣品蛋白經(jīng)漂洗去除，加入酶48標(biāo)記的抗生物素抗體55與生物素46結(jié)合，未結(jié)合的酶標(biāo)抗體經(jīng)漂洗去除；在酶48的催化下，底物49生成有色產(chǎn)物或發(fā)光產(chǎn)物50，檢測微?；蜩偳段⒖子猩a(chǎn)物或發(fā)光產(chǎn)物的有無及顏色的深淺或發(fā)光的強弱，獲得分析結(jié)果。圖13蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)—藥物半抗原相互作用流式檢測分析原理示意中為幾種具有代表性的基本方法的實驗原理，實施中可在此基礎(chǔ)上衍生出許多不同的操作方法；圖中2為固相微粒，3為連接分子層；圖13A為直接法，用已知抗體58捕獲未知的樣品抗原59，檢測標(biāo)記分子熒光素60，根據(jù)熒光的有無和強弱判斷樣品抗原59的有無與含量。圖13B為間接法，用已知抗原61捕獲未知的樣品抗體62，再用熒光素60標(biāo)記的抗抗體63結(jié)合樣品抗體62，檢測標(biāo)記分子熒光素60，根據(jù)熒光的有無和強弱判斷樣品抗體62的有無與含量。圖13C為夾心法，用已知抗體58捕獲未知的樣品抗原59，再用熒光素60標(biāo)記的抗體64(與抗體58結(jié)合同一抗原分子的不同或相同表位或決定簇)結(jié)合樣品抗原59，檢測標(biāo)記分子熒光素60，根據(jù)熒光的有無和強弱判斷樣品抗原59的有無與含量。圖13D為競爭法，未知的樣品抗原59與熒光素60標(biāo)記的已知抗原61，競爭結(jié)合固相的已知抗體58，檢測被捕獲的標(biāo)記分子熒光素60，根據(jù)熒光的有無和強弱判斷樣品抗原59的有無與含量，熒光強提示未知的樣品抗原59含量低，反之則含量高。圖13E為雙標(biāo)記法，熒光素65標(biāo)記的未知的樣品抗原59與熒光素60標(biāo)記的已知抗原61競爭結(jié)合固相的已知抗體58，分別檢測被捕獲抗原的標(biāo)記分子熒光素60和65，根據(jù)熒光的有無和強弱判斷樣品抗原59的有無與含量，熒光素60的熒光強提示未知的樣品抗原59含量低，反之則含量高；熒光素65的熒光強提示未知的樣品抗原59含量高。圖13F為橋聯(lián)法(直接法)，親合素68標(biāo)記的藥物靶蛋白67與固相化的半抗原藥物分子66結(jié)合，加入標(biāo)記分子熒光素25標(biāo)記的生物素46，檢測熒光素25，根據(jù)熒光的有無和強弱判斷藥物靶分子的有無與含量。實施中，用不同的洗脫液洗脫結(jié)合的藥物靶分子，根據(jù)固相熒光素25的強弱變化，可以分析半抗原與藥物靶分子的親合力，為后續(xù)藥物分子的分離純化等提供依據(jù)。
本發(fā)明在實施中的基本操作步驟和方法如下一.可編碼固相微粒的制備固相微粒的制備方法包括以下基本方法和步驟1.編碼。用編碼器對固相顆粒進行編碼，編碼可在加工過程中進行，如用光刻或蝕刻法在編碼介質(zhì)上進行編碼；或在加工完成后進行，如商售的微型無線電信號反射器(AVID公司和BioMedic Data System公司等)2.表面處理固相微粒的表面處理因所選材料的不同而略有不同，每種材料其具體處理方法和條件都有多種，本發(fā)明在此將《生物分子固定化技術(shù)及應(yīng)用》(蔣中華等，1998年，化學(xué)出版社)及中國專利號為01207812.3與申請?zhí)枮?0120798.9、02121325.9和02123775.1、的專利為主要參考文獻。運用公知的各種生物大分子固相化技術(shù)，處理各種材料的固相微粒，使其表面帶有特定的連接分子層，與核酸、蛋白以及藥物等分子及其衍生物上的活性基團反應(yīng)，而具有特定的吸附能力。如用2％丙氨基-三乙基硅烷無水丙酮溶液(APES，3-Aminopropyltriethoxysilane，Sigma公司，目錄號A3648)處理的多孔玻璃微珠(Weetall，H.H.，Biochem.Biophys.Acta，1970；2121)；商售的經(jīng)表面處理的各種層析基質(zhì)(如溴化氰活化的Sepharose-4B)，多肽與寡核苷酸固相合成用的聚苯乙烯珠或控孔玻璃珠(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，Sigma公司)等。3.包被將不同的核酸、蛋白與藥物及其衍生物分子分別與固相微粒表面連接分子的活性基團連接，或在固相微粒表面進行原位固相合成以獲得不同的表面活性分子層。表面活性分子的獲得方法主要是①修飾連接。利用固相微粒表面連接分子上的活性基團通過化學(xué)鍵與表面活性分子連接使之在固相基質(zhì)表面被固相化；②固相合成。運用固相化學(xué)合成技術(shù)，直接在微粒表面進行藥物、多肽和寡核苷酸分子等的固相合成(Edge R.Wang等，1998，核酸探針的合成、標(biāo)記及應(yīng)用，科學(xué)出版社)；合成反應(yīng)可以在試管中或裝填于合成儀的專用柱體中進行；③生物合成。運用PCR，LCR和RCR等DNA擴增技術(shù)，以已知序列的核苷酸分子為模板，將其中一個引物連接在微珠上，或以固相合成的寡核苷酸分子為引物在固相顆粒表面進行的各種DNA擴增反應(yīng)，擴增產(chǎn)物通過固相化的引物連接并固相化在微珠或微孔的表面；3封閉用封閉液(如含添加劑的PBS、Tris-HC1或HEPES等緩沖液)與固相微粒共育，以封閉去除固相微粒表面可能殘留的活性基團或非特異性結(jié)合位點，以減少檢測中可能出現(xiàn)的非特異性結(jié)合。由此即獲得能與化學(xué)分子、生物分子、抗體和/或抗原，酶、核酸或寡核苷酸分子，以及藥物或其衍生物等特異性結(jié)合，并可用于對結(jié)合物進行檢測的可編碼固相微粒。常用的封閉液添加劑有鮭精或酵母DNA聚蔗糖、肝素、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白(0.5-5％)、脫脂奶粉(0.1-6％)、酪蛋白(0.5-2％)、白明膠(0.1-0.5％)，正常動物血清(0.5-5％)和去垢劑等(如Tween 20，NP40，Triton X-100、SDS)等。二.樣品的檢測分析樣品的檢測分析一般包括以下基本步驟和方法1.樣品的制備根據(jù)檢測目的和被檢物等的生物、化學(xué)性質(zhì)的不同，生物樣品在檢測前將分別進行不同的處理。常見樣品處理方法包括①核酸提取物用DNA或RNA抽提液處理各種生物樣品、生物體液或標(biāo)本以提取樣品中的DNA或RNA等；②蛋白等生物成分提取物用組織細(xì)胞裂解液配合勻漿或超聲粉碎等處理組織細(xì)胞或細(xì)菌，使之裂解獲得真性蛋白溶液或生物樣品、生物體液或生物標(biāo)本等的分離提取物；③人工合成產(chǎn)物運用各種人工合成技術(shù)獲得的藥物前體、先導(dǎo)化合物以及多肽合成儀、核酸合成儀等的合成產(chǎn)物等；④反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；⑤PCR、LCR或RT-PCR等的擴增產(chǎn)物。2.樣品的標(biāo)記①直接標(biāo)記。運用公知的生物分子標(biāo)記技術(shù)，分別用生物素、酶、熒光素、膠體金、同位素或稀土離子及其螯合劑等物質(zhì)或其衍生物等標(biāo)記分子作為指示劑直接標(biāo)記樣品或生物標(biāo)本；②采用間接標(biāo)記。運用生物分子的相互作用，用標(biāo)記分子的標(biāo)記產(chǎn)物(如熒光抗體，生物素-HRP等標(biāo)記物)標(biāo)記樣品；③摻入標(biāo)記，運用各種合成技術(shù)，如固相合成技術(shù)、PCR擴增等將標(biāo)記分子或標(biāo)記物摻入被標(biāo)記分子中。3.加待檢樣品①將樣品或處理樣品與固相微粒共育，使之與各微粒表面已固相化的不同生物、化學(xué)或藥物分子等雜交或結(jié)合；被檢樣品中互補或?qū)?yīng)的生物分子被固相微粒捕獲或特異結(jié)合，剩余的和未結(jié)合的部分經(jīng)漂洗去除。②將微量的樣品核酸與寡核苷酸引物、dNTP，可摻入標(biāo)記物和耐熱DNA聚合酶、鏈接酶以及固相微粒等一起進行加熱變性、退火、延長擴增、連接等反應(yīng)，并進行適當(dāng)周期的PCR或RT-PCR等反應(yīng)循環(huán)。4.漂洗借助離心、微柱、檢測板的微流路等用洗液漂洗，以去除固相微粒表面殘留的被檢樣品(未結(jié)合物或稱游離物)或標(biāo)記物等。5.結(jié)果分析根據(jù)標(biāo)記分子的不同，目測或用流式細(xì)胞儀、掃描儀等儀器觀察并記錄各微粒表面反應(yīng)的有無以及強弱(如生成產(chǎn)物顏色的深淺、膠體金沉積、熒光強度、放射強度等的強弱變化)。但是在標(biāo)記物為蛋白酶時，操作中必須增加漂洗和添加底物等步驟才能觀察檢測結(jié)果，其檢測結(jié)果為呈色反應(yīng)或發(fā)光反應(yīng)。6.解碼。用解碼器、讀碼器或顯微鏡等，借助計算機確定該樣品中，被檢測物的組成以及各組分的含量，結(jié)構(gòu)、序列等。
本發(fā)明在實施中，上述操作步驟依據(jù)固相微粒表面活性分子、被檢測物、標(biāo)記物和結(jié)果顯示方法等的不同，可有多種不同的組合方式。各步反應(yīng)可在微量反應(yīng)管、微孔板或微量反應(yīng)柱(或微層析柱)中進行。各微粒的表面活性分子可以相同，用于篩選樣品中的不同成分；也可以不同，用于對同一分子或同一樣品中的不同成分進行高通量的篩選或平行檢測分析。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明。實施例鑲嵌式高通量基因芯片在核酸—蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用。
用核酸或寡核苷酸鏈文庫進行DNA聚合酶、復(fù)制酶等核酸結(jié)合蛋白以及細(xì)胞生長因子、激素、小肽、抗體等生物活性分子篩選的潛在市場價值和廣泛的應(yīng)用前景，已經(jīng)引起基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床診斷及藥物篩選等方面的廣泛關(guān)注。運用本發(fā)明所述的DNA固相擴增與流式檢測分析技術(shù)，很容易構(gòu)建序列長度和庫容量足夠大的核酸和寡核苷酸文庫，而每個固相微粒表面的核酸序列可由解碼或讀碼器非?？焖俚貜目删幋a裝置中提取，通過計算機檢索獲得。1.核酸固相微粒的制備按需要在固相合成專用基質(zhì)微粒上，用多通道DNA合成儀合成特定序列的核苷酸鏈分子，建立固相微粒核苷酸鏈組合分子庫，封閉液封閉非特異性結(jié)合位點。2.編碼根據(jù)固相微粒表面的核苷酸序列對固相微粒進行編碼。3.檢測樣品組織、細(xì)胞、細(xì)菌、病毒或噬菌體等經(jīng)裂解液或勻漿處理的獲得蛋白提取物，用熒光素標(biāo)記，分子篩層析去除游離的熒光素小分子，取適量加入微量反應(yīng)柱中，置翻轉(zhuǎn)混合器與固相微粒核苷酸組合分子庫孵育10-120分鐘，連續(xù)流洗或離心以去除殘留的或非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。4.觀察結(jié)果流式細(xì)胞儀分析結(jié)果，比較不同來源或經(jīng)不同處理的組織、細(xì)胞或細(xì)菌等的蛋白質(zhì)結(jié)合譜，分析差異譜帶與結(jié)構(gòu)、功能、基因調(diào)控或與疾病等的關(guān)系，并分選出陽性固相微粒。5.將陽性微粒隨機裝填入高密度微孔板中，一孔一珠，封蓋，掃描儀分析記錄各微孔熒光強度；比較不同流洗條件以及競爭結(jié)合物或拮抗劑對各孔固相微粒與被檢測物結(jié)合強度及結(jié)合量的影響，解碼器或讀碼器給出各固相微粒核苷酸鏈的堿基序列。5.質(zhì)譜分析對分析中感興趣的反應(yīng)孔，取適量復(fù)本固相微粒加入蛋白提取物，以完全一致的實驗條件重復(fù)步驟3，徹底漂洗后加入適量胰蛋白酶(蛋白質(zhì)水解酶)，室溫或37℃反應(yīng)2-6小時或過夜，取適量點樣進行質(zhì)譜分析，獲得蛋白指紋圖譜，通過計算機處理獲得蛋白質(zhì)的氨基酸序列。6.蛋白質(zhì)磷酸化分析取適量胰蛋白酶水解液，加入適量體積的細(xì)菌堿性磷酸酶(溶于HEPES 20mmol/L，pH7.0，含NaCl 150mmol/L，0.1％Triton X-100，10％甘油)，30℃反應(yīng)60分鐘，取適量進行質(zhì)譜分析；對照未經(jīng)處理的分析結(jié)果，以測定和分析蛋白質(zhì)有無磷酸化以及磷酸化的可能部位。7.蛋白質(zhì)糖基化分析取出適量胰蛋白酶水解液，加入PNGase試劑(溶于Tris-HCl緩沖液中，20mmol/L，pH7.2，含50mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA)適量，37℃反應(yīng)60-120分鐘，取適量進行質(zhì)譜或色譜分析，對照未經(jīng)處理的分析結(jié)果，以測定和分析蛋白質(zhì)有無糖基化以及糖基化的程度與部位。8.蛋白質(zhì)等電點和分子量測定取適量復(fù)本固相微粒與蛋白提取物反應(yīng)，充分漂洗并分裝于不同的微量試管中，分別加入專用等電聚焦和SDS-PAGE電泳樣品緩沖液，取出適量分別電泳，以測定等電點和分子量，并與質(zhì)譜分析結(jié)果對比。9.基因克隆以該寡核苷酸分子為特異性引物，應(yīng)用PCR技術(shù)進行上下游核酸片段的擴增，以克隆全長或長鏈核酸分子片段。
本發(fā)明把固相合成與分離技術(shù)同信息編碼與高通量的流式細(xì)胞檢測分析與分選技術(shù)相結(jié)合，集數(shù)種技術(shù)的優(yōu)點于一身，具有定量準(zhǔn)確、信息量大、靈敏度高、制造成本低，方便快捷、用途廣等突出優(yōu)點，是一種新的可廣泛用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)，環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的高通量篩選與檢測分析技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種可同時檢測、分析和篩選樣品中的核酸、蛋白與化學(xué)分子及藥物分子的DNA固相擴增與流式檢測分析技術(shù)及試劑盒的制備方法，該技術(shù)和試劑盒至少包括下述成分或步驟①一定數(shù)量的可編碼固相微粒，由可編碼裝置、基質(zhì)、連接分子層以及表面活性分子組成；可編碼裝置分內(nèi)置式和外置式；內(nèi)置式可編碼裝置由基質(zhì)包裹，位于可編碼固相微粒的核心；基質(zhì)表面為連接分子層，可將相同或不同的表面活性分子連接在固相顆粒的表面；表面活性分子可與樣品中的生物、化學(xué)或藥物等分子特異結(jié)合或雜交；在一個微粒表面通常只連接一種表面活性分子；②封閉為去除非特異性結(jié)合位點，用封閉液處理固相微粒表面；③編碼將表面活性分子的結(jié)構(gòu)、特性等生物、化學(xué)信息進行編碼并存入可編碼裝置中；④樣品經(jīng)過處理或不經(jīng)處理直接與各固相微粒表面連接的各種相同或不同的生物、化學(xué)分子相互作用，并與之特異性雜交或結(jié)合的被檢物；⑤標(biāo)記被檢樣品用指示性標(biāo)記分子及其衍生物或標(biāo)記物等進行標(biāo)記；⑥漂洗用洗液或洗脫液洗脫與固相微粒表面活性分子結(jié)合或非特異結(jié)合的各種分子；⑦檢測與分析對固相基質(zhì)表面保留的標(biāo)記分子或標(biāo)記物的有無、強弱以及含量進行檢測和分析；⑧解碼識別可編碼裝置中存儲的編碼信號，將編碼信號轉(zhuǎn)換為固相微粒表面所結(jié)合的生物、化學(xué)分子的結(jié)構(gòu)、特性等信息的可讀數(shù)據(jù)；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可編碼固相微粒，由包裹在外表面的固相基質(zhì)和位于核心的內(nèi)置式微型可編碼裝置組成；固相基質(zhì)為任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的硬質(zhì)或軟質(zhì)、金屬或非金屬、導(dǎo)體或半導(dǎo)體、絕緣體、單體或復(fù)合材料，經(jīng)加工而成的，大小均一、具有不同外觀形狀的空心體、多孔或?qū)嵭捏w；微粒經(jīng)表面處理可獲得具有不同活性基團的連接分子層，借助其活性基團可進一步與不同的核酸或寡核苷酸、蛋白與多肽等生物或化學(xué)分子連接，獲得具有不同結(jié)合特性的表面活性分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的可編碼裝置，是可存儲或記憶固相微粒所攜帶的表面活性分子的結(jié)構(gòu)與特性等信息的，內(nèi)置式微型元器件與結(jié)構(gòu)或外置的微型結(jié)構(gòu)或設(shè)備；可編碼裝置對固相微粒所攜帶的表面活性分子的結(jié)構(gòu)與特性等信息的存儲或記憶可用下述方法之一或組合予以實現(xiàn)①可編碼裝置由內(nèi)置的微型能量轉(zhuǎn)換器、存儲器、信號發(fā)生器、信號放大器、發(fā)射裝置等結(jié)構(gòu)組成，通過光電、聲電、電磁波、磁性介質(zhì)等信息載體，存儲、記憶和傳遞分子結(jié)構(gòu)信息；通過編碼、存儲編碼信息、接收外來編碼信號和控制信號，自啟動，發(fā)射存儲信息給解碼器，實現(xiàn)對固相微粒表面活性分子結(jié)構(gòu)信息的編碼、存儲和識別；②可編碼裝置由內(nèi)置的微型存儲介質(zhì)、條形碼、數(shù)碼、光斑或凹斑等組成，通過條形碼、數(shù)碼、光斑或凹斑等信息載體存儲、記憶和傳遞分子信息；存儲介質(zhì)可為任何經(jīng)光刻或蝕刻能記錄條形碼、數(shù)碼、光斑或凹斑的、任何可加工成型的、透光的、不透光的、反光的、硬質(zhì)或軟質(zhì)、金屬或非金屬、導(dǎo)體或半導(dǎo)體、塑料、陶瓷、玻璃等單體或復(fù)合材料做基質(zhì)制備的；檢測分析時讀碼器讀取并識別條形碼、數(shù)碼、光斑或凹斑，以實現(xiàn)對分子結(jié)構(gòu)與特性等信息的編碼、存儲和識別；③位序編碼裝置由自動進樣器和樣品盤等結(jié)構(gòu)組成，通過樣品在樣品盤中的位置和進樣順序?qū)崿F(xiàn)對分子結(jié)構(gòu)等信息的編碼、存儲與傳遞；④可編碼裝置為具有微流路的微孔板，利用微孔在微孔板上的位置和排列順序，對鑲嵌在微孔中固相微粒的表面活性分子的結(jié)構(gòu)與特性等信息進行編碼、存儲和識別；
4.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的連接分子層，可分別由具有親水、疏水、長臂、短臂，直鏈或支鏈等分子特性的連接分子所形成的單分子層組成；連接分子一端連接在固相基質(zhì)上，其游離端具有活性基團可連接各種化學(xué)或生物分子；
5.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2和權(quán)利要求3所述的表面活性分子，是指通過固相微粒連接分子層上的活性基團，分別連接的具有不同序列和長度的多肽、蛋白質(zhì)、核酸或寡核苷酸及其衍生物、藥物分子及其前體或先導(dǎo)化合物等大分子或小分子化合物，在微粒表面形成的具有一定結(jié)合特性的活性分子；一個微粒表面通常只有一種表面活性分子；各種固相微粒表面活性分子的制備與包被方法至少包括①通過多肽合成儀、DNA合成儀或其它固相合成技術(shù)，直接在微粒的固相基質(zhì)表面合成，并保留在固相微粒表面②通過連接分子上的活性基團連接或吸附；③以微粒表面的特異性寡核苷酸分子為固相化引物，與游離的寡核苷酸分子引物配對，以已知序列的核酸分子為模板，在微粒表面通過至少一個循環(huán)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)延長寡核苷酸鏈并進一步擴增，獲得由長鏈核酸分子組成的表面活性分子；PCR循環(huán)反應(yīng)包括a)加熱變性；b)退火；c)DNA聚合酶延長核苷酸鏈序列。④以微粒表面的特異性寡核苷酸分子為固相化引物，與游離的寡核苷酸分子引物配對，以已知序列的核酸分子為模板，在微粒表面通過鏈接酶鏈反應(yīng)(LCR)延長寡核苷酸鏈并擴增，獲得由長鏈核酸組成的表面活性分子；LCR循環(huán)反應(yīng)包括a)加熱變性；b)退火；c)DNA鏈接酶連接；⑤以微粒表面的特異性寡核苷酸分子為固相化鉚接引物，與游離的寡核苷酸分子引物配對，以已知序列的特異性核酸分子為模板，在微粒表面通過鉚接聚合酶鏈反應(yīng)(RCR)延長寡核苷酸鏈并進一步擴增，獲得由長鏈核酸組成的表面活性分子；RCR循環(huán)反應(yīng)包括a)加熱變性；b)退火；c)DNA聚合酶延長靶核苷酸鏈序列；d)DNA鏈接酶連接。⑥以親合層析、吸附層析材料為固相基質(zhì)，通過配基配體、抗原抗體、疏水結(jié)合以及交換反應(yīng)將生物分子吸附在固相微粒表面；⑦將微粒與細(xì)菌、細(xì)胞等微生物體共育或共培養(yǎng)，使微生物體附著在微粒表面；
6.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求5所述的樣品，其核酸分子可用PCR反應(yīng)，進行至少一個循環(huán)的擴增或延長；樣品核酸分子的延長或擴增可通過下述方式進行①反應(yīng)在液相中進行，引物全部溶于液相中；②在固-液相界面上進行，其中有一個為固相化引物，用至少一個循環(huán)的PCR反應(yīng)進行擴增或延長；③在固-液相界面上進行，其中有一個為固相化引物，用至少一個循環(huán)的LCR反應(yīng)進行延長和擴增；④在固-液相界面上進行，其中有一個為固相化鉚接物，用至少一個循環(huán)的RCR反應(yīng)進行延長和擴增；
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)記，是指用熒光染料、酶類、生物素、半抗原、膠體金、同位素、稀土離子及其螯合劑等標(biāo)記分子或其衍生物直接標(biāo)記樣品；或用能與樣品中被檢物特異性結(jié)合的標(biāo)記物標(biāo)記樣品；
8.根據(jù)權(quán)利要求5和權(quán)利要求6所述的固相化引物，是指①DNA固相合成儀合成的，仍連接在固相基質(zhì)上的合成產(chǎn)物；②5’端與固相基質(zhì)連接的寡核苷酸分子；③通過3’端第1-5位任意一個堿基上的側(cè)鏈基團與固相基質(zhì)連接，保留游離的3’末端堿基的寡核苷酸；④以帶有游離的3’末端堿基的微粒為固相基質(zhì)，該固相基質(zhì)由3’端第1-5位任意一個堿基上的側(cè)鏈基團與固相基質(zhì)連接，再經(jīng)固相合成獲得寡核苷酸產(chǎn)物；
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，至少有一管裝有一定數(shù)量的可編碼固相微粒，微粒表面分別有某種特定序列或結(jié)構(gòu)的多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、核酸分子，寡糖、多糖，酯或類脂等以及藥物前體、前體化合物等表面活性分子，并與下述成分分別或共同組成不同的試劑盒①至少有一管為樣品處理液；②至少有一管分別為dNTP、引物和用于PCR擴增的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶和/或耐熱DNA鏈接酶；③至少有一管分別為dNTP和反轉(zhuǎn)錄酶；④至少有一管為含標(biāo)記分子或標(biāo)記物的標(biāo)記試劑；⑤在標(biāo)記物為酶類時，至少有一種顯色底物或發(fā)光底物；⑥至少有一管為洗滌液或其濃縮液；⑦至少有一管為蛋白質(zhì)濃度檢測分析試劑；⑧至少有一管為核酸內(nèi)切酶、蛋白水解酶、蛋白質(zhì)糖基化或蛋白質(zhì)磷酸化分析試劑；；⑨至少有一管為組織細(xì)胞染色液；⑩至少有一管為電泳樣品緩沖液；
10.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求9所述的檢測方法和試劑盒，可以用試劑盒中的試劑通過下述不同的方法對可編碼固相微粒表面所結(jié)合的樣品成分分別做基因克隆、質(zhì)譜分析、序列測定、蛋白質(zhì)磷酸化、糖基化或電泳等進一步分析前的處理(1)用微孔板編碼時，可直接在感興趣的陽性微孔中加入PCR、LCR、RCR試劑或核酸內(nèi)切酶、蛋白水解酶、磷酸酶或電泳樣品緩沖液、蛋白質(zhì)糖基化等分析試劑，對結(jié)合物在原位做進一步分析前的樣品處理；(2)分選陽性固相微粒，在微量反應(yīng)器中加入PCR、LCR、RCR試劑或核酸內(nèi)切酶、蛋白水解酶、磷酸酶或電泳樣品緩沖液或蛋白質(zhì)糖基化分析等試劑做進一步分析前的樣品處理；(3)將樣品分別與感興趣陽性微孔或微粒的復(fù)本微粒共育，以同樣的條件重復(fù)微孔板的操作步驟，將樣品中感興趣的物質(zhì)成分吸附在微粒上，充分漂洗去除未結(jié)合的樣品混合物，加入PCR、LCR、RCR試劑、核酸內(nèi)切酶或蛋白水解酶、磷酸酶或電泳樣品緩沖液或蛋白質(zhì)糖基化分析等試劑，對結(jié)合物做進一步分析前的樣品處理。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種DNA固相擴增與流式檢測分析技術(shù)及試劑盒的制備方法，該技術(shù)靈敏快速、信息量大，制造簡便、成本低。主要特征在于以流式細(xì)胞儀為主要檢測分析手段，把多種不同的信息編碼技術(shù)用于各種固相合成與擴增產(chǎn)物，親合吸附層析等制備過程中的固相分離物、微載體表面附著的微生物體以及各種固相基質(zhì)微粒表面結(jié)合、吸附或包被的生物、化學(xué)分子等表面活性分子結(jié)構(gòu)與特性等信息的編碼，并將此編碼微粒用于核酸、蛋白、藥物和化學(xué)分子等的大規(guī)模檢測分析與篩選。本發(fā)明可廣泛地用于環(huán)境檢測、生物醫(yī)藥研究、疾病診斷以及基因組、蛋白質(zhì)組學(xué)和分子文庫等領(lǐng)域。
文檔編號G01N33/58GK1470873SQ02125570
公開日2004年1月28日 申請日期2002年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月22日
發(fā)明者趙翀, 趙 申請人:趙翀, 趙