一種基于線粒體coi基因檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的pcr擴(kuò)增試劑盒及擴(kuò)增引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及寄生蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于線粒體C0I基因檢測(cè)華支睪 吸蟲(chóng)囊蝴的PCR擴(kuò)增試劑盒及擴(kuò)增引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 華支睪吸蟲(chóng)?。–lonorchiasis)是由于感染華支睪吸蟲(chóng)（Clonorchis sinensis， Cs)引起的食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康。該病主要分布在東亞、東南亞 和東歐的部分國(guó)家，如中國(guó)、韓國(guó)、老撾和越南等。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球約有3500萬(wàn)人感染這種吸 蟲(chóng)，其中1500萬(wàn)人分布在我國(guó)的各個(gè)省市區(qū)（除內(nèi)蒙古、青海、西藏和新疆外均有發(fā)現(xiàn)）， 以廣東、廣西和東北三省尤為嚴(yán)重。目前，華支睪吸蟲(chóng)的鑒定方法還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，目前 對(duì)華支睪吸蟲(chóng)囊蝴的診斷依賴于顯微鏡檢查。眾所周知，顯微鏡檢查耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，檢查效率 低，對(duì)檢查者臨床工作經(jīng)驗(yàn)要求較高，而且對(duì)于與華支睪吸蟲(chóng)親緣關(guān)系相近的囊蝴，蟲(chóng)卵形 態(tài)相似，普通光鏡無(wú)法區(qū)分，使用這種方法往往會(huì)出現(xiàn)誤判。免疫診斷法雖然較顯微鏡檢查 法效率高，但也常常為靈敏度和特異性所局限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于線粒體C0I基因檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)囊蝴的PCR擴(kuò)增 試劑盒，靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確，為華支睪吸蟲(chóng)感染的診治和預(yù)防提供有效的 技術(shù)手段。
[0004] 本發(fā)明還提供了一種基于線粒體C0I基因檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)囊蝴的擴(kuò)增引物，特異 性強(qiáng)。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：
[0006] -種基于線粒體C0I基因檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)囊蝴的PCR擴(kuò)增試劑盒，包括PCR擴(kuò)增 反應(yīng)液，所述 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)液包括：Tris-HCl 10mmol/L, KC150mmol/L, MgCl2l. 5mmol/L, dNTPs 0? 8mmol/L，正向引物 0? 4 y mol/L，反向引物 0? 4 y mol/L，DNA 模板 20ng/ y L，Taq 酶 0. 075U/yL〇
[0007] 本發(fā)明以華支睪吸蟲(chóng)線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基1 (C0I)基因?yàn)槟繕?biāo)，專門(mén)設(shè)計(jì) 了針對(duì)性的特異性引物，進(jìn)一步的設(shè)計(jì)了檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)結(jié)果特異，結(jié)果易判斷，靈敏度 高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確，為華支睪吸蟲(chóng)感染的診治和預(yù)防提供有效的技術(shù)手段。
[0008] 作為優(yōu)選，所述正向引物序列為：5' -GAGITCCAGCAAGCATATATAATC-3'（SEQID NO. 1) 〇
[0009] 作為優(yōu)選，所述反向引物序列為：5'-GTCACAITTGTACTACTTTAACAGGTA-3'（SEQ ID NO. 2) 〇
[0010] 作為優(yōu)選，所述Tris-HCl的pH為8. 3。
[0011] -種基于線粒體C0I基因檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)囊蝴的擴(kuò)增引物所述擴(kuò)增引物包括 正向引物和反向引物，所述正向引物序列為：5' -GAGTTCCAGCAAGCATATATAATC-3'（SEQ ID NO. 1)，所述反向引物序列為：5'-GTCACAITTGTACTACTTTAACAGGTA-3'（SEQ ID NO. 2)。采用 本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性擴(kuò)增引物，檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)。
[0012] 本發(fā)明的有益效果是：靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確，為華支睪吸蟲(chóng)感染的 診治和預(yù)防提供有效的技術(shù)手段。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1是本發(fā)明試劑盒對(duì)華支睪吸蟲(chóng)DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，
[0014] 圖中：M :100bp DNA marker，1-2:目的擴(kuò)增條帶。
[0015] 圖2是本發(fā)明試劑盒的特異性試驗(yàn)結(jié)果圖，
[0016] 圖中：M:100bpDNAmarker;1:目的擴(kuò)增條帶；2-4:簡(jiǎn)單異尖線蟲(chóng)、刺激隱核蟲(chóng)和 棘顎口線蟲(chóng)。
[0017] 圖3是本發(fā)明試劑盒的敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖，
[0018] 圖中：M :100bp DNA Marker ;1 :40ng/ y L華支睪吸蟲(chóng) DNA ;2 :4ng/ y L 華支睪吸蟲(chóng) DNA ;3 :400pg/ y L華支睪吸蟲(chóng)DNA ;4 :40pg/ y L華支睪吸蟲(chóng)DNA ;5 :4pg/ y L華支睪吸蟲(chóng) DNA ;6 :0? 4pg/ y L 華支睪吸蟲(chóng) DNA。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面通過(guò)具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說(shuō)明。
[0020] 本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。 下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0021] 本發(fā)明實(shí)施如下：
[0022] 1、材料與方法
[0023] 1. 1 材料：
[0024] 囊蝴和華支睪吸蟲(chóng)DNA陽(yáng)性對(duì)照來(lái)源：2013年5月底采集舟山市場(chǎng)上銷(xiāo)售的麥穗 魚(yú)，用消化法從魚(yú)肉組織中分離獲得華支睪吸蟲(chóng)囊蝴。華支睪吸蟲(chóng)DNA陽(yáng)性對(duì)照品由舟山 出入境檢驗(yàn)檢疫局提供。簡(jiǎn)單異尖線蟲(chóng)、刺激隱核蟲(chóng)和棘顎口線蟲(chóng)由舟山出入境檢驗(yàn)檢疫 局提供。
[0025] dNTPs、Taq酶均購(gòu)自大連寶生物公司。
[0026] 1. 2 方法
[0027] 1. 2. 1囊蝴的分離
[0028]將麥穗魚(yú)用清水洗凈，去除魚(yú)頭、魚(yú)尾、魚(yú)鰭、魚(yú)刺及內(nèi)臟，將魚(yú)肉用絞肉機(jī)加工 成肉泥，放入玻璃杯。按每克魚(yú)肉加入10mL人工胃液（鹽酸濃度為8mL/L，胃蛋白酶濃 度8g/L，氯化鈉濃度為9g/L)，37°C孵箱作用2h，將消化完全的魚(yú)肉消化液經(jīng)80目分離篩 過(guò)濾集中于2L的分液漏斗中沉淀0. 5h，放出約300mL的消化液至500mL的燒杯中，沉淀 10-30min后，棄去上面的濁液，用清水反復(fù)清洗至液體清亮，隨后將含蟲(chóng)體的液體轉(zhuǎn)移至 15mL尖底離心管內(nèi)，沉淀lmin后將含囊蝴的上清液體吸至另一新管內(nèi)，反復(fù)沉淀幾次，顯 微鏡下檢查囊蝴純凈度。將剩余的囊蝴保存在Alsever' s溶液（Alsever's Solution，市 售）中，置于4°C冰箱備用。
[0029] 1.2. 2囊蝴的形態(tài)學(xué)和DNA提取
[0030] 取少量上述收集到的囊蝴置于顯微鏡下觀察，并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定。隨后按 照Takara universal Genomic DNA Extraction kit (市售，購(gòu)自大連寶生物公司）說(shuō)明書(shū) 中提供的方法提取囊蝴的基因組DNA。
[0031] 1. 2. 3引物設(shè)計(jì)與合成
[0032] 針對(duì)華支睪吸蟲(chóng)線粒體C0I基因（GenBank:AF096229)序列設(shè)計(jì)特異性引物1對(duì)： 正向引物序列為：5'-GAGITCCAGCAAGCATATATAATC-3'（SEQ ID N0. 1)，反向引物序列為：5'_
[0033] GTCACAITTGTACTACTTTAACAGGTA-3'（SEQ ID N0. 2)。引物設(shè)計(jì)采用 DNASTAR5. 0 軟 件程序設(shè)計(jì)完成，由生工生物（上海）有限公司合成，對(duì)上述2. 2提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 獲得228kb目標(biāo)產(chǎn)物。
[0034] 1. 2. 4目的基因擴(kuò)增與序列測(cè)定
[0035] 20yL的PCR反應(yīng)體系中組分如下：
[0036] pH8. 3 的 Tris-HCl 10mmol/L，KC1 50mmol/L，MgCl2l. 5mmol/L，dNTPsO. 8mmol/L， 正向引物（SEQ ID NO. 1)0.4 y