專(zhuān)利名稱(chēng)：一種測(cè)定鱟試劑靈敏度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)，具體地說(shuō)是一種測(cè)定鱟試劑靈敏度的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌內(nèi)毒素(Bacterial Endotoxin)是革蘭氏陰性細(xì)菌所產(chǎn)生的具有各種生物活性的大分子物質(zhì)，其主要化學(xué)成分為脂多糖(LPS)；內(nèi)毒素是注射劑藥品(原料等)中的主要污染物質(zhì)。
細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)方法有家兔試驗(yàn)法、鱟試驗(yàn)法。鱟試驗(yàn)法(LimulusAmebocyte Lysate，LAL，或Tachypleus Amebocyte Lysate，TAL)是利用鱟試劑與內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)的機(jī)理，以定性或定量檢測(cè)藥品或機(jī)體血液中的感染細(xì)菌內(nèi)毒素的一種體外檢測(cè)方法。采用產(chǎn)色或產(chǎn)螢光的肽型化合物，用于分析內(nèi)毒素，化合物結(jié)構(gòu)R1-A1-A2-A3-A4-B-R2，R2代表產(chǎn)色或產(chǎn)螢光基團(tuán)；內(nèi)毒素激活LAL的酶，酶水解肽型化合物生成顏色[文獻(xiàn)1.美國(guó)專(zhuān)利名稱(chēng)為Peptide-type substrates useful in the quantitative determination ofendotoxin.專(zhuān)利號(hào)為US4510241]；利用內(nèi)毒素的脂多糖與多粘菌素或八肽或類(lèi)似的環(huán)肽的相互作用來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素，環(huán)肽或脂多糖上標(biāo)記酶以供進(jìn)一步檢測(cè)[文獻(xiàn)2.歐洲專(zhuān)利名稱(chēng)為Endotoxin assay.專(zhuān)利號(hào)為EP0265127]；用于鱟試劑測(cè)定用的肽型化合物，結(jié)構(gòu)X-A1-A2-A3-B-R，A1-A2-A3是氨基酸，B是酰胺混合物，R與鱟試劑反應(yīng)釋放后產(chǎn)生氨基，進(jìn)一步形成可見(jiàn)顏色[文獻(xiàn)3.歐洲專(zhuān)利名稱(chēng)為Peptide substrates and method for thequantitative assay ofendotoxin.專(zhuān)利號(hào)為EP0228666]；一種用鱟血液變形細(xì)胞溶解物的試劑，及其測(cè)定含絲氨酸蛋白酶樣品中內(nèi)毒素的方法[文獻(xiàn)4.中國(guó)專(zhuān)利名稱(chēng)為用于內(nèi)毒素測(cè)定的試劑以及使用該試劑進(jìn)行測(cè)定的方法，專(zhuān)利號(hào)為ZL94103286.8]；用于內(nèi)毒素特異性鑒別的含有鱟變形細(xì)胞溶解物試劑和烷基葡糖苷的試劑，及使用該試劑特異性鑒別樣品中內(nèi)毒素的方法[文獻(xiàn)5.中國(guó)專(zhuān)利名稱(chēng)為用于內(nèi)毒素特異性鑒別的試劑，專(zhuān)利號(hào)為ZL94117898.6]；一種鱟試劑細(xì)菌內(nèi)毒素快檢盒及使用方法，是按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法所需的鱟試劑、內(nèi)毒素、溶解液、移液滴管等有關(guān)用具經(jīng)特殊處理后，分套包裝成試劑盒，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作[文獻(xiàn)6.中國(guó)專(zhuān)利名稱(chēng)為鱟試劑細(xì)菌內(nèi)毒素快檢盒及使用方法，專(zhuān)利號(hào)為ZL95115774.4]；一種鱟試劑的活性定向生產(chǎn)工藝，制得鱟試劑不易受污染，靈敏度高，自身空白陰性觀(guān)察時(shí)間長(zhǎng)，產(chǎn)品穩(wěn)定性高[文獻(xiàn)7.中國(guó)專(zhuān)利專(zhuān)利號(hào)為ZL95105652.2]；一種通過(guò)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)水中細(xì)菌毒素含量進(jìn)行限量測(cè)定的儀器[文獻(xiàn)8.中國(guó)專(zhuān)利名稱(chēng)為一種細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀，專(zhuān)利號(hào)為ZL95216488.4]，它具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低廉、操作方便、檢測(cè)判定結(jié)果可靠以及符合藥典規(guī)定等諸多優(yōu)點(diǎn)。
利用動(dòng)態(tài)比濁法和動(dòng)態(tài)比色法原理，可以采用儀器來(lái)定量測(cè)定內(nèi)毒素的濃度C，即在鱟試劑反應(yīng)過(guò)程中，觀(guān)察其濁度變化曲線(xiàn)或產(chǎn)色物質(zhì)的顏色變化曲線(xiàn)，預(yù)設(shè)一個(gè)吸光度OD值如OD0.02或拐點(diǎn)，以反應(yīng)曲線(xiàn)從開(kāi)始上升到該預(yù)設(shè)值時(shí)經(jīng)歷的時(shí)間作為反應(yīng)時(shí)間(T(OD0.02)或T50，秒)，該反應(yīng)時(shí)間的對(duì)數(shù)與內(nèi)毒素濃度的對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，即標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為L(zhǎng)ogT(OD0.02)＝a+b LogC或者Log T50＝a+b LogC，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的比較來(lái)計(jì)算樣品中的內(nèi)毒素濃度。國(guó)內(nèi)外常用的相應(yīng)的檢測(cè)儀器有美國(guó)LAL-5000型、日本和光Toxinometer ET-201系列、國(guó)內(nèi)金山川EDS-98，MB-80系列檢測(cè)系統(tǒng)及天大BET-32系列檢測(cè)系統(tǒng)。
采用鱟試驗(yàn)法，不管是定性還是定量測(cè)定內(nèi)毒素的含量，鱟試劑靈敏度的準(zhǔn)確性是至關(guān)重要的；常規(guī)的鱟試劑靈敏度的測(cè)定方法是限量法分別進(jìn)行預(yù)測(cè)定和正式測(cè)定，需要將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品等比稀釋為至少4個(gè)濃度，每個(gè)濃度做4個(gè)管，所用標(biāo)準(zhǔn)品多，試驗(yàn)準(zhǔn)備耗時(shí)長(zhǎng)；反應(yīng)保溫時(shí)間為60±2分鐘，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)；觀(guān)察結(jié)果用目測(cè)法，容易出現(xiàn)人為誤差；內(nèi)毒素的回收率在50-200％之間，范圍寬。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一種測(cè)定鱟試劑靈敏度的方法，以準(zhǔn)確、快速地測(cè)定鱟試劑的靈敏度，解決了測(cè)定鱟試劑靈敏度的方法穩(wěn)定性問(wèn)題。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為1)采用同一個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，在內(nèi)毒素測(cè)定儀上，分別對(duì)不同靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，得到相應(yīng)的特征反應(yīng)時(shí)間的均值和標(biāo)準(zhǔn)差；2)待測(cè)靈敏度的鱟試劑，與同一個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素反應(yīng)并得到相應(yīng)的特征反應(yīng)時(shí)間，將該反應(yīng)時(shí)間與不同靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑的反應(yīng)時(shí)間的均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行比較，判斷并得到待測(cè)鱟試劑的靈敏度。
內(nèi)毒素測(cè)定儀是采用動(dòng)態(tài)比濁法或動(dòng)態(tài)比色法定量測(cè)定內(nèi)毒素，得到相應(yīng)的不同靈敏度鱟試劑的相應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間的均值和標(biāo)準(zhǔn)差；所述動(dòng)態(tài)比濁法為OD限值法、透光率限值法或T50歸一化法；標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑靈敏度范圍最好為0.01～0.5EU/ml；未知鱟試劑的靈敏度范圍最好在0.01～0.5EU/ml；待測(cè)靈敏度的鱟試劑，與一個(gè)或多個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素反應(yīng)，得到相應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間，該反應(yīng)時(shí)間為200～8000秒；最好為470～3600秒。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.快速。本發(fā)明采用定量法來(lái)測(cè)定鱟試劑的靈敏度，由于利用其定量測(cè)定的原理，采用同一個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，在內(nèi)毒素測(cè)定儀上，分別對(duì)不同靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，得到相應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，然后采用同一濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)即可完成鱟試劑靈敏度的測(cè)定，試驗(yàn)準(zhǔn)備耗時(shí)短。另外，在內(nèi)毒素測(cè)定儀器上，采用鱟試劑直接測(cè)定內(nèi)毒素，最少試驗(yàn)10分鐘即可得到相應(yīng)的數(shù)據(jù)，用于鱟試劑靈敏度的計(jì)算，反應(yīng)時(shí)間短。
2.準(zhǔn)確。本發(fā)明可以利用已有的內(nèi)毒素測(cè)定儀器，實(shí)現(xiàn)鱟試劑靈敏度的準(zhǔn)確、定量化測(cè)定，計(jì)算的鱟試劑的靈敏度精確。觀(guān)察結(jié)果用儀器測(cè)定吸光度法，結(jié)果客觀(guān)、準(zhǔn)確。
3.應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明可應(yīng)用于動(dòng)態(tài)比濁法和動(dòng)態(tài)比色法，可望應(yīng)用于科研、藥品生產(chǎn)檢驗(yàn)、鱟試劑的生產(chǎn)過(guò)程監(jiān)控和質(zhì)量控制等，為藥品中內(nèi)毒素的測(cè)定提供更科學(xué)、客觀(guān)的方法。


圖1為采用7.3EU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，分別與不同靈敏度的鱟試劑反應(yīng)特征反應(yīng)時(shí)間結(jié)果示意圖。
圖2為采用不同的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，分別與0.06EU/ml靈敏度的鱟試劑反應(yīng)特征反應(yīng)時(shí)間結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.
1)單一濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素對(duì)不同鱟試劑的試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度30EU/ml，分別對(duì)靈敏度為0.01EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，得到相應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間T(OD0.02)的均值及其標(biāo)準(zhǔn)差(1)350±80(秒)；采用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度4.4EU/ml，分別對(duì)靈敏度為0.06EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑進(jìn)行五次重復(fù)試驗(yàn)，得到相應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間T(OD0.02)的均值及其標(biāo)準(zhǔn)差(2)775±50(秒)；采用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度2.2EU/ml，分別對(duì)靈敏度為0.125EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，得到相應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間T(OD0.02)的均值及其標(biāo)準(zhǔn)差(3)1035±120(秒)；采用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度4.4EU/ml，分別對(duì)靈敏度為0.25EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑進(jìn)行二次重復(fù)試驗(yàn)，得到相應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間T(OD0.02)的均值及其標(biāo)準(zhǔn)差(4)1100±71(秒)；采用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度2.2EU/ml，分別對(duì)靈敏度為0.5EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑進(jìn)行七次重復(fù)試驗(yàn)，得到相應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間T(OD0.02)的均值及其標(biāo)準(zhǔn)差(5)1450±180(秒)；采用7.3EU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，分別與0.01、0.06、0.125、0.25EU/ml靈敏度的鱟試劑反應(yīng)，重復(fù)三次，得到特征反應(yīng)時(shí)間，其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(秒)分別為480±14；590±20；637±12；937±21；(見(jiàn)圖1所示)采用22、7.3、3.7、1.8EU/ml EU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，分別與0.06EU/ml靈敏度的鱟試劑反應(yīng)，重復(fù)三次，得到特征反應(yīng)時(shí)間，其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(秒)分別為450±20；590±20；877±15；1193±51；(見(jiàn)圖2所示)2)鱟試劑的靈敏度測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度4.4EU/ml，對(duì)待測(cè)鱟試劑1進(jìn)行試驗(yàn)，得到反應(yīng)時(shí)間T(OD0.02)值為820秒，在(2)的反應(yīng)時(shí)間范圍內(nèi)，所以鱟試劑1的靈敏度是0.06EU/ml。
比較例1.
常規(guī)的鱟試劑靈敏度的測(cè)定方法是限量法，需要進(jìn)行預(yù)測(cè)定和正式測(cè)定，需要將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品以2倍等比稀釋?zhuān)x擇能出現(xiàn)陽(yáng)性和陰性結(jié)果的4個(gè)邊界稀釋液，每一稀釋液作4個(gè)管，且其最高濃度的4個(gè)管應(yīng)均為陽(yáng)性、最低濃度的4個(gè)管應(yīng)均為陰性，輕輕振動(dòng)上述試管混勻內(nèi)容物，封閉管口，置37±1℃水浴中，保溫60±2分鐘觀(guān)察結(jié)果并按要求計(jì)算本批鱟試劑靈敏度(λ)，內(nèi)毒素的回收率在50～200％之間；即將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素與鱟試劑在37℃保溫反應(yīng)1小時(shí)，根據(jù)目測(cè)是否出現(xiàn)凝膠來(lái)判斷、計(jì)算鱟試劑靈敏度。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于1)采用同一個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，在內(nèi)毒素測(cè)定儀上，分別對(duì)不同靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，得到相應(yīng)的特征反應(yīng)時(shí)間的均值和標(biāo)準(zhǔn)差；2)待測(cè)靈敏度的鱟試劑，與同一個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素反應(yīng)并得到相應(yīng)的特征反應(yīng)時(shí)間，將該反應(yīng)時(shí)間與不同靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑的反應(yīng)時(shí)間的均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行比較，判斷并得到待測(cè)鱟試劑的靈敏度。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于內(nèi)毒素測(cè)定儀是采用動(dòng)態(tài)比濁法或動(dòng)態(tài)比色法定量測(cè)定內(nèi)毒素，得到相應(yīng)的不同靈敏度鱟試劑的相應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
3.按照權(quán)利要求2所述的一種測(cè)定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于所述動(dòng)態(tài)比濁法為OD限值法、透光率限值法或T50歸一化法。
4.按照權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑靈敏度范圍為0.01～0.5EU/ml。
5.按照權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于未知鱟試劑的靈敏度范圍在0.01～0.5EU/ml。
6.按照權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于待測(cè)靈敏度的鱟試劑，與一個(gè)或多個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素反應(yīng)，得到相應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間，該反應(yīng)時(shí)間為200～8000秒。
7.按照權(quán)利要求6所述的一種測(cè)定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于所述反應(yīng)時(shí)間為470～3600秒。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)，具體地說(shuō)是一種測(cè)定鱟試劑的靈敏度的方法，1)采用同一個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，在內(nèi)毒素測(cè)定儀上，分別對(duì)不同靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，得到相應(yīng)的特征反應(yīng)時(shí)間的均值和標(biāo)準(zhǔn)差；2)待測(cè)靈敏度的鱟試劑，與同一個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素反應(yīng)并得到相應(yīng)的特征反應(yīng)時(shí)間，將該反應(yīng)時(shí)間與不同靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑的反應(yīng)時(shí)間的均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行比較，判斷并得到待測(cè)鱟試劑的靈敏度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是快速、準(zhǔn)確、應(yīng)用范圍廣。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1536364SQ03111399
公開(kāi)日2004年10月13日 申請(qǐng)日期2003年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月9日
發(fā)明者李京華, 邵英光, 王俊德 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所