專利名稱：一種無(wú)試劑安培免疫傳感器的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫傳感器的制備及其應(yīng)用，特別是涉及一種無(wú)試劑安培型免疫傳感器的制備及其在免疫分析上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近幾十年來(lái)，免疫分析技術(shù)結(jié)合了抗原、抗體分子間的特異性識(shí)別反應(yīng)和電化學(xué)、光譜學(xué)、聲學(xué)等技術(shù)的靈敏、方便等特性，以其對(duì)腫瘤標(biāo)志物等分析物的高選擇性和高靈敏性，成為臨床、生物化學(xué)、環(huán)境分析等各個(gè)領(lǐng)域重要分析手段之一。常規(guī)的免疫分析方法主要有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法、熒光免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、流動(dòng)注射免疫分析法等。上述方法主要是利用在抗體上標(biāo)記放射性同位素、酶分子、熒光物質(zhì)等，當(dāng)待測(cè)抗原與標(biāo)記抗體經(jīng)過(guò)特異性反應(yīng)，洗板分離后，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記的放射性同位素或熒光物質(zhì)的信號(hào)，或是測(cè)定標(biāo)記酶作用于底物所產(chǎn)生的電活性物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等的信號(hào)進(jìn)行測(cè)定。其操作步驟主要包括第一抗體對(duì)測(cè)定抗原識(shí)別，洗滌，與標(biāo)記二抗反應(yīng)，洗板，加入底物測(cè)定等。
免疫傳感器結(jié)合了免疫分析和光譜或電化學(xué)技術(shù)等諸多特點(diǎn)，在對(duì)分析樣品的測(cè)定時(shí)可不經(jīng)預(yù)處理，操作中無(wú)需洗滌、分離步驟等，受到了廣泛重視。許多種傳感器，特別是各種電化學(xué)傳感器，已在各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮了重要的作用。
電化學(xué)免疫傳感器通常分為電位型免疫傳感器和安培型免疫傳感器。電位型免疫傳感器是將抗原或抗體分子固定在電極表面上，當(dāng)該免疫傳感器在含有待測(cè)抗原和標(biāo)記抗體的溶液中溫育后，待測(cè)抗原的量可通過(guò)在該免疫傳感器上電位的變化進(jìn)行測(cè)定。安培型免疫傳感器則將抗原或抗體分子固定在電極表面上，當(dāng)該傳感器在含有待測(cè)抗原和標(biāo)記抗體的溶液中溫育后，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記在抗體上的酶作用于底物所產(chǎn)生的電活性物質(zhì)的氧化還原信號(hào)來(lái)測(cè)定待測(cè)抗原含量。辣根過(guò)氧化酶、堿性磷酸酶、漆酶和葡萄糖氧化酶等經(jīng)常被用作抗體的標(biāo)記酶，利用它們催化相應(yīng)底物產(chǎn)生電活性物質(zhì)來(lái)制備安培免疫傳感器。如將單克隆抗體固定在傳感器表面，利用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的抗體，通過(guò)夾心反應(yīng)，測(cè)定標(biāo)記在抗體上的辣根過(guò)氧化酶催化待測(cè)溶液中的氧氣或過(guò)氧化氫等底物的電流信號(hào)進(jìn)行測(cè)定；將抗體固定在傳感器表面，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法，利用堿性磷酸酶標(biāo)記抗體對(duì)溶液中萘酚、對(duì)氨基苯酚磷酸鹽等底物的電流信號(hào)進(jìn)行測(cè)定等。
可見(jiàn)，常規(guī)的免疫分析方法操作步驟繁瑣，分析時(shí)間較長(zhǎng)，樣品消耗量大，測(cè)定成本較高，而已有的安培免疫傳感器需要在待測(cè)溶液中加入媒介體或是底物等非免疫試劑，即使是利用待測(cè)溶液中溶解的氧氣作為媒介體，其測(cè)定結(jié)果也受到環(huán)境溫度、壓力、溶液組成等變化的影響。如何避免媒介體和底物的加入，簡(jiǎn)化測(cè)定體系，從而簡(jiǎn)化操作步驟，縮短分析時(shí)間，降低測(cè)定成本已成為人們關(guān)注的問(wèn)題。
固定化酶的直接電化學(xué)已經(jīng)被廣泛用作生物傳感器和無(wú)介質(zhì)生物傳感器的開(kāi)發(fā)，該方法避免了向樣品溶液中加入媒介體以及媒介體對(duì)電極表面的污染。為了克服現(xiàn)有免疫分析方法的缺點(diǎn)，避免在免疫分析中媒介體和底物的加入，簡(jiǎn)化分析步驟，縮短分析時(shí)間，減少樣品消耗，進(jìn)而降低測(cè)定成本，實(shí)現(xiàn)臨床上的在線快速分析，我們首次將固定化酶的直接電化學(xué)性質(zhì)應(yīng)用于免疫分析中，發(fā)展無(wú)試劑免疫分析方法并制備了免疫傳感器，用于臨床腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明的目本發(fā)明是利用鈦溶膠氣相沉積制備技術(shù)(已申請(qǐng)專利，申請(qǐng)?zhí)枮?1138059.4)，將鈦溶膠的膠凝化過(guò)程用于抗原分子在載體表面的包埋，構(gòu)造新型免疫傳感器，并利用標(biāo)記在抗體上的辣根過(guò)氧化酶在與固定在電極表面上的抗原發(fā)生免疫反應(yīng)后表現(xiàn)出的直接電化學(xué)性質(zhì)，開(kāi)發(fā)了一種新的無(wú)試劑免疫分析技術(shù)。
2、技術(shù)方案本發(fā)明的具體實(shí)施方法如下無(wú)試劑安培免疫傳感器的制備方法，其特征在于該制備步驟是(1)將待測(cè)抗原如CA125溶解在pH值為6.5～7.0的緩沖溶液中，緩沖溶液可選擇磷酸鹽緩沖溶液或者Tris～HCl緩沖溶液或者B～R緩沖溶液；所選擇的緩沖溶液因抗原種類而異，標(biāo)準(zhǔn)是使免疫反應(yīng)的活性和電化學(xué)響應(yīng)最大。
(2)對(duì)載體如玻碳或者石墨電極的表面在+1.70V～+1.80V，優(yōu)選+1.75V，進(jìn)行恒電位電解處理250秒-350秒，優(yōu)選300秒，得到富氧基團(tuán)的電極表面；對(duì)載體表面預(yù)處理的要求是，應(yīng)得到平整、干凈、親水性的表面；(3)在載體表面滴涂上(1)中所得的溶液，并將其懸于金屬烷氧基化合物如四異丙氧基鈦或四甲氧基鈦液面的上方，然后將此體系密閉；(4)將以上密閉體系置于15℃～35℃的水浴中，恒溫2～6小時(shí)；密閉體系中液面上的金屬烷氧基化合物蒸汽與載體表面的溶液接觸，發(fā)生緩慢的水解反應(yīng)生成二氧化鈦溶膠，膠凝化后將抗原分子包埋并固定于載體表面，獲得新型免疫功能膜并可制成免疫傳感器。
利用上述制取的無(wú)試劑安培免疫傳感器測(cè)定待測(cè)抗原的方法，其特征在于(1)在常溫或體溫下，經(jīng)40～70min的溫育優(yōu)化；(2)配制濃度范圍在0～500U/mi的待測(cè)抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液和固定量酶標(biāo)記抗體的反應(yīng)溶液，在最大電流響應(yīng)時(shí)相應(yīng)的量的測(cè)定條件下，免疫傳感器分別在這些反應(yīng)溶液中溫育40～70min后，取出，二次水洗滌，于pH值為6.5-7.0的緩沖溶液如磷酸鹽緩沖溶液或者Tris-HCl緩沖溶液或者B-R緩沖溶液中分別測(cè)定出酶在免疫傳感器上直接電化學(xué)信號(hào)的降低，得到該待測(cè)抗原的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線；見(jiàn)附圖1。
(3)在最大電流響應(yīng)時(shí)相應(yīng)的量的測(cè)定條件下，將免疫傳感器在含待測(cè)抗原和固定量酶標(biāo)記抗體的反應(yīng)溶液中溫育40～70min，取出，二次水洗滌后，于pH值為6.5～7.0的緩沖溶液如磷酸鹽緩沖溶液或者Tris-HCl緩沖溶液或者B-R緩沖溶液中測(cè)定出酶在免疫傳感器上直接電化學(xué)信號(hào)的降低，在該抗原的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)濃度。
影響所獲得的免疫功能膜和免疫傳感器性能的主要因素有四個(gè)方面(1)緩沖溶液的pH值只有在一定的酸度下，抗原才具有最佳活性。如果緩沖溶液的酸度偏離這一數(shù)值，將抗原分子溶解于其中就會(huì)傷害它的活性，從而影響免疫功能膜和免疫傳感器的性能。
(2)載體表面性質(zhì)載體表面是否親水性，對(duì)能否生成均勻、有效的免疫功能膜至關(guān)重要。若載體表面顯疏水性，含待測(cè)抗原溶液滴涂在載體表面后會(huì)自動(dòng)聚集形成微滴，溶膠膠凝化以后，生成的免疫功能膜膜厚、干脆且不均勻，最終影響免疫功能膜及免疫傳感器的性能。
(3)溫度當(dāng)?shù)瓮坑锌乖芤旱妮d體懸于金屬烷氧基化合物如四異丙氧基鈦或者四甲氧基鈦液面之上時(shí)，會(huì)有兩個(gè)過(guò)程同時(shí)發(fā)生，一是金屬烷氧基化合物蒸汽在載體表面沉積，另一個(gè)是載體表面溶液中水分的揮發(fā)。如果溫度太高，金屬烷氧基化合物的蒸汽壓太大，水解的速度太快，此時(shí)形成的就不是溶膠，而是二氧化鈦的顆粒沉淀；如果溫度太低，金屬烷氧基化合物的蒸汽壓太小，水分揮發(fā)的速度就會(huì)比蒸汽沉積的速度快，載體表面以致沒(méi)有足夠的水與金屬烷氧基化合物的蒸汽發(fā)生水解反應(yīng)來(lái)生成想要的溶膠。
(4)時(shí)間足夠的時(shí)間能使水解反應(yīng)充分，同時(shí)也能保證溶膠完全膠凝化。太短的時(shí)間會(huì)使反應(yīng)不充分，膠凝化不完全；太長(zhǎng)的時(shí)間，在溶膠完全膠凝化以后就毫無(wú)意義了。
利用無(wú)試劑免疫傳感器測(cè)定抗原條件的優(yōu)化包括以下三個(gè)方面(1)溫育溫度免疫反應(yīng)一般在人體或高等動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生，其對(duì)溫度較敏感。在適合的溫度下如常溫或人體溫度，免疫反應(yīng)達(dá)到最大效率。低于該溫度，抗原、抗體分子活性較低，反應(yīng)較慢；高于該溫度，抗原、抗體分子容易變性直至失活。
(2)溫育時(shí)間免疫反應(yīng)中抗原、抗體間的識(shí)別、結(jié)合通常需要一定時(shí)間來(lái)完成，為保證測(cè)定的準(zhǔn)確性和靈敏性，要求提供足夠長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間確保免疫反應(yīng)完全，此時(shí)間一般為40-70min。
(3)反應(yīng)溶液中酶標(biāo)抗體的量該測(cè)定利用競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法，即通過(guò)反應(yīng)溶液中游離待測(cè)抗原與固定在免疫傳感器上的抗原產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，使反應(yīng)溶液中酶標(biāo)抗體與固定在免疫傳感器上的抗原發(fā)生的反應(yīng)量減少?gòu)亩a(chǎn)生信號(hào)降低間接來(lái)測(cè)定待測(cè)抗原的量。反應(yīng)溶液中酶標(biāo)抗體的量應(yīng)等于傳感器表面固定的抗原的量，此時(shí)，獲得最大檢測(cè)范圍且檢測(cè)最靈敏。若酶標(biāo)抗體的量小于該值，會(huì)使檢測(cè)范圍縮??；若酶標(biāo)抗體的量大于該值，會(huì)使測(cè)定結(jié)果偏小。
3、有益效果該方法利用特異性免疫反應(yīng)和標(biāo)記抗體的酶在二氧化鈦溶膠凝膠膜上表現(xiàn)的直接電化學(xué)響應(yīng)，發(fā)展了新穎的無(wú)試劑免疫分析方法并制備了免疫傳感器。利用二氧化鈦溶膠凝膠氣相沉積法固定抗原分子，并利用競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法，通過(guò)直接測(cè)定反應(yīng)到免疫傳感器表面上標(biāo)記抗體的酶的直接電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)的降低直接得到待測(cè)抗原的濃度。該方法較現(xiàn)有的免疫分析方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)無(wú)需向待測(cè)樣品溶液中加入媒介體或其它試劑，避免了媒介體等對(duì)電極的污染，簡(jiǎn)化了分析體系；(2)分析測(cè)定中免疫反應(yīng)一步完成，減少樣品消耗，且無(wú)需洗滌，分離等步驟，簡(jiǎn)化了免疫分析的操作步驟，縮短了分析時(shí)間，適用于臨床上在線快速檢測(cè)；(3)通過(guò)對(duì)不同標(biāo)記抗體的酶的直接電化學(xué)的檢測(cè)或?qū)㈦娀钚晕镔|(zhì)直接標(biāo)記在抗體上，可以完成多種不同抗原分子的直接測(cè)定；(4)該傳感器表現(xiàn)出很好的精確性，重復(fù)性和穩(wěn)定性，可發(fā)展成為一次性免疫測(cè)定傳感器并向市場(chǎng)推廣。
四

附圖1是CA125測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
五、實(shí)施方式1、實(shí)施例1CA125免疫傳感器的制備選擇直徑4mm的盤(pán)狀平面玻碳電極作載體材料，以CA125為例作為包埋固定的對(duì)象(a)電極拋光先將電極表面用金相砂紙打磨，然后分別用1.0，0.3，0.05μm的γ-氧化鋁漿在麂皮上拋光，接著用二次水沖洗干凈，電極表面依次用1∶1硝酸、丙酮、二次水超聲清洗，得到新鮮干凈的電極表面。
(b)電極表明預(yù)處理將拋光后的電極在pH值為5.0的磷酸鹽緩沖溶液中于+1.75V恒電位下電解300秒后，再分別在+0.3V～+1.3V和+0.3V～-1.3V電位范圍內(nèi)循環(huán)掃描直至得到穩(wěn)定電流值。取出電極，二次水沖洗后，氮?dú)獯蹈伞?br> (c)取5微升500U/mL標(biāo)準(zhǔn)CA125抗原溶液，滴涂在經(jīng)(b)步驟處理的電極表面，然后將此電極懸于四異丙氧基鈦液面的上方，將體系密閉后于25℃恒溫4小時(shí)。
(d)在密閉體系中，四異丙氧基鈦蒸汽與電極表面的抗原溶液接觸，發(fā)生緩慢的水解反應(yīng)生成二氧化鈦溶膠。溶膠在膠凝成膜的過(guò)程中將CA125抗原包埋凝膠膜內(nèi)，從而被固定在電極表面，制成CA125免疫傳感器。
2.實(shí)施例2CA125的測(cè)定
(a)測(cè)定條件的優(yōu)化分別改變溫育溫度，溫育時(shí)間及反應(yīng)溶液中HRP標(biāo)記CA125抗體的量，選擇最大電流響應(yīng)時(shí)相應(yīng)的量作為最佳測(cè)定條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)在33℃下溫育40min，得到最大電流響應(yīng)，當(dāng)50微升反應(yīng)溶液中HRP標(biāo)記CA125抗體量大于83％時(shí)，電流響應(yīng)達(dá)到最大值。
(b)CA125的測(cè)定在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，利用競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法，測(cè)定一系列標(biāo)準(zhǔn)CA125抗原濃度，確定CA125測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，測(cè)定樣品中CA125抗原的濃度。
權(quán)利要求
1.一種無(wú)試劑安培免疫傳感器的制備方法，其特征在于制備步驟是(1)將待測(cè)抗原溶解在pH值為6.5～7.0的緩沖溶液中；(2)對(duì)載體表面在+1.70V～+1.80V條件下進(jìn)行恒電位電解處理250秒～350秒得到富氧基團(tuán)的電極表面；(3)在載體表面滴涂上述溶液，并將其懸于金屬烷氧基化合物液面的上方，然后將此體系密閉；(4)將以上密閉體系置于15℃～35℃的水浴中，恒溫2～6小時(shí)；密閉體系中液面上的金屬烷氧基化合物蒸汽與載體表面的溶液接觸，發(fā)生緩慢的水解反應(yīng)生成二氧化鈦溶膠，膠凝化后將抗原分子包埋并固定于載體表面，獲得新型免疫功能膜并可制成免疫傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)試劑安培免疫傳感器的制備方法，其中(1)所述的緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液或者Tris-HCl緩沖溶液或者B-R緩沖溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)試劑安培免疫傳感器的制備方法，其中(1)所述待測(cè)抗原為CA125。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)試劑安培免疫傳感器的制備方法，其中(2)所述的電壓為+1.75V。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)試劑安培免疫傳感器的制備方法，其中(2)所述的處理時(shí)間為300秒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)試劑安培免疫傳感器的制備方法，其中(2)所述載體為玻碳或者石墨電極。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)試劑安培免疫傳感器的制備方法，其中(3)所述的金屬烷氧基化合物為四異丙氧基鈦或者四甲氧基鈦。
8.一種利用權(quán)利要求1所述的無(wú)試劑安培免疫傳感器測(cè)定待測(cè)抗原的方法，其特征在于(1)在常溫或體溫下，經(jīng)40～70min的溫育優(yōu)化；(2)配制濃度范圍在0～500U/ml的待測(cè)抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液和固定量酶標(biāo)記抗體的反應(yīng)溶液，通過(guò)選擇最大電流響應(yīng)時(shí)相應(yīng)的量作為測(cè)定條件，利用竟?fàn)幟庖叻磻?yīng)，免疫傳感器分別在這些反應(yīng)溶液中溫育40～70min后，取出，二次水洗滌，于pH值為6.5～7.0的磷酸鹽緩沖溶液或者Tris-HCl緩沖溶液或者B-R緩沖溶液中分別測(cè)定出酶在免疫傳感器上直接電化學(xué)信號(hào)的降低，得到該待測(cè)抗原的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)在最大電流響應(yīng)時(shí)相應(yīng)的量的測(cè)定條件下，將免疫傳感器在含待測(cè)抗原和固定量酶標(biāo)記抗體的反應(yīng)溶液中溫育40～70min，取出，二次水洗滌后，于pH值為6.5～7.0的磷酸鹽緩沖溶液或者Tris-HCl緩沖溶液或者B-R緩沖溶液中測(cè)定出酶在免疫傳感器上直接電化學(xué)信號(hào)的降低，在該抗原的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種無(wú)試劑安培免疫傳感器的制備方法和在免疫分析中的應(yīng)用，其制備步驟是將待測(cè)抗原溶解在緩沖溶液中，對(duì)載體表面進(jìn)行預(yù)處理并在其表面滴涂上述溶液，懸于金屬烷氧基化合物的液面上方，密閉此體系恒溫水浴可獲得免疫傳感器。對(duì)待測(cè)抗原測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，然后進(jìn)行一系列的處理可得到待測(cè)抗原的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及通過(guò)電化學(xué)信號(hào)的降低，在測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出相應(yīng)濃度。此方法無(wú)需向待測(cè)樣品溶液中加入媒介體或其它試劑，避免了媒介體等對(duì)電極的污染，簡(jiǎn)化了分析體系，分析反應(yīng)也可一步完成，具有很好的精確性、重復(fù)性和穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)G01N33/535GK1438482SQ0311305
公開(kāi)日2003年8月27日 申請(qǐng)日期2003年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月26日
發(fā)明者嚴(yán)楓, 戴宗, 鞠熀先 申請(qǐng)人:江蘇省腫瘤醫(yī)院, 南京大學(xué)