專利名稱：胃炎篩選方法
背景技術(shù)：
消化不良是基本衛(wèi)生保健中的常見診斷，但是卻沒有嚴(yán)格的定義。在英國每年普遍的消化不良大約為25％，而根據(jù)有關(guān)會(huì)議在基本衛(wèi)生保健中其值為3-4％(Harris，A.，Eur JGastroenterol Hepat 1999；11(Suppl 1)531-5)。在各種上腸胃管道的慢性疾病之中有一些屬于一般的胃炎種類。胃炎是一種胃粘膜的炎癥，它由廣泛的未充分定義的癥狀而表現(xiàn)出來，例如消化不良，“燒心”以及頻繁打嗝。用于診斷腸胃疾病的典型方法依賴于這樣的一些因素，如癥狀的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，個(gè)體的總體健康狀態(tài)，患者的醫(yī)藥歷史，為了提供合情合理的盡可能成功的治療方法而要求的特殊診斷方法，以及診斷裝置的可利用率。
帶有活組織檢查術(shù)組織病理學(xué)的檢測食管胃十二指腸鏡檢術(shù)(EGD)是確定胃和十二指腸粘膜狀態(tài)的參比標(biāo)準(zhǔn)。這種檢查安全、準(zhǔn)確并且有時(shí)候是必需的，例如，在老年人群中，和特別是存在警告性癥狀比如重量減輕、厭食、吞咽困難或者腸胃出血的人群中。上部內(nèi)窺鏡檢查的需求在增加，在英國每年大約有0.5％的人進(jìn)行該項(xiàng)檢查(Working Party of theClinical Services Committee of the British Society of Gastroenterology，Provisionof gastrointestihal endoscopy and related serviees for a district general hospital.Gut 1991；3295-105；Gear，M.W.L.，and Wilkinson，S.P.，BrJ Hosp Med 1989；41438-44)。沒有EGD和粘膜的可視性檢查，胃炎很難被診斷。然而，EGD很昂貴，對(duì)患者來說是不方便的，并且一般情況下不推薦給兒童或患有嚴(yán)重心肺疾病的患者使用。因此，對(duì)于沒有嚴(yán)重癥狀的患者可能就沒有采用腸胃疾病的精確診斷方式。這樣的患者可能僅僅被給予常規(guī)的治療手段，例如抗酸劑或抑制胃酸分泌的藥物。而這樣的治療手段可能暫時(shí)緩解了癥狀，卻經(jīng)常沒有實(shí)現(xiàn)治愈。更有效的治療依賴于對(duì)腸胃疾病真實(shí)情況的更好診斷。例如，許多腸胃疾病是由粘膜的細(xì)菌感染所介導(dǎo)的，在這種情況下細(xì)菌感染治療可能是治療明顯的腸胃疾病的最有效的方法。
需要有一種胃鏡檢查法前的篩選方法來減少內(nèi)窺鏡的工作量，并且在此方向上已經(jīng)進(jìn)行了嘗試而且在簡單的消化不良患者中取得了一些成功(Bodger，K.，er al.，Scand JGastroenterol 1999；34856-63；and Moayyedi，R，et al.，Eur J Gastroenterol Hepatol1999；111245-50)。在年青的患者(＜40歲)中進(jìn)行幽門螺旋桿菌(H.pylori)感染的篩選而基于感染存在的治療策略減少了內(nèi)窺鏡的工作量。這種策略在減少消化不良的癥狀、消化不良求診率以及抗分泌藥物處方上與基于內(nèi)窺鏡的策略同樣有效(Moayyedl，P.，et al.，EurJ Gastroenterol Hepatol 1999；111245-50)。然而在年老的消化不良患者中，胃炎及其結(jié)果在以EGID為起始診斷步驟的檢查中要高得多。
發(fā)炎的胃粘膜將特異的信息傳送給血流從而使通過血清學(xué)分析進(jìn)行胃炎診斷成為可能。粘膜的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞組分在酸分泌腺體和竇之間變化。這有助于將體性和廣泛性胃炎與竇性胃炎區(qū)分開來。已經(jīng)描述過許多的血清學(xué)標(biāo)記。幽門螺旋桿菌(H.Pylori)的感染是導(dǎo)致慢性胃炎、十二指腸潰瘍、粘膜相關(guān)的淋巴組織(MALT)淋巴瘤以及胃腫瘤的主要原因。(Chiba，N.，etal.，Can Fam Physician 1998.；441481-8；Genta，R.M.，Gut 1998；4335-8；Coyle，W.J.，et al.，Gastrointest Endose 1998；48327-8；Lee，B.M.，et al.，Jpn J Cancer Res 1998；89597-603)，并且各種幽門螺旋桿菌(H.Pylori)抗原的抗體能夠容易地在血液中檢測出來(Bodger，K，et al.，Scand J Gastroenterol 1999；34856-63；Moayyedi，P.，et al.，EurJ Gastroenterol Hepatol 1999；111245-50)。這種感染有時(shí)與傾向?qū)е抡衬んw萎縮的自身免疫反應(yīng)相關(guān)(Ozasa，K，et al.，Dig Dis Sci 1999；44253-6)。胃自身免疫性疾病和常見的幾種其他自身變異性疾病例如，甲狀腺炎，胰島素依賴型糖尿病和某些情況的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的共同特征是出現(xiàn)了壁細(xì)胞的自身抗體(Bech，K et al.，Acta Endocrinol.1991，124534-9；Barrio，R.，et al.，Pediatr Endocrinol Metab 1997，10511-6；Datta，A.Et al.，IndianJ Med Res 1990，92228-32；Mrdh，S.，et al.，Scand J Gastroenterol 1991，261089-96)。已發(fā)現(xiàn)壁細(xì)胞H，K-ATP酶a-和R-亞基是自身免疫萎縮性胃炎中主要的自身抗原(Karisson，A.，et al.，J Clin Invest 1988，81A75-9；Song，Y.H.，et al.，Scand J gastroenterol 1994，29122-7；Ma，J.Y.et al.，Scand J Gastroenterol 1994，20790-4)。由于壁細(xì)胞的正常流動(dòng)在健康個(gè)體中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)低滴度的H，K-ATP抗體。
胃蛋白酶原1(PG1)由胃體粘膜的主細(xì)胞和粘液頸細(xì)胞分泌到胃管腔中，但是有一小部分(大約1％)滲漏至血流中(Baron，JR，Clinical tests of gastric secretionHistory，Methodology and Interpretation.(1978)LondonMacmillan)。血清中PG1濃度升高通常見于患有十二指腸潰瘍的患者中(Samioff，I.M.，et al.，Gastroenterol 1975 Jul，69(1).83-90)。在由于嚴(yán)重的胃體粘膜萎縮而導(dǎo)致惡性貧血的患者中血清PG1顯著下降(Samioff I.M.，et al.，Gastroenterol 1982 Jul，83(1 Pt 2)204-9)。
現(xiàn)存的腸胃疾病非侵入性檢測方法包括監(jiān)控流至受影響區(qū)域的血流以檢測炎癥(US5524622)。此方法的明顯缺點(diǎn)是需要給患者體內(nèi)注射多種物質(zhì)并且隨后用伽瑪照相機(jī)進(jìn)行檢測。此外，該方法僅僅檢測炎癥，不能確定任何炎癥的內(nèi)在原因。其他檢測腸胃疾病的方法包括測定個(gè)體的分析物，例如胃蛋白酶原(US5879897)或幽門螺旋桿菌(US5814455；6067989；6068985；6090611)。其他血清學(xué)的標(biāo)記是胃泌素(Borch，K，et al.，Scand J Gastroeterol1997，32198-202)，胃蛋白酶原11(Carmel，R.，AmJPathol1998，90307-12)以及胃蛋白酶原抗體(Mrdh，S.，et al.，Acta Physiol Scand 1989，136581-7)。盡管這些標(biāo)記中的每一種都可以用來診斷胃粘膜的變化，但是健康受檢者和患者之間的重疊率非常高，并且在患者的各種亞組之中更高。因此所有這些標(biāo)記中沒有一個(gè)可以單獨(dú)提供可靠的診斷結(jié)果。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種篩選各種類型胃炎的方法，它涉及到對(duì)H，K-ATP酶抗體，H.pylori抗體以及血清胃蛋白酶原1濃度測定結(jié)果的評(píng)估。對(duì)多種與胃炎相關(guān)的分析物的分析提供了一種針對(duì)胃炎的各種亞組的可靠指示。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中包括一種診斷人可能患有胃炎的方法，該方法對(duì)血液樣本進(jìn)行評(píng)估，其中包括測定血液樣本中H，K-ATP酶特異性抗體、幽門螺旋桿菌特異性抗體的存在以及胃蛋白酶原1的濃度，然后在一個(gè)軟件形式的系統(tǒng)中將H，K-ATP酶抗體、幽門螺旋桿菌抗體以及胃蛋白酶原濃度與正常人群中H，K-ATP酶抗體、幽門螺旋桿菌抗體以及胃蛋白酶原濃度相對(duì)比，其中樣本中各項(xiàng)水平的變化就指示了胃炎，并且由此，優(yōu)選的是變化了的檢測水平導(dǎo)致進(jìn)行關(guān)于胃炎的進(jìn)一步的研究。
一種涉及方法的優(yōu)選實(shí)施例，其中確定所述指示物水平的步驟包括對(duì)所檢測的指示物進(jìn)行免疫測定。
另一種涉及方法的優(yōu)選實(shí)施例，其中指示物的組包括一種附加指示物，該附加指示物包括用胃蛋白酶原1的水平乘以幽門螺旋桿菌抗體的水平，并且這種附加指示物的水平被拿來與標(biāo)準(zhǔn)值相比較。
又一種涉及方法的其他優(yōu)選實(shí)施例，其中明顯高于正常人群水平的H，K-ATP酶特異性抗體和幽門螺旋桿菌特異性抗體的水平作為胃炎的指示物。
又一種涉及方法的優(yōu)選實(shí)施例，其中降低的胃蛋白酶原1濃度水平作為胃體萎縮的指示物。
一種涉及方法的其他優(yōu)選實(shí)施例，其中升高的胃蛋白酶原1水平作為任意的不涉及任何自身免疫的體性胃炎的指示物。
又一種涉及方法的其他優(yōu)選實(shí)施例，其中與正常人群不同的H，K-ATP酶特異性抗體水平作為一種自身免疫性胃體萎縮的指示物。
另一種涉及方法的優(yōu)選實(shí)施例，其中與正常人群不同的幽門螺旋桿菌抗體的水平作為竇性或廣泛性胃炎的指示物。
又一種涉及方法的優(yōu)選實(shí)施例，其中升高了的幽門螺旋桿菌抗體的水平和正常至降低了的胃蛋白酶原濃度作為萎縮的指示物。
一種涉及方法的其它優(yōu)選實(shí)施例，其中非常低濃度的胃蛋白酶原與升高了的H，K-ATP酶特異性抗體水平組合作為胃體萎縮的指示物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于篩選胃炎的試劑盒，它包括適合于檢測H，K-ATP酶特異性抗體，幽門螺旋桿菌抗體以及胃蛋白酶原1濃度的試劑。
本發(fā)明后一個(gè)方面的一種優(yōu)選實(shí)施例是一種試劑盒，其中的試劑包括胃蛋白酶原1抗體、H，K-ATP酶和幽門螺旋桿菌的蛋白質(zhì)或多肽。
本發(fā)明后一個(gè)方面的一種其他優(yōu)選實(shí)施例是一種試劑盒，其中的試劑包括固定在一種固相支持物上的胃蛋白酶原1，H，K-ATP酶和幽門螺旋桿菌抗原。
本發(fā)明后一個(gè)方面的另一種優(yōu)選實(shí)施例是一種試劑盒，其中它還包含標(biāo)記了的抗一人抗體。
本發(fā)明后一個(gè)方面的又一種優(yōu)選實(shí)施例是一種試劑盒，其中的所提供試劑的數(shù)量對(duì)于完成檢測H，K-ATP酶抗體，幽門螺旋桿菌抗體以及胃蛋白酶原1濃度的測定所需要的數(shù)量來說是足夠的。
附圖簡述

圖1A-1D分別顯示了胃粘膜正常(N)的個(gè)體和患有十二指腸潰瘍(DU)、萎縮性胃炎(AG)以及伴有惡性貧血的胃炎(PA)的患者的H，K-ATP酶抗體，幽門螺旋桿菌抗體以及胃蛋白酶原1的濃度，以及用幽門螺旋桿菌抗體的水平乘以胃蛋白酶原1濃度的結(jié)果。
圖2是描述檢測評(píng)估方案的流程圖。
圖3A-3D顯示的是針對(duì)N、DU、AG和PA檢測組采用本發(fā)明的篩選檢測方法所鑒別出的四個(gè)主要組的分布情況的圓圖。
圖4A-4D顯示的是針對(duì)正常人群采用本發(fā)明的篩選檢測方法所鑒別出的四個(gè)主要組的分布情況的圓圖。
發(fā)明詳述胃炎和消化不良是基本衛(wèi)生保健中的常見疾病，但是卻沒有嚴(yán)格的定義。本發(fā)明的目標(biāo)是提供一種用于胃炎的血清學(xué)篩選檢測方法。帶有活組織檢查和組織學(xué)檢測的食管胃十二指腸鏡檢術(shù)(EGD)要求熟練和有經(jīng)驗(yàn)的人員并且目前它是用于診斷胃炎、良性潰瘍和腫瘤形成的唯一可靠的技術(shù)。后兩類通常與慢性胃炎密切相關(guān)。以前的研究經(jīng)常認(rèn)為血清學(xué)具有很有限的診斷價(jià)值。然而本發(fā)明針對(duì)分析的血清學(xué)數(shù)據(jù)的的評(píng)估方案作為消化不良的胃鏡檢查前篩選是十分有用的，它不用考慮患者的年齡，與現(xiàn)有技術(shù)(Bodger，K，et al.，Scand J Gastroenterol 1999，34856-63；Moayyedi，R，et al.，Eur J Gastroenterol Hepatol 1999，111245-50)相比具有很大的改進(jìn)。免疫系統(tǒng)和來自發(fā)炎的胃粘膜的化學(xué)信號(hào)提供了血清學(xué)分析物以及檢測胃炎的診斷可行性。
確定H，K-ATP酶抗體，幽門螺旋桿菌抗體以及胃蛋白酶原1的濃度的測定方法是已知的。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，確定分析物水平的方法是通過免疫測定。免疫測定可以是任何已知的方法，包括但不限于，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，酶免疫測定(EIA)，放射免疫測定(RIA)，免疫沉淀法(IP)，以及免疫配基相互作用的光或電化學(xué)檢測。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，免疫測定中的抗原被固定在一個(gè)固相支持物上，加入樣本，隨后是標(biāo)記了的抗體。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是一個(gè)對(duì)胃炎進(jìn)行篩選的的試劑盒。該試劑盒包括針對(duì)選自由H，K-ATP酶抗體，幽門螺旋桿菌抗體以及胃蛋白酶原1的水平所組成的組中至少兩個(gè)指示物進(jìn)行測定所需要的試劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，測定是免疫測定，并且試劑盒包含被固定在一種或更多固相支持物(例如微量滴定板，試紙條，硝化纖維或其他合適的材料)上的分析物。標(biāo)記了的抗體也包括在檢測中。試劑盒優(yōu)選地包含可完成不同測定中的每個(gè)測定的數(shù)量足夠的試劑。例如，試劑盒可以包含足以完成十個(gè)H，K-ATP酶測定，十個(gè)幽門螺旋桿菌測定以及十個(gè)胃蛋白酶原測定的試劑。此外，試劑盒還可以包含分析物特異性抗體，標(biāo)記試劑，陽性和陰性對(duì)照以及洗脫液。
免疫測定方法是建立在對(duì)來自患者的血液樣本進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上；測定了H，K-ATP酶自身抗體，幽門螺旋桿菌抗體以及胃蛋白酶原的濃度。所有這些分析物都作為胃粘膜發(fā)炎情況下的標(biāo)記物。檢測分析物的方法，例如免疫測定，在本領(lǐng)域中是公知的。
測定結(jié)果通過一種新的分組程序來進(jìn)行分析，在其中結(jié)果被拿來與來自正常人群的健康個(gè)體的參考值進(jìn)行對(duì)比。一個(gè)數(shù)學(xué)表達(dá)式(胃蛋白酶原濃度乘以幽門螺旋桿菌抗體的滴度所得的結(jié)果)對(duì)于鑒別一組特異性患者來說是必需的。其他的數(shù)學(xué)程序也可以被用來給它們提供實(shí)現(xiàn)對(duì)胃炎患者有用的分組。而這種診斷胃粘膜中發(fā)炎情況的分組程序以前需要更為昂貴和復(fù)雜的帶有對(duì)來自粘膜的活組織檢查的病理組織學(xué)檢測的胃鏡檢查術(shù)。
來自正常人群中健康個(gè)體的參考值可以針對(duì)每個(gè)測定而標(biāo)準(zhǔn)化。在這個(gè)實(shí)施例中，為了確定患者患有胃炎的可能性，檢測結(jié)果被拿來與標(biāo)準(zhǔn)化了的參考值相對(duì)比。試劑盒將包含針對(duì)每個(gè)測定的一列標(biāo)準(zhǔn)化了的參考值。在可替換的實(shí)施例中，參考值通過隨同患者樣本一起檢測一個(gè)正常的對(duì)照而獲得。在該實(shí)施例中，試劑盒將包含一個(gè)正常的對(duì)照以及標(biāo)準(zhǔn)。在進(jìn)行該測定時(shí)，操作人員要在檢測患者樣本的同時(shí)進(jìn)行對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)的測定。對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果隨后被拿來與患者樣本的結(jié)果相對(duì)比。
來自被胃鏡和活組織檢查術(shù)檢查過的受檢者的血清被拿來進(jìn)行了H，K-ATP酶抗體，幽門螺旋桿菌抗體以及胃蛋白酶原1的分析。診斷結(jié)果是正常胃粘膜(n＝50)，十二指腸潰瘍(n＝53)，伴有惡性貧血的萎縮性體性胃炎(n＝50)或不伴有惡性貧血的萎縮性體性胃炎(n＝46)。評(píng)估方案(流程圖)通過在血清學(xué)和胃炎粘膜形態(tài)學(xué)檢測之間進(jìn)行診斷符合度的優(yōu)化而得以建立。獲得了四個(gè)主要的血清學(xué)組和十三個(gè)亞組，它們對(duì)檢測胃炎的總敏感率為98％(146/149)(95％CI 94-100％)，特異性為84％(42/50)(95％CI 71-93％)。另外來自一般人群的483名受檢者的血清通過血清學(xué)分組。在這個(gè)人群中的總敏感率為88％(211/240)(95％CI 83-92％)而特異性為81％(196/243)(95％CI 75-85％)。在用來研發(fā)評(píng)估方案的組中和在一般人群的樣本中血清學(xué)和胃粘膜形態(tài)學(xué)診斷之間表現(xiàn)出很好的符合度。因此，血清學(xué)檢測用作受檢者的初步鑒別是很合適的，這些受檢者包括帶有正常胃粘膜的，已證明消除了幽門螺旋桿菌的，以及處于發(fā)展為惡性的危險(xiǎn)中的和其他需要進(jìn)行胃鏡檢查的人。
在測定樣本的閱讀中，與正常對(duì)照值相比患者樣本中的分析物變化了的水平是患者患有胃炎的指示。“變化了的”意思是水平顯著高于或低于正常對(duì)照。何為顯著值取決于所進(jìn)行的特異性檢測的準(zhǔn)確性和精確性并且可以通過經(jīng)驗(yàn)而無需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來確定。此外，為了獲得患者是否患有胃炎的更為準(zhǔn)確的確定，患者中多個(gè)分析物的水平被拿來與正常對(duì)照值相對(duì)比。例如，一般來說，患者的H，K-ATP酶抗體和幽門螺旋桿菌抗體高于正常對(duì)照水平指示的是胃炎，而患者的胃蛋白酶原水平顯著高于(十二指腸潰瘍)或顯著低于(嚴(yán)重的胃體萎縮)正常對(duì)照也指示的是胃炎。胃蛋白酶原濃度乘以幽門螺旋桿菌滴度顯著高于或顯著低于正常對(duì)照也可以是胃炎的指示。為了確定患者患有胃炎的可能性和/或確定患者胃炎的亞組，多個(gè)測定結(jié)果組合起來與正常對(duì)照值相對(duì)比。由于一些分析物可以高于或低于正常對(duì)照水平并且仍然指示的是胃炎，因此患者中多個(gè)分析物水平與正常對(duì)照同樣分析物水平的對(duì)比為胃炎提供了更為準(zhǔn)確的測定。
采用病理組織學(xué)檢測作為參比標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明顯示血清學(xué)測定的組合對(duì)帶有正常胃粘膜的受檢者的檢出率為87％(196/225，圖2中的組1A；表2)，而在研究組中的檢出率為84％(42/50，組1A；表1)。在研究組中，患有十二指腸潰瘍的受檢者血清學(xué)檢出率為91％(48/53，組2)而伴有或不伴有惡性貧血的體性萎縮性胃炎受檢者的血清檢出率為84％(81/96，組3加4)。所有患有惡性貧血的受檢者都落入組4中。在人群樣本中，組2A-D占15％。在這些人之中，僅有3％具有正常粘膜，而萎縮性竇性胃炎和廣泛性胃炎總共占88％。再組2A-D中的所有受檢者都是幽門螺旋桿菌陽性的。因此建議落入組2A-D中的年齡在40-50歲或更小的受檢者可以根據(jù)目前對(duì)消化性潰瘍疾病的建議而進(jìn)行治療。
在人群樣本中僅有12個(gè)受檢者落入組4A4C中；一個(gè)患有非萎縮性體性胃炎而其他11個(gè)人患有萎縮性體性胃炎。因此，屬于組4的受檢者由于惡性危險(xiǎn)很高，應(yīng)該建議做EGID。
在人群樣本中有12％(29/225)具有正常的胃粘膜，但是其血清學(xué)分析的結(jié)果不正常。這種矛盾有幾種可能的解釋；血清分析的一些結(jié)果可能反映了以前的發(fā)炎情況，或者是ELISAs比大多數(shù)有經(jīng)驗(yàn)的檢測者對(duì)于粘膜的微小變化具有更高的敏感性。
在結(jié)論中，帶有活組織檢查的EGID作為胃粘膜狀態(tài)的準(zhǔn)確診斷方法仍然是參比標(biāo)準(zhǔn)。然而，如以下例子所示，血清學(xué)檢測在與患者的癥狀和醫(yī)藥歷史相結(jié)合時(shí)是一種很好的補(bǔ)充。其作用相當(dāng)于“血清學(xué)活組織檢查”。因此，血清學(xué)測定非常適合于消化不良的胃鏡前篩選從而鑒別(a)帶有正常胃粘膜的患者(組1A)，(b)帶有高水平的血清PG1和高的“H.p.X PG1-因子”的幽門螺旋桿菌陽性患者，以及(c)患有體性萎縮性胃炎的患者(組3加4)。(a)中的患者可以進(jìn)行“非酸相關(guān)的”疾病的進(jìn)一步檢查，那些在(b)中的小于40-50歲的患者因該根據(jù)針對(duì)消化性潰瘍疾病的建議進(jìn)行治療，而在治療不成功的情況下，患者應(yīng)該考慮EGD。(c)中的患者具有發(fā)展成胃惡性腫瘤的高危險(xiǎn)性，應(yīng)該考慮EGD。
所描述的血清學(xué)測定和評(píng)估程序很簡單并且可以在任何具有一些免疫測定經(jīng)驗(yàn)的臨床實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。它們減少了內(nèi)窺鏡的工作量，有利于患者，也為醫(yī)生提供了有價(jià)值的診斷而且節(jié)約成本。
實(shí)施例1為了進(jìn)行血清學(xué)結(jié)果的初始評(píng)估，選擇了內(nèi)窺鏡和組織解剖學(xué)檢查過的四組受檢者的血清；50名受檢者具有正常的胃粘膜(N)(38名男性和12名女性，年齡中間值為63歲，范圍從37-80歲)，53名受檢者患有急性十二指腸潰瘍(DU)(39名男性和14名女性，年齡中間值為52歲，范圍從20-79)，46名受檢者診斷為患有輕微至嚴(yán)重的體性萎縮性胃炎(AG)(23名男性和23名女性，年齡中間值為68歲，范圍從40-82)，50名受檢者患有伴有惡性貧血的體性萎縮性胃炎(PA)(23名男性和27名女性，年齡中間值為68歲，范圍從40-83)。惡性貧血的診斷標(biāo)準(zhǔn)包括希林氏檢測，該檢測顯示內(nèi)因子的缺失并且在以前就公開了(Borch，K，etal.，Scand J Gastroenterol 1984，19154-60)。
實(shí)施例2從瑞典的一般人群中隨機(jī)選擇483受檢者的樣本(266名男性和217名女性，年齡中間值為65歲，范圍從37至85歲)，采用帶有活組織檢查的EW和血液樣本。此研究的結(jié)果最近已經(jīng)發(fā)表(Borch，K，et al.，Dig Dis Sci，2000，451322-29)。在活組織檢查樣本中，胃炎根據(jù)悉尼系統(tǒng)被分成竇性、體性以及廣泛性胃炎，伴有或不伴有萎縮性以及存在或不存在幽門螺旋桿菌(Price，A.，J Gastroenterol Hepatol 1991，6209-22；Dixon，M.F.，et al.，Am JSurg Pathol 1996，201161-81)。EW如前面所描述的那樣進(jìn)行(Borch，K，et al.，Dig DisSci，2000，451322-29)。三個(gè)活組織檢查取自胃體(主胃體，前胃體以及后胃體)和幽門3cm之內(nèi)的胃竇。
實(shí)施例3抗原的制備H，K-ATP酶如以前所描述的從豬胃粘膜來制備(Mrdh，S.，et al.，Scand JGastroenterol 1991，261089-96)。在這種豬抗原的制品中自身抗體與H，K-ATP酶的結(jié)合與人類抗原相類似(Song，Y.H.，et al.，Scand J Gastroenterol 1994，29122-7；Ma，11.Y.et al.，Scand J Gastroenterol 1994，207904；Karisson，F(xiàn).A.，et al.，Clin exp Immunol1987，70604-10)。富集H，K-ATP酶的囊狀膜采用低濃度的去垢劑(0.13％(w/v)的辛烷基葡糖苷，或者0.06％(w/v)的十二烷基硫酸鈉)處理以除去松散粘附著的蛋白，例如，胃蛋白酶/胃蛋白酶原，然后在-70T下儲(chǔ)存在pH7.4的蔗糖/Hepes-Tris緩沖液中。幽門螺旋桿菌的抗原采用如Ma等描述的方法(Ma，J.Y.，et al.，Scand J Gastroenterol 1994，29961-6)從五個(gè)菌株(CCUG17874，25，66，1139和253)制備。
實(shí)施例4酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)ELISA如描述的那樣((Ma，J.Y.，et al.，Scand J Gastroenterol 1994，29961-6)進(jìn)行，它采用Nunc-Immuno板(Maxisorp，Nunc，Roskilde，Denmark)，板上包被的是50pl在50mM的pH9.8的碳酸鈉緩沖液中的指示性抗原制品(5pg/ml)，在4℃下孵育過夜。小孔依次采用以1∶100比例稀釋在含有0.05％(v/v)吐溫20(Tween-20)的磷酸鹽緩沖液(PBS-T)中的血清，生物素化山羊抗人IgG(Amersham Intcrnational PLC，Amersham UK)，鏈霉抗生物素蛋白(Amersham International PLC，Amersham UK)，以及生物素化堿性磷酸酶(Boehringer-Mannheim Biochemicals，Mannheim，Germany)進(jìn)行孵育。最后，加入100pl以1mg/ml溶解在pH9.8的50mM碳酸鈉緩沖液中的p-硝基苯磷酸鹽。吸收值采用計(jì)算機(jī)化的ELISA閱讀儀(Vmax，Molecular Devices，CA，USA)在405rim下連續(xù)閱讀。所有的孵育都在持續(xù)振蕩的條件下進(jìn)行，在每個(gè)孵育步驟之間板用PBS-T洗脫三次。每個(gè)血清樣本采用雙份進(jìn)行分析，在每塊免疫板中包括陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)樣本的光密度(mOD/每分鐘)閱讀與每塊免疫板上的陽性標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)，而其數(shù)據(jù)則代表抗體的相對(duì)滴度。陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)的變化系數(shù)分別是5.7±2.9和8.1±3.5(M+SD)。
實(shí)施例5血清胃蛋白酶原1(PG1)的分析測定基于非競爭性夾心技術(shù)，采用馬蘿卜過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的PG1特異性抗體檢測結(jié)合到固定抗體的PG1。后一種抗體被固定在微量滴定板上并且具有與酶標(biāo)抗體不一樣的PG1抗原位點(diǎn)親和性。
血清胃蛋白酶原1(PG1)的測定采用Gaswtrost PG1(Gastroset PG1 Cat.No.67882.Orion Diagnostica，Espoo，F(xiàn)iniand)根據(jù)制造商的說明來進(jìn)行。20ul等分的標(biāo)準(zhǔn)、對(duì)照和血清樣本雙份加入到用固定化胃蛋白酶原1抗體預(yù)包被了的微量滴定板上。加入測定緩沖液(100ul)并且將微量滴定孔孵育30分鐘，洗脫兩次，然后再采用以1∶100稀釋于測定緩沖液中的馬蘿卜過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的PG1特異性抗體孵育30分鐘；終止反應(yīng)并且在ELISA閱讀以中檢測顏色發(fā)展情況。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果以在考慮相關(guān)度時(shí)帶有95％置信區(qū)間的中間值和四分位差(25th-75th百分位)比率(百分比)來描述。Wilcoxon’s符號(hào)級(jí)檢測被用來評(píng)估患者組樣本對(duì)之間的差異。顯著性水平為p＜0.05。
實(shí)施例6來自組N，DU，AG和PA中的血清的分析酶聯(lián)免疫吸附測定具有內(nèi)窺鏡和活組織檢查的組織解剖學(xué)檢測診斷結(jié)果的四組受檢者的血清進(jìn)行了H，K-ATP酶抗體(圖1A)，幽門螺旋桿菌抗體(圖1B)，以及胃蛋白酶原(PG1)的分析。f-(幽門螺旋桿菌抗體X PG1的相關(guān)滴度)的結(jié)果見于圖1D中。這些組包括胃粘膜正常的受檢者(N，n＝50)，患有十二指腸潰瘍的受檢者(DU，n＝53)，患有輕微至嚴(yán)重的體性萎縮性胃炎的受檢者(AG，n＝46)，以及患有惡性貧血的受檢者(PA，n＝50)。結(jié)果以帶有中間值和四分位差(25th-75th百分位，Hspread)的箱形圖表示。在內(nèi)外圍欄之外的值分別以星號(hào)表示并且成開放式，上部圍欄分別用四分位差范圍+1.5Hspread+3Hspread來限定(SYSTAT參考手冊)。Y軸以外的值見于括號(hào)中。顯著性用**(p＜0.01)和***(p＜0.001)來表示；n.s.表示不顯著。
H，K-ATP酶抗體在由具有正常胃粘膜的受檢者組成的研究組(N)中H，K-ATP酶抗體滴度中間值是2.0(范圍0.7-9.0；圖1A)。在DU，AG和PA組中相應(yīng)的值分別是9.3(范圍1.6-82.7)，3.8(范圍0.8-137)以及32.3(范圍1.4-128)(與正常值相比p＜0.001)。
幽門螺旋桿菌抗體組N中幽門螺旋桿菌抗體的滴度中間值為1.0(范圍1.04，5；圖1B)。在DU，AG和PA組中相應(yīng)的值分別是47.5(范圍4.1-136)，18.0(范圍1.0-53.0)以及3.5(范圍1.3-27.2)(與正常值相比p＜0.001)。
血清胃蛋白酶原1組N中血清胃蛋白酶原1的中間值為66.3pg/L(范圍213-163；圖1C)。在DU，AG和PA組中相應(yīng)的值分別是149pg/L(范圍47.2-500)，31.8pg/L(范圍2.6-127)以及4.4pg/L(范圍0-61.0)(與正常值相比p＜0.001)。
因子f＝(幽門螺旋桿菌抗體的滴度×血清胃蛋白酶原1)盡管采用三種血清學(xué)的參數(shù)可以顯著區(qū)分患者組，但是仍然有重疊。幽門螺旋桿菌的滴度和PG1濃度在DU組中高而在PA組中低。因此，為了更好地區(qū)分不同的組，對(duì)來自幽門螺旋桿菌抗體滴度和PG1的ELISAs分析結(jié)果的產(chǎn)物(f)進(jìn)行了評(píng)估(圖1D)。所有的組都與其它組顯著不同(p＜0.01或p＜0.001，圖1D)。組N中f的中間值為77.5(范圍24.0-344)。在DU組中它是8105(范圍19340303；與正常值相比p＜0.001)，在A組中為500(范圍5.0-3901，與正常值相比p＜0.001)，在PA組中為12.0(范圍0-915；與正常值相比p＜0.001)。
實(shí)施例7血清學(xué)診斷的評(píng)估方案(流程圖)胃粘膜的狀態(tài)通過活組織檢查切片的病理組織學(xué)檢測方式而確定。這使得將參比標(biāo)準(zhǔn)與血清學(xué)分析的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比成為可能。研發(fā)出了診斷評(píng)估方案(圖2)。該方案的分辨水平采用在N，DU，AG和PA研究組中的血清學(xué)分析結(jié)果(在刪除血清偏離值之后)進(jìn)行優(yōu)化。采用SYSTAT軟件來實(shí)現(xiàn)患者組之間的最大分辨率?！胺治鑫铩笔荋，K-ATP酶抗體(HK)，幽門螺旋桿菌抗體(HP)，s-胃蛋白酶原1(PG1)，以及f＝(幽門螺旋桿菌抗體的滴度×血清胃蛋白酶原1)(HP*PG1)。這個(gè)方案將個(gè)體血清分成血清學(xué)組1-4及其亞組。
評(píng)估方案用于分析被相應(yīng)分類和分組了的每個(gè)個(gè)體血清的結(jié)果。標(biāo)1顯示的是四個(gè)研究組的血清學(xué)分組正常(N)，十二指腸潰瘍(DU)，沒有惡性貧血的體性胃炎(AG)以及惡性貧血癥(PA)。圖2中給出的血清學(xué)診斷方案被應(yīng)用于血清學(xué)數(shù)據(jù)。
分組結(jié)果在血清學(xué)亞組1A-4C中。在每個(gè)亞組中為了選擇通道而指示出了分辨水平并且在括號(hào)中指示出了每個(gè)組中的中間值。在每個(gè)血清學(xué)組中的研究組的分布情況，性別以及年齡被顯示出來。在組1A中獲得了84％的組N中受檢者(42/50)。來自組N中受檢者的一些血清是血清學(xué)的偏離值(例如在組113-1D，3A和4A中)。組2A-2D中在獲得了91％(48/53)的患有DU的受檢者，在組3A和3B中獲得了57％(26/46)的患有AG的受檢者以及18％(9/50)的被診斷為患有PA的受檢者。在組4A-4C中，獲得了72％(36/50)的患有PA的受檢者以及22％(10/46)的患有AG的受檢者。AG和PA組的這種重疊絲毫不令人驚奇，因?yàn)樗鼈兇淼氖窍嗤募膊≈皇翘幱诓煌臅r(shí)間進(jìn)程的位點(diǎn)上。此外，14％AG受檢者的個(gè)別重疊被發(fā)現(xiàn)于組2中。其他的重疊很小。檢測胃炎的總敏感率為98％(146/149)(95％CI 94-100％)而特異性為84％(42/50)(95％CI 71-93％)。


圖3A-3D代表的是通過血清學(xué)鑒別的四個(gè)主要的組織形態(tài)學(xué)診斷的組的分布情況組1A包含94％的N，4％的DU和2％的PA；組2(A-D)包含86％的DU和14％的AG；組3(A-B)包含66％的AG和23％的PA，8％的DU以及3％的N；組4(A-C)包含77％的PA，21％的AG，以及2％的N。組3和4一起包含了95％的在組AG和PA中的受檢者(分別是42％以及53％)，2％的N，以及3％的DU。在表1中由組1B-D所代表的較小的組包含了12名受檢者，其中50％屬于N組，但是血清學(xué)檢測他們的值為偏離值。在這些亞組中仍然有六名受檢者或者是AG(17％)或者是PA(33％)。
實(shí)施例8一般人群樣本的血清學(xué)診斷從瑞典的一般人群中隨機(jī)選擇483受檢者的樣本(266名男性和217名女性，年齡中間值為65歲，范圍從37至85歲)，采用如前所述帶有活組織檢查的WD和血液樣本檢測。55％(243/483)具有正常胃粘膜。而其余的患有胃炎(Borch，K，et al.，Dig Dis Sci，2000，451322-29)。在本研究中，米自這個(gè)人群的血清根據(jù)圖2中的方案進(jìn)行分析和分組并且其結(jié)果與組織形態(tài)學(xué)診斷結(jié)果相對(duì)比。表2顯示的是一般人群樣本的血清學(xué)分組。圖2中所給出的血清學(xué)診斷方案被應(yīng)用于血清學(xué)數(shù)據(jù)。分組結(jié)果為血清學(xué)亞組1A-4C。在每個(gè)亞組中為了選擇通道而指示出了分辨水平并且在括號(hào)中指示出了每個(gè)組中的中間值。在每個(gè)血清學(xué)組中的組織形態(tài)學(xué)診斷的組的分布情況，性別以及年齡被顯示出來。形態(tài)學(xué)診斷是正常(0)，非萎縮性竇性胃炎(1)，萎縮性竇性胃炎(2)，非萎縮性廣泛性胃炎(3)，萎縮性廣泛性胃炎(4)，非萎縮性體性胃炎(5)，以及萎縮性體性胃炎(6)。



在組1A中，87％(196/225)的受檢者顯示的血清學(xué)值指示正常的胃粘膜。7％(16/243)的帶有正常胃粘膜的受檢者具有低的PG1水平而在組1B中得到，同時(shí)8％(20/243)的受檢者由于H，K-ATP酶抗體水平升高而在組1D中得到。6％(29/483)的人群樣本被診斷為患有組1A中所得到的任何種類的胃炎。
在組2A-21D中，有15％(73/483)通過血清學(xué)分組程序的方式(表2)得到。在組2A-2D中僅有兩名受檢者具有正常粘膜。在組2A-21D中占優(yōu)勢的形態(tài)學(xué)診斷結(jié)果是伴有萎縮性的竇性胃炎(24名受檢者)以及不伴有萎縮性的廣泛性胃炎(33名受檢者)。在組3A-313中的受檢者顯示出對(duì)幽門螺旋桿菌血清學(xué)的陽性。在組3A中，得到了20％(95/483)的人群并且占優(yōu)勢的形態(tài)學(xué)診斷結(jié)果是伴有萎縮性的竇性胃炎(39名受檢者)，不伴有萎縮性的廣泛性胃炎(26名受檢者)，以及伴有萎縮性的廣泛性胃炎或者體性萎縮性胃炎(17名受檢者)。在組4A-4C中PG1的值通常很低，它指示了更多的體萎縮可能性。在這些組中只發(fā)現(xiàn)了12名受檢者患有伴有萎縮性的體性胃炎。在人群中血清學(xué)地檢測胃炎的總敏感率為88％(211/240)(95％ CI 83-92％)并且特異性為81％(196/243)(95％ CI 75-85％)。
對(duì)應(yīng)于在一般人群的樣本的四個(gè)主要的組中的血清學(xué)結(jié)果的分布情況圖如圖4A-4D所示。顯示了在血清學(xué)組1A 2(A-D)，3(A-和4(A-C)中組織形態(tài)學(xué)診斷組的分布情況圖。形態(tài)學(xué)的診斷是正常(0)，非萎縮性竇性胃炎(1)，萎縮性竇性胃炎(2)，非萎縮性廣泛性胃炎(3)，萎縮性廣泛性胃炎(4)，非萎縮性體性胃炎(5)，以及萎縮性體性胃炎(6)。
在組1A中，組織形態(tài)學(xué)評(píng)估正常的占87％(196？225)。在組2中，伴有萎縮性的竇性胃炎占33％(24/73)，廣泛性胃炎占45％(33/73)，它們是優(yōu)勢組。在組3(A-B)中，伴有萎縮性的竇性胃炎為40％(50/123)，廣泛性胃炎28％(35/123)，萎縮性體性胃炎15％(18/123)，它們是優(yōu)勢組。在組4(A-C)中]，萎縮性體性胃炎占92％(11/12)而非萎縮性體性胃炎為剩余的8％(1/12)。
在組3加4中占優(yōu)勢的組織形態(tài)學(xué)診斷結(jié)果是萎縮性竇性胃炎為35％(50/145)，廣泛性胃炎24％(35/145)，以及體性萎縮性胃炎20％(29/145)。在組3加4中這三個(gè)亞組占79％(114/145)。在人群中萎縮性體性胃炎的發(fā)生率為7％(32/483)，其中有91％(29/32)在組3加4中得到。
盡管本發(fā)明的方法和試劑盒的優(yōu)選實(shí)施例在上面已經(jīng)詳細(xì)描述了，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然了解實(shí)施例有多種類型。本發(fā)明方法和試劑盒的描述僅僅是用來說明優(yōu)選的實(shí)施例而并不是對(duì)本發(fā)明的限制。
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權(quán)利要求
1.種通過評(píng)估血液樣本而診斷在人體中可能存在胃炎的方法，包括測定血液樣本針對(duì)H，K-ATP酶的特異性抗體、針對(duì)幽門螺旋桿菌的特異性抗體的存在以及PG1的濃度，然后在一個(gè)軟件形式的系統(tǒng)中將H，K-ATP酶抗體、幽門螺旋桿菌抗體以及胃蛋白酶原1濃度分別與正常人群中H，K-ATP酶抗體、幽門螺旋桿菌抗體的值以及胃蛋白酶原1濃度相對(duì)比，其中樣本中各項(xiàng)水平的變化就指示了胃炎。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中變化了的檢測水平導(dǎo)致進(jìn)行關(guān)于胃炎的進(jìn)一步的研究。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中確定所述指示物水平的步驟包括對(duì)所檢測的指示物進(jìn)行免疫測定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中指示物的組包括種附加指示物，該附加指示物包括用胃蛋白酶原1的水平乘以幽門螺旋桿菌抗體的水平，并且這種附加指示物的水平被拿來與標(biāo)準(zhǔn)值相比較。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的一個(gè)或多個(gè)方法，其中明顯高于正常人群水平的H，K-ATP酶特異性抗體和幽門螺旋桿菌特異性抗體的水平作為胃炎的指示物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的一個(gè)或多個(gè)方法，其中降低的胃蛋白酶原1濃度水平作為胃體萎縮的指示物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的一個(gè)或多個(gè)方法，其中升高的胃蛋白酶原1水平作為任意的不涉及任何自身免疫的體性胃炎的指示物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的一個(gè)或多個(gè)方法，其中與正常人群不同的H，K-ATP酶抗體水平作為一種自身免疫性胃體萎縮的指示物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的一個(gè)或多個(gè)方法，其中與正常人群不同的幽門螺旋桿菌抗體的水平作為竇性或廣泛性胃炎的指示物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的一個(gè)或多個(gè)方法，其中升高了的幽門螺旋桿菌抗體的水平和正常至降低了的胃蛋白酶原1的濃度作為萎縮的指示物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的一個(gè)或多個(gè)方法，其中非常低濃度的胃蛋白酶原1與升高了的H，K-ATP酶特異性抗體水平組合作為胃體萎縮的指示物。
12.一種用于篩選胃炎的試劑盒，包括適合于檢測H，K-ATP酶抗體，幽門螺旋桿菌抗體以及胃蛋白酶原1濃度的試劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的試劑盒，其中的試劑包括胃蛋白酶原1抗體、H，K-ATP酶和幽門螺旋桿菌的蛋白質(zhì)或多肽。
14.據(jù)權(quán)利要求11的試劑盒，其中的試劑包括固定在一種固相支持物上的胃蛋白酶原1，H，K-ATP酶和幽門螺旋桿菌抗原。
15.據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，其中它進(jìn)一步包含標(biāo)記了的抗—人抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求11的試劑盒，其中的所提供試劑的數(shù)量對(duì)于完成檢測H，K-ATP酶抗體，幽門螺旋桿菌抗體以及胃蛋白酶原1濃度的測定所需要的數(shù)量來說是足夠的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過評(píng)估血液樣本而診斷在人體中可能存在胃炎的方法，包括測定血液樣本針對(duì)H，K－ATP酶的特異性抗體、針對(duì)幽門螺旋桿菌的特異性抗體的存在以及PG1的濃度，然后在一個(gè)軟件形式的系統(tǒng)中將H，K－ATP酶抗體、幽門螺旋桿菌抗體以及胃蛋白酶原1濃度分別與正常人群中H，K－ATP酶抗體、幽門螺旋桿菌抗體的值以及胃蛋白酶原1濃度相對(duì)比，其中樣本中各項(xiàng)水平的變化就指示了胃炎，并且由此，優(yōu)選的是變化了的檢測水平導(dǎo)致進(jìn)行關(guān)于胃炎的進(jìn)一步的研究。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1701235SQ03806799
公開日2005年11月23日 申請(qǐng)日期2003年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月27日
發(fā)明者斯文·馬爾德, 埃里克·馬爾德 申請(qǐng)人:艾特羅弗斯公司