專利名稱：生物傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種生物傳感器的制備方法，具體的講，本發(fā)明屬于硅溶膠-凝膠膜固載血紅蛋白第三代生物傳感器的制備方法。
背景技術(shù)：
生物電傳感器在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)療衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。生物傳感器是利用生物物質(zhì)作為識(shí)別元件，將被測(cè)物質(zhì)的濃度與可測(cè)量的電信號(hào)關(guān)聯(lián)起來(lái)。生物傳感器中研究最多的是酶?jìng)鞲衅?。根?jù)酶與電極間電子轉(zhuǎn)移的機(jī)理大致可將酶生物傳感器分為三代在葡萄糖傳感器中，采用酶的天然介體一氧的催化原理設(shè)計(jì)制作的酶?jìng)鞲衅鞣Q為第一代生物傳感器；第二代生物傳感器將人工合成的媒介體摻入酶層中，減少了空間氧的干擾；第三代生物傳感器是指在無(wú)媒介體存在下，利用酶與電極間的直接電子傳遞制作的酶?jìng)鞲衅?。近年?lái)，第三代生物傳感器的研究十分活躍，但大多數(shù)都集中在以天然酶(如辣根過(guò)氧化物酶HRP)作為識(shí)別元件。然而，天然酶基的第三代生物傳感器最大的缺點(diǎn)是使用壽命短、價(jià)格昂貴。
由于血紅蛋白具有和HRP相同的鐵卟啉輔基而可望代替HRP作為生物傳感器的識(shí)別元件，這方面的研究吸引了大量化學(xué)工作者的興趣。然而，由于血紅蛋白分子龐大，活性中心深埋于折疊的肽鏈之中。所以，要使血紅蛋白成為第三代生物傳感器的識(shí)別元件，需要克服的困難就是實(shí)現(xiàn)其直接的電子轉(zhuǎn)移。也就是既要有效的固載血紅蛋白于電極表面，又要防止由于固載而使其變性失活，還要實(shí)現(xiàn)血紅蛋白與電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移。硅溶膠-凝膠過(guò)程條件溫和，化學(xué)惰性，包埋于溶膠-凝膠中的生物活性物質(zhì)可以保持其結(jié)構(gòu)、活性和功能，而且小分子可通過(guò)溶膠-凝膠的孔道與生物活性物質(zhì)接觸?；诖?，硅溶膠-凝膠已經(jīng)廣泛的用于電極表面固載生物酶而研制葡萄糖、H2O2傳感器等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種硅溶膠-凝膠膜固載血紅蛋白第三代生物傳感器的制備方法。
我們的發(fā)明思想是用硅溶膠-凝膠儲(chǔ)備液涂于已修飾了血紅蛋白的碳糊電極表面，使其在室溫下現(xiàn)場(chǎng)堿催化聚合成膜而使血紅蛋白固載，從而制成硅溶膠-凝膠膜固載血紅蛋白第三代生物傳感器。制成的傳感器具有較強(qiáng)的過(guò)氧化物酶的催化特性，能夠?qū)2O2、O2、亞硝酸鹽、三氯乙酸等選擇性的電催化還原。該傳感器達(dá)到平衡的時(shí)間短、響應(yīng)快、制作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、使用壽命長(zhǎng)。
一種生物傳感器的制備方法，其特征在于該方法將含有15-20mg/mL血紅蛋白的磷酸鹽溶液涂于碳糊電極表面，室溫干燥生成血紅蛋白膜；再在血紅蛋白膜表面均勻涂布由硅烷、醇、氫氧化鈉溶液組成的硅溶膠-凝膠液，經(jīng)過(guò)室溫堿催化聚合生成硅溶膠-凝膠膜固載血紅蛋白生物傳感器。
本發(fā)明所用的硅烷選自四乙氧基硅烷或四甲氧基硅烷。
本發(fā)明所用的醇選自乙醇或甲醇。
由于本發(fā)明固載血紅蛋白使用硅溶膠-凝膠膜，并且采用了現(xiàn)場(chǎng)堿催化成膜，從而避免了強(qiáng)酸作催化劑而導(dǎo)致的血紅蛋白的變性。實(shí)驗(yàn)證明固載于碳糊電極表面的血紅蛋白保持了其原始的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，因而顯示了較強(qiáng)的過(guò)氧化物酶的催化活性。另外，硅的溶膠-凝膠膜存在有大量的羥基基團(tuán)可以和蛋白質(zhì)形成氫鍵，可以防止血紅蛋白從電極表面脫落；加上血紅蛋白本身比HRP穩(wěn)定，從而使得本發(fā)明制得的第三代生物傳感器具有比生物酶有較強(qiáng)的操作穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的使用壽命。
由于本發(fā)明采用的基底電極是碳糊電極、識(shí)別元件是血紅蛋白、固載血紅蛋白使用硅溶膠-凝膠膜。材料得來(lái)容易，制作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉。
本發(fā)明制備的生物傳感器具有較好的酸堿適應(yīng)性，能夠在pH4-9的范圍內(nèi)均顯示出較好的催化活性和穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將5g石墨粉與3mL液體石蠟混合均勻后，取適量填入玻璃管[4.5mm(i.d.)；5.5mm(o.d.)]的一端約5mm的高度，另一端插進(jìn)一根銅線構(gòu)成碳糊電極。電極的表面在稱量紙上磨光滑。
將600μL乙醇、50μL四乙氧基硅烷(TEOS)、10μL 5mmol/L的NaOH溶液以及60μLH2O于一支小試管中快速混合后得到硅溶膠-凝膠液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 將5μL 15mg/mL血紅蛋白的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)滴到碳糊電極的表面，用一端封口的毛細(xì)管涂布均勻；室溫涼干1h。然后，將10μL硅溶膠-凝膠儲(chǔ)備液滴到已被Hb修飾的電極表面并涂布均勻，使其在室溫下聚合1小時(shí)。最后，將制備好的電極(即硅溶膠-凝膠膜固載血紅蛋白第三代生物傳感器)浸于pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液中置于4℃冰箱保存。該傳感器具有良好的響應(yīng)性能達(dá)到平衡時(shí)間短，不大于10分鐘；響應(yīng)快，約0.5-1分鐘；使用壽命長(zhǎng)，10周以上。
實(shí)施例2硅溶膠-凝膠液的組成為600μL甲醇、50μL四甲氧基硅烷(TMOS)、10μL 5mmol/L的NaOH溶液以及60μLH2O。其它操作步驟同實(shí)施例1。
實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的傳感器的性能傳感器用于水溶液中過(guò)氧化氫的測(cè)定過(guò)氧化氫響應(yīng)靈敏度為64.8μA/mmol/L。
檢出限為8.6×10-7mol/L測(cè)量線性范圍為1×10-6-2.8×10-4mol/L。
傳感器用于水溶液中亞硝酸鹽的測(cè)定檢出限為3×10-7mol/L。
測(cè)量線性范圍為0-8.6×10-4mol/L。
傳感器用于水溶液中三氯乙酸的測(cè)定檢出限為3×10-6mol/L。
測(cè)量線性范圍為2.3×10-5-8.6×10-3mol/L。
傳感器在22℃的室溫條件下用于水溶液中溶解氧的測(cè)定檢出限為5.2×10-6mol/L測(cè)量線性范圍為7.8×10-6-1×10-3mol/L。
權(quán)利要求
1.一種生物傳感器的制備方法，其特征在于該方法將含有15-20mg/mL血紅蛋白的磷酸鹽溶液涂于碳糊電極表面，室溫干燥生成血紅蛋白膜；再在血紅蛋白膜表面均勻涂布由硅烷、醇、氫氧化鈉溶液組成的硅溶膠-凝膠液，經(jīng)過(guò)室溫堿催化聚合生成硅溶膠-凝膠膜固載血紅蛋白生物傳感器。
2.如權(quán)利要求1所說(shuō)的方法，其特征在于硅烷選自四乙氧基硅烷或四甲氧基硅烷。
3.如權(quán)利要求1所說(shuō)的方法，其特征在于醇選自乙醇或甲醇。
全文摘要
本發(fā)明屬于硅溶膠－凝膠膜固載血紅蛋白傳感器的制備方法。本發(fā)明采用硅烷在堿性條件下現(xiàn)場(chǎng)水解聚合形成薄膜，用該薄膜固載血紅蛋白于碳糊電極表面而制成生物傳感器。該傳感器對(duì)于過(guò)氧化氫、氧氣、亞硝酸鹽、三氯乙酸等具有催化電流響應(yīng)，其優(yōu)點(diǎn)在于平衡時(shí)間短、響應(yīng)快、靈敏度高、使用壽命長(zhǎng)、制作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉。
文檔編號(hào)G01N27/327GK1635370SQ200310117748
公開(kāi)日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2003年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月30日
發(fā)明者呂功煊, 王全林 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所