專利名稱：低密度脂蛋白中膽固醇的多重定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及同時(shí)測量血液中作為被檢成分的低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇的方法。
背景技術(shù)：
低密度脂蛋白(以下稱作“LDL”)在血液膽固醇運(yùn)輸中起主要作用。特別是，在動(dòng)脈粥樣硬化病例中血管壁上沉積的絕大多數(shù)膽固醇來自LDL。LDL膽固醇量的增加是動(dòng)脈粥樣硬化疾病的主要危險(xiǎn)因素之一。因此LDL膽固醇的單獨(dú)定量在臨床上很有用。此外，總膽固醇測量包括測量所有脂蛋白，如乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、LDL、以及高密度脂蛋白(HDL)中的膽固醇?？偰懝檀紲y量仍然是主要的脂類檢驗(yàn)。
定量LDL膽固醇的常規(guī)方法包括一種包含兩個(gè)操作(分級分離和膽固醇定量)的方法以及使用基于總膽固醇、HDL膽固醇和甘油三酯水平的Friedewald′s方程的計(jì)算方法。
分級分離包括超速離心法、沉淀法、和免疫學(xué)方法等。這些方法需要離心或過濾樣品，考慮到便利和經(jīng)濟(jì)的原因，使得它們當(dāng)前很難在臨床檢查領(lǐng)域中推廣。此外，包括Friedewald′s方程的計(jì)算方法因其不考慮個(gè)體變異，所以在準(zhǔn)確度方面也有很多問題，其使用受限。
然而最近已經(jīng)報(bào)道了不需要分級分離的定量LDL膽固醇的方法(JP專利公開(Kokai)No.11-318496A(1999))。這種方法當(dāng)前在檢測領(lǐng)域中應(yīng)用于臨床檢測的試劑。這種方法包括第一步，選擇性除去樣品中除LDL外的脂蛋白中的膽固醇的(術(shù)語“除去”意思是分解酯型膽固醇和游離膽固醇，并且使分解產(chǎn)物在隨后的第二步中不被檢測到)，以及第二步定量LDL膽固醇。
然而，盡管上述測量LDL膽固醇的試劑在臨床上很有用，但是該試劑的使用沒有輕易地普及。這是因?yàn)閷?shí)踐中一直廣泛地進(jìn)行總膽固醇測量，并且通過Friedewald′s方程獲得LDL膽固醇水平。然而，如上所述，通過使用Friedewald′s方程獲得的LDL膽固醇水平有很多問題。因此，LDL膽固醇水平的精確測量具有臨床意義。因此，期望進(jìn)一步改進(jìn)和推廣使用測量LDL膽固醇的試劑，其具有很高的臨床意義。
同時(shí)，關(guān)于HDL中膽固醇的測量，已經(jīng)報(bào)道了僅用一次測量連續(xù)測量HDL中膽固醇和總膽固醇的方法(M L Sampson等，Ann ClinBiochem，37，479-487，2000)。這種方法包括將樣品放入試管中，使用抗apoB抗體測量樣品中的HDL膽固醇，使用脫氧膽酸破壞抗apoB抗體和apoB抗體的復(fù)合體(含有結(jié)合到其上的抗apoB抗體的HDL膽固醇)，然后酶促測量剩余的非HDL膽固醇。可通過將兩次測量獲得的值加起來得到總膽固醇水平。廣泛地在醫(yī)學(xué)檢查等領(lǐng)域中常規(guī)測量總膽固醇和HDL膽固醇。因此，能同時(shí)測量兩種膽固醇的水平很有意義。
專利文件1JP專利公開(Kokai)No.11-318496A(1999)非專利文件1M L Sampson等，Ann Clin Biochem，37，479-487，2000發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供僅用一次測量就能同時(shí)定量LDL膽固醇和總膽固醇的方法。這個(gè)方法作為一種多重定量方法很有效，其中僅用一次測量可獲得多項(xiàng)的定量值。
鑒于最近引起注意的LDL膽固醇的精確測量的重要性，以及通常已知的總膽固醇測量的重要性，我們集中研究了建立同時(shí)測量LDL膽固醇和總膽固醇的系統(tǒng)。
通過改變部分上述定量LDL膽固醇的方法，并且進(jìn)一步使用已經(jīng)用于臨床和化學(xué)檢查的自動(dòng)分析儀的同時(shí)分析多個(gè)項(xiàng)目的功能我們已經(jīng)能夠僅用一次測量同時(shí)對LDL膽固醇和總膽固醇定量；即，可僅用一次測量分析在不同條件下的測量值的功能。
具體地，這種定量方法能在第一步中檢測樣品中除LDL外的脂蛋白中的膽固醇(其在常規(guī)方法的第一步中被選擇性地除去)在第二步中檢測LDL膽固醇反應(yīng)。


圖1顯示本發(fā)明方法的原理。如圖1所示，本發(fā)明的方法包括兩個(gè)步驟。在第一步中，基于樣品中除LDL外的脂蛋白中膽固醇發(fā)生反應(yīng)，然后測量因反應(yīng)所導(dǎo)致的反應(yīng)液的吸光度變化。在第二步中，基于樣品中LDL中的膽固醇發(fā)生反應(yīng)，然后測量因反應(yīng)所導(dǎo)致的反應(yīng)液的吸光度變化。在第二步中吸光度的變化相應(yīng)于LDL膽固醇的量，而第一步中的吸光度變化與第二步中的吸光度變化之和相應(yīng)于總膽固醇量的變化。使用自動(dòng)分析儀，通過改變測量這種吸光度變化的分析條件，可僅用一次測量同時(shí)測量多個(gè)項(xiàng)目。圖1顯示該測量方法原理的實(shí)例。具體地，在第一步中，可僅基于LDL中的膽固醇發(fā)生反應(yīng)。在第二步中，可基于除LDL外的脂蛋白中膽固醇的發(fā)生反應(yīng)。
如在圖1中所示，在使用自動(dòng)分析儀同時(shí)分析多個(gè)項(xiàng)目的測量條件下，通過第一步中的反應(yīng)所獲得的吸光度與第二步中的反應(yīng)所獲得的吸光度的差異來定量LDL膽固醇。具體地，通過從測量2中所獲得的吸光度(即，在第二步中測得的吸光度)減去測量1中所獲得的吸光度(即，在第一步中測得的吸光度)得到這種差異。
在另一種測量條件下，通過得到吸光度的總量(通過測量2獲得的吸光度)定量總膽固醇；即，第一步中的吸光度變化和第二步中的吸光度變化之和。
如上所述，本發(fā)明提供利用自動(dòng)分析儀同時(shí)分析多個(gè)項(xiàng)目的功能，僅用一次測量同時(shí)定量生物樣品中待測成分中的LDL膽固醇和總膽固醇的方法。
本發(fā)明如下(1)一種同時(shí)測定生物樣品所含低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇的方法，其中僅用一次測量定量生物樣品所含低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇。
(2)(1)的方法，其包括引起生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白中的發(fā)生膽固醇反應(yīng)的第一步和引起剩余的低密度脂蛋白中的膽固醇發(fā)生反應(yīng)的第二步。
(3)(1)的方法，其中僅用一次測量獲得反映生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白中膽固醇現(xiàn)有量的測量值以及反映低密度脂蛋白中的膽固醇現(xiàn)有量的測量值，接著根據(jù)上述兩個(gè)值同時(shí)測定生物樣品所含低密度脂蛋白中的膽固醇現(xiàn)有量和總膽固醇的現(xiàn)有量。
(4)(3)的方法，其包括獲得反映生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白中膽固醇現(xiàn)有量的測量值的第一步和獲得反映剩余的低密度脂蛋白中的膽固醇現(xiàn)有量的測量值的第二步。
(5)(1)到(4)中任何一項(xiàng)的方法，其中，在存在對除低密度脂蛋白外的脂蛋白起作用的表面活性劑時(shí)，第一步包括使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用于生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白，將所產(chǎn)生的過氧化氫轉(zhuǎn)化成醌染料，然后測量反應(yīng)產(chǎn)物，或者包括使膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶作用于生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白，然后測量所產(chǎn)生的NADH(還原的β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)。
(6)(1)到(5)中任何一項(xiàng)的方法，其中第二步包括，向第一步的反應(yīng)產(chǎn)物添加至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑，使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用于剩余的低密度脂蛋白，將所產(chǎn)生的過氧化氫轉(zhuǎn)化成醌染料，然后測量反應(yīng)產(chǎn)物，或者包括使膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶作用于剩余的低密度脂蛋白，接著測量所產(chǎn)生的NADH(還原的β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)。
(7)(1)到(6)中任何一項(xiàng)的方法，其中使用用于臨床和化學(xué)檢測的自動(dòng)分析儀，僅用一次測量在不同測量條件下進(jìn)行分析。
(8)(1)到(7)中任何一項(xiàng)的方法，其中通過找到在第一步和第二步中所獲得的作為測量值的吸光度的差異來定量血液中低密度脂蛋白中的膽固醇。
(9)(1)到(8)中任何一項(xiàng)的方法，其中通過得到基于在第一步中所獲得的作為測量值的吸光度變化和在第二步中所獲得的作為測量值的吸光度變化的總吸光度來定量總膽固醇。
(10)一種用于根據(jù)(1)到(6)中任何一項(xiàng)的方法同時(shí)測定生物樣品所含低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇的試劑組合物。
(11)(10)的試劑組合物，其包括作用于除低密度脂蛋白外的脂蛋白的表面活性劑、至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑，膽固醇酯酶、和膽固醇氧化酶。
(12)(10)的試劑組合物，其包括作用于除低密度脂蛋白外的脂蛋白的表面活性劑、至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑、膽固醇酯酶、和膽固醇脫氫酶。
本發(fā)明是同時(shí)測定生物樣品中所含LDL中的的膽固醇和總膽固醇的方法，其中僅用一次測量定量生物樣品中所含LDL中的的膽固醇和總膽固醇。具體地，本發(fā)明的方法包括使生物樣品中除LDL外的脂蛋白中的膽固醇起反應(yīng)的第一步以及隨后使剩余的LDL中的膽固醇起反應(yīng)的第二步。例如，本發(fā)明的方法可通過僅用一次測量獲得反映生物樣品中除LDL外的脂蛋白中膽固醇現(xiàn)有量的測量值和反映LDL中膽固醇現(xiàn)有量的測量值，然后根據(jù)上述兩個(gè)值同時(shí)測定生物樣品中所含LDL中的的膽固醇和總膽固醇的現(xiàn)有量來完成。
脂蛋白中所含有的膽固醇的實(shí)例包括酯型膽固醇(膽固醇酯)和游離膽固醇。在本說明書中，“膽固醇”包含這兩種類型。
本發(fā)明的方法所檢驗(yàn)的生物樣品是可能含有脂蛋白，如HDL、LDL、VLDL、或CM的樣品。這種生物樣品的實(shí)例包括但不限于，體液，如血液、血清、和血漿，及其稀釋液。“除LDL外的脂蛋白”是指HDL、VLDL、CM等。
“反映除LDL外的脂蛋白中膽固醇現(xiàn)有量的測量值”和“反映LDL中膽固醇現(xiàn)有量的測量值”是指通過定量生物樣品所含脂蛋白中膽固醇的濃度或絕對量所獲得的值。獲得這種值的測量方法沒有限制。這種值對應(yīng)于生物樣品所含脂蛋白中膽固醇的濃度或絕對量，最終通過多種方法的組合而獲得這個(gè)值。例如，這個(gè)值可能與生物樣品所含脂蛋白中膽固醇的濃度或絕對量成正比或者成反比。這種測量值的實(shí)例是來自用特殊藥物處理脂蛋白中的膽固醇所產(chǎn)生的化合物的吸光度。另外，在這種情況中，這種測量值的實(shí)例包括絕對值和變化值。例如，在第一步和第二步之間的吸光度變化如圖1所示，除了在第一步中所提高的吸光度，還包括在第二步中所提高的吸光度。這是因?yàn)樵诘谝徊降姆磻?yīng)中所產(chǎn)生的化合物與在第二步的反應(yīng)中所產(chǎn)生的化合物具有相同的吸光度波長。在第一步的反應(yīng)中所產(chǎn)生的化合物的吸光度波長可以不同于在第二步的反應(yīng)中所產(chǎn)生的化合物的吸光度波長。在這種情況下，不將在第二步中所提高的吸光度加到在第一步中所提高的吸光度中，當(dāng)開始第二步時(shí)在另一個(gè)波長測量的吸光度從0開始提高。在圖1中，通過測量1獲得在第一步中反映除LDL外的脂蛋白中膽固醇現(xiàn)有量的吸光度。這種吸光度是“反映除LDL外的脂蛋白中膽固醇現(xiàn)有量的測量值”。此外，在第二步中，吸光度通過測量2獲得，除了反映在第一步中所獲得的除LDL外脂蛋白中膽固醇的現(xiàn)有量的吸光度，其還包括對應(yīng)于LDL中膽固醇現(xiàn)有量的吸光度。這種吸光度代表總膽固醇的現(xiàn)有量。此外，這種吸光度是“反映LDL中膽固醇現(xiàn)有量的測量值”，因?yàn)槌嗽诘谝徊街兴@得的吸光度外，其還包括對應(yīng)于LDL中膽固醇現(xiàn)有量的吸光度。此外，當(dāng)考慮添加這種吸光度時(shí)，“反映LDL中膽固醇現(xiàn)有量的測量值”也可被說成是“含有反映LDL中膽固醇現(xiàn)有量值的測量值”。此外，在這種情況中，對應(yīng)于已經(jīng)加上吸光度的LDL中膽固醇現(xiàn)有量的吸光度變化，也是“反映LDL中膽固醇現(xiàn)有量的測量值”。即，在第二步中，可僅測量吸光度變化。
在此期間，當(dāng)在第一步中所產(chǎn)生的化合物的吸光度波長與在第二步中所產(chǎn)生的化合物的吸光度的波長不同時(shí)，在第一步中所測得的吸光度是“反映在除LDL外的脂蛋白中膽固醇現(xiàn)有量的測量值”。在第二步中，在不同于第一步中的波長下所測得的吸光度是“反映在LDL中的膽固醇現(xiàn)有量的測量值”。
當(dāng)用一次測量獲得兩類測量值時(shí)，所使用的“僅一次測量”包括從處理生物樣品到測量以獲得許多必需測量值的一系列處理。這種一次測量包括添加試劑和獲得測量值的許多實(shí)例。優(yōu)選地，一次測量是在一個(gè)測量管或單獨(dú)的孔中完成。
“基于這兩個(gè)測量值同時(shí)獲得生物樣品中所含LDL中的的膽固醇和總膽固醇的現(xiàn)有量”意思是通過計(jì)算這兩個(gè)測量值獲得LDL中的膽固醇和總膽固醇的濃度或絕對量。例如，如圖1所示，基于在測量2中所獲得的測量值可得到總膽固醇的現(xiàn)有量?？赏ㄟ^從在測量2中所獲得的測量值中減去在測量1中所獲得的測量值得到LDL中膽固醇的現(xiàn)有量。如上所述當(dāng)在第一步的反應(yīng)中所產(chǎn)生的化合物的吸光度波長不同于在第二步的反應(yīng)中所產(chǎn)生的化合物的吸光度波長時(shí)，可從在第二步中所測得的值得到LDL中膽固醇的現(xiàn)有量，可通過將在第一步中所測得的值加上在第二步中所測得的值得到總膽固醇的現(xiàn)有量。
本發(fā)明的方法包括第一和第二步。第一步包括處理樣品中除LDL外的脂蛋白，如HDL、VLDL、和CM中的膽固醇，然后得到反映現(xiàn)有量的測量值。隨后的第二步包括處理剩余的LDL膽固醇，然后得到反映現(xiàn)有量的測量值。因此，“處理”意思是用化學(xué)、物理、和/或生物化學(xué)方法進(jìn)行反應(yīng)。
第一步中的處理意思是在存在對除LDL外的脂蛋白起作用的表面活性劑時(shí)，通過酶反應(yīng)分解膽固醇?？捎没瘜W(xué)、物理、和/或生物化學(xué)方法測量分解產(chǎn)物或由反應(yīng)所產(chǎn)生的產(chǎn)物?！氨砻婊钚詣┳饔糜凇敝阜纸庵鞍缀蛷闹鞍字嗅尫拍懝檀?。
選擇性測量除LDL外的脂蛋白中所含有的膽固醇(即，在HDL、VLDL、CM等中所含有的膽固醇)的具體實(shí)例包括下列方法。
具體地，方法的實(shí)例包括，在存在對除LDL外的脂蛋白起作用的表面活性劑時(shí)，使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶對它們的靶脂蛋白起作用，通過4-氨基安替比林與基于酚或苯胺的氫供體化合物之間的氧化縮合反應(yīng)，經(jīng)過使用過氧化物酶，將所產(chǎn)生的過氧化氫轉(zhuǎn)化成有色的醌，然后在400nm和700nm波長之間測量反應(yīng)產(chǎn)物。在這個(gè)實(shí)例中所測得的有色醌的吸光度反映生物樣品中除LDL外的脂蛋白中膽固醇的現(xiàn)有量。另外，在氫供體化合物中，這種基于苯胺的氫供體化合物的實(shí)例包括N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-乙基-N-磺基丙基-3-甲氧基苯胺(ADPS)、N-乙基-N-磺基丙基苯胺(ALPS)、N-乙基-N-磺基丙基-3，5-二甲氧基苯胺(DAPS)、N-磺基丙基-3，5-二甲氧基苯胺(HDAPS)、N-乙基-N-磺基丙基-3，5-二甲氧基苯胺(MAPS)、N-乙基-N-磺基丙基-3-甲基苯胺(TOPS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺(ADOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)苯胺(ALOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、和N-磺基丙基苯胺(HALPS)。
這種方法的另一個(gè)實(shí)例包括使膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶作用于它們的靶脂蛋白，并在340nm波長處測量所產(chǎn)生的NADH(還原的β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)。然而，該方法不限于此。在這個(gè)實(shí)例中測得的NADH的吸光度反映在生物樣品中除LDL外的脂蛋白中膽固醇的現(xiàn)有量。
第一步的反應(yīng)液中膽固醇酯酶的濃度優(yōu)選大約0.2到2.0IU/ml。關(guān)于其來源，由假單胞菌(Pseudomonas)屬細(xì)菌所產(chǎn)生的膽固醇酯酶是有效的。此外，膽固醇氧化酶的濃度優(yōu)選大約0.1到0.7IU/ml。優(yōu)選使用細(xì)菌、酵母等來源的膽固醇氧化酶。此外，當(dāng)將過氧化氫轉(zhuǎn)化成有色醌時(shí)，過氧化物酶的濃度優(yōu)選0.4到3.0IU/ml。4-氨基安替比林的濃度優(yōu)選0.4到4.0mmol/l?；诜踊虮桨返臍涔w化合物的濃度優(yōu)選0.4到2.0mmol/l。
此外，當(dāng)測量除醌染料外的NADH時(shí)，膽固醇酯酶的濃度與上述相同，膽固醇脫氫酶的濃度優(yōu)選0.2到1.0IU/ml，NADH的濃度優(yōu)選2.0到5.0mmol/l。
第一步中使用的作用于除LDL外的脂蛋白的表面活性劑的優(yōu)選實(shí)例是具有HLB值13以上、15以下，優(yōu)選13以上、14以下的聚環(huán)氧烷衍生物。這種衍生物的實(shí)例包括具有高級醇的縮合產(chǎn)物、具有高級脂肪酸的縮合產(chǎn)物、具有高級脂肪酸酰胺的縮合產(chǎn)物、具有高級烷基胺的縮合產(chǎn)物、具有高級烷基硫醇的縮合產(chǎn)物、以及具有烷基酚的縮合產(chǎn)物。另外，計(jì)算表面活性劑的HLB的方法是公知的，描述于，例如，Hiroshi Horiuchi，″New Surfactants，″1986，Sankyo Shuppan中。
這種HLB值13以上、15以下的聚環(huán)氧烷衍生物的優(yōu)選的具體實(shí)例包括，但不限于，HLB值13以上、15以下的化合物，如聚氧化乙烯十二烷基醚、聚氧化乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯高級醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧化乙烯壬基苯基醚、以及聚氧乙烯芐基苯基醚。
在第一步中使用的上述表面活性劑的濃度優(yōu)選可以是大約0.1到10g/l，更優(yōu)選大約0.5到5.0g/l。
第一步優(yōu)選在pH 5到9的緩沖液中進(jìn)行。優(yōu)選的緩沖液是含有胺，如tris、三乙醇胺的緩沖液，或者Good’s緩沖液。具體說來優(yōu)選作為Good’s緩沖液的Bis-Tris、PIPES、MOPSO、BES、HEPES、和POPSO。這種緩沖液的濃度優(yōu)選大約10到500mM。
為了在第一步中抑制與LDL的反應(yīng)以及進(jìn)一步提高與其它脂蛋白的反應(yīng)，反應(yīng)液可含有二價(jià)金屬離子?？墒褂枚r(jià)金屬離子如銅離子、鐵離子、以及鎂離子。特別優(yōu)選鎂離子。二價(jià)金屬離子的濃度可優(yōu)選大約5到200mM。
此外，在第一步中也可向反應(yīng)液中添加脂蛋白酯酶。優(yōu)選添加這種酶，因?yàn)槠溆绕湟子赩LDL中的膽固醇的反應(yīng)。在反應(yīng)液中這種酶的濃度可優(yōu)選是大約5.0到10.0U/ml。
在第一步中反應(yīng)溫度可優(yōu)選大約30℃到40℃，最優(yōu)選37℃。另外，反應(yīng)時(shí)間可以是大約2到10分鐘。
根據(jù)本發(fā)明的方法，在存在白蛋白時(shí)進(jìn)行第一步。白蛋白沒有特殊限制，只要是白蛋白即可?？蓛?yōu)選使用商品化的白蛋白，如血清白蛋白。白蛋白的來源沒有特殊限制，可以是任何動(dòng)物，如人、牛、豬、或馬。特別優(yōu)選使用廣泛使用的牛血清白蛋白。在第一步的反應(yīng)液中上述白蛋白的濃度優(yōu)選0.1到5.0g/dl，更優(yōu)選0.3到3.0g/dl。
在隨后的第二步中，定量試驗(yàn)樣品中剩余的膽固醇。這可通過例如，添加至少對LDL起作用的表面活性劑以及定量由在第一步中添加的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶所產(chǎn)生的過氧化氫來完成。可通過包括4-氨基安替比林和基于酚或苯胺的氫供體化合物之間使用過氧化物酶的氧化和縮合反應(yīng)將過氧化氫轉(zhuǎn)化成有色醌，然后在400nm和700nm之間的波長測量反應(yīng)產(chǎn)物的方法定量過氧化氫。當(dāng)在第一步的反應(yīng)中也產(chǎn)生有色醌時(shí)，在第二步中所測得的有色醌的吸光度除包括在第二步中所產(chǎn)生的有色醌的吸光度外，還包括在第一步中所產(chǎn)生的有色醌吸光度。這個(gè)吸光度反映生物樣品所含LDL中膽固醇的現(xiàn)有量，也代表生物樣品中所有脂蛋白中的膽固醇的現(xiàn)有量。另一方面，當(dāng)在第一步的反應(yīng)中產(chǎn)生NADH時(shí)，在不同于NADH的吸光度的波長測量有色醌的吸光度。因此，在第二步的反應(yīng)中所產(chǎn)生的有色醌的吸光度代表生物樣品所含LDL中膽固醇的現(xiàn)有量。在第二步的反應(yīng)中所產(chǎn)生的有色醌的吸光度和在第一步的反應(yīng)中所產(chǎn)生的NADH吸光度的總和代表生物樣品中總膽固醇的現(xiàn)有量。此外，使膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶作用于它們的靶脂蛋白，可在340nm的波長測量所產(chǎn)生的NADH(還原的β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)。當(dāng)在第一步的反應(yīng)中也產(chǎn)生NADH時(shí)，在第二步中所測得的NADH的吸光度除包含在第二步的反應(yīng)中所產(chǎn)生的NADH的吸光度外，還包括在第一步的反應(yīng)中所產(chǎn)生的NADH的吸光度。這個(gè)吸光度反映生物樣品所含LDL中膽固醇的現(xiàn)有量，也代表生物樣品中的所有脂蛋白中膽固醇的現(xiàn)有量。另一方面，當(dāng)在第一步的反應(yīng)中產(chǎn)生有色醌時(shí)，在不同于有色醌的吸光度的波長下測量NADH的吸光度。因此，在第二步的反應(yīng)中所產(chǎn)生的NADH吸光度代表生物樣品所含LDL中膽固醇的現(xiàn)有量。在第二步的反應(yīng)中所產(chǎn)生的NADH吸光度和在第一步的反應(yīng)中所產(chǎn)生的有色醌吸光度的總和代表生物樣品中總膽固醇的現(xiàn)有量。
這里，至少對LDL起作用的表面活性劑可以是選擇性地僅作用于LDL的表面活性劑，或者可以是對所有脂蛋白起作用的表面活性劑。
這種對所有脂蛋白起作用的表面活性劑的優(yōu)選實(shí)例是HLB值11以上、13以下，優(yōu)選12以上、13以下的聚環(huán)氧烷衍生物。這種衍生物的實(shí)例包括具有高級醇的縮合產(chǎn)物、具有高級脂肪酸的縮合產(chǎn)物、具有高級脂肪酸酰胺的縮合產(chǎn)物、具有高級烷基胺的縮合產(chǎn)物、具有高級烷基硫醇的縮合產(chǎn)物、以及具有烷基酚的縮合產(chǎn)物。
這種HLB值11以上、13以下的聚環(huán)氧烷衍生物的優(yōu)選的具體實(shí)例包括，但不限于，HLB值11以上、13以下的化合物，如聚氧化乙烯十二烷基醚、聚氧化乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯高級醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、以及聚氧化乙烯壬基苯基醚。
這種選擇性地僅對LDL起作用的表面活性劑的實(shí)例是陰離子表面活性劑。這里所使用的陰離子表面活性劑的優(yōu)選實(shí)例包括，但不特別限于，具有一個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)的陰離子表面活性劑，其中一個(gè)或多個(gè)C4到C18的線性或分支的烷基結(jié)合到芳香環(huán)上。這里，芳香環(huán)可優(yōu)選地由碳和氫構(gòu)成，如苯、萘、和聯(lián)苯。進(jìn)一步優(yōu)選所提及的具有一個(gè)或多個(gè)親水基團(tuán)，如硫酸酯結(jié)合到其上的芳香環(huán)。在下列式(I)到(V)中顯示這種陰離子表面活性劑的優(yōu)選實(shí)例。
化學(xué)式1 化學(xué)式2 化學(xué)式3
化學(xué)式4 化學(xué)式5 在式(I)到(V)中，R代表C4到C18的線性或分支的烷基。在第二步中使用的陰離子表面活性劑的優(yōu)選實(shí)例是高級醇硫酸鈉。
在第二步中使用的表面活性劑的濃度優(yōu)選是大約0.1到100g/l，更優(yōu)選大約1到50g/l。
第二步中其它優(yōu)選的反應(yīng)條件與第一步中優(yōu)選的反應(yīng)條件相同。
優(yōu)選地在單一反應(yīng)室內(nèi)連續(xù)完成第一步和第二步。通過自動(dòng)分析儀自動(dòng)測量第一步完成后的吸光度和第二步完成后的吸光度。
在本發(fā)明的方法中使用的分析儀是具有同時(shí)分析多個(gè)項(xiàng)目功能的自動(dòng)分析儀，通過其可同時(shí)分析多個(gè)項(xiàng)目。
考慮到分析儀的同時(shí)分析多個(gè)項(xiàng)目的功能，可向反應(yīng)室中加入第一到第四個(gè)試劑，可將反應(yīng)時(shí)間設(shè)為從3分鐘到20分鐘。此外，因?yàn)樵诜磻?yīng)期間在許多情況下進(jìn)行光度測定，可設(shè)置不同的測量時(shí)間。因此，也可以設(shè)置用于比色分析、速率分析或者比色法和速率法的組合的不同時(shí)間。此外，在不同波長的同時(shí)測量也是可能的。通過適當(dāng)設(shè)置用于分析和測量的這些條件，可獲得同時(shí)測量本發(fā)明所述的多個(gè)項(xiàng)目。
可使用具有這種同時(shí)分析多個(gè)項(xiàng)目功能的商品化的自動(dòng)分析儀。
本發(fā)明進(jìn)一步包括試劑組合物，其是同時(shí)測定生物樣品中所含LDL中的的膽固醇和總膽固醇的試劑盒。本發(fā)明所述的試劑組合物含有對除LDL外的脂蛋白起作用的表面活性劑、至少對LDL起作用的表面活性劑、膽固醇酯酶、以及膽固醇氧化酶。通過使用該試劑組合物，可測量由反應(yīng)所產(chǎn)生的有色醌的吸光度。此外，本發(fā)明的試劑組合物含有對除LDL外的脂蛋白起作用的表面活性劑、至少對LDL起作用的表面活性劑、膽固醇酯酶、以及膽固醇脫氫酶。通過使用該試劑組合物，可測量由反應(yīng)所產(chǎn)生的NADH的吸光度。本發(fā)明的試劑組合物進(jìn)一步含有已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)脂蛋白溶液、緩沖液等。
本說明書包括在日本專利申請No.2002-362970的說明書和/或附圖中所公開的部分或全部內(nèi)容，其是本申請的優(yōu)先權(quán)文件。
附圖簡述圖1.顯示本發(fā)明的多重定量方法的原理。
圖2.顯示通過本發(fā)明的多重定量方法測得的LDL中膽固醇水平和獨(dú)立測得的LDL中膽固醇水平之間的相關(guān)性。
圖3.顯示通過本發(fā)明所述的多重定量方法測得的總膽固醇水平和獨(dú)立測得的總膽固醇水平之間的相關(guān)性。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式基于本發(fā)明的實(shí)施例將給出具體解釋。然而，本發(fā)明不受下列實(shí)施例限制。
(試劑)制備具有下列組成的試劑，用于同時(shí)測量LDL膽固醇和總膽固醇。
第一試劑
PIPES緩沖液pH 7.0 50mmol/lHDAOS 0.7mmol/l4-氨基安替比林 1.5mmol/l膽固醇酯酶 0.8IU/ml膽固醇氧化酶0.5IU/ml過氧化物酶 1.0單位/ml氯化鎂 10mmol/lEMULGEN B66表面活性劑(Kao 0.2％Chemical Company)第二試劑PIPES緩沖液pH 7.0 50mmol/lTriton×100 3.0％作為接受評估的對照產(chǎn)品，使用用于自動(dòng)分析的LDL-EX N試劑(DENKA SEIKEN CO.，LTD生產(chǎn)的商品化產(chǎn)品)和用于自動(dòng)分析的T-CHO(S)N試劑(DENKA SEIKEN CO.，LTD生產(chǎn)的商品化產(chǎn)品)。
(樣品)制備30份人血清樣品。
TBA-30R (TOSHIBA CORPORATION)用作自動(dòng)分析儀。
(LDL-C和T-CHO試劑用于自動(dòng)測量(多試劑))測量條件多項(xiàng)的同時(shí)分析將在37℃預(yù)熱的300μl第一試劑與4μl的每種樣品混合，隨后在37℃反應(yīng)5分鐘。然后添100μl第二試劑，反應(yīng)進(jìn)行5分鐘，然后在600nm測量吸光度。通過從添加第二試劑后測得的吸光度中減去添加第一試劑后測得的吸光度完成LDL膽固醇(LDL-C)測量。通過測量添加第二試劑后的吸光度完成總膽固醇(T-CHO)測量。通過將這些吸光度與以前測得的已知濃度樣品的吸光度比較，計(jì)算LDL-C和T-CHO的濃度。
(用于比較的對照試劑)測量條件(在相同條件下分別測量LDL-C和T-CHO)將在37℃預(yù)熱的300μl第一試劑與4μl的每種樣品混合，隨后在37℃反應(yīng)5分鐘。然后添加100μl第二試劑，反應(yīng)進(jìn)行5分鐘，然后在600nm測量吸光度。通過從添加第二試劑后測得的吸光度中減去添加第一試劑后測得的吸光度完成測量。通過將這些吸光度與以前測得的已知濃度樣品的吸光度比較，計(jì)算濃度。
如在圖2和3中所示，根據(jù)本方法的同時(shí)定量，獲得與通過分別測量LDL-C和T-CHO所獲得的結(jié)果相似的測量結(jié)果。
在此將這里所引用的所有出版物、專利、以及專利申請全部引入作為參考。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明的方法使僅用一次測量同時(shí)定量LDL膽固醇和總膽固醇成為可能。
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)測定生物樣品所含低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇的方法，其中用一次測量定量生物樣品所含低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇。
2.權(quán)利要求1的方法，其中包括使生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白中的膽固醇反應(yīng)的第一步和使剩余的低密度脂蛋白中的膽固醇反應(yīng)的第二步。
3.權(quán)利要求1的方法，其中僅用一次測量獲得反映生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白中的膽固醇現(xiàn)有量的測量值和反映低密度脂蛋白中的膽固醇現(xiàn)有量的測量值，然后根據(jù)上述兩個(gè)值同時(shí)測定生物樣品所含低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇的現(xiàn)有量。
4.權(quán)利要求3的方法，其包括獲得反映生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白中膽固醇現(xiàn)有量的測量值的第一步和獲得反映剩余低密度脂蛋白中膽固醇現(xiàn)有量的測量值的第二步。
5.權(quán)利要求1到4中任何一項(xiàng)的方法，其中在存在對除低密度脂蛋白外的脂蛋白起作用的表面活性劑時(shí)，第一步包括使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用于生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白，將所產(chǎn)生的過氧化氫轉(zhuǎn)化成醌染料，然后測量反應(yīng)產(chǎn)物，或者包括使膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶作用于生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白，然后測量所產(chǎn)生的NADH(還原的β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)。
6.權(quán)利要求1到5中任何一項(xiàng)的方法，其中第二步包括，向第一步的反應(yīng)產(chǎn)物添加至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑，使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用于剩余的低密度脂蛋白，將所產(chǎn)生的過氧化氫轉(zhuǎn)化成醌染料，然后測量反應(yīng)產(chǎn)物，或者包括使膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶作用于剩余的低密度脂蛋白，然后測量所產(chǎn)生的NADH(還原的β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)。
7.權(quán)利要求1到6中任何一項(xiàng)的方法，其中使用用于臨床和化學(xué)檢測的自動(dòng)分析儀，僅用一次測量在不同測量條件下進(jìn)行分析。
8.權(quán)利要求1到7中任何一項(xiàng)的方法，其中通過得到在第一步和第二步中所獲得的作為測量值的吸光度的差異，定量血液中低密度脂蛋白中的膽固醇。
9.權(quán)利要求1到8中任何一項(xiàng)的方法，其中通過得到基于在第一步中所獲得的作為測量值的吸光度變化和在第二步中所獲得的作為測量值的吸光度變化的總吸光度，定量總膽固醇。
10.一種用于根據(jù)權(quán)利要求1到6中任何一項(xiàng)的方法同時(shí)測定生物樣品所含低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇的試劑組合物。
11.權(quán)利要求10的試劑組合物，其包括作用于除低密度脂蛋白外的脂蛋白的表面活性劑、至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑、膽固醇酯酶、和膽固醇氧化酶。
12.權(quán)利要求10的試劑組合物，其包括作用于除低密度脂蛋白外的脂蛋白的表面活性劑、至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑、膽固醇酯酶、和膽固醇脫氫酶。
全文摘要
本發(fā)明旨在提供同時(shí)定量作為血液中待檢測成分的低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇的方法。一種同時(shí)定量作為生物樣品中待檢測成分的低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇的方法，由此通過單個(gè)測量步驟來定量生物樣品所含低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇。
文檔編號G01N33/92GK1748036SQ20038010974
公開日2006年3月15日 申請日期2003年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月13日
發(fā)明者松井寬史 申請人:電化生研株式會(huì)社