專利名稱：畜禽肉中高、低密度脂蛋白膽固醇含量的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種畜禽肉中高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇含量的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
膽固醇分為高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇兩種，高密度脂蛋白膽固醇可減少患冠狀動(dòng)脈心臟病的危險(xiǎn)，被稱為“好”膽固醇；低密度脂蛋白膽固醇會(huì)增加患冠狀動(dòng)脈心臟病的危險(xiǎn)，被稱為“壞”膽固醇。人體內(nèi)的膽固醇有兩個(gè)來源，一是內(nèi)源合成，二是來自動(dòng)物性食物。近年來，隨著生活水平的提高，動(dòng)物性食物在人們膳食中占的比例逐漸增大，外源的膽固醇攝入過多，誘發(fā)了各種心血管疾病。為此，科研工作者研發(fā)了高密度脂蛋白膽固醇含量高、低密度脂蛋白膽固醇含量低的畜禽肉，使人們?cè)诓唤档蜕钯|(zhì)量的同時(shí)降低患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。目前，國(guó)內(nèi)還沒有測(cè)定畜禽肉中高、低密度脂蛋白膽固醇的含量的標(biāo)準(zhǔn)方法，一些科研工作者常借鑒醫(yī)學(xué)上測(cè)血液中高低密度脂蛋白膽固醇的方法進(jìn)行測(cè)定，首先將畜禽肉加一定比例的生理鹽水進(jìn)行勻漿，然后離心取上清液，測(cè)上清液中兩種膽固醇的含量。由于膽固醇不溶于水，上述方法測(cè)定的兩種膽固醇的含量只是畜禽肉滲出液中的含量，它是畜禽肉中高、低密度脂蛋白膽固醇的部分值，并非畜禽肉中兩種膽固醇含量的真值。

發(fā)明內(nèi)容
為了測(cè)定畜禽肉中兩種膽固醇含量的真值，申請(qǐng)人廣泛查閱了相關(guān)資料，進(jìn)行了相關(guān)試驗(yàn)技術(shù)的集成創(chuàng)新，通過大量的試驗(yàn)研究，建立了一種畜禽肉中高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的測(cè)定方法，為客觀準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)畜禽肉提供了新方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是畜禽肉中高密度脂蛋白膽固醇的測(cè)定方法，其特征是，將畜禽肉中的脂類用氫氧化鉀和無水乙醇皂化，膽固醇作為不皂化物用無水乙醚提取出來，然后用磷鎢酸-氯化鎂沉淀劑將其中的高密度脂蛋白膽固醇分離出來，最后用氣相色譜儀測(cè)出高密度脂蛋白膽固醇的峰面積，根據(jù)峰面積計(jì)算其含量。具體步驟為(1)皂化取0. 1 1. 5克畜禽肉，用0. 5 1. 5mol/L的氫氧化鉀和無水乙醇在75°C 95°C 水浴上皂化至澄清；所述氫氧化鉀和無水乙醇的體積比為1 1;(2)膽固醇提取然后將皂化后的溶液用乙醚提取3次，之后用蒸餾水洗滌3次，無水硫酸鈉干燥乙醚層，用高純氮吹干或真空干燥箱烘干后，加入無水乙醇溶解提取出的膽固醇；(3)高密度脂蛋白膽固醇的分離然后用磷鎢酸-氯化鎂配成的沉淀劑和膽固醇溶液等體積混合均勻，靜置、離心、 過濾，即得高密度脂蛋白膽固醇溶液；所用磷鎢酸-氯化鎂沉淀劑pH為6. 1 士0. 1，磷鎢酸含量為4. 4克/升，氯化鎂含量為11克/升；
(4)測(cè)定與計(jì)算最后，用氣相色譜儀外標(biāo)法測(cè)高密度脂蛋白膽固醇溶液中高密度脂蛋白膽固醇的峰面積，通過公式X = cXAXVX100/As/m/1000(X 試樣中高脂蛋白膽固醇的含量，單位為毫克每百克；c 標(biāo)準(zhǔn)工作液中膽固醇的濃度，單位為微克每毫升；A 試樣溶液中膽固醇的峰面積；V 試樣溶液最終定容的體積，單位為毫升；AS 標(biāo)準(zhǔn)工作液中膽固醇的峰面積； m:肉樣的質(zhì)量，單位為克。)計(jì)算出畜禽肉中高密度脂蛋白膽固醇的含量。本發(fā)明的技術(shù)方案是畜禽肉中低密度脂蛋白膽固醇的測(cè)定方法，其特征是，首先是將畜禽肉中的脂類用氫氧化鉀和無水乙醇皂化，膽固醇作為不皂化物用無水乙醚提取出來，用檬酸鈉-肝素沉淀劑將其中的低密度脂蛋白膽固醇分離出來，最后用氣相色譜儀測(cè)出低密度脂蛋白膽固醇的峰面積，根據(jù)峰面積計(jì)算其含量。具體步驟為(1)皂化取0. 1 1. 5克畜禽肉，用0. 5 1. 5mol/L的氫氧化鉀和無水乙醇在75°C 95°C 水浴上緩慢皂化至溶液澄清；所述氫氧化鉀和無水乙醇的體積比為1 1;(2)膽固醇提取然后將皂化后的溶液用乙醚提取3次，之后用蒸餾水洗滌3次，無水硫酸鈉干燥乙醚層，用高純氮吹干或真空干燥箱烘干后，加入無水乙醇溶解提取出的膽固醇；(3)低密度脂蛋白膽固醇的分離用檸檬酸鈉-肝素配成的沉淀劑和膽固醇溶液等體積混合、靜置、離心、過濾，即得低密度脂蛋白膽固醇溶液；所用試劑檸檬酸鈉-肝素沉淀劑pH為5. 12士0. 02，檸檬酸鈉的含量為18. 8克/升，肝素的含量為12500U/升。(4)測(cè)定與計(jì)算最后用氣相色譜儀外標(biāo)法測(cè)低密度脂蛋白膽固醇溶液中低密度脂蛋白膽固醇的峰面積，通過公式X = cXAXVX100/As/m/1000(X 試樣中低密度脂蛋白膽固醇的含量， 單位為毫克每百克；c 標(biāo)準(zhǔn)工作液中膽固醇的濃度，單位為微克每毫升；A 試樣溶液中膽固醇的峰面積；V 試樣溶液最終定容的體積，單位為毫升-A 標(biāo)準(zhǔn)工作液中膽固醇的峰面積；m:肉樣的質(zhì)量，單位為克。)計(jì)算出畜禽肉中低密度脂蛋白膽固醇的含量。本發(fā)明氣相色譜條件優(yōu)選為色譜柱DB_5彈性石英毛細(xì)管柱(30米0. 32毫米X /0. 25微米)載氣99. 99%氮?dú)?，恒?. 4毫升/分鐘柱溫初始溫度200°C，1分鐘后，以30°C /分鐘升至280°C，保持10分鐘進(jìn)樣口溫度280°C檢測(cè)器溫度290°C進(jìn)樣量及方式1微升不分流進(jìn)樣空氣流速350毫升/分鐘氫氣流速30毫升/分鐘本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明能準(zhǔn)確定量地測(cè)出畜禽肉中高、低密度脂蛋白膽固醇的含量，而采用醫(yī)學(xué)方法所測(cè)得的值為畜禽肌肉組織滲出液中的含量，并非肌肉中全部含量。因此，本發(fā)明將為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)功能性畜禽肉提供正確可靠的方法。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1畜禽肉中高密度脂蛋白膽固醇的測(cè)定方法1.所用試劑氫氧化鉀(分析純)，無水乙醇(分析純)，無水乙醚(分析純)，無水硫酸鈉(分析純)，蒸餾水，磷鎢酸(分析純)，氯化鎂(分析純)，膽固醇(標(biāo)準(zhǔn)品)，高純氮2.操作方法及步驟(1)皂化稱取0.5 1.0克試樣，置于100毫升帶塞比色管中，加入10毫升lmol/L氫氧化鉀溶液，10毫升無水乙醇，混勻，裝上冷凝管，在75°C 95°C水浴上緩慢皂化至溶液澄清 (約需1小時(shí))，然后用流水冷卻。(2)膽固醇提取將試樣皂化液移入50毫升分液漏斗中，加入10毫升乙醚混勻，靜置分層，將水層放入上述比色管中，并加入10毫升乙醚，輕輕振搖，靜置分層，將乙醚層移入上述分液漏斗中。再加入10毫升乙醚于比色管中，重復(fù)提取1次，將乙醚層移入分液漏斗中。用15毫升蒸餾水分三次洗滌分液漏斗中的溶液。分層后棄去水層，用10克無水硫酸鈉干燥乙醚層， 將乙醚層移入另一帶塞比色管中。用高純氮吹干后，加入1毫升無水乙醇溶解吹干后的膽固醇。(3)高密度脂蛋白膽固醇的分離分別稱取磷鎢酸0.044克和氯化鎂0. 11克，定容至10毫升，pH值為6. 1 士0. 1，準(zhǔn)確吸取磷鎢酸-氯化鎂溶液0. 5毫升，與等體積的膽固醇提取液混勻，室溫靜置10分鐘后， 3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，用過濾器將離心后懸浮固形物過濾掉，濾液即為高密度脂蛋白膽固醇溶液。(4)測(cè)定根據(jù)試樣溶液中高密度脂蛋白膽固醇的含量情況，選定峰面積相近的標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)工作液和試樣溶液中膽固醇的相應(yīng)值應(yīng)均在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)工作液和試樣溶液等體積間隔進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。氣象色譜條件色譜柱DB_5彈性石英毛細(xì)管柱(30米0. 32毫米X /0. 25微米)載氣99. 99%氮?dú)?，恒?. 4毫升/分鐘柱溫初始溫度200°C，1分鐘后，以30°C /分鐘升至280°C，保持10分鐘進(jìn)樣口溫度280°C檢測(cè)器溫度290°C 進(jìn)樣量及方式1微升不分流進(jìn)樣空氣流速350毫升/分鐘氫氣流速30毫升/分鐘(5)計(jì)算X = cXAXVX100/As/m/1000X 試樣中高密度脂蛋白膽固醇的含量，單位為毫克每百克；
c 標(biāo)準(zhǔn)工作液中膽固醇的濃度，單位為微克每毫升；A 試樣溶液中膽固醇的峰面積；V 試樣溶液最終定容的體積，單位為毫升；As 標(biāo)準(zhǔn)工作液中膽固醇的峰面積；m:肉樣的質(zhì)量，單位為克。實(shí)施例2畜禽肉中低密度脂蛋白膽固醇的測(cè)定方法1.所用試劑氫氧化鉀(分析純)，無水乙醇(分析純)，無水乙醚(分析純)，無水硫酸鈉(分析純)，蒸餾水，檸檬酸鈉(分析純)，肝素，膽固醇(標(biāo)準(zhǔn)品)，高純氮2.操作方法及步驟(1)皂化稱取0.5 1.0克試樣，置于100毫升帶塞比色管中，加入10毫升lmol/L氫氧化鉀溶液，10毫升無水乙醇，混勻，裝上冷凝管，在75°C 95°C水浴上緩慢皂化至溶液澄清 (約需1小時(shí))，然后用流水冷卻。(2)膽固醇提取將試樣皂化液移入50毫升分液漏斗中，加入10毫升乙醚混勻，靜置分層，將水層放入上述比色管中，并加入10毫升乙醚，輕輕振搖，靜置分層，將乙醚層移入上述分液漏斗中。再加入10毫升乙醚于比色管中，重復(fù)提取1次，將乙醚層移入分液漏斗中。用15毫升蒸餾水分三次洗滌分液漏斗中的溶液。分層后棄去水層，用10克無水硫酸鈉干燥乙醚層， 將乙醚層移入另一帶塞比色管中。用高純氮吹干后，加入1毫升無水乙醇溶解吹干后的膽固醇。(3)高密度脂蛋白膽固醇的分離分別稱取檸檬酸鈉0. 188g，肝素(125U)，定容至10毫升，pH值為5. 12士0.02，準(zhǔn)確吸取檸檬酸鈉-肝素溶液0. 5毫升，與等體積的膽固醇提取液混勻，室溫靜置10分鐘后， 3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，用過濾器將離心后懸浮固形物過濾掉，濾液即為低密度脂蛋白膽固醇溶液。(4)測(cè)定根據(jù)試樣溶液中低密度脂蛋白膽固醇的含量情況，選定峰面積相近的標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)工作液和試樣溶液中膽固醇的相應(yīng)值應(yīng)均在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)工作液和試樣溶液等體積間隔進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。氣相色譜條件色譜柱DB_5彈性石英毛細(xì)管柱(30米0. 32毫米X /0. 25微米)載氣99. 99%氮?dú)猓懔?. 4毫升/分鐘柱溫初始溫度200°C，1分鐘后，以30°C /分鐘升至280°C，保持10分鐘進(jìn)樣口溫度280°C檢測(cè)器溫度290°C 進(jìn)樣量及方式1微升不分流進(jìn)樣
空氣流速350毫升/分鐘
氫氣流速30毫升/分鐘(5)計(jì)算X = cXAXVX100/As/m/1000X 試樣中低密度脂蛋白膽固醇的含量，單位為毫克每百克；c 標(biāo)準(zhǔn)工作液中膽固醇的濃度，單位為微克每毫升；A 試樣溶液中膽固醇的峰面積；V 試樣溶液最終定容的體積，單位為毫升；As 標(biāo)準(zhǔn)工作液中膽固醇的峰面積；m:肉樣的質(zhì)量，單位為克。試驗(yàn)例1 2009年3月 5月，受濟(jì)南環(huán)億生物科技有限公司委托，我們進(jìn)行了 “環(huán)億1號(hào)” 飼料添加劑(具有降低總膽固醇，提高高密度脂蛋白膽固醇的作用)飼喂肉雞的試驗(yàn)。選 1日齡AA肉雞200只，均分成兩組，對(duì)照組采用普通日糧，試驗(yàn)組采用添加環(huán)億1號(hào)添加劑的日糧，8周后，每組選5只共10只體重接近的AA肉雞進(jìn)行屠宰，取胸肉采用兩種方法測(cè)高密度脂蛋白膽固醇。(樣品1-5號(hào)為對(duì)照組，6-10號(hào)為試驗(yàn)組)測(cè)定方法一見本實(shí)施例1測(cè)定方法二 醫(yī)學(xué)方法。前處理取胸肉加等質(zhì)量的生理鹽水進(jìn)行勻漿，將勻漿液 3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液，用測(cè)人血清中高密度脂蛋白膽固醇的試劑盒測(cè)定。操作步驟(來源于試劑盒說明書)1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100 μ 1，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μ 1，混勻；然后從第一孔、 第二孔中各取100μ 1分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50 μ 1，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50 μ 1棄掉，再各取50 μ 1分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50 μ 1分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μ 1，混勻后從第七、第八孔中分別取50μ 1加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50 μ 1，混勻后從第九第十孔中各取50 μ 1棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50 μ 1，濃度分別為 600pg/mL，400pg/mL,200pg/mL,100pg/mL,50pg/mL)。2.加樣分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、 待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μ 1，然后再加待測(cè)樣品 10μ 1 (樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。3.溫育用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘。4.配液將30 (48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 (48T的20倍)倍稀釋后5.洗滌小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6.加酶每孔加入酶標(biāo)試劑50 μ 1，空白孔除外。7.溫育操作同3。
8.洗滌操作同5。9.顯色每孔先加入顯色劑Α50μ 1，再加入顯色劑Β50μ 1，輕輕震蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘·10.終止每孔加終止液50 μ 1，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。11.測(cè)定以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(0D值)。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。12.計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線， 根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。兩種方法的測(cè)試結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，實(shí)施例1的方法所測(cè)的值顯著大于醫(yī)學(xué)方法的測(cè)定值。表1兩種方法測(cè)定AA肉雞胸肉中高密度脂蛋白膽固醇含量的結(jié)果比較
實(shí)施例1的方法測(cè)定的AA肉雞醫(yī)學(xué)方法測(cè)定的AA肉雞胸肉中樣品號(hào)胸肉中的高密度脂蛋白膽固醇含的高密度脂蛋白膽固醇含量值
量值(mg/100g)(mg/100g)
18.246.1828 366.2738.596.4448.816.6159.026.7767.055.2977.295.4787.485.6198.136.10109.347.01試驗(yàn)例2:2009年3月 5月，受濟(jì)南環(huán)億生物科技有限公司委托，我們進(jìn)行了 “環(huán)億1號(hào)” 飼料添加劑(具有降低總膽固醇，提高高密度脂蛋白膽固醇的作用)飼喂肉雞的試驗(yàn)。選 1日齡AA肉雞200只，均分成兩組，對(duì)照組采用普通日糧，試驗(yàn)組采用添加環(huán)億1號(hào)添加劑的日糧，8周后，每組選5只共10只體重接近的AA肉雞進(jìn)行屠宰，取胸肉同時(shí)采用兩種方法測(cè)低密度脂蛋白膽固醇。(其中樣品1-5號(hào)為對(duì)照組，6-10號(hào)為試驗(yàn)組)測(cè)定方法一見本實(shí)施例2測(cè)定方法二 醫(yī)學(xué)方法。前處理取胸肉加等質(zhì)量的生理鹽水進(jìn)行勻漿，將勻漿液 3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液，用測(cè)人血清中低密度脂蛋白膽固醇的試劑盒測(cè)定。操作步驟(來源于試劑盒說明書)1、準(zhǔn)備從冰箱取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30分鐘。2、配液用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。
3、加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本取足夠數(shù)量的酶標(biāo)包被板，固定于框架上，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔和空白對(duì)照孔，記錄各孔位置，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μ L ；待測(cè)樣本孔中先加入待測(cè)樣本10 μ L，再加樣本稀釋液40μ L(即樣本稀釋5倍)；空白對(duì)照孔不加。4、溫育37 °C水浴鍋或恒溫箱溫育30min。5、洗板棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置lmin，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次。6、加酶標(biāo)工作液每孔加入酶標(biāo)工作液50 μ L，空白對(duì)照孔不加。7、溫育37 °C水浴鍋或恒溫箱溫育30min。8、洗板棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置lmin，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次9、顯色每孔先加入顯色劑A液50 μ L，再加入顯色劑B液50 μ L，平板混勻器混勻 30s (或用手輕輕震蕩混勻30s)，37°C避光顯色15min。10、終止取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50 μ L，終止反應(yīng)(顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。11、測(cè)定以空白孔調(diào)零，在終止后15分鐘內(nèi)，用450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值 (0D 值)。12、計(jì)算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。最終濃度為實(shí)際測(cè)定濃度乘以稀釋倍數(shù)。兩種方法的測(cè)試結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，實(shí)施例2的方法測(cè)定值大于醫(yī)學(xué)方法的測(cè)定值。表2兩種方法測(cè)定AA肉雞胸肉中低密度脂蛋白膽固醇含量的結(jié)果比較
權(quán)利要求
1.畜禽肉中高密度脂蛋白膽固醇的測(cè)定方法，其特征是，將畜禽肉中的脂類用氫氧化鉀和無水乙醇皂化，膽固醇作為不皂化物用無水乙醚提取出來，然后用磷鎢酸-氯化鎂沉淀劑將其中的高密度脂蛋白膽固醇分離出來，最后用氣相色譜儀測(cè)出高密度脂蛋白膽固醇的峰面積，根據(jù)峰面積計(jì)算其含量。
2.如權(quán)利要求1所述的畜禽肉中高密度脂蛋白膽固醇的測(cè)定方法，其特征是，(1)皂化取畜禽肉，用0. 5 1. 5mol/L的氫氧化鉀和無水乙醇在75°C 95°C水浴上皂化至澄清；所述氫氧化鉀和無水乙醇的體積比為1 1;(2)膽固醇提取然后將皂化后的溶液用乙醚提取3次，之后用蒸餾水洗滌3次，無水硫酸鈉干燥乙醚層，用高純氮吹干或真空干燥箱烘干后，加入無水乙醇溶解提取出的膽固醇；(3)高密度脂蛋白膽固醇的分離然后用磷鎢酸-氯化鎂沉淀劑和膽固醇溶液等體積混合均勻，靜置、離心、過濾，即得高密度脂蛋白膽固醇溶液；所用磷鎢酸-氯化鎂沉淀劑PH為6. 1 士0. 1，磷鎢酸含量為4. 4 克/升，氯化鎂含量為11克/升；(4)測(cè)定與計(jì)算最后，用氣相色譜儀外標(biāo)法測(cè)高密度脂蛋白膽固醇溶液中高密度脂蛋白膽固醇的峰面積，通過公式X = cXAXVX100/As/m/1000，計(jì)算出畜禽肉中高密度脂蛋白膽固醇的含量； 所述公式中其中X 試樣中高脂蛋白膽固醇的含量，單位為毫克每百克；c 標(biāo)準(zhǔn)工作液中膽固醇的濃度，單位為微克每毫升；A 試樣溶液中膽固醇的峰面積；V 試樣溶液最終定容的體積，單位為毫升；AS 標(biāo)準(zhǔn)工作液中膽固醇的峰面積；m 肉樣的質(zhì)量，單位為克。
3.如權(quán)利要求1或2所述的畜禽肉中高密度脂蛋白膽固醇的測(cè)定方法，其特征是，所述氣象色譜儀的氣相色譜條件為色譜柱DB-5彈性石英毛細(xì)管柱； 載氣99. 99%氮?dú)猓懔?. 4毫升/分鐘；柱溫初始溫度200°C，1分鐘后，以30°C /分鐘升至280°C，保持10分鐘；進(jìn)樣口溫度280°C ；檢測(cè)器溫度290°C ；進(jìn)樣量及方式1微升不分流進(jìn)樣；空氣流速350毫升/分鐘；氫氣流速30毫升/分鐘。
4.畜禽肉中低密度脂蛋白膽固醇的測(cè)定方法，其特征是，首先是將畜禽肉中的脂類用氫氧化鉀和無水乙醇皂化，膽固醇作為不皂化物用無水乙醚提取出來，用檬酸鈉-肝素沉淀劑將其中的低密度脂蛋白膽固醇分離出來，最后用氣相色譜儀測(cè)出低密度脂蛋白膽固醇的峰面積，根據(jù)峰面積計(jì)算其含量。
5.如權(quán)利要求4所述的畜禽肉中低密度脂蛋白膽固醇的測(cè)定方法，其特征是， (1)皂化取畜禽肉，用0. 5 1. 5mol/L的氫氧化鉀和無水乙醇在75°C 95°C水浴上緩慢皂化至溶液澄清；所述氫氧化鉀和無水乙醇的體積比為1 1;(2)膽固醇提取然后將皂化后的溶液用乙醚提取3次，之后用蒸餾水洗滌3次，無水硫酸鈉干燥乙醚層，用高純氮吹干或真空干燥箱烘干后，加入無水乙醇溶解提取出的膽固醇；(3)低密度脂蛋白膽固醇的分離用檸檬酸鈉-肝素配成的沉淀劑和膽固醇溶液等體積混合、靜置、離心、過濾，即得低密度脂蛋白膽固醇溶液；所用試劑檸檬酸鈉-肝素沉淀劑PH為5. 12士0. 02，檸檬酸鈉的含量為18. 8克/升，肝素的含量為12500U/升；(4)測(cè)定與計(jì)算最后用氣相色譜儀外標(biāo)法測(cè)低密度脂蛋白膽固醇溶液中低密度脂蛋白膽固醇的峰面積，通過公式X = cXAXVX100/As/m/1000計(jì)算出畜禽肉中低密度脂蛋白膽固醇的含量； 所述公式中其中X 試樣中高脂蛋白膽固醇的含量，單位為毫克每百克；c 標(biāo)準(zhǔn)工作液中膽固醇的濃度，單位為微克每毫升；A 試樣溶液中膽固醇的峰面積；V 試樣溶液最終定容的體積，單位為毫升；AS 標(biāo)準(zhǔn)工作液中膽固醇的峰面積；m 肉樣的質(zhì)量，單位為克。
6.如權(quán)利要求4或5所述的畜禽肉中低密度脂蛋白膽固醇的測(cè)定方法，其特征是，所述氣象色譜儀的氣相色譜條件為色譜柱DB-5彈性石英毛細(xì)管柱； 載氣99. 99%氮?dú)?，恒?. 4毫升/分鐘；柱溫初始溫度200°C，1分鐘后，以30°C /分鐘升至280°C，保持10分鐘；進(jìn)樣口溫度280°C ；檢測(cè)器溫度290°C ；進(jìn)樣量及方式1微升不分流進(jìn)樣；空氣流速350毫升/分鐘；氫氣流速30毫升/分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種畜禽肉中高、低密度脂蛋白膽固醇含量的測(cè)定方法，它是先將畜禽肉中的脂類用氫氧化鉀和無水乙醇皂化，膽固醇作為不皂化物用無水乙醚提取出來，然后用磷鎢酸-氯化鎂沉淀劑將其中的高密度脂蛋白膽固醇分離出來，用檬酸鈉-肝素沉淀劑將其中的低密度脂蛋白膽固醇分離出來，最后用氣相色譜儀測(cè)出高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的峰面積，根據(jù)峰面積計(jì)算其含量。本發(fā)明能準(zhǔn)確定量地測(cè)出畜禽肉中高、低密度脂蛋白膽固醇的含量，而采用醫(yī)學(xué)方法所測(cè)得的值為畜禽肌肉組織滲出液中的含量，并非肌肉中全部含量。因此，本發(fā)明將為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)功能性畜禽肉提供正確可靠的方法。
文檔編號(hào)G01N30/88GK102156175SQ20111006737
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者井慶川, 劉濤, 劉瑞亭, 劉雪蘭, 武彬, 石天虹, 閻佩佩, 魏祥法 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所