專利名稱：血清低密度脂蛋白膽固醇的定量測定試劑及測定試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及血清樣品中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的定量測定試劑及試劑盒。
背景技術：
血清中的脂類物質如膽固醇和甘油三酯等并不是以游離形式存在于血清中，而是與各種載脂蛋白結合后以脂蛋白的形式存在于血清中，血清中的脂蛋白是顆粒狀的物質， 根據顆粒的大小與密度可分為四類脂蛋白乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)，不同的脂蛋白在體內發(fā)揮不同的生理與病理功能， 上個世紀七十年代開始，眾多的流行病學研究證實，血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平與動脈粥樣硬化或冠心病的發(fā)病率呈正相關，目前已公認低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C) 是冠心病的重要風險因子，因為LDL對動脈粥樣硬化斑塊的形成有極大的作用。Gottingen 的危險、發(fā)生率和流行病學研究(GRIP 表明，在所有的脂類和各種脂蛋白中，低密度脂蛋白膽固醇和冠心病死亡率之間呈現最強烈的相關。對低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量的測定是目前臨床實驗室普遍開展的工作。國際上測定低密度脂蛋白膽固醇的參考方法是β定量法，這一方法要使用能達到極大離心力的超速離心機，經長時間離心后除去極低密度脂蛋白(VLDL)，測定密度> 1.006 組份中的膽固醇含量，并從中減去高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量(密度> 1.063)，得到 LDL-C的含量。此法需要昂貴的設備超速離心機，操作復雜費時，處理樣品的能力低下，無法在一般臨床實驗室開展對低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的測定。20世紀80年代發(fā)展出幾種相對比較適合臨床實驗室使用的較為簡單的測定 LDL-C的方法，這類方法的基本原理是以各種沉淀劑如高分子葡聚糖硫酸鹽、多聚陰離子、 聚乙烯硫酸鹽(PVS)、肝素等使血清中的LDL沉淀，離心分離沉淀物后，測定分離了 LDL后的樣品上清液的膽固醇含量，同時測定原始血清樣品的總膽固醇含量，從中減去前述分離了 LDL后的樣品上清液的膽固醇含量，將其差值作為LDL-C的含量。這一類方法都不是對 LDL-C的直接測定，是間接測定方法。所以對同一樣品至少要進行二次膽固醇含量測定才能得到LDL-C含量，而且由于有沉淀離心分離LDL的操作，因而無法實現自動化測定。這類方法對樣品的處理能力也往往不能滿足臨床的需求，方法的精密度與準確度和特異性方面缺乏明顯的優(yōu)越性。由于沉淀法測定LDL-C的多種缺陷和使用不便，又有一種根據血清樣品的總膽固醇含量(Tc)、甘油三酯含量(TG)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)三者含量，以一個經驗公式計算出LDL-C含量的方法，即Friedewald公式計算法。當一個血清樣品的TC、TG和HDL-C 含量都在正常范圍內，而且對上述三項脂類的測定都有較好的準確性時，根據Friedewald 公式計算得出的LDL-C含量一般也可認為是準確的；但Friedewald公式計算法不能適用于血脂異常尤其是高甘油三酯血癥病人的血清樣品，而臨床上需要測定LDL-C的對象往往是有血脂異常的情況，如果對這些病人的血清樣品以Friedewald公式計算法計算LDL-C含量，得到的結果對臨床的診斷與治療是沒有意義的，而且很有可能對臨床造成誤導。
在20世紀90年代初曾短暫出現第二代的根據抗原-抗體免疫法原理的沉淀分離 LDL的方法，只是在沉淀法的甚而上對樣品上用新的方法取代離心操作步驟，并無實質性的改進，這類方法也沒有在國內推廣使用。1998年首先由日本學者報告適合自動分析儀使用的勻相直接測定LDL-C的方法， 屬第三代方法。此類方法的出現，為直接測定血清LDL-C開拓了一個嶄新的思路，隨之涌現了數種免去先分離LDL而可以在勻相體系中直接測定LDL-C的方法。其中一種是“增溶法”(Sol法)先用表面活性劑和糖化合物封閉非LDL脂蛋白(包括VLDL、CM和HDL)，然后在反應體系中用酶法測定LDL-C ；另一種是“表面活性劑法”(SUR法)在一種特殊的表面活性劑存在下，保護LDL-C不被反應體系中的酶水解，但其他脂蛋白所含的膽固醇被酶水解， 然后加入另一種特殊的表面活性劑，解除對LDL的保護，使LDL-C被酶水解后顯色測定；第三種方法是“保護法”(PRO法)先用一種保護劑保護LDL不被酶催化反應，但其他脂蛋白所含的膽固醇被酶水解，然后加入去保護劑，解除對LDL的保護，使LDL-C被酶水解后顯色測定；第四種方法是“紫外法”(CAL法)一種特殊的試劑與LDL結合形成可溶性聚合物，也不參與膽固醇的酶解反應，然后使LDL解聚，參與膽固醇的酶解反應，但是最后以脫氫酶途徑利用輔酶I的轉化以紫外光波長檢測反應產物；再一種方法是選擇性抑制法，用α-環(huán)糊精、硫酸葡聚糖和聚氧乙烯-聚丙烯封閉，共聚多糖抑制非LDL與膽固醇酶試劑的反應， 僅使LDL-C被酶水解并測定。這類勻相直接測定LDL-C的方法，適合自動化分析儀器進行測定，可以對臨床大量檢測樣品進行快速測定，目前已普遍在各級醫(yī)院的臨床實驗室中推廣使用。目前，勻相直接測定LDL-C的市售試劑已打破了進口產品一統天下，已有不少國內的相關商品化試劑盒供應。經相關專利的檢索，也檢索到一些相關勻相直接測定LDL-C 的專利。但本專利申請的內容具有獨立的特點，試劑性能更為優(yōu)良，能有效抗干擾能力，價格更為低廉，為臨床需要提供了一個較好的選擇。
發(fā)明內容
在對消除法勻相直接測定LDLC的方法進行多年研究以及反復實驗后，在以下幾方面有了重大突破1、試劑中特殊的表面活性劑品種與分子量大小的選擇非常重要，優(yōu)選后的表面活性劑對在第一步酶反應中消除非LDL-C，保護LDL-C起到關鍵的作用，是本發(fā)明測定方法的技術關鍵。2、試劑中進行膽固醇水解反應的酶的來源、試劑中的濃度與相對比例的選擇，是勻相直接準確測定樣品LDL-C濃度的另一個關鍵因素。3、本法包含兩次測定脂蛋白膽固醇的反應，雖然所采用的方法都是相同的膽固醇氧化酶的方法原理，但在第一步反應中分使膽固醇分解后不進行呈色反應，而第二步LDL 膽固醇的反應時，使膽固醇分解后進行呈色反應，最后可以通過比色測定。因此顯色劑的選擇、顯色劑濃度的選擇、和反應路徑的設計對試劑與方法學而言是十分重要的。4、本試劑中的穩(wěn)定劑并不特指某一個，其實有一種或多種試劑成分發(fā)揮了穩(wěn)定劑的作用，對保持試劑的長期穩(wěn)定，和抵抗多種明確的和不明確的干擾因素的影響發(fā)揮重要的作用。
本發(fā)明的目的之一是，提供一種以消除法原理代替沉淀法分離LDL，并可在勻相體系中直接自動分析測定樣品中LDL-C含量的試劑，所述試劑由分別放置的試劑1和試劑2 組成，其中，所述試劑1中含有膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、4-氨基安替比林、過氧化氫酶、 特殊的表面活性劑、緩沖劑、和穩(wěn)定劑等；所述試劑2中含有過氧化物酶、顯色劑、另一種表面活性劑、以及穩(wěn)定劑和緩沖劑。本發(fā)明的另一個目的是，提供一種直接定量測定血清樣品中LDL-C含量的試劑盒，其中裝有分別放置的前述試劑1和試劑2。本發(fā)明的再一個目的是提供一種在勻相體系中直接定量測定血清樣品中LDL-C 含量的方法。具體而言，本發(fā)明用于勻相中直接定量測定血清樣品中LDL-C含量的試劑盒由分別放置的試劑1和試劑2組成。其中，所述試劑1中含有膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、4-氨基安替比林、過氧化氫酶、特殊的表面活性劑、緩沖劑、和穩(wěn)定劑等。所述試劑1的作用在于提供特殊的表面活性劑，保護LDL-C不被反應體系中的酶水解，但其他脂蛋白所含的膽固醇被酶水解。由于試劑1中僅含一種顯色劑成分，并且有穩(wěn)定劑的保護，所以試劑1在單獨放置時是穩(wěn)定的；且在樣品測定時由試劑1提供反應所需的全部成分，但不合在反應時發(fā)生完全的呈色反應。如本文中使用的，術語“高純度”是指產品的純度大于95%。所述的特殊的表面活性劑選自苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚、硫酸葡聚糖等其中的一種或多種。特殊的表面活性劑在試劑溶液中的濃度可以根據使非LDL脂蛋白膽固醇完全分解的需求而定，其優(yōu)選的濃度范圍為500mg/L 10000mg/L，更為優(yōu)選的濃度范圍為 2000mg/L 5000mg/L。所述的使非LDL脂蛋白膽固醇完全分解的酶試劑包括膽固醇酯酶(CE)、膽固醇氧化酶(COD)和過氧化氫酶(Catalase)，其具體實例中，膽固醇酯酶(CE)選自由假單胞菌提取的高純度制品，在試劑中的濃度范圍為500U/L 15000U/L;膽固醇氧化酶(COD)選自由基因工程重組產品提取的高純度制品，在試劑中的濃度范圍為500U/L 15000U/L ；過氧化氫酶(Catalase)選自由曲霉菌提取的高純度制品，在試劑中的濃度范圍為1000U/L 30000U/L。所述的試劑1的具體實例中含有顯色劑成分之一的4-氨基安替比林G-AAP)，其作用并不在第一反應次酶反應中發(fā)揮，而是留待在第二次酶反應中參與呈色反應。在具體實例中4-AAP的優(yōu)選濃度范圍為50mg/L 500mg/L。其中，本發(fā)明所述試劑2中含有含有過氧化物酶、顯色劑、另一種表面活性劑、以及穩(wěn)定劑和緩沖劑。所述試劑2的作用在于提供解除對LDL保護的另一種表面活性劑，使LDL-C在反應體系中仍存在的膽固醇酶法試劑的作用下可被分解。所述試劑2的另一作用在于提供的過氧化物酶(POD)與顯色劑，使LDL膽固醇分解后產物與兩種同時存在的顯色劑反應，生成有色化合物，以供比色測定。所述的試劑2中含有的表面活性劑選自脂肪酸鹽系列、磺酸鹽系列的一種或多種，其具體實例可以選擇十二烷基磺酸鈉。在試劑溶液中的優(yōu)選濃度范圍為500mg/L 50000mg/L，更為優(yōu)選的濃度范圍為15000mg/L 25000mg/L。所述試劑2含有的過氧化物酶(POD)選自由辣根提取的高穩(wěn)定性制品，其具體實例中，在試劑中的優(yōu)選濃度范圍為200U/L 50000U/L，更為優(yōu)選的濃度范圍為1000U/L 5000U/L。所述的試劑2含有的顯色劑選自酚類化合物及其衍生物如苯酚、4-氯苯酚、N-乙基-N- (-2羥基-3-磺丙基)-間甲苯胺鈉鹽(TOOS)或者N-乙基-N- (-2羥基-3-磺丙基)-3，5_ 二甲氧基苯胺鈉鹽(HDAOS)等中的一種或多種，其具體實例中，選擇N-乙基-N-(-2羥基-3-磺丙基)_間甲苯胺鈉鹽(TOOS)或者N-乙基-N-(-2羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺鈉鹽(HDAOS)，呈色后有的靈敏度和較好的穩(wěn)定性。顯色劑在試劑溶液中的優(yōu)選濃度范圍為0. 5g/L 10. Og/L，更為優(yōu)選的濃度范圍為1. Og/L 3. Og/L。所述的試劑2還含有維持反應環(huán)境pH穩(wěn)定的緩沖劑，選自GOODS緩沖液、MOPS緩沖液、磷酸鹽緩沖液中的一種或多種。其具體實例中，選擇MOPS緩沖液的優(yōu)選濃度范圍為 0. 5mmol/L 200mmol/L，更為優(yōu)選的濃度范圍為30mmol/L 100mmol/L ；緩沖液的pH優(yōu)選范圍為5.0 8. 7。所述的試劑2含有的穩(wěn)定劑選自四乙基乙二醇二鈉鹽(EDTA)，其在試劑溶液中的優(yōu)選濃度范圍為0. lg/L 10g/L。本發(fā)明所述以酶學方法在勻相體系中直接定量測定人血清樣品中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量的試劑盒是將分別放置的上述試劑1和試劑2以不同的規(guī)格(ml)裝入試劑盒包裝中。該試劑盒具有多種不同的規(guī)格，可以分別適用于目前在臨床實驗室普遍使用的各種國內外品牌的自動生化分析儀器。本發(fā)明所述以酶學方法在勻相體系中直接定量測定人血清樣品中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量的方法包括 規(guī)定血清樣品與試劑1和試劑2的容積比例，其比例為樣品試劑1 試劑2 =3 210 70。 測定操作的步驟為在反應容器中(一般為分析儀器的比色皿)先加入待測血清樣品，再加入試劑1，混勻后在37°C的恒溫環(huán)境中定時保溫5分鐘，使非LDL膽固醇在第一反應中分解，并在加入試劑2之前測定一定波長下的吸光度Al ；然后再加入試劑2起動第二次酶的反應，繼續(xù)保溫，在反應到達終點后，在上述相同的的波長處測定吸光度A2。用同樣的方法測定校準液的吸光度Al與A2，血清樣品中的LDL-C含量可通過下述的計算式得到LDL-C (mmol/L) = ( Δ A 測定 / Δ A 校準)X Cs (校準液 LDL-C 濃度)其中ΔΑ測定=樣品測定的(Α2-Α1)，ΔΑ校準=校準品測定的(Α2-Α1)本發(fā)明的LDL-C測定方法只需3 10微升(μ )血清樣品，總的反應體積也僅有 300 μ 1左右，檢測的靈敏度以測定LDL-C的最低檢測限(LLD)表示，至少可達0. lmmol/L, 所以是一種高效率、高靈敏度、低成本、快速微量的直接自動測定方法。附圖簡述
圖1示出在實施例2中本發(fā)明試劑與對照試劑對LDL-C的測定結果。
具體實施方式
下面的實施例是對本專利申請的具體描述，但是，本專利申請不限于這些實施例， 這些實施例也不能解釋為對本專利申請的限制。實施例1 一、按照下述成分和比例配制下述本發(fā)明試劑1及試劑2 試劑1
膽固醇酯酶1000 U/L
膽固醇氧化酶1000 U/L
過氧化氫酶30000 U/L
MOPS 緩沖液 pH7.035 mmol/L
NaOH0.5 g/L
硫酸葡聚糖2.0 g/L
疊氮化鈉0.5 g/L
氯化鎂2.0 g/L
4-氨基安替吡啉0.12 g/L
CHAPS4.0 g/L
BSA1.5 g/L
曲拉通 X-IOO1500 mg/L試劑2
過氧化物酶3000 U/L
MOPS 緩沖液 pH7.035mmol/L
NaOH0.5 g/L
EDTA0.2 g/L
BSA1.5 g/L
疊氮化鈉0.5 g/L
TOOS1.8 g/L
曲拉通 X-IOO1500 mg/L
十二烷基橫酸鈉2000 mg/Lニ、測定使用HITACHI 7100型自動生化分析儀，設置分析參數具體為分析方 法終點法；測定點=16,34 ；檢測波長:570nm(主)/700nm(副)；反應溫度:37°C ；樣品量 3.0ul ；試劑Rl 210 u 1 ；試劑R2 :70 u 1 ；反應方向上升；校準模式線性模式，2點校準； 単位mmol/L。儀器自動執(zhí)行以下操作過程在比色皿中先加入待測血清樣品3 iU，再加入試劑1 210 μ 1，混勻后在37°C的恒溫環(huán)境中定時保溫5分鐘，讀取吸光度Al ；然后再加入試劑2起動第二次酶的反應，繼續(xù)保溫，在反應到達終點時，讀取吸光度A2。儀器自動根據計算公式LDL-C (mmol/L) = ( Δ A 測定 / Δ A 校準)X Cs (校準液 LDL-C 濃度)其中ΔΑ測定=樣品測定的(Α2-Α1)，ΔΑ校準=校準品測定的(Α2-Α1)自動報告樣品LDL-C的測定結果。對高、中、低三個LDL-C含量水平的血清樣品進行測定，每份樣品各以上述標準操作方法重復測定20次，按正規(guī)的統計學要求，求取每份樣品測定結果的平均值和標準差， 然后按公式變異系數(CV% )=標準差/平均值X 100%計算變異系數CV%，結果列于下表1中。表1低濃度LDL-C測定的結果
權利要求
1.一種定量測定血清樣品中低密度脂蛋白膽固醇含量的試劑，其適用于自動生化分析儀器進行自動定量測定低密度脂蛋白膽固醇，該試劑由分別放置的溶液型試劑1和試劑2 兩部分組成，其中，所述試劑1中含有膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、4-氨基安替比林、過氧化氫酶、表面活性齊IJ、緩沖劑、和穩(wěn)定劑；以及所述試劑2中含有過氧化物酶、顯色劑、與試劑1中的表面活性劑不同的表面活性劑、 穩(wěn)定劑、和緩沖劑。
2.根據權利要求1所述的試劑，其特征在于，在所述試劑1中，所述的膽固醇酯酶選自由假單胞菌或牛胰腺提取的高純度制品；所述的膽固醇氧化酶選自由諾卡氏菌、紅曲霉菌、 假單胞菌、鏈霉菌、或基因工程重組產品提取的高純度制品；所述的4-氨基安替比林選自高純度制品；所述的過氧化氫酶選自由曲霉菌或牛肝細胞提取的高純度制品。
3.根據權利要求1所述的試劑，其特征在于，在所述試劑1中，所述的表面活性劑選自苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚和硫酸葡聚糖中的一種或多種；所述的緩沖劑選自GOODS緩沖液、MOPS緩沖液、磷酸鹽緩沖液中的一種或多種；所述的穩(wěn)定劑選自曲拉通X系列和吐溫系列的一種或多種。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的試劑，其特征在于，在所述試劑1中，所述的膽固醇酯酶在試劑溶液中的濃度范圍為100U/L 20000U/L;所述的膽固醇氧化酶在試劑溶液中的濃度范圍為500U/L 30000U/L ；所述的過氧化氫酶在試劑溶液中的濃度范圍為200U/L 50000U/L ；所述的表面活性劑在試劑溶液中的的濃度范圍為500mg/L 10000mg/L ；緩沖液的濃度范圍為0. 5mmol/L 150mmol/L ；緩沖液的pH范圍為5. 0 8. 7 ； 所述的穩(wěn)定劑在試劑溶液中的濃度范圍為500mg/L 50000mg/L ；所述的4-氨基安替比林在試劑溶液中的濃度范圍為0. 05g/L 2. Og/L。
5.根據權利要求1所述的試劑，其特征在于，在所述試劑2中，所述的過氧化物酶選自由辣根提取的高穩(wěn)定性制品，并且所述的過氧化物酶在試劑溶液中的濃度范圍為200U/ L 50000U/L。
6.根據權利要求1所述的試劑，其特征在于，在所述試劑2中，所述的顯色劑選自苯酚、 4-氯苯酚、N-乙基-N- (-2羥基-3-磺丙基)-間甲苯胺鈉鹽和N-乙基-N- (-2羥基-3-磺丙基)-3，5- 二甲氧基苯胺鈉鹽中的一種或多種，并且所述的顯色劑在試劑溶液中的濃度范圍為 0. 5g/L 10. 0g/L。
7.根據權利要求1所述的試劑，其特征在于，在所述試劑2中，所述的表面活性劑選自脂肪酸鹽系列、磺酸鹽中的一種或多種，并且所述的表面活性劑在試劑溶液中的優(yōu)選濃度范圍為 500mg/L 50000mg/L。
8.根據權利要求1所述的試劑，其特征在于，在所述試劑2中，所述的緩沖劑選自 GOODS緩沖液、MOPS緩沖液、磷酸鹽緩沖液中的一種或多種，并且緩沖液的濃度范圍為 0. 5mmol/L 200mmol/L ；緩沖液的pH優(yōu)選范圍為5. 0 8. 7。
9.根據權利要求1所述的試劑，其特征在于，在所述試劑2中，所述的穩(wěn)定劑為四乙基乙二醇二鈉鹽，其在試劑溶液中的濃度范圍為0. lg/L 10g/L。
10.一種定量測定血清樣品中低密度脂蛋白膽固醇含量的試劑盒，其特征在于其中裝有權利要求1至9中任一項所述的定量測定血清樣品中低密度脂蛋白膽固醇含量的試劑，該試劑由分別放置的試劑1和試劑2組成。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以酶學方法在勻相體系中直接定量測定人血清中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量的試劑，適用于自動生化分析儀器進行自動定量測定低密度脂蛋白膽固醇。該試劑由分別放置的溶液型試劑1和試劑2兩部分組成，其中，試劑1中含有膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、4-氨基安替比林、過氧化氫酶、表面活性劑、緩沖劑、和穩(wěn)定劑；試劑2中含有過氧化物酶、顯色劑、另一種表面活性劑、以及穩(wěn)定劑和緩沖劑。本發(fā)明還提供了一種無需對血清樣品預處理而在勻相體系中直接測定低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量的方法，本發(fā)明還提供了一種適合臨床實驗室具體使用本發(fā)明方法的裝有本發(fā)明試劑1和試劑2的試劑盒。
文檔編號G01N33/52GK102539731SQ20121000509
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權日2012年1月9日
發(fā)明者宋高峰, 李清華 申請人:寧波天康生物科技有限公司