專利名稱：一種甲狀腺過氧化物酶抗體磁分離酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)分析領(lǐng)域，具體涉及到一種人甲狀腺過氧化物酶抗體磁分離酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
大家知道，甲狀腺自身免疫性疾病患者血清中通常含有甲狀腺微粒體抗原，這種抗原自發(fā)現(xiàn)20多年來，其生物學(xué)基本性質(zhì)一直沒有研究清楚。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多研究證實(shí)甲狀腺微粒體抗原的主要成分是甲狀腺過氧化物酶(NAOKATA YOKOYAMA等，Journal of clinical Endocrinology andMetabolism)。甲狀腺過氧化物酶是一種膜整合蛋白，定位于濾泡細(xì)胞的頂端膜上，該酶以血紅素為輔基，分子量約為101KD。甲狀腺自身免疫疾病的傳統(tǒng)檢測(cè)通常以甲狀腺微粒體抗體為主，以放射免疫和酶聯(lián)免疫吸附方法為主。隨著甲狀腺過氧化物酶的分子生物學(xué)性質(zhì)和與甲狀腺微粒體抗原關(guān)系的深入研究，陸續(xù)出現(xiàn)了甲狀腺過氧化物酶抗體的免疫學(xué)檢測(cè)方法，大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，但是依然以定性或半定量檢測(cè)為主。
免疫磁性微球是表面攜帶有活化功能基團(tuán)的直徑在0.1-10μm范圍的高分子包被磁性顆粒。磁性顆粒具有超順磁性，在磁場(chǎng)下具磁場(chǎng)響應(yīng)性，將免疫磁性微球用于免疫檢測(cè)的固相，將大大提高反應(yīng)的表面積，更容易進(jìn)行固液分離，使檢測(cè)的靈敏度得到很大的提高。
從小牛腸粘膜提取的堿性磷酸酶分子量約140KD，以堿性磷酸酶作為示蹤酶的免疫檢測(cè)方法，其靈敏度高于酶聯(lián)免疫吸附分析檢測(cè)中常用的辣根過氧化物酶，空白值(本底)也較低(吳建民，臨床化學(xué)自動(dòng)化免疫分析，科學(xué)出版社)。堿性磷酸酶常用的底物有對(duì)硝基苯磷酸鹽(PNP)，4-甲基傘形酮磷酸鹽(4-MUP)等，也可以使用單磷酸酚酞(PPM)作為底物，加入堿性終止液后顯色。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有較高穩(wěn)定性，靈敏度和準(zhǔn)確性的人甲狀腺過氧化物酶抗體磁分離酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析方法。利用該方法，使用重組人甲狀腺過氧化物酶抗原偶聯(lián)磁性微珠為固相，山羊抗人免疫球蛋白G抗體連接堿性磷酸酶為二抗酶標(biāo)試劑，單磷酸酚酞溶液為底物溶液，采用免疫學(xué)原理，就可以進(jìn)行血清中人甲狀腺過氧化物酶抗體的定量測(cè)定，其操作步驟如下1、加樣與免疫反應(yīng)在平底試管中加入10-30μl血清樣本(預(yù)先用樣本稀釋緩沖液進(jìn)行1∶50-100稀釋)，標(biāo)準(zhǔn)品，或質(zhì)量控制血清，加入60-120μl 8-14mg/ml固相磁分離試劑(表面偶聯(lián)重組人甲狀腺過氧化物酶抗原)，混勻后，37℃溫育15-60分鐘。
2、洗滌將平底試管放在磁分離器上分離2分鐘，然后用圓周運(yùn)動(dòng)倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，拍擊分離器以除去掛壁液體。每管中加入清洗液100-500μl，充分混勻后，將平底試管放在磁分離器上分離2分鐘，然后用圓周運(yùn)動(dòng)倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，拍擊分離器以除去掛壁液體。重復(fù)兩次。
3、加入二抗酶標(biāo)試劑在每一試管中加入堿性磷酸酶(EC3.1.3.1)連接的山羊抗人免疫球蛋白G抗體工作液30-120μl，混勻后，37℃溫育15分鐘。
4、洗滌同(2)步驟。
5、加入單磷酸酚酞底物溶液每管加入90-120μl單磷酸酚酞底物溶液，混勻后，37℃溫育15-60分鐘。
6、終止顯色每管加入300-500μl堿性終止液，并放在磁分離器上分離5分鐘以上。
7、讀取吸光值在分光光度計(jì)上或使用磁酶免測(cè)定儀I(北京倍愛康生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn))上讀取吸光值，波長(zhǎng)為492nm/550nm。
在上述步驟中，標(biāo)準(zhǔn)品的配制為2g氯化鈉，2.42三羥基氨基甲烷，5g牛血清白蛋白，0.5ml普勞可林300用1000ml純化水溶解，用鹽酸調(diào)pH至7.6，0.2μm過濾器過濾，于4℃保存，作為標(biāo)準(zhǔn)品的緩沖液。參照WHO 1STIRP 66/387標(biāo)準(zhǔn))濃度配制標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品范圍為0-1000IU/ml)，于4℃保存，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在上述步驟中，固相磁分離試劑的制備為將直徑范圍0.1-10μm的磁性微球用戊二醛進(jìn)行活化，室溫混勻4小時(shí)后，用0.01mol/l PBS pH7.4緩沖液清洗三次，并用該溶液進(jìn)行懸浮，濃度為50-100mg/ml；然后，每毫升懸液中加入重組人甲狀腺過氧化物酶抗原20-100μg，于37℃混勻溫育3-8小時(shí)；用等體積的0.01mol/l PBS 5％BSA pH7.4緩沖液于37℃封閉30-90分鐘；最后，用0.5％BSA0.02mol/l Tris-HCl pH8.0緩沖液清洗三次，并用該溶液配制成8-14mg/ml的工作液。
在上述步驟中，二抗酶標(biāo)試劑的制備為(1)將山羊抗人免疫球蛋白G抗體溶于0.01mol/l PBS pH7.4溶液中，濃度5-10mg/ml；加入20mmol/l活化劑N-琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二巰基)丙酸[SPDP]二甲亞砜溶液20-30μl，室溫放置30-60分鐘；通過Sephadex G25柱子除去活化劑，收集蛋白峰；每毫升活化的抗體溶液中加入500μl 24mg/ml二硫蘇糖醇(DTT)0.01mol/l PBS pH7.4溶液，混勻后，室溫放置30分鐘；通過Sephadex G25柱子除去游離的二硫蘇糖醇，收集蛋白峰。
(2)將堿性磷酸酶溶于2mmol/l EDTA 20mmol/l Tris-HCl pH8.0溶液中，濃度5mg/ml；加入0.10mg/ml Traunt試劑(巰基活化試劑)室溫放置1小時(shí)；通過Sephadex G25柱子除去游離的活化劑，收集蛋白峰。
(3)將(1)和(2)溶液按照抗體與堿性磷酸酶分子摩爾比1∶1混合，室溫放置4小時(shí)，然后使用Superdex200凝膠層析柱分離純化，收集第一和第二峰，除去未連接的游離抗體和堿性磷酸酶，將連接物保存于4℃。
(4)用1mmol/1MgCl2 20mmol/l Tris-HCl pH8.0溶液將連接物配制成0.5-2μg/ml工作液，使用0.2μm過濾器過濾。
在上述步驟中，清洗液的配制組成氯化鈉(NaCl)2g，磷酸二氫鈉(NaH2PO4.12H2O)2.9g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.2g，氯化鉀(KCl)0.2g，曲拉通X-100 0.5ml，吐溫20 0.2ml，布蘭尼道克斯(Bronidox-L)5g，用純化水配成1000ml，用0.2μm過濾器過濾，于室溫保存。
在上述步驟中，底物溶液的配制組成乙醇胺100g，氯化鈉(NaCl)2g，單磷酸酚酞4g，用純化水配成1000ml，用37％鹽酸調(diào)pH至8.4，用0.2μm過濾器過濾，于4℃保存。
在上述步驟中，終止液的配制組成氯化鈉(NaCl)1g，碳酸鈉(Na2CO3)15g，EDTA-Na2 10g，用純化水配成1000ml，用0.2μm過濾器過濾，于室溫保存。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于利用了重組人甲狀腺過氧化物酶抗原包被免疫磁性微珠作為固相，并采用了堿性磷酸酶作為標(biāo)記酶，大大提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。對(duì)甲狀腺疾病患者和正常人血清進(jìn)行甲狀腺過氧化物酶抗體的定量測(cè)定，結(jié)合其他臨床癥狀(如甲狀腺球蛋白抗體)就可以判斷檢查者是否患有自身免疫性甲狀腺疾病。
具體實(shí)施例方式
材料與儀器1、標(biāo)準(zhǔn)品0，10，40，100，250，500IU/ml(參照WHO 1STIRP 66/387標(biāo)準(zhǔn))各1ml。
2、磁分離試劑(10mg/ml)20ml。
3、二抗酶標(biāo)試劑(1μg/ml)20ml。
4、洗滌液100ml；5、底物溶液100ml。
6、終止溶液200ml。
7、樣本稀釋液100ml。
8、甲狀腺自身免疫疾病患者血清100份，正常人血清100份。
9、磁分離酶聯(lián)免疫測(cè)定儀I型機(jī)(北京倍愛康生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn))。
10、水浴箱(用于37℃溫浴)。
試劑制備上述溶液1-6的配制參照本發(fā)明方法中所描述的配制過程進(jìn)行。
稀釋液的配制如下使用小牛血清加入0.2％的疊氮鈉，用0.45μm過濾器過濾操作步驟
首先，將血清樣本用樣本稀釋液進(jìn)行1∶100的稀釋。然后，按照下面的操作步驟進(jìn)行。
1、加樣與免疫反應(yīng)在平底試管中加入15μl血清樣本，標(biāo)準(zhǔn)品，或質(zhì)量控制血清，加入60μl 10mg/ml磁分離試劑(表面偶聯(lián)重組人甲狀腺過氧化物酶抗原)，混勻后，37℃溫育30分鐘。
2、洗滌將平底試管放在磁分離器上分離2分鐘，然后用一大而緩慢的圓周運(yùn)動(dòng)倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，拍擊分離器以除去掛壁液體。每管中加入清洗液150μl，充分混勻后，將平底試管放在磁分離器上分離2分鐘，然后用一大而緩慢的圓周運(yùn)動(dòng)倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，拍擊分離器以除去掛壁液體。重復(fù)兩次。
3、加入二抗酶標(biāo)試劑在每一試管中加入堿性磷酸酶(EC3.1.3.1)連接的山羊抗人免疫球蛋白G抗體工作液30μl，混勻后，37℃溫育15分鐘。
4、洗滌同(2)步驟。
5、加入單磷酸酚酞底物溶液每管加入100μl單磷酸酚酞底物溶液，混勻后，37℃溫育15分鐘。
6、終止顯色每管加入300μl堿性終止液，并放在磁分離器上分離10分鐘。
7、讀取吸光值使用磁酶免測(cè)定儀I(北京倍愛康生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn))上讀取吸光值，波長(zhǎng)為492nm/550nm，根據(jù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)試樣本的濃度。
檢測(cè)結(jié)果

對(duì)零標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行20次重復(fù)測(cè)試，取零標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)測(cè)定的平均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差，即為其靈敏度。本方法的靈敏度為＜5IU/ml.
對(duì)7個(gè)不同濃度的病人血清使用兩批試劑分別進(jìn)行20次重復(fù)測(cè)試，病人血清的濃度范圍為5-1000IU/ml，計(jì)算其批內(nèi)變異。結(jié)果批內(nèi)變異(CV)平均為4.5％。
對(duì)7個(gè)不同濃度的病人血清使用兩批試劑和不同的操作人員分別進(jìn)行20次重復(fù)測(cè)試，病人血清的濃度范圍為5-1000IU/ml，計(jì)算其批間變異。結(jié)果批間變異(CV)平均為8.9％。
對(duì)5份病人樣本進(jìn)行倍比稀釋，稀釋倍數(shù)從1∶2至1∶32，按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)試，計(jì)算其稀釋回收率。結(jié)果如下


對(duì)5份病人樣本進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每份樣本按照50∶1加入高濃度標(biāo)準(zhǔn)品，按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)試，計(jì)算其添加回收率。結(jié)果如下

權(quán)利要求
1.一種人甲狀腺過氧化物酶抗體磁分離酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于檢測(cè)步驟為a、加樣與免疫反應(yīng)在平底試管中加入10-30μl血清樣本標(biāo)準(zhǔn)品或質(zhì)量控制血清，加入60-120μl 8-14mg/ml固相磁分離試劑，混勻后，37℃溫育15-60分鐘；b、洗滌將平底試管放在磁分離器上分離2分鐘，然后用圓周運(yùn)動(dòng)倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，拍擊分離器以除去掛壁液體，每管中加入清洗液100-500μl，充分混勻后，將平底試管放在磁分離器上分離2分鐘，然后用圓周運(yùn)動(dòng)倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，拍擊分離器以除去掛壁液體；重復(fù)兩次；c、加入二抗酶標(biāo)試劑在每一試管中加入堿性磷酸酶EC3.1.3.1連接的山羊抗人免疫球蛋白G抗體工作液30-120μl，混勻后，37℃溫育15分鐘；d、洗滌同b步驟；e、加入單磷酸酚酞底物溶液每管加入90-120μl單磷酸酚酞底物溶液，混勻后，37℃溫育15-60分鐘；f、終止顯色每管加入300-500μl堿性終止液，并放在磁分離器上分離5分鐘以上；g、讀取吸光值在分光光度計(jì)上或使用磁酶免測(cè)定儀I上讀取吸光值，波長(zhǎng)為492nm/550nm。
2.按照權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)品的配制為2g氯化鈉，2.42三羥基氨基甲烷，5g牛血清白蛋白，0.5ml普勞可林300用1000ml純化水溶解，用鹽酸調(diào)pH至7.6，0.2μm過濾器過濾，于4℃保存，作為標(biāo)準(zhǔn)品的緩沖液；參照WHO lSTIRP 66/387標(biāo)準(zhǔn)濃度配制標(biāo)準(zhǔn)品，其標(biāo)準(zhǔn)品范圍為0-1000IU/ml，于4℃保存，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述的固相磁分離試劑的制備為將直徑范圍0.1-10μm的磁性微球用戊二醛進(jìn)行活化，室溫混勻4小時(shí)后，用0.01mol/l PBS pH7.4緩沖液清洗三次，并用該溶液進(jìn)行懸浮，濃度為50-100mg/ml；然后，每毫升懸液中加入重組人甲狀腺過氧化物酶抗原20-100μg，于37℃混勻溫育3-8小時(shí)；用等體積的0.01mol/l PBS 5％BSA pH7.4緩沖液于37℃封閉30-90分鐘；最后，用0.5％BSA 0.02mol/l Tris-HCl pH8.0緩沖液清洗三次，并用該溶液配制成8-14mg/ml的工作液。
4.按照權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于上述二抗酶標(biāo)試劑的制備為a、將山羊抗人免疫球蛋白G抗體溶于0.01mol/l PBS pH7.4溶液中，濃度5-10mg/ml；加入20mmol/l活化劑N-琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二巰基)丙酸[SPDP]二甲亞砜溶液20-30μl，室溫放置30-60分鐘；通過Sephadex G25柱子除去活化劑，收集蛋白峰；每毫升活化的抗體溶液中加入500μl 24mg/ml二硫蘇糖醇(DTT)0.01mol/l PBS pH7.4溶液，混勻后，室溫放置30分鐘；通過Sephadex G25柱子除去游離的二硫蘇糖醇，收集蛋白峰；b、將堿性磷酸酶溶于2mmol/l EDTA 20 mmol/l Tris-HCl pH8.0溶液中，濃度5mg/ml；加入0.10mg/ml Traunt試劑(巰基活化試劑)室溫放置1小時(shí)；通過Sephadex G25柱子除去游離的活化劑，收集蛋白峰；c、將a和b溶液按照抗體與堿性磷酸酶分子摩爾比1∶1混合，室溫放置4小時(shí)，然后使用Superdex200凝膠層析柱分離純化，收集第一和第二峰，除去未連接的游離抗體和堿性磷酸酶，將連接物保存于4℃；d、用1mmol/lMgCl2 20mmol/l Tris-HCl pH8.0溶液將連接物配制成0.5-2μg/ml工作液，使用0.2μm過濾器過濾。
5.按照權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所清洗液的配制組成氯化鈉2g，磷酸二氫鈉2.9g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鉀0.2g，曲拉通X-1000.5ml，吐溫20 0.2ml，布蘭尼道克斯5g，用純化水配成1000ml，用0.2μm過濾器過濾，于室溫保存。
6.按照權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所步底物溶液的配制組成乙醇胺100g，氯化鈉2g，單磷酸酚酞4g，用純化水配成1000ml，用37％鹽酸調(diào)pH至8.4，用0.2μm過濾器過濾，于4℃保存。
7.按照權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述終止液的配制組成氯化鈉1g，碳酸鈉15g，EDTA-Na2 10g，用純化水配成1000ml，用0.2μm過濾器過濾，于室溫保存。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人甲狀腺過氧化物酶抗體磁分離酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其檢測(cè)步驟為加樣與免疫反應(yīng)，洗滌，加入二抗酶標(biāo)試劑，再洗滌，加入單磷酸酚酞底物溶液，終止顯色，讀取吸光值。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于利用了重組人甲狀腺過氧化物酶抗原包被免疫磁性微珠作為固相，并采用了堿性磷酸酶作為標(biāo)記酶，大大提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。對(duì)甲狀腺疾病患者和正常人血清進(jìn)行甲狀腺過氧化物酶抗體的定量測(cè)定，結(jié)合其他臨床癥狀就可以判斷檢查者是否患有自身免疫性甲狀腺疾病。
文檔編號(hào)G01N33/551GK1595161SQ20041000923
公開日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2004年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月22日
發(fā)明者劉振世, 周昊, 陳海生, 張玉慶, 楊祥良 申請(qǐng)人:北京倍愛康生物技術(shù)股份有限公司