專利名稱：一種海水鲆鰈魚類受精卵的組織切片方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及顯微組織切片技術(shù)，具體的說是一種適用于海水鲆鰈魚類受精卵的一套胚胎定位包埋連續(xù)切片方法。
背景技術(shù)：
在已有的針對魚卵的切片報道中，所用材料均為淡水魚卵，例如草魚和鯽魚，而海水魚類魚卵的組織切片尚未見到報道。對淡水魚卵是將其用Bouin’s固定液或者Smith固定液固定后去膜，按普通生物組織切片方法進行乙醇梯度脫水，經(jīng)二甲苯透明處理后，做石蠟包埋切片。
但是利用這種方法進行海水鲆鰈類魚卵的組織切片卻很容易切碎，不能得到完整切片。其主要的原因在于鲆鰈類魚卵與其他大多數(shù)淡水魚卵有所不同，它們與大多數(shù)海水魚卵一樣為透明的浮性卵，卵黃十分豐富，外周有韌性較強的卵膜，經(jīng)過固定處理后的卵與大多數(shù)淡水魚卵相比其卵周隙狹小幾乎不可見，很難完整去膜，所以應用去膜再處理的方法在海水鲆鰈類魚卵切片實驗中不具有可行性。

發(fā)明內(nèi)容
針對普通生物和淡水魚類受精卵組織切片方法不能應用于海水鲆鰈魚類卵切片的不足之處，本發(fā)明經(jīng)過一系列的實驗包括方法的篩選和條件的優(yōu)化以及重復實驗，建立了一整套的適用于海水鲆鰈魚類卵切片的材料固定、處理和組織切片方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是1)材料固定魚卵放入50～100倍體積Bouin’s固定液固定，魚卵經(jīng)Bouin’s固定液固定6～12小時后，用70％乙醇反復沖洗，并更換數(shù)次，以洗去固定液，在70％乙醇中保存、備用。
2)材料預處理用70％乙醇反復沖洗卵球更換數(shù)次后，用解剖針在魚卵的植物極附近戳破卵膜，注意不能損傷動物極。
3)瓊脂定位包埋將卵置于載玻片上，滴上溫熱瓊脂膠，自然冷卻成瓊脂塊，在解剖鏡下用解剖針調(diào)整好卵的位置，瓊脂濃度1～2％。
4)脫水處理經(jīng)70％、80％、90％、95％、100％梯度酒精脫水處理，每步處理30～60min，95％乙醇中加入伊紅將卵球染成紅色，以方便后期切片時觀察其位置。
5)透明處理用松油醇對瓊脂塊進行透明處理，將瓊脂塊浸沒于松油醇中，處理時間根據(jù)瓊脂塊的大小和透明情況判斷，需要4小時以上，一般在4～12小時，延長時間無不良影響。
6)透蠟處理經(jīng)松油醇與石蠟等體積混液處理4小時以上，一般在4～12小時，方可放入石蠟中，石蠟滲透共四次，每次處理1小時以上，一般在1～4小時。
7)石蠟包埋透蠟完成后即可進行包埋，作成石蠟塊。
8)進行組織切片，將獲得的切片經(jīng)貼片、烤片處理后進行蘇木精伊紅(HE)染色，染色后顯微攝影觀察并拍照。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果在于1.本發(fā)明建立了適宜海水魚類浮性卵固定的方法和條件，針對海水鲆鰈魚類受精卵為多卵黃浮性卵、含有油球、卵膜韌性強以及卵周隙狹小的特點，探索建立了一套適用于海水鲆鰈魚類受精卵的有效的組織切片方法。有報道認為用Bouin’s固定液固定多卵黃魚卵容易造成卵黃的脆硬而導致切片失敗，而應該用Smith固定液固定。但我們的固定處理時間梯度實驗證明，魚卵經(jīng)Bouin’s固定液固定6～12小時，卵黃不會發(fā)生脆硬現(xiàn)象，切片正常，可以避免使用Smith固定液帶來的繁雜的操作步驟。
2.本發(fā)明解決了卵子不能完全脫水的問題。由于卵膜堅韌而致密，使卵子脫水時因滲透壓的作用卵膜發(fā)生嚴重皺縮，導致切片失敗，一般采用剝除卵膜的方法來解決，但鲆鰈類的卵經(jīng)Bouin’s固定液固定后卵周隙狹小無法用解剖針除去卵膜，本發(fā)明則通過用解剖針在卵膜上打孔解決這個難點。
3.本發(fā)明解決了卵的定位問題。用瓊脂對卵進行預先包埋定位已有先例，方法是將凝固的瓊脂燙出小洞放入卵后再用熱瓊脂包埋，本發(fā)明對此加以改進，將卵直接瓊脂包埋，避免了瓊脂分層導致切片失敗。
4.本發(fā)明應用于牙鲆及大菱鲆受精卵的組織切片實驗中，都獲得了完整的組織切片，效果良好重復性高(見附圖1-3)。因此本發(fā)明適用于鲆鰈類魚卵的組織切片。
5、本發(fā)明方法簡單有效，容易掌握，不但適用于海水鲆鰈魚類受精卵組織切片，也適用于同屬浮性卵、多卵黃的其它海水魚類的卵組織切片中，其適用范圍廣泛。


圖1本發(fā)明用于牙鲆受精卵切片實驗中獲得的完整切片。
圖2應用本發(fā)明獲得的牙鲆受精卵胚盤部分的切片。
圖3應用本發(fā)明獲得的牙鲆受精卵將要進行第一次分裂的切片。
具體實施例方式
下面結(jié)合實例詳述本發(fā)明。
本發(fā)明乙醇濃度均為體積百分比濃度，瓊脂濃度1～2％為重量體積比濃度，即每100ml瓊脂水溶液中含1～2克瓊脂。
實施例1牙鲆受精卵組織切片步驟一將不同發(fā)育時期的牙鲆受精卵放入50倍體積的Bouin’s固定液中固定10小時，用70％乙醇洗滌數(shù)次后(洗去固定液)保存。
步驟二將保存的卵用70％乙醇沖洗后，用解剖針在植物極方向戳破卵膜。
步驟三將其置于載玻片上，滴上熱熔瓊脂后在解剖鏡下調(diào)整好卵的位置和方向。
步驟四包埋好的瓊脂塊作為一個組織塊經(jīng)70％、80％、90％、95％、100％乙醇脫水，每組處理時間為30min。95％乙醇中加入少量伊紅至將卵球染成紅色。
步驟五放入松油醇中進行透明處理，處理時間4小時。
步驟六放入松油醇和熱熔石蠟等混液中處理，處理時間4小時。
步驟七再將組織塊依次放入杯號為I、II、III、IV的熱熔石蠟中進行透蠟處理，每次處理時間1小時。
步驟八進行石蠟包埋，做成石蠟塊。
步驟九進行組織切片，將獲得的切片經(jīng)貼片、烤片處理后進行蘇木精伊紅染色，染色后顯微攝影觀察并拍照。
實施例2大菱鲆受精卵組織切片步驟一將不同發(fā)育時期的大菱鲆受精卵放于50倍體積的Bouin’s固定液中固定12小時，用70％乙醇洗滌數(shù)次后(洗去固定液)保存。
步驟二將保存的卵用70％乙醇沖洗后，用解剖針在植物極方向上戳破卵膜。
步驟三置于載玻片上，滴上熱熔瓊脂后在解剖鏡下調(diào)整好卵的位置和方向。
步驟四包埋好的瓊脂塊作為一個組織塊經(jīng)70％、80％、90％、95％、100％乙醇脫水，每組處理時間為1小時。95％乙醇中加入少量伊紅至將卵球染成紅色。
步驟五脫水后的瓊脂塊放入松油醇中進行透明處理，處理時間6小時。
步驟六放入松油醇和熱熔石蠟等混液中處理，處理時間6小時。
步驟七再將組織塊依次放入杯號為I、II、III、IV的熱熔石蠟中進行透蠟處理，每次處理時間2小時。
步驟八將處理好的組織塊進行石蠟包埋，作成石蠟塊。
步驟九進行組織切片，將獲得的切片經(jīng)貼片、烤片處理后進行蘇木精伊紅染色，染色后顯微攝影觀察并拍照。
實施例3牙鲆受精卵組織切片步驟一將不同發(fā)育時期的牙鲆受精卵放于100倍體積的Bouin’s固定液中固定6小時，用70％乙醇洗滌數(shù)次后(洗去固定液)保存。
步驟二將保存的卵用70％乙醇沖洗后，用解剖針在植物極方向上戳破卵膜。
步驟三置于載玻片上，滴上熱熔瓊脂后在解剖鏡下調(diào)整好卵的位置和方向。
步驟四包埋好的瓊脂塊作為一個組織塊經(jīng)70％、80％、90％、95％、100％乙醇脫水，每組處理時間為45min。95％乙醇中加入少量伊紅至將卵球染成紅色。
步驟五脫水后的瓊脂塊放入松油醇中進行透明處理，處理時間12小時。
步驟六放入松油醇和熱熔石蠟等混液中處理，處理時間12小時。
步驟七再將組織塊依次放入杯號為I、II、III、IV的熱熔石蠟中進行透蠟處理，每次處理時間4小時。
步驟八將處理好的組織塊進行石蠟包埋，做成石蠟塊。
步驟九進行組織切片，將獲得的切片經(jīng)貼片、烤片處理后進行蘇木精伊紅染色，染色后顯微攝影觀察并拍照。
權(quán)利要求
1.一種海水鲆鰈魚類受精卵的組織切片方法，其步驟如下1)材料固定魚卵經(jīng)Bouin’s固定液固定6～12小時后，用70％乙醇反復沖洗，并更換數(shù)次，以洗去固定液，在70％乙醇中保存、備用；2)材料預處理用70％乙醇沖洗卵球后，用解剖針在魚卵的植物極附近戳破卵膜；3)瓊脂定位包埋將卵置于載玻片上，滴上溫熱瓊脂膠，自然冷卻成瓊脂塊，在解剖鏡下用解剖針調(diào)整好卵的位置，瓊脂濃度1～2％；4)脫水處理經(jīng)70％、80％、90％、95％、100％梯度酒精脫水處理，每步處理30～60min，95％乙醇中加入伊紅將卵球染成紅色，以方便后期切片時觀察其位置；5)透明處理用松油醇對瓊脂塊進行透明處理，將瓊脂塊浸沒于松油醇中，處理時間4小時以上；6)透蠟處理經(jīng)松油醇與石蠟等體積混液處理4小時以上，然后放入石蠟中進行滲透；7)石蠟包埋透蠟完成后即可進行包埋，做成石蠟塊；8)進行組織切片。
2.按照權(quán)利要求1所述海水鲆鰈魚類受精卵的組織切片方法，其特征在于所述步驟1)中，魚卵放入50～100倍體積Bouin’s固定液固定。
3.按照權(quán)利要求1所述海水鲆鰈魚類受精卵的組織切片方法，其特征在于所述步驟5)中，瓊脂塊浸沒于松油醇中，處理時間4～12小時。
4.按照權(quán)利要求1所述海水鲆鰈魚類受精卵的組織切片方法，其特征在于所述步驟6)中，松油醇與石蠟等體積混液處理4～12小時。
5.按照權(quán)利要求1所述海水鲆鰈魚類受精卵的組織切片方法，其特征在于所述步驟6)中，石蠟滲透共四次，每次處理1～4小時。
全文摘要
本發(fā)明是一種適用于海水鲆鰈魚類受精卵的一套胚胎定位包埋連續(xù)切片方法，涉及顯微組織切片技術(shù)。本發(fā)明針對海水鲆鰈魚類受精卵為多卵黃浮性卵、卵膜韌性強以及卵周隙狹小的特點，探索建立了一套針對海水鲆鰈魚類受精卵的有效的組織切片方法。(1)Bouin’s固定液固定多卵黃浮性卵及處理時間的優(yōu)化。(2)用解剖針在植物極方向戳破卵膜解決因卵周隙狹小不能剝離卵膜的難點。(3)采用熱瓊脂直接包埋法定位胚胎。本發(fā)明方法簡單有效，容易掌握，不但適用于海水鲆鰈魚類受精卵組織切片，也適用于同屬浮性卵、多卵黃的其它海水魚類卵的組織切片。
文檔編號G01N1/06GK1749730SQ20041005043
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月17日
發(fā)明者孫威, 尤鋒, 張培軍, 徐永立 申請人:中國科學院海洋研究所