專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)2，4－滴的一次性安培型免疫傳感器及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，特別涉及可快速檢測(cè)2，4-滴的新技術(shù)。這種一次性免疫傳感器可以用于湖泊、水庫(kù)、河流、污水處理廠、農(nóng)藥廠等的污染快速監(jiān)測(cè)，也可以用于蔬菜等食品中2，4-滴農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)。
背景技術(shù)：
40年代以來(lái)，人類(lèi)大量使用合成有機(jī)化學(xué)農(nóng)藥防治農(nóng)田病蟲(chóng)害，2，4-滴是2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-滴ichlorophenoxyacetic Aci滴，中文名稱(chēng)縮寫(xiě)為2，4-滴)是一種世界范圍內(nèi)廣泛使用的除草劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，是全世界年銷(xiāo)售額超過(guò)億元的農(nóng)藥之一，也是20世紀(jì)全球使用最廣泛和對(duì)全球農(nóng)業(yè)影響最大的農(nóng)藥品種的22種農(nóng)藥之一。目前大量研究表明，2，4-滴易于通過(guò)皮膚和呼吸進(jìn)入人體，具有潛在的致癌性(誘發(fā)軟組織惡性腫瘤和何杰金氏淋巴瘤)、致突變性，并影響人類(lèi)的正常生育，對(duì)人類(lèi)健康和生態(tài)環(huán)境造成的危害不容忽視?！吨腥A人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范》的非常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目中將2，4-滴的最大濃度規(guī)定為0.03mg/L。目前，常用的2，4-滴檢測(cè)方法是固-液萃取(Liqui滴-Soli滴Extraction)和氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(GC-MS)，需要復(fù)雜的預(yù)處理和昂貴的設(shè)備，檢測(cè)過(guò)程繁復(fù)(萃取、還原、衍生化和純化)、耗時(shí)長(zhǎng)，限制了常規(guī)監(jiān)測(cè)次數(shù)。
免疫分析技術(shù)也是檢測(cè)2，4-滴的重要分析方法之一。主要是利用放射性同位素、酶等物質(zhì)標(biāo)記2，4-滴，在待測(cè)2，4-滴與標(biāo)記2，4-滴共同競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合2，4-滴抗體后，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記物含量反映待測(cè)水樣中2，4-滴的濃度。近年來(lái)，檢測(cè)環(huán)境有機(jī)污染物的安培型免疫傳感器也越來(lái)越引起人們的重視。這種電化學(xué)器件，與傳統(tǒng)的免疫化學(xué)分析方法相結(jié)合，既有很好的特異性，又有較低的檢測(cè)限。而且與其他技術(shù)相比，這種傳感器對(duì)儀器設(shè)備的要求低，操作簡(jiǎn)單。采用絲網(wǎng)印刷工藝制備的一次性厚膜型電化學(xué)免疫傳感器更進(jìn)一步降低了檢測(cè)的成本，使大規(guī)模地快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)環(huán)境有機(jī)污染物成為可能。
近年來(lái)，相繼采用絲網(wǎng)印刷工藝開(kāi)發(fā)了三電極結(jié)構(gòu)的免疫傳感器，主要結(jié)構(gòu)是條式和對(duì)稱(chēng)的圓盤(pán)式。其中條式結(jié)構(gòu)沒(méi)有考慮電極表面溶液擴(kuò)散方向圓心對(duì)稱(chēng)的特點(diǎn)，需要額外增加定量池的結(jié)構(gòu)。對(duì)稱(chēng)圓盤(pán)式雖然改進(jìn)了這一點(diǎn)，但其參比電極和對(duì)電極對(duì)稱(chēng)的分立于工作電極兩側(cè)，其電場(chǎng)分布和電流趨勢(shì)呈單邊分布，導(dǎo)致信號(hào)檢測(cè)不穩(wěn)定。
目前2，4-D免疫傳感器制備技術(shù)主要是停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，使用的主要是玻碳電極。少數(shù)集成電路工藝制備的電極，也都是基于直接競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)的。而間接免疫競(jìng)爭(zhēng)法的研究，也由于偶聯(lián)物的橋基作用明顯，因此檢測(cè)中要采用2，4-D與其抗血清預(yù)先溫育的方法。該方法的檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)步驟較長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為克服已有技術(shù)的不足之處，提出一種檢測(cè)2，4-滴的一次性安培型免疫傳感器及其制備和使用方法，該傳感器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，與其他對(duì)稱(chēng)式三電極結(jié)構(gòu)相比，具有電場(chǎng)分布均勻，呈環(huán)形對(duì)稱(chēng)，與電子媒介體的擴(kuò)散方向一致，可以較好地抑制電流噪聲、消除干擾。該制備和使用方法操作方便，成本低，可快速進(jìn)行2，4-滴的野外分析。
本發(fā)明的檢測(cè)2，4-滴的一次性安培型免疫傳感器，為采用絲網(wǎng)印刷工藝制備的厚膜電極，其特征在于，包括PVC基板，及在該基板上依次同心分布的碳圓盤(pán)電極、參比電極、對(duì)電極及與各電極相連的接線端，絕緣層，以及在碳圓盤(pán)電極上固定的生物分子膜層。
本發(fā)明的上述2，4-D一次性安培型免疫傳感器的制備方法如下1)絲網(wǎng)印刷工藝制備傳感器先在PVC基片上印刷銀漿層形成同心分布的三電極，銀漿層上的部分區(qū)域印刷碳漿層，(碳粉直徑可在10～100μm)，再印刷絕緣層；工作為中心的碳圓盤(pán)電極(印刷好的電極可在50±3℃下過(guò)夜；同一批制備的碳圓盤(pán)電極中抽樣測(cè)定電極的電荷傳遞系數(shù))；2)2，4-滴-PLL的合成采用碳二亞胺法合成2，4-滴-PLL偶聯(lián)物，偶聯(lián)比在10～20之間；3)2，4-滴抗血清的選用選用兔源2，4-滴抗血清，其效價(jià)大于2000；4)2，4-滴敏感生物分子在傳感器表面的固定化首先采用戊二醛交聯(lián)法固定多聚賴(lài)氨酸-2，4-滴、卵清白蛋白(OVA)、戊二醛，其中OVA用于阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)；然后進(jìn)行抑制反應(yīng)的預(yù)溫育，在傳感器表面滴加標(biāo)準(zhǔn)濃度2，4-滴和抗血清混合溶液固化后形成生物分子膜層。
本發(fā)明使用上述免疫傳感器測(cè)定2，4-滴的方法，包括以下步驟(1)間接競(jìng)爭(zhēng)免疫(由于免疫傳感器表面已經(jīng)預(yù)先溫育了2，4-滴標(biāo)準(zhǔn)樣與抗血清)測(cè)定時(shí)直接在上述免疫傳感器上滴加2，4-D與電極表面抗原進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)免疫后(每個(gè)傳感器可滴加樣品4～40μl)，把過(guò)氧化物酶標(biāo)陽(yáng)抗兔(IGG)滴加到電極表面，與傳感器上的多克隆抗體(即生物分子膜層)發(fā)生免疫，然后加底物溶液(本底物溶液可為H2O2與OPD)；(2)電流測(cè)定當(dāng)?shù)渭拥孜锶芤汉蠓磻?yīng)120±10s后，在極化電壓是-100至-150mV的條件下，使用恒電位儀檢測(cè)恒電位下的時(shí)間-電流曲線；從電流-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線可查得樣品中2，4-滴的濃度。
本發(fā)明的特點(diǎn)技術(shù)效果本發(fā)明采用多抗技術(shù)制備2，4-滴抗血清，采用絲網(wǎng)印刷工藝制備厚膜電極，并采用交聯(lián)法固定生物分子。2，4-滴與多聚賴(lài)氨酸(PLL)的偶聯(lián)物，并與2，4-滴抗血清和HRP酶標(biāo)二抗進(jìn)行間接免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。在還原電位控制下，在HRP酶在鄰苯二胺和H2O2的共同作用下發(fā)生酶促反應(yīng)產(chǎn)生還原電流，檢測(cè)還原電流可反映2，4-滴的濃度。
為了克服預(yù)溫育造成的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)，本發(fā)明把2，4-D與抗血清直接溫育在傳感器表面，從而減少檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟本發(fā)明具有靈敏度高，檢測(cè)下限低，檢測(cè)速度快，成本低廉，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。


圖1是本發(fā)明的2，4-滴免疫傳感器的結(jié)構(gòu)圖。
圖2是本發(fā)明采用絲網(wǎng)印刷工藝制備的傳感器的工藝過(guò)程圖。
圖3是本發(fā)明的間接免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的流程圖。
圖4是2，4-滴檢測(cè)的標(biāo)定曲線。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提出的一種檢測(cè)2，4-滴的一次性安培型免疫傳感器及其制備和使用方法結(jié)合附圖及實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明如下本發(fā)明的一種檢測(cè)2，4-滴的一次性安培型免疫傳感器如圖1所示該傳感器采用絲網(wǎng)印刷工藝制備的厚膜電極，采用同心式三電極結(jié)構(gòu)，電極結(jié)構(gòu)，包括PVC基板6，及在該基板6上絲網(wǎng)印刷成的依次同心分布的碳圓盤(pán)電極1、參比電極2、對(duì)電極3及與各電極相連的接線端5，絕緣層4，以及在碳圓盤(pán)電極上固定的生物分子膜層。
本發(fā)明的實(shí)施例的碳圓盤(pán)電極1直徑為2mm，參比電極2的半徑為2mm，對(duì)電極3的半徑為3mm。
本發(fā)明的2，4-D一次性安培型免疫傳感器的制備方法如圖2所示1)絲網(wǎng)印刷工藝制備傳感器先在PVC基片上印刷形成同心分布的三電極，如圖2(1)所示，銀漿層上的部分區(qū)域印刷碳漿層，如圖2(2)所示，本實(shí)施例的碳粉直徑在10～100μm，再印刷絕緣層，如圖2(3)所示，印刷后的電極，如圖2(4)所示；工作為中心的碳圓盤(pán)電極(本實(shí)施例的碳圓盤(pán)電極為直徑2mm。印刷好的電極在50±3℃下過(guò)夜；測(cè)定同次批量制備碳電極的電荷傳遞系數(shù))；2)2，4-滴-PLL的合成采用碳二亞胺法合成2，4-滴-PLL偶聯(lián)物，偶聯(lián)比在10～20之間；3)2，4-滴抗血清的選用選用兔源2，4-滴抗血清，其效價(jià)應(yīng)大于2000；4)2，4-滴敏感生物分子在傳感器表面的固定化首先采用戊二醛交聯(lián)法固定多聚賴(lài)氨酸-2，4-滴、OVA、戊二醛，其中OVA用于阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)；然后進(jìn)行抑制反應(yīng)的預(yù)溫育，滴加標(biāo)準(zhǔn)濃度2，4-滴和抗血清混合溶液固化后形成生物分子膜層。
本發(fā)明使用上述免疫傳感器測(cè)定2，4-滴的方法如圖3所示，包括以下步驟
(1)間接競(jìng)爭(zhēng)免疫由于免疫傳感器表面已經(jīng)預(yù)先溫育了2，4-滴標(biāo)準(zhǔn)樣與抗血清，測(cè)定時(shí)直接在上述免疫傳感器上滴加待測(cè)的含2，4-D的液體與電極表面抗原進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)免疫，每個(gè)傳感器滴加樣品4～40μl后，把過(guò)氧化物酶標(biāo)陽(yáng)抗兔(IGG)滴加到電極表面，與傳感器上的多克隆抗體(即生物分子膜層)發(fā)生免疫，然后加底物溶液(本實(shí)施例為H2O2與o-鄰苯二胺(OPD))；(2)電流測(cè)定當(dāng)?shù)渭拥孜锶芤汉蠓磻?yīng)120±10s，在極化電壓是-100mV至-150mV條件下，使用恒電位儀檢測(cè)恒電位下的時(shí)間-電流曲線。從電流-濃度曲線(如圖4所示)可查得2，4-滴的濃度。
本發(fā)明的實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明如下1.傳感器的制備(1)制備2，4-D-PLL偶聯(lián)物步驟如下稱(chēng)取18mg的2，4-D，溶入1.5mL 0.05M的PBS緩沖液，加入19mg EDC并攪拌。然后加200μL 10mg/mL的PLL到溶液中并攪拌?；旌先芤涸谑覝叵蚂o置1小時(shí)。4±1℃透析24h(0.1M NaHCO3，換4次PBS溶液)。
(2)制備抗血清步驟如下采用雌性新西蘭白兔進(jìn)行。采用水溶性碳二亞胺(EDC)偶聯(lián)試驗(yàn)得到的免疫偶聯(lián)比為16∶1的合成抗原免疫小鼠。新西蘭白兔的免疫劑量采用相同的初次免疫和加強(qiáng)免疫劑量。免疫原劑量為0.8mg，半抗原劑量為40μg。初次免疫的免疫原用弗氏完全佐劑乳化。加強(qiáng)免疫的免疫原采用弗氏不完全佐劑乳化。新西蘭白兔采用背部皮下多點(diǎn)注射。初次免疫后10天或14天，進(jìn)行加強(qiáng)免疫。隨后7天或10天采血測(cè)定效價(jià)。重復(fù)加強(qiáng)免疫，直到獲得效價(jià)較高(大于2000)的抗血清。新西蘭白兔采用耳緣靜脈取血法。
(3)采用本發(fā)明傳感器的結(jié)構(gòu)。絲網(wǎng)印刷工藝制備傳感器的材料為0.2mm厚的PVC薄膜，銀漿為Acheson公司427SS，碳漿是日本Jujo Ch01，印刷藍(lán)色油墨作為絕緣層。在每次印刷完畢之后，電極都在烘箱內(nèi)以40℃干燥2h。在固定抗體之前，制備好的電極在室溫下老化7天。
(4)進(jìn)行生物分子固定。先進(jìn)行去離子水超聲清洗，氮?dú)獯蹈桑缓笤趥鞲衅鞅砻姘灰憾嗑圪?lài)氨酸-2，4-滴、OVA、戊二醛；包被方法每個(gè)電極滴加樣品4μl，37℃溫育2hr，清洗吹干后，4℃保存。最后滴加把標(biāo)準(zhǔn)濃度2，4-滴，抗血清混合溶液，37℃反應(yīng)1hr，清洗吹干。
2.傳感器的使用(1)檢測(cè)時(shí)直接滴加2，4-D與電極表面抗原進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)免疫，每個(gè)傳感器滴加樣品4～40μl，37±1℃反應(yīng)1hr，清洗吹干。然后把過(guò)氧化物酶標(biāo)陽(yáng)抗兔(IGG)滴加到電極表面，與傳感器上多克隆抗體(即第一抗體)發(fā)生免疫，每個(gè)傳感器點(diǎn)樣4μl，37±1℃反應(yīng)0.5hr，清洗吹干。
(2)酶活力的檢測(cè)底物溶液是H2O2與OPD濃度分別為1mM，5mM。電流測(cè)定的底物溶液，用PBS緩沖液稀釋?zhuān)琌PD與H2O2濃度分別為5mM，1mM。每個(gè)傳感器滴加40μL底物溶液，反應(yīng)120±10s后，使用CHI660A電化學(xué)工作站檢測(cè)恒電位下的時(shí)間-電流曲線。其中極化電壓是-100mV至-150mV，檢測(cè)時(shí)間120±10s。從電流-濃度曲線(圖4)可查得2，4-滴的濃度。
(3)標(biāo)準(zhǔn)電流-濃度曲線的制作采用上述免疫傳感器和檢測(cè)方法，用2，4-滴標(biāo)準(zhǔn)樣配制600mg/L的PBS溶液。并稀釋到1.0ng/mL。測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖4所示檢測(cè)下限1ng/mL；線性區(qū)間1ng/mL-30μg/mL；線性度R＝97.4％
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)2，4-滴的一次性安培型免疫傳感器，為采用絲網(wǎng)印刷工藝制備的厚膜電極，其特征在于，包括PVC基板，及在該基板上依次同心分布的碳圓盤(pán)電極、參比電極、對(duì)電極及與各電極相連的接線端，絕緣層，以及在碳圓盤(pán)電極上固定的生物分子膜層。
2.一種2，4-D一次性安培型免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)絲網(wǎng)印刷工藝制備傳感器先在PVC基片上印刷銀漿層形成同心分布的三電極，銀漿層上的部分區(qū)域印刷碳漿層，再印刷絕緣層；工作為中心的碳圓盤(pán)電極；2)2，4-滴-PLL的合成采用碳二亞胺法合成2，4-滴-PLL偶聯(lián)物，偶聯(lián)比在10～20之間；3)2，4-滴抗血清的選用選用兔源2，4-滴抗血清，其效價(jià)大于2000；4)2，4-滴敏感生物分子在傳感器表面的固定化首先采用戊二醛交聯(lián)法固定多聚賴(lài)氨酸-2，4-滴、卵清白蛋白、戊二醛，其中卵清白蛋白用于阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)；然后進(jìn)行抑制反應(yīng)的預(yù)溫育，在傳感器表面滴加標(biāo)準(zhǔn)濃度2，4-滴和抗血清混合溶液固化后形成生物分子膜層。
3.一種使用一次性安培型免疫傳感器測(cè)定2，4-滴的方法，其特征在于，傳感器包括PVC基板，及在該基板上依次同心分布的碳圓盤(pán)電極、參比電極、對(duì)電極及與各電極相連的接線端，絕緣層，以及在碳圓盤(pán)電極上固定的生物分子膜層；測(cè)定2，4-滴包括以下步驟(1)間接競(jìng)爭(zhēng)免疫直接在所述免疫傳感器上滴加樣品2，4-D與電極表面抗原進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)免疫，把過(guò)氧化物酶標(biāo)陽(yáng)抗兔滴加到電極表面，與該傳感器上的生物分子膜發(fā)生免疫，然后加底物溶液；(2)電流測(cè)定當(dāng)?shù)渭拥孜锶芤汉蠓磻?yīng)120±10s后，在極化電壓是-100至-150mV的條件下，使用恒電位儀檢測(cè)恒電位下的時(shí)間-電流曲線；從電流-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線可查得樣品中2，4-滴的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)2，4－滴的一次性安培型免疫傳感器及其制備和使用方法，屬于環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域。該傳感器為采用絲網(wǎng)印刷工藝制備的厚膜電極，其特征在于，包括PVC基板，及在該基板上依次同心分布的碳圓盤(pán)電極、參比電極、對(duì)電極及與各電極相連的接線端，絕緣層，以及在碳圓盤(pán)電極上固定的生物分子膜層。該傳感器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，與其他對(duì)稱(chēng)式三電極結(jié)構(gòu)相比，具有電場(chǎng)分布均勻，呈環(huán)形對(duì)稱(chēng)，與電子媒介體的擴(kuò)散方向一致，可以較好地抑制電流噪聲、消除干擾。該制備和使用方法操作方便，成本低，可快速進(jìn)行2，4－滴的野外分析。
文檔編號(hào)G01N33/561GK1603809SQ20041009607
公開(kāi)日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2004年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月29日
發(fā)明者施漢昌, 何苗, 蔡強(qiáng) 申請(qǐng)人:清華大學(xué)