專利名稱：酶標(biāo)儀在膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫透射比濁法，特別是涉及用酶標(biāo)儀檢測的方法。
背景技術(shù)：
免疫比濁法是利用蛋白質(zhì)復(fù)雜結(jié)構(gòu)所具有的抗原特性，以被測蛋白質(zhì)作為一種抗原與特異性抗體結(jié)合后形成不溶性免疫復(fù)合物，經(jīng)可見光照射檢測蛋白質(zhì)含量的比濁方法。但這種免疫復(fù)合物的濁度變化太小，經(jīng)可見光照射后的吸光值變化小，靈敏度很低。經(jīng)過研究和改進(jìn)又產(chǎn)生了膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法。膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法是將抗體分子結(jié)合到膠乳的表面，常用的膠乳是粒徑為0.1um～0.2um的高分子微球，當(dāng)膠乳的粒徑小于入射光波長時(shí)，單個(gè)膠乳顆粒在入射光波長內(nèi)透射性良好，兩個(gè)膠乳顆粒凝聚時(shí)，則透過光減少，這種減少的程度與膠乳凝聚成正比，也與抗原量成正比。膠乳表面可以吸附多個(gè)抗體，當(dāng)免疫反應(yīng)發(fā)生時(shí)，膠乳表面的抗體和多個(gè)抗原結(jié)合，這些抗原又和膠乳表面的抗體結(jié)合，這樣，抗原與膠乳表面結(jié)合的抗體發(fā)生連鎖反應(yīng)，大量的膠乳通過免疫反應(yīng)一層一層地聚集在一起形成團(tuán)塊狀不溶性免疫顆粒復(fù)合物，膠乳的粒徑發(fā)生改變，其透射性能也發(fā)生明顯的變化，經(jīng)可見光照射檢測濁度的變化。膠乳增強(qiáng)濁度的免疫透射比濁大大提高了檢測的靈敏度，有廣闊的應(yīng)用前景。目前，對免疫顆粒復(fù)合物濁度檢測的儀器主要是分光光度計(jì)和全自動(dòng)(半自動(dòng))生化分析儀，分光光度計(jì)每次只能檢測一個(gè)樣本，而且每次檢測完后要清洗比色池，操作煩瑣，誤差大。生化分析儀操作方便，準(zhǔn)確度高，但每次檢測所需試劑量大，檢測成本高。我們采用酶標(biāo)儀檢測免疫顆粒復(fù)合物的吸光值，一次可以檢測多個(gè)標(biāo)本，測定速度快，所需試劑量小，成本低，適合于一般的醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了在膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁中應(yīng)用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測的方法，該方法是以粒徑為0.1um～0.2um的聚苯乙烯膠乳粒子為載體，將多個(gè)抗體結(jié)合到膠乳表面，形成抗體膠乳。由于膠乳是雙層結(jié)構(gòu)的高分子微球，表面可以結(jié)合大量的抗體，將膠乳粒子包裹起來，當(dāng)免疫凝聚發(fā)生時(shí)，膠乳表面的抗體與抗原結(jié)合，抗原又和膠乳表面的抗體結(jié)合，這樣，抗體膠乳和抗原發(fā)生連鎖反應(yīng)，大量的膠乳粒子通過免疫反應(yīng)一層一層聚集在一起，形成不溶性復(fù)合物，膠乳粒子的粒徑發(fā)生明顯改變，其透射性也發(fā)生明顯變化。采用具有一定透射波長的酶標(biāo)儀檢測這種不溶性免疫復(fù)合物吸光值的變化，吸光值的增大與膠乳聚集程度成正比，也與抗原量成正比。用酶標(biāo)儀檢測某種已知濃度的抗原與抗體膠乳反應(yīng)后的吸光值，以該抗原濃度值為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣本中該抗原與相應(yīng)抗體膠乳反應(yīng)后的吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線推算樣本中該抗原的濃度。因此采用膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁檢測的產(chǎn)品都可采用一定波長的酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測?，F(xiàn)以人血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白檢測為例說明，具體步驟如下(1).將兔抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體結(jié)合到聚苯乙烯膠乳的表面，形成抗轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體膠乳。
(2).將已知濃度的人轉(zhuǎn)鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作倍比稀釋，得到六個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。
(3).將(2)中六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品分別與抗轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體膠乳反應(yīng)，生成不溶性免疫復(fù)合物。
(4).用酶標(biāo)儀在405nm波長處檢測免疫復(fù)合物的吸光值。
(5).以六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(6).將待測血清樣本與抗轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體膠乳反應(yīng)，生成不溶性免疫復(fù)合物，在酶標(biāo)儀上檢測該免疫復(fù)合物吸光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求血清樣本中轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度。
(7).在分光光度計(jì)上405nm波長處測(3)和(6)中所述的不溶性免疫復(fù)合物的吸光值，以六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以分光光度計(jì)所測的相應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所測得的血清樣本吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清樣本中轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度。
比較分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀所測標(biāo)準(zhǔn)品和血清樣本的濃度值及兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)可知，兩種檢測方法在方法學(xué)上沒有差異，所以在膠乳增強(qiáng)的免疫透射比濁法中用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測是一種新的檢測方法。
本發(fā)明的有益效果是給臨床上提供了一種用酶標(biāo)儀檢測的免疫透射比濁的檢測方法，該方法可同時(shí)檢測多個(gè)標(biāo)本，檢測速度快，耗時(shí)短，所需試劑量小，成本低，適合于在一般的醫(yī)療機(jī)構(gòu)中使用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了將酶標(biāo)儀用于膠乳增強(qiáng)的免疫透射比濁的檢測方法，所有通過膠乳增強(qiáng)濁度進(jìn)行免疫透射比濁都可以用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，以人血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白為例說明，具體實(shí)施方式
如下1.聚苯乙烯膠乳按公知技術(shù)(快速檢驗(yàn)資料匯編人民衛(wèi)生出版社出版，上海第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)組編著，1973年，1～40頁)制備，取0.1mol/L pH8.2的甘氨酸緩沖液稀釋的2％聚苯乙烯膠乳(膠乳粒徑0.1um)1ml，加入100μl兔抗轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體，加甘氨酸緩沖液稀釋到5ml，10000g離心10分鐘，吸去上清，再加甘氨酸緩沖液稀釋，如此清洗二次，最后用甘氨酸緩沖液稀釋至1ml即得兔抗轉(zhuǎn)鐵蛋白膠乳。
2.取轉(zhuǎn)鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(5mg/ml)50μl，用0.1mol/L甘氨酸緩沖液依次稀釋成下列系列標(biāo)準(zhǔn)濃度5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.31mg/ml、0mg/ml。取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品5μl各一管，空白管加5μl 0.1mol/L甘氨酸緩沖液。
3.在各管中加入220μl 0.1mol/L甘氨酸緩沖液，混勻，37℃反應(yīng)5分鐘。
4.取2％轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體膠乳，用0.1mol/L的甘氨酸緩沖液稀釋至1％，各管加1％轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體膠乳35μl，混勻，37℃反應(yīng)5分鐘。
5.在酶標(biāo)儀上檢測各管405nm波長處的吸光值，測得值如下

6.以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)吸光值減去空白管吸光值后的值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得相關(guān)系數(shù)r＝0.989。
7.取正常人新鮮血清兩份各5μl，空白管直接加5μl 0.1mol/L的甘氨酸緩沖液。在各管中加入220μl 0.1mol/L甘氨酸緩沖液，混勻，37℃反應(yīng)5分鐘，再往各管加入1％轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體膠乳35μl，充分混勻，37℃反應(yīng)5分鐘后，在酶標(biāo)儀上檢測405nm波長處的吸光值分別為0.605、0.661，空白管吸光值為0.010。將血清樣本吸光值減去空白管吸光值后的值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度分別為3.06g/l、3.39g/l。據(jù)公知技術(shù)(中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)全書，人民衛(wèi)生出版社出版，李影林主編，1996年)知正常人血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度范圍是2.0～4.0g/l。
8.用分光光度計(jì)代替(5)步和(7)步中的酶標(biāo)儀進(jìn)行測值，測得結(jié)果如下

兩份正常人血清的吸光值分別為0.633、0.701空白管吸光值為0.0099.以(8)步中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以各管吸光值減去空白管吸光值后的值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得相關(guān)系數(shù)r＝0.984。將血清樣本吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得血清樣本中轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度分別為3.07g/l、3.46g/l。
以上兩種方法所測得血清樣本的濃度之間的差異低于5％，所以在膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法中用酶標(biāo)儀檢測和用分光光度計(jì)檢測在方法學(xué)上沒有差異，因此用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測的膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法是一種新的檢測方法，具有良好的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種用于膠乳免疫透射比濁的檢測方法，其特征在于該方法是用酶標(biāo)儀檢測經(jīng)膠乳增強(qiáng)濁度的免疫顆粒復(fù)合物的吸光值。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用酶標(biāo)儀檢測經(jīng)膠乳增強(qiáng)濁度的不溶性免疫顆粒復(fù)合物吸光值的免疫透射比濁法，該方法是將抗體結(jié)合到具有一定光密度值的聚苯乙烯膠乳表面，形成抗體膠乳。該抗體膠乳與血清樣本中相對應(yīng)的蛋白抗原結(jié)合，這樣，當(dāng)免疫反應(yīng)發(fā)生時(shí)，抗體膠乳與蛋白抗原發(fā)生連鎖反應(yīng)，大量膠乳通過免疫反應(yīng)一層一層聚集在一起形成不溶性免疫顆粒復(fù)合物，膠乳的粒徑發(fā)生改變，其透射性及吸光度值也發(fā)生明顯的變化。采用具有一定透射波長的酶標(biāo)儀檢測這種膠乳顆粒聚集的吸光值的變化，并通過繪制某種已知濃度抗原與相應(yīng)抗體膠乳顆粒反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算待測標(biāo)本中同一抗原的濃度。
文檔編號G01N21/31GK1786713SQ20041009758
公開日2006年6月14日 申請日期2004年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月9日
發(fā)明者陳金華 申請人:陳金華