專利名稱：對微囊藻毒素－lr進行化學修飾并合成完全抗原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及對微囊藻毒素-LR分子合成完全抗原的方法。
背景技術(shù)：
微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR，簡稱MC-LR)是目前已知急性毒性最強、危害最大的一種淡水藍藻毒素。微囊藻毒素是一組環(huán)狀七肽，其中微囊藻毒素-LR的分子結(jié)構(gòu)式如下 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素各種異構(gòu)體有60多種，其變化主要在于第2位和第4位上2個L-氨基酸的不同，如MC-LR這2個位置上的氨基酸分別為亮氨酸和精氨酸(見上式中的序號2和4)。研究發(fā)現(xiàn)，第5位氨基酸Adda對微囊藻毒素的毒性是必需的，其共軛立體結(jié)構(gòu)會影響其毒性，結(jié)構(gòu)改變則毒性改變。
免疫檢測技術(shù)的關(guān)鍵在于獲得特異性和親和力良好的抗體，而抗體的這2個主要特性很大程度上取決于抗原的性質(zhì)；微囊藻毒素-LR分子量為1000左右，本身不具備免疫原性，屬于半抗原，只有與大分子物質(zhì)連接合成完全抗原才能促使機體產(chǎn)生免疫反應，從而獲得抗體。合成并純化免疫性能良好的MC-LR完全抗原是非常關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)。
一般來說，連接位點應選擇對免疫來說最不重要的區(qū)域，而將抗原決定簇基團(致毒基團)暴露在外面，因為抗體對遠離連接位點的基團的識別能力遠遠大于鄰近連接位點的基團的識別能力。
目前大多數(shù)研究(制備微囊藻毒素-LR的抗體)的連接位點都是選擇MC-LR第3位的D-MeAsp或第6位的D-Glu。利用其羧基只接與載體蛋白相連，不通過化學修飾。這樣帶來的后果是由此產(chǎn)生的抗體只能識別帶有Adda氨基酸的藻毒素，而不能將各種微囊藻毒素區(qū)別開來，從而不能很好的應用于免疫檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服已有技術(shù)的不足之處，提出一種對微囊藻毒素-LR分子進行化學修飾并合成完全抗原的方法，本方法選擇第7位氨基酸Mdha作為連接位點，Mdha遠離致毒基團Adda，因而抗體能夠有效的識別出微囊藻毒素和節(jié)球藻毒素；而且遠離兩個可變的氨基酸，因而能夠識別出微囊藻毒素的各種異構(gòu)體，可提高微囊藻毒素-LR抗體的特異性。
本發(fā)明提出的一種對微囊藻毒素-LR分子進行化學修飾并合成完全抗原的方法，包括對微囊藻毒素-LR的化學修飾和用戊二醛1步法合成完全抗原兩部分，所述對微囊藻毒素-LR的化學修飾方法的具體步驟如下1)將2-巰基乙胺和MC-LR按照大摩爾比(1000～5000)∶1充分混和在pH＝8.0～10.0的堿性碳酸鹽緩沖液中；混合均勻，在40℃～60℃反應1～2小時；2)反應完畢，降到室溫(20℃～30℃)，加入與2-巰基乙胺等摩爾的乙酸使反應停止，得到中間產(chǎn)物H2N-etMC-LR；3)采用固相萃取技術(shù)對該中間產(chǎn)物進行純化；所述用戊二醛1步法合成完全抗原方法的具體步驟如下4)將所獲得的純化后的中間產(chǎn)物溶于緩沖溶液中，使其在溶液中的濃度為0.1～1mg/mL；5)按中間產(chǎn)物戊二醛摩爾比為1∶(5～20)加入適量戊二醛，劇烈振搖，充分搖勻后，按中間產(chǎn)物BSA摩爾比10～15∶1加入BSA溶液，充分混合，反應12小時以上；6)反應完畢，混合物在PBS中透析24小時以上，得到微囊藻毒素-LR的完全抗原。
上述采用固相萃取技術(shù)的純化方法，采用C18固相萃取柱，具體步驟如下活化用甲醇活化C18柱，并用高純水調(diào)整，分為2～3次使用；上樣將水樣以5～10mL/min的流速流過固相萃取柱進行富集濃縮。重力過濾；淋洗裝樣完畢后，用1～10％甲醇水溶液淋洗以凈化樣品，分為2～4次使用；洗脫待固相萃取柱吹干后，用甲醇(分為多次)將微囊藻毒素洗脫并收集。
本發(fā)明的特點及技術(shù)效果本方法選擇第7位氨基酸Mdha作為連接位點，Mdha遠離致毒基團Adda，因而抗體能夠有效的識別出微囊藻毒素和節(jié)球藻毒素；而且遠離兩個可變的氨基酸，因而能夠識別出微囊藻毒素的各種異構(gòu)體，可提高微囊藻毒素-LR抗體的特異性。
本發(fā)明利用2-巰基乙胺在上述第7位氨基酸的雙鍵處引入1個氨基，通過它與載體蛋白連接；并通過SPE固相萃取技術(shù)來純化中間產(chǎn)物；通過MS測定產(chǎn)物的分子量從而鑒定修飾是否成功。
本發(fā)明偶聯(lián)劑的選擇在上述對MC-LR進行氨基修飾后(修飾產(chǎn)物)，用戊二醛作為偶聯(lián)劑，采用戊二醛一步法將MC-LR。戊二醛是一種雙功能偶聯(lián)試劑，能通過它兩端的醛基將2個自由氨基合成到一塊。通過戊二醛合成還可為多肽和載體蛋白之間提供一段非常靈活的長鏈，使它們之間有較大的空間，從而將半抗原充分暴露在外面，形成有利的免疫表位，進而達到良好的免疫效果。
具體實施例方式
實施例1首先進行微囊藻毒素-LR的氨基修飾，具體步驟如下將0.5mg MC-LR溶于2ml 0.1M pH＝9的碳酸鹽緩沖液中；稱取60.4mg 2-巰基乙胺加入上述溶液中?；旌衔锍浞謸u勻，在40℃反應2小時；反應完畢，降到室溫20℃，加入與2-巰基乙胺等摩爾的乙酸使反應停止，得到中間產(chǎn)物H2N-etMC-LR；采用固相萃取技術(shù)純化中間產(chǎn)物，材料為500mg 6mL C18BondElut cartridge；再用戊二醛1步法合成完全抗原，具體步驟如下將所獲得的中間產(chǎn)物(含MC-LR約0.5mg)溶于3mL 0.01mol/LpH7.4的PBS中(預先加入3％v/v的甲醇methanol，即加入100uL甲醇)；按MC-LR∶戊二醛摩爾比為5∶1加入適量0.1％的戊二醛，劇烈振搖，按MC-LR∶BSA摩爾比10∶1加入1mg/mL的BSA溶液5mL，充分混合，4℃振蕩16小時；反應完畢，混合物在PBS中透析24小時，4℃，(8小時換一次，共3次；每次用PBS 2L)；上述采用固相萃取技術(shù)的純化方法，具體步驟如下活化用4mL甲醇活化，并用6mL高純水調(diào)整，分為2～3次使用；上樣將水樣以5～10mL/min的流速流過固相萃取柱進行富集濃縮。重力過濾；淋洗裝樣完畢后，用5％甲醇水溶液6mL淋洗以凈化樣品，分為3次使用；洗脫待固相萃取柱吹干后，以4mL甲醇(分為2次)將微囊藻毒素洗脫并收集。
中間產(chǎn)物的鑒定采用MS儀測定主要產(chǎn)物的分子量。
MC-LR的修飾及純化結(jié)果對于修飾后的MC-LR，為了證實引進游離的巰基乙胺是否成功，本研究利用質(zhì)譜儀MS測定目標產(chǎn)物(中間產(chǎn)物)的分子量。將2-巰基乙胺與MC-LR按照摩爾比3000∶1反應，固相萃取純化后，用甲醇洗脫，MS測定值為1072.7；主要產(chǎn)物的理論分子量為MC-LR與H2N-CH2CH2-SH的分子量之和，即1072.2，二者基本一致。結(jié)果表明，氨基修飾是成功的。對于合成抗原的鑒定，本實施例采用了紫外掃描技術(shù)。
對于合成抗原的鑒定，本實施例采用了紫外掃描技術(shù)。
合成完全抗原的定性分析對BSA，MC-LR及完全抗原的紫外掃描曲線顯示完全抗原和BSA同樣在280nm處有吸收峰；而238nm是MC-LR的吸收峰，完全抗原紫外掃描結(jié)果在238nm附近發(fā)生明顯的紅移，從而可以判斷，合成是有效的。
實施例2首先進行微囊藻毒素-LR的氨基修飾，具體步驟如下將1.0mg MC-LR溶于2ml 0.1M pH＝9的碳酸鹽緩沖液中；稱取500mg 2-巰基乙胺加入上述溶液中。混合物充分搖勻，在60℃反應1小時；反應完畢，降到室溫25℃，加入與2-巰基乙胺等摩爾的乙酸使反應停止；用500mg 6ml C18BondElut cartridge純化中間產(chǎn)物；再來用戊二醛1步法合成完全抗原，具體步驟如下將所獲得的中間產(chǎn)物(含MC-LR約1.0mg)溶于3mL 0.01mol/L pH7.4的PBS中(預先加入3％v/v的甲醇methanol，即加入100uL甲醇)；按MC-LR∶戊二醛摩爾比為15∶1加入適量0.1％的戊二醛，劇烈振搖；按MC-LR∶BSA摩爾比20∶1加入1mg/mL的BSA溶液5mL，充分混合，4℃振蕩20小時；反應完畢，混合物在PBS中透析24小時，4℃。
對于合成抗原的鑒定采用多電荷生物質(zhì)譜技術(shù)將所獲得的完全抗原純化、脫鹽后，利用API3000液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定的質(zhì)譜圖顯示BSA分子量為66463.0，每連接上1個中間產(chǎn)物分子，分子量增加1000左右。從完全抗原的質(zhì)譜圖可以發(fā)現(xiàn)，分子量分布從66000一直到73000，合成比在3～8之間的完全抗原是存在的，未參與合成的BSA信號較小。
權(quán)利要求
1.一種對微囊藻毒素-LR分子進行化學修飾并合成完全抗原的方法，包括對微囊藻毒素-LR的化學修飾和用戊二醛1步法合成完全抗原兩部分；所述對微囊藻毒素-LR的化學修飾方法的具體步驟如下1)將2-巰基乙胺和MC-LR按照大摩爾比(1000～5000)∶1充分混和在pH＝8.0～10.0的堿性碳酸鹽緩沖液中；混合均勻，在40℃～60℃反應1～2小時；2)反應完畢，降到室溫，加入與2-巰基乙胺等摩爾的乙酸使反應停止，得到中間產(chǎn)物H2N-etMC-LR；3)采用固相萃取技術(shù)對該中間產(chǎn)物進行純化；所述用戊二醛1步法合成完全抗原方法的具體步驟如下4)將所獲得的純化后的中間產(chǎn)物溶于緩沖溶液中，使其在溶液中的濃度為0.1～1mg/mL；5)按中間產(chǎn)物∶戊二醛摩爾比為1∶(5～20)加入適量戊二醛，劇烈振搖，充分搖勻后，按中間產(chǎn)物∶BSA摩爾比10～15∶1加入BSA溶液，充分混合，反應12小時以上；6)反應完畢，混合物在PBS中透析24小時以上，得到微囊藻毒素-LR的完全抗原。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述采用固相萃取技術(shù)的純化方法，采用C18固相萃取柱，具體步驟如下活化用甲醇活化C18柱，并用高純水調(diào)整，分為2～3次使用；上樣將水樣以5～10mL/min的流速流過固相萃取柱進行富集濃縮。重力過濾；淋洗裝樣完畢后，用1～10％甲醇水溶液淋洗以凈化樣品，分為2～4次使用；洗脫待固相萃取柱吹干后，用甲醇將微囊藻毒素洗脫并收集。
全文摘要
本發(fā)明涉及對微囊藻毒素－LR進行化學修飾并合成完全抗原的方法，屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，包括對微囊藻毒素－LR的化學修飾和用戊二醛1步法合成完全抗原兩部分；本方法選擇第7位氨基酸Mdha作為連接位點，Mdha遠離致毒基團Adda，因而抗體能夠有效的識別出微囊藻毒素和節(jié)球藻毒素；而且遠離兩個可變的氨基酸，因而能夠識別出微囊藻毒素的各種異構(gòu)體，可提高微囊藻毒素－LR抗體的特異性。
文檔編號G01N33/531GK1603827SQ20041009607
公開日2005年4月6日 申請日期2004年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月29日
發(fā)明者何苗, 盛建武, 施漢昌 申請人:清華大學