本發(fā)明涉及醫(yī)學免疫診斷領域，具體地指一種D-二聚體免疫膠乳微球制備方法及應用。
背景技術：
：D-二聚體是纖維蛋白單體經活化因子XIII交聯后，再經纖溶酶水解所產生的一種特異性降解產物，是一個特異性的纖溶過程標記物。血漿D二聚體測定是了解繼發(fā)性纖維蛋白溶解功能的一個試驗?，F有技術采用的膠乳增強免疫比濁法檢查原理為：抗D-D單克隆抗體包被于膠乳顆粒上，受體血漿中如果存在D-二聚體，將產生抗原-抗體反應，乳膠顆粒發(fā)生聚集現象。1977年Sternberg創(chuàng)建了速率散射比濁法，是以測定的溶液對光的散射程度來判斷樣品中抗原的含量。一定波長的光沿水平軸照射，碰到小顆粒的免疫復合物可導致光散射，散射強度與抗原抗體免疫復合物的含量成正比。但免疫比濁法由于檢測靈敏度達不到臨床的要求，于是出現了膠乳增強免疫比濁法。其基本原理是首先將抗體吸附在一種膠乳顆粒上，當遇到相應的抗原時，抗原抗體結合而出現膠乳凝集。單個膠乳顆粒的大小在入射光波長之內，光線可透過。當兩個以上膠乳顆粒凝集可阻礙光線透過，使透射光減少，其減少程度與膠乳凝集的程度成正比，亦與抗原成反比?，F有技術中常采用聚苯乙烯微球偶聯抗體，得到用于檢測的膠乳試劑，但偶聯效率普遍偏低，只有60～80％，且偶聯時碳化二亞胺類活化劑對抗體活性破壞較大，導致產品成品率低。技術實現要素：本發(fā)明的目的就是要克服現有D-二聚體免疫膠乳微球制備方法產品成品率低的缺陷，提供一種偶聯效率高、偶聯后抗體活性影響小的D-二聚體免疫膠乳微球制備方法及由采用該D-二聚體免疫膠乳微球的膠乳增強免疫比濁法D-二聚體測定試劑盒。為實現上述目的，本發(fā)明所提供的D-二聚體免疫膠乳微球制備方法，步驟如下：1)準備粒徑范圍200～400nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用濃度為50mmol/L的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至終濃度0.4～0.6％w/v，得到pH為5.5～6.5的微球溶液；2)以2-嗎啉乙磺酸緩沖液溶解碳化二亞胺，得到濃度為10mg/mL的碳化二亞胺溶液；3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量為計，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例將碳化二亞胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震蕩活化1h，震蕩速度為30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；4)將濃度≤10mg/mL的DD單克隆抗體在pH8.5～9.5條件下溶解，溶劑是50mmol/L的硼酸鹽緩沖液，使抗體終濃度在0.005～0.02mg/mL之間，得到FDP單抗溶液，儲存于2～8℃?zhèn)溆茫?)將FDP單抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗體與微球質量比為0.001～0.02:1，整個滴加過程持續(xù)4～7min，使活化聚苯乙烯微球與抗體上的氨基耦合，兩者的混合液呈中性，之后2～8℃震蕩12～24h，震蕩速度為30～50r/min，即得D-二聚體免疫膠乳微球。優(yōu)選地，所述步驟3)中震蕩活化條件為：4℃震蕩活化1h，震蕩速度為50r/min。優(yōu)選地，所述步驟5)中使活化聚苯乙烯微球與抗體上的氨基耦合時，4℃震蕩16h，震蕩速度為50r/min。本發(fā)明還提供了一種膠乳增強免疫比濁法D-二聚體測定試劑盒，包括D-二聚體檢測試劑R1和D-二聚體檢測試劑R2；所述D-二聚體檢測試劑R1中各組分及含量為：0.01～13％穩(wěn)定劑1、10～200mM的緩沖液1、1～6％的促凝劑1、0.02～0.1％的防腐劑1；所述D-二聚體檢測試劑R2中各組分及含量為：0.01～23％穩(wěn)定劑2、1～5mg/ml的D-二聚體免疫膠乳微球、10～200mM的緩沖液2、0.02～0.1％的防腐劑2、0.05～5％的賦形劑2；所述D-二聚體檢測試劑R2的制備方法為：1)準備粒徑范圍200～400nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用濃度為50mmol/L的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至終濃度0.4～0.6％w/v，得到pH為5.5～6.5的微球溶液；2)以2-嗎啉乙磺酸緩沖液溶解碳化二亞胺，得到濃度為10mg/mL的碳化二亞胺溶液，3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量為計，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例將碳化二亞胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震蕩活化1h，震蕩速度為30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；4)將濃度≤10mg/mL的DD單克隆抗體在pH8.5～9.5條件下溶解，溶劑是50mmol/L的硼酸鹽緩沖液，使抗體終濃度在0.005～0.02mg/mL之間，得到FDP單抗溶液，儲存于2～8℃?zhèn)溆茫?)將FDP單抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗體與微球質量比為0.001～0.02:1，整個滴加過程持續(xù)4～7min，使活化聚苯乙烯微球與抗體上的氨基耦合，兩者的混合液呈中性，之后2～8℃震蕩12～24h，震蕩速度為30～50r/min，即得D-二聚體免疫膠乳微球；6)向D-二聚體免疫膠乳微球中加入含有穩(wěn)定劑2和緩沖液2的封閉液，震蕩得到膠乳溶液；7)膠乳溶液離心，去上清液，以除去其中殘留的活化劑，然后加入防腐劑2至貯存濃度，超聲分散，即得。優(yōu)選地，所述穩(wěn)定劑1選自0.5～0.9％的氯化鈉、0.1～3％的BSA、5～50mM的乙二胺四乙酸二鈉、0.01～1％的Tween-20、1～10％的丙三醇中的一種或兩種以上；所述緩沖液1選自4-羥乙基哌嗪乙磺酸-氫氧化鈉緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸-氫氧化鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液中的一種或兩種以上；所述促凝劑1選自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或硫酸葡聚糖中的一種；所述防腐劑1選自疊氮鈉、Proclin300或硫柳汞中的一種；所述穩(wěn)定劑2選自0.5～0.9％的氯化鈉、0.1～3％的BSA、5～50mM的乙二胺四乙酸二鈉、0.01～1％的Tween-20、1～10％的丙三醇中的一種或兩種以上；所述緩沖液2選自4-羥乙基哌嗪乙磺酸-氫氧化鈉緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸-氫氧化鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液中的一種或兩種以上；所述防腐劑2選自疊氮鈉、Proclin300或硫柳汞中的一種。所述賦形劑2選自甘露醇、海藻糖、蔗糖或葡萄糖中的一種或兩種；進一步優(yōu)選地，所述D-二聚體檢測試劑R1中各組分及含量為：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、pH7.4的100～200mMTris、0.02～2％的PEG、0.05％的NaN3；所述D-二聚體檢測試劑R2中各組分及含量為：0.4～0.8％的BSA、2～6％蔗糖、1～5mg/ml的D-二聚體免疫膠乳微球、pH7.4的25～50mmol/L甘氨酸緩沖液、0.05％的NaN3；或所述D-二聚體檢測試劑R1和所述D-二聚體檢測試劑R2中0.05％的NaN3替換為0.1％的Proclin300。進一步地，上述試劑盒還包括D-二聚體校準品，其各組分及含量為：0.01～13％的校準品穩(wěn)定劑、20mg/L的D-二聚體、10～200mM的校準品緩沖液、0.02～0.1％的校準品防腐劑、0.05～5％的校準品賦形劑。優(yōu)選地，所述校準品穩(wěn)定劑選自0.5～0.9％的氯化鈉、0.1～3％的BSA、5～50mM的乙二胺四乙酸二鈉、0.01～1％的Tween-20、1～10％的丙三醇中的一種或兩種以上；所述校準品緩沖液選自4-羥乙基哌嗪乙磺酸-氫氧化鈉緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸-氫氧化鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液中的一種或兩種以上；所述校準品防腐劑選自疊氮鈉、Proclin300或硫柳汞中的一種；所述校準品賦形劑選自甘露醇、海藻糖、蔗糖或葡萄糖中的一種或兩種。進一步優(yōu)選地，所述D-二聚體校準品中各組分及含量為：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、2～6％蔗糖、0.1～0.5％海藻糖、20mg/L的D-二聚體、pH7.4的25～50mmol/L甘氨酸緩沖液、0.05％的NaN3；或所述D-二聚體校準品中各組分及含量為：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、2～6％蔗糖、0.1～0.5％海藻糖、20mg/L的D-二聚體、pH7.4的25～50mmol/L甘氨酸緩沖液、0.1％的Proclin300。優(yōu)選地，上述試劑盒的技術方案中，所述步驟3)中震蕩活化條件為：4℃震蕩活化1h，震蕩速度為50r/min。優(yōu)選地，上述試劑盒的技術方案中，所述步驟5)中使活化聚苯乙烯微球與抗體上的氨基耦合時，4℃震蕩16h，震蕩速度為50r/min。優(yōu)選地，上述試劑盒的技術方案中，所述步驟6)中震蕩條件為：25℃震蕩2h，然后轉入4℃震蕩24h，震蕩速度為50r/min。本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明方法制備的D-二聚體免疫膠乳微球時優(yōu)化化學交聯方法，將聚苯乙烯微球的羧基在低pH條件下活化，與高pH條件溶解的抗體上的氨基耦合，兩者的混合液呈中性，在低溫下偶聯12～24h，既保證了抗體的偶聯效率，同時極大程度的降低了活化劑對抗體活性的破壞。(2)本發(fā)明D-二聚體免疫膠乳微球的膠乳增強免疫比濁法D-二聚體測定試劑盒具有靈敏度高、定量準確、重復性好、性質穩(wěn)定的特點，最低檢測低限可達0.01mg/L。(3)本發(fā)明試劑盒具有較強的特異性。本實驗中使用的是針對不同抗原表位的單克隆抗體，極大提高了反應時的特異性。(4)可應用于全自動生化分析儀或凝血分析儀，操作快速、簡單，從檢測至采集結果只需5～10分鐘，具有較好的臨床應用前景。具體實施方式以下結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。實施例1本發(fā)明所提供的D-二聚體免疫膠乳微球制備方法如下：1、準備粒徑240nm的聚苯乙烯微球，濃度為10％，取用2ml；聚苯乙烯微球首先用濃度為50mmol/L的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至終濃度0.5％w/v，得到pH為5.5～6.5的微球溶液，溶液的體積是40mL；2、以2-嗎啉乙磺酸緩沖液溶解碳化二亞胺，得到濃度為10mg/mL的碳化二亞胺溶液；3、以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量為計，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例將碳化二亞胺溶液滴加至微球溶液中，共滴加80μL，4℃震蕩活化1h，震蕩速度為50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；4、將DD單克隆抗體(市售DD單克隆抗體DD2和DD41，兩者的終濃度≤10mg/mL)在pH8.5～9.5條件下溶解，溶劑是50mmol/L的硼酸鹽緩沖液，使抗體終濃度在0.008mg/mL，得到FDP單抗溶液，溶液的體積是40mL，儲存于4℃?zhèn)溆茫?、將FDP單抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗體與微球質量比為0.001～0.02:1，整個滴加過程持續(xù)5min，兩者的混合液呈中性，之后4℃震蕩16h，震蕩速度為50r/min，即得D-二聚體免疫膠乳微球1。實施例2本發(fā)明所提供的D-二聚體免疫膠乳微球制備方法如下：1、準備粒徑200nm的聚苯乙烯微球，濃度為10％，取用2ml；聚苯乙烯微球首先用濃度為50mmol/L的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至終濃度0.4％w/v，得到pH為5.5～6.5的微球溶液，溶液的體積是50mL；2、以2-嗎啉乙磺酸緩沖液溶解碳化二亞胺，得到濃度為10mg/mL的碳化二亞胺溶液；3、以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量為計，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例將碳化二亞胺溶液滴加至微球溶液中，共滴加80μL，8℃震蕩活化1h，震蕩速度為30r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；4、將DD單克隆抗體(市售DD單克隆抗體DD2和DD41，兩者的總濃度≤10mg/mL)在pH8.5～9.5條件下溶解，溶劑是50mmol/L的硼酸鹽緩沖液，使抗體終濃度在0.02mg/mL，得到FDP單抗溶液，溶液的體積是40mL，儲存于4℃?zhèn)溆茫?、將FDP單抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗體與微球質量比為0.001～0.02:1，整個滴加過程持續(xù)4min，兩者的混合液呈中性，之后8℃震蕩12h，震蕩速度為30r/min，即得D-二聚體免疫膠乳微球2。實施例3本發(fā)明所提供的D-二聚體免疫膠乳微球制備方法如下：1、準備粒徑400nm的聚苯乙烯微球，濃度為10％，取用2ml；聚苯乙烯微球首先用濃度為50mmol/L的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至終濃度0.6％w/v，得到pH為5.5～6.5的微球溶液，溶液的體積是40mL；2、以2-嗎啉乙磺酸緩沖液溶解碳化二亞胺，得到濃度為10mg/mL的碳化二亞胺溶液；3、以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量為計，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例將碳化二亞胺溶液滴加至微球溶液中，共滴加84μL，2℃震蕩活化1h，震蕩速度為50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；4、將DD單克隆抗體(市售DD單克隆抗體DD2和DD41，兩者的總濃度≤10mg/mL)在pH8.5～9.5條件下溶解，溶劑是50mmol/L的硼酸鹽緩沖液，使抗體終濃度在0.005mg/mL，得到FDP單抗溶液，溶液的體積是40mL，儲存于4℃?zhèn)溆茫?、將FDP單抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗體與微球質量比為0.001～0.02:1，整個滴加過程持續(xù)4min，兩者的混合液呈中性，之后2℃震蕩24h，震蕩速度為50r/min，即得D-二聚體免疫膠乳微球3。實施例4以實施例1制備的D-二聚體免疫膠乳微球1為原料，制備膠乳增強免疫比濁法測定D-二聚體的試劑盒。其各組分如下：D-二聚體檢測試劑R1中各組分及含量為：0.8％BSA、0.5％NaCl、200mMTris(pH＝7.4)、0.02％PEG6000、0.05％NaN3；D-二聚體檢測試劑R2中各組分的及含量為：0.4％BSA、6％蔗糖、1mg/ml的D-二聚體免疫膠乳微球、25mmol/L的甘氨酸緩沖液(pH＝7.4)、0.05％NaN3；D-二聚體校準品中各組分及含量為：0.8％BSA、0.5％NaCl、6％蔗糖、0.1％海藻糖、20mg/L的D-二聚體、25mmol/L的甘氨酸緩沖液、0.05％NaN3。其中，D-二聚體檢測試劑R2的制備步驟如下：1、向80mL的D-二聚體免疫膠乳微球1的溶液中加入40mL封閉液，25℃震蕩2h，然后轉入4℃震蕩24h，震蕩速度為50r/min，得到膠乳溶液；封閉液組分為：3％w/v的BSA、100mmol/L的甘氨酸緩沖液(pH＝8.5不含防腐劑)。2、膠乳溶液以15000r/min離心15～25min，去掉上清液，然后加入含有NaN3成分的貯存液至貯存濃度，超聲分散即得。實施例5以實施例1制備的D-二聚體免疫膠乳微球1為原料，制備膠乳增強免疫比濁法測定D-二聚體的試劑盒。其各組分如下：D-二聚體檢測試劑R1中各組分及含量為：0.4％BSA、0.9％NaCl、100mMTris(pH＝7.4)、2％PEG8000、0.1％Proclin300；D-二聚體檢測試劑R2中各組分的及含量為：0.6％BSA、2％蔗糖、2mg/ml的D-二聚體免疫膠乳微球、50mmol/L的甘氨酸緩沖液(pH＝7.4)、0.1％Proclin300；D-二聚體校準品中各組分及含量為：0.4％BSA、0.9％NaCl、2％蔗糖、0.5％海藻糖、20mg/L的D-二聚體、50mmol/L的甘氨酸緩沖液、0.1％Proclin300。其中，D-二聚體檢測試劑R2的制備步驟如下：1、向80mL的D-二聚體免疫膠乳微球1的溶液中加入40mL封閉液，25℃震蕩2h，然后轉入4℃震蕩24h，震蕩速度為50r/min，得到膠乳溶液；封閉液組分為：3％w/v的BSA、100mmol/L的甘氨酸緩沖液(pH＝8.5不含防腐劑)。2、膠乳溶液以15000r/min離心30～45min，去掉上清液，然后加入含有Proclin300成分的貯存液至貯存濃度，超聲分散即得。實施例6以實施例1制備的D-二聚體免疫膠乳微球1為原料，制備膠乳增強免疫比濁法測定D-二聚體的試劑盒。其各組分如下：D-二聚體檢測試劑R1中各組分及含量為：3％BSA、50mM乙二胺四乙酸二鈉、0.9％的NaCl、1％的Tween-20、1％的丙三醇、10mM的磷酸鹽緩沖液(PBS)、100mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸-氫氧化鈉緩沖液(Hepes)、1％的PEG6000、0.02％的硫柳汞；D-二聚體檢測試劑R2中各組分的含量為：10％的丙三醇、0.05％葡萄糖、1mg/ml的D-二聚體免疫膠乳微球、10mM的3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸-氫氧化鈉緩沖液(Mopso)、0.04％的硫柳汞；D-二聚體校準品中各組分的含量為：1％的Tween-20、10％的丙三醇、0.05％葡萄糖、20mg/L的D-二聚體、200mM的硼酸鹽緩沖液(BBS)、0.04％的硫柳汞；其中，D-二聚體檢測試劑R2的制備步驟如下：1、向80mL的D-二聚體免疫膠乳微球1的溶液中加入40mL封閉液，25℃震蕩2h，然后轉入4℃震蕩24h，震蕩速度為50r/min，得到膠乳溶液；封閉液中含葡萄糖、丙三醇和3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸-氫氧化鈉緩沖液(Mopso)。2、膠乳溶液以15000r/min離心30～45min，去掉上清液，然后加入含有硫柳汞成分的貯存液至貯存濃度1mg/mL，超聲分散即得。實施例7以實施例1制備的D-二聚體免疫膠乳微球1為原料，制備膠乳增強免疫比濁法測定D-二聚體的試劑盒。其各組分如下：D-二聚體檢測試劑R1中各組分的含量為：5mM乙二胺四乙酸二鈉、10％的丙三醇、50mmol/L的甘氨酸緩沖液、6％的硫酸葡聚糖、0.08％的NaN3；D-二聚體檢測試劑R2中各組分的含量為：0.9％的NaCl、3％BSA、50mM乙二胺四乙酸二鈉、1％的Tween-20、10％的丙三醇、3％甘露醇、2％海藻糖、5mg/ml的D-二聚體免疫膠乳微球、110mM的Tris、0.05％的Proclin300；D-二聚體校準品中各組分的含量為：1％的NaCl、3％甘露醇、2％海藻糖、20mg/L的D-二聚體、50mM的磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.02％的NaN3；其中，D-二聚體檢測試劑R2的制備步驟如下：1、向100mL的D-二聚體免疫膠乳微球1的溶液中加入50mL封閉液，25℃震蕩2h，然后轉入4℃震蕩24h，震蕩速度為50r/min，得到膠乳溶液；封閉液中含NaCl、BSA、乙二胺四乙酸二鈉、Tween-20、丙三醇、甘露醇、海藻糖、及Tris。2、膠乳溶液以15000r/min離心30～45min，去掉上清液，然后加入含有Proclin300成分的貯存液至貯存濃度5mg/mL，超聲分散即得。試驗例一、D-二聚體免疫膠乳微球偶聯效率及活性檢測(1)準備4份50mg的CRP多克隆抗體及4份粒徑120nm的聚苯乙烯膠乳顆粒，三份采用實施例1～3所提供的制備方法，制得D-二聚體免疫膠乳微球1～3；(2)另一份采用現有D-二聚體免疫膠乳微球的制備方法，制得對照D-二聚體免疫膠乳微球；對照D-二聚體免疫膠乳微球的制備方法步驟如下：1)取1ml的表面帶有羧基基團的聚苯乙烯膠乳顆粒(顆粒直徑240nm)用50mM的pH＝6.0的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至10ml，終濃度為1％w/v。2)再加入0.5％w/v的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和0.5％w/v的硫代N羥基琥珀酰胺進行活化膠乳，37℃水浴1小時。3)離心，去上清液(含殘留活化交聯劑)，用2-嗎啉乙磺酸緩沖液清洗一遍，再加入50mg的DD單克隆抗體進行交聯反應，37℃水浴4小時，即得。(3)對D-二聚體免疫膠乳微球1～3和對照D-二聚體免疫膠乳微球分別離心分離，以收集上清中未偶聯的抗體，然后再對上述微球分別加入封閉液，封閉膠乳表面殘留活化位點。針對上述免疫乳膠微球的檢測試驗如下：1、通過在封閉前離心分離未偶聯的抗體，采用BCA蛋白濃度測定法得到未偶聯抗體的質量，即可求出偶聯效率，得到實施例1～3的制備方法偶聯效率分別為95、86、90％，而現有制備方法的偶聯效率為75％。2、通過酶聯免疫吸附法檢測上述已封閉的免疫膠乳微球的抗體效價，計算得出D-二聚體免疫膠乳微球1～3的活性分別為1:640、1:610、1:600，對照D-二聚體免疫膠乳微球的活性為1:40。上述試驗證明本發(fā)明方法既保證了抗體的偶聯效率，同時極大程度的降低了活化劑對抗體活性的破壞。二、試劑盒在生化分析儀上的應用1、將實施例4中的D-二聚體校準品配置成5個濃度梯度和一個空白對照，采用透射比濁蛋白分析儀進行檢測，檢測步驟為：將15ul的各校準品分別加入到裝有150ul的D-二聚體檢測試劑R1試劑和攪拌子的比色杯中，將比色杯放入檢測口，儀器自動檢測到比色杯，再加入150ulD-二聚體檢測試劑R2試劑加入到比色杯中，儀器自動攪拌混勻10s，測定吸光度OD1，反應1min后，測定吸光度OD2，儀器自動計算吸光度的差值：ΔOD＝OD2-OD1。每個濃度檢測5次，測得的各濃度校準品的ΔOD的平均值作縱坐標，相應的濃度作橫坐標，制作濃度-吸光度差值校準曲線，通過excel計算得到曲線方程為Y＝0.1646X-0.0034。2、然后放入待測品1人的血漿，測定得到其吸光度差值ΔOD，然后根據上述濃度-吸光度差值校準曲線，計算得到待測品1中D-二聚體的濃度。3、同一份人血待測品1稀釋10倍，然后采用實施例4的試劑盒進行檢測，測定得到其吸光度差值，然后根據上述濃度-吸光度差值校準曲線，計算得到人血待測品1稀釋100倍后，其中D-二聚體的濃度。重復上述人血待測品1檢測5次，所得的結果見下表1表1人血待測品中CRP濃度檢測重復試驗測定的數值偏小，是會導致CV值偏大.4、同一份人血待測品1再采用實施例5～7的試劑盒進行檢測，測定得到其吸光度差值，然后根據各個試劑盒的濃度-吸光度差值校準曲線，計算得到待測品1中D-二聚體的濃度，重復5次取平均值，并計算Cv％，所得的結果見下表2。表2不同試劑盒針對同一人血待測品檢測試驗試劑盒實施例編號實施例4實施例5實施例6實施例7人血待測品中DD濃度0.78mg/L0.82mg/L0.93mg/L0.71mg/LCv％4.33％4.79％4.52％4.98％上述試驗表明，本發(fā)明的試劑盒最低檢測低限可達0.01mg/L，靈敏度高、定量準確、重復性好、性質穩(wěn)定。當前第1頁1 2 3