專利名稱：選擇適于wt1疫苗患者的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的方法以及包括所述選擇方法的用于治療癌癥的治療方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種在作為指標(biāo)的WT1-特異性CTL前體頻度等基礎(chǔ)上選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的方法。
背景技術(shù)：
業(yè)已鑒定WT1基因(Wilms腫瘤基因1)是Wilms腫瘤即小兒腎腫瘤的致病基因之一(Cell 60509，1990，Nature 343774，1990)。WT1基因編碼轉(zhuǎn)錄因子WT1，WT1在諸如細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及組織發(fā)育的眾多過程中起重要作用(Int.Rev.Cytol.181151，1998)。最初WT1基因被解釋是一種腫瘤抑制基因。然而，后續(xù)研究揭示W(wǎng)T1基因在白血病和包括肺癌和乳腺癌的多種實(shí)體瘤中高表達(dá)，因而，表明WT1基因更確切地發(fā)揮著促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的致癌功能。另外，證實(shí)用WT1-衍生的肽體外刺激對(duì)HLA-A*0201或HLA*-A0202陽(yáng)性的外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)了肽-特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)，并且CTLs殺死了內(nèi)源性表達(dá)WT1的白血病和實(shí)體瘤細(xì)胞。這些結(jié)果證實(shí)WT1是癌癥免疫治療有希望的靶分子(Int.J.Hematol 76127，2002)。
已知體外測(cè)定抗原肽-特異性CTLs的方法，包括HLA單體方法、HLA二聚體方法和HLA四聚體方法(Science 27494，1996)、HLA五聚體方法和ELISPOT方法(J.Immunol.Methods 11029，1988)、實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)(J.Immunol.Methods 210195，1997)、有限稀釋方法(Br.J.Cancer 771907，1998)等等。通過生物素?；瘡?fù)合物(HLA單體)制備HLA-四聚體，該復(fù)合物通過連接肽與HLAα-鏈和β2-微球蛋白形成，并使其單體與熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白結(jié)合以用于四聚化。CTLs頻度可通過用HLA四聚體染色肽-特異性CTLs并用流式細(xì)胞儀分析而得到測(cè)定。通過HLA單體方法、HLA二聚體方法和HLA五聚體方法對(duì)CTL頻度的測(cè)定都可根據(jù)相同的原理進(jìn)行。
未被疫苗刺激的CTLs稱為“CTL前體細(xì)胞”。認(rèn)為對(duì)給定癌抗原特異的CTL前體細(xì)胞存在的頻度越高，則誘導(dǎo)特異性CTLs的效率也越高，當(dāng)所述抗原作為癌疫苗施用時(shí)，更易獲得癌疫苗治療的臨床應(yīng)答。換句話說，如果在疫苗接種前選擇出表現(xiàn)高頻度存在對(duì)所選擇的給定癌抗原特異的CTLs前體細(xì)胞的患者，則使用所述癌抗原治療可能更有效。
使用HLA四聚體和黑素瘤患者的外周血單核細(xì)胞(PBMC)以及在幾篇文章中所報(bào)道的測(cè)定了CTL前體細(xì)胞頻度，然而，它們顯示了對(duì)癌抗原肽特異的CTL前體細(xì)胞的頻度低(J.Immunother.2466，2001、Hum.Gene.Ther.13569，2002)。從這些結(jié)果可以看出對(duì)抗原特異的CTL前體細(xì)胞的存在頻度通常很低，因此以CTL前體細(xì)胞頻度作為指標(biāo)，難以選擇適于癌癥疫苗的患者。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在作為指標(biāo)的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞頻度等基礎(chǔ)上選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的方法。
本發(fā)明人使用來(lái)自WT1的癌抗原肽制備了HLA四聚體，并在造血惡性腫瘤或肺癌患者中，在疫苗施用前CTL前體細(xì)胞頻度的測(cè)定中使用所產(chǎn)生的四聚體。令人吃驚的是，較迄今為止已知的健康個(gè)體，發(fā)現(xiàn)CTL前體細(xì)胞(WT1-特異性CTL前體細(xì)胞)以高頻度存在。該結(jié)果揭示了，只要與癌抗原相關(guān)，以WT1-特異性CTL前體細(xì)胞頻度為指標(biāo)即有可能選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者或鑒定WT1疫苗靶分子。同樣地，既然患多種癌癥的患者顯示了高頻度的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞，那么很清楚癌癥的診斷可基于作為指標(biāo)的WT1特異性CTL前體細(xì)胞頻度。
本發(fā)明人接著根據(jù)相關(guān)的功能對(duì)WT1-特異性CTL前體細(xì)胞進(jìn)一步分類，并發(fā)現(xiàn)，特別是效應(yīng)物型CTL前體細(xì)胞(此后，可簡(jiǎn)稱為“效應(yīng)細(xì)胞”)在CTL前體細(xì)胞中以高比例存在。該結(jié)果表明對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的選擇或癌癥的診斷也可在作為指標(biāo)的效應(yīng)物型WT1特異性CTL前體細(xì)胞的頻度基礎(chǔ)上進(jìn)行。
另外，本發(fā)明人測(cè)定了經(jīng)歷來(lái)自WT1癌抗原肽(“WT1肽”)治療的患者中WT1-特異性CTLs的頻度，并發(fā)現(xiàn)相對(duì)于給藥之前所獲得的結(jié)果，治療效果與給藥后CTL頻度的增加相關(guān)，。
在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
因而，本發(fā)明提供了下列各項(xiàng)
(1)一種選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答的患者的方法，包括下列(a)、(b)和(c)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)測(cè)定(a)中生物學(xué)樣品的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量；和(c)判斷(b)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答性。
(2)如上述(1)的選擇方法，其中通過HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法、HLA五聚體方法、ELISPOT方法、實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)和有限稀釋方法的任一種進(jìn)行WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量的測(cè)定。
(3)如上述(2)的選擇方法，其中通過HLA四聚體方法進(jìn)行測(cè)定。
(4)如上述(3)的選擇方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將(a)中生物學(xué)樣品與含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA四聚體接觸；(c)測(cè)定與HLA四聚體結(jié)合的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量；和(d)判斷(c)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答性。
(5)如上述(4)的選擇方法，其中通過測(cè)定在CD8-陽(yáng)性或CD8/CD3-陽(yáng)性CTL前體細(xì)胞中HLA四聚體結(jié)合細(xì)胞的比例進(jìn)行(4)中步驟(c)。
(6)如上述(4)或(5)的選擇方法，其中作為HLA四聚體組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(7)如上述(4)-(6)中任一項(xiàng)的選擇方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
(8)如上述(1)-(7)中任一項(xiàng)的選擇方法，其使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行。
(9)如上述(1)-(8)中任一項(xiàng)的選擇方法，其中使用與健康受試者相比為1.5倍或更高的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量作為指標(biāo)評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答性。
(10)如上述(1)的選擇方法，其中CTL前體細(xì)胞是效應(yīng)物型CTL前體細(xì)胞。
(11)如上述(10)的選擇方法，其使用HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法、HLA五聚體方法、ELISPOT方法、實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)和有限稀釋方法的任一種測(cè)定效應(yīng)物型的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量。
(12)如上述(11)的選擇方法，其使用HLA四聚體方法。
(13)如上述(12)的選擇方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將(a)中生物學(xué)樣品與含有WT1-衍生的癌抗原肽、抗-CD8抗體、抗-CD45RA抗體和抗-CD27抗體的HLA四聚體接觸；(c)測(cè)定對(duì)CD8或CD8/CD3陽(yáng)性并與HLA四聚體結(jié)合的CTL前體細(xì)胞中CD45RA-陽(yáng)性和CD27-陰性的效應(yīng)物型CTL前體細(xì)胞的比例；和(d)判斷(c)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答性。
(14)如上述(13)的選擇方法，其中作為HLA四聚體組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(15)如上述(13)或(14)的選擇方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
(16)如上述(10)-(15)中任一項(xiàng)的選擇方法，其使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行。
(17)一種診斷癌癥的方法，包括下列(a)、(b)和(c)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)測(cè)定(a)中生物學(xué)樣品的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量；和(c)判斷(b)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)測(cè)試受試者是否患癌癥。
(18)如上述(17)的診斷方法，其中通過HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法、HLA五聚體方法、ELISPOT方法、實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)和有限稀釋方法的任一種進(jìn)行WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量的測(cè)定。
(19)如上述(18)的診斷方法，其中通過HLA四聚體方法進(jìn)行測(cè)定。
(20)如上述(19)的診斷方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將(a)中生物學(xué)樣品與含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA四聚體接觸；(c)測(cè)定與HLA四聚體結(jié)合的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量；和(d)判斷(c)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)測(cè)試受試者是否患癌癥。
(21)如上述(20)的診斷方法，其中通過測(cè)定CD8-陽(yáng)性或CD8/CD3-陽(yáng)性CTL前體細(xì)胞中HLA四聚體結(jié)合細(xì)胞的比例進(jìn)行(20)中步驟(c)。
(22)如上述(20)或(21)的診斷方法，其中作為HLA四聚體組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(23)如上述(20)-(22)中任一項(xiàng)的診斷方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
(24)如上述(17)-(23)中任一項(xiàng)的診斷方法，其使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行。
(25)如上述(17)-(24)中任一項(xiàng)的診斷方法，其中使用與健康受試者相比為1.5倍或更高的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量作為指標(biāo)診斷癌癥。
(26)如上述(17)的診斷方法，其中CTL前體細(xì)胞是效應(yīng)物型CTL前體細(xì)胞。
(27)如上述(26)的診斷方法，其使用HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法、HLA五聚體方法、ELISPOT方法、實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)和有限稀釋方法的任一種測(cè)定WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量。
(28)如上述(27)的診斷方法，其使用HLA四聚體方法。
(29)如上述(28)的診斷方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將(a)中生物學(xué)樣品與含有WT1-衍生的癌抗原肽、抗-CD8抗體、抗-CD45RA抗體和抗-CD27抗體的HLA四聚體接觸；(c)測(cè)定對(duì)CD8或CD8/CD3陽(yáng)性并與HLA四聚體結(jié)合的CTL前體細(xì)胞中CD45RA-陽(yáng)性和CD27-陰性的效應(yīng)物型CTL前體細(xì)胞的比例；和(d)判斷(c)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)測(cè)試受試者是否患癌癥。
(30)如上述(29)的診斷方法，其中作為HLA四聚體組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(31)如上述(29)或(30)的診斷方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
(32)如上述(26)-(31)中任一項(xiàng)的診斷方法，其使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行。
(33)一種鑒定WT1疫苗的靶分子的方法，所述分子對(duì)于患者是特有的，包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將WT1疫苗的多個(gè)靶分子分別應(yīng)用于(a)的生物學(xué)樣品；(c)分別測(cè)定(b)的生物學(xué)樣品中的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量，并相互比較結(jié)果；和(d)在(c)中獲得結(jié)果的基礎(chǔ)上鑒定對(duì)測(cè)試患者有效的WT1疫苗的靶分子。
(34)如上述(33)的鑒定方法，其中使用HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法、HLA五聚體方法、ELISPOT方法、實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)和有限稀釋方法的任一種進(jìn)行WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量的測(cè)定。
(35)如上述(34)的鑒定方法，其中使用HLA四聚體方法進(jìn)行測(cè)定。
(36)如上述(35)的鑒定方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將含有不同WT1-衍生的癌抗原肽的多個(gè)HLA四聚體分別與(a)的生物學(xué)樣品接觸；(c)分別測(cè)定與HLA四聚體結(jié)合的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量，并相互比較結(jié)果；和(d)在(c)中獲得結(jié)果的基礎(chǔ)上鑒定對(duì)測(cè)試患者有效的WT1-衍生的癌抗原肽。
(37)如上述(36)的鑒定方法，其中通過測(cè)定CD8-陽(yáng)性或CD8/CD3-陽(yáng)性CTL前體細(xì)胞中與HLA四聚體結(jié)合的細(xì)胞的比例進(jìn)行(36)中步驟(c)。
(38)如上述(36)或(37)中的鑒定方法，其中作為HLA四聚體組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(39)如上述(36)-(38)中任一項(xiàng)的鑒定方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
(40)如上述(33)-(39)中任一項(xiàng)的鑒定方法，其使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行。
(41)一種用于選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的臨床診斷試劑，其包含作為成分的、含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體。
(42)如上述(41)的臨床診斷試劑，其中作為HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(43)如上述(41)或(42)的臨床診斷試劑，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
(44)一種包含如上述(41)-(43)中任一項(xiàng)的臨床診斷試劑的試劑盒。
(45)一種用于在給定患者中治療癌癥的藥物組合物，其包括如上述(33)-(40)中任一項(xiàng)的WT1疫苗的靶分子的鑒定方法鑒定的靶分子，所述靶分子是患者特有的。
(46)一種用于癌癥的診斷試劑，其包含作為成分的、含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體。
(47)如上述(46)的診斷試劑，其中作為HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(48)如上述(46)或(47)的診斷試劑，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
(49)一種試劑盒，其包含如上述(46)-(48)中任一項(xiàng)的診斷試劑。
(50)一種確定患者對(duì)WT1疫苗適合性的方法，包括下列(a)、(b)和(c)步驟(a)從接受了WT1疫苗的測(cè)試受試者中分離含有CTL的生物學(xué)樣品；(b)測(cè)定(a)中生物學(xué)樣品的WT1-特異性CTLs的存在頻度或數(shù)量；和(c)判斷(b)的測(cè)定值相對(duì)于WT1疫苗施用前所獲得的生物學(xué)樣品是否高，并評(píng)價(jià)患者是否適于WT1疫苗治療。
(51)如上述(50)的確定方法，其中使用HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法、HLA五聚體方法、ELISPOT方法、實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)和有限稀釋方法的任一種進(jìn)行WT1-特異性CTLs的存在頻度或數(shù)量的測(cè)定。
(52)如上述(51)的確定方法，其中使用HLA四聚體方法進(jìn)行測(cè)定。
(53)如上述(52)的確定方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從接受了WT1疫苗的測(cè)試受試者中分離含有CTLs的生物學(xué)樣品；
(b)將含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA四聚體與(a)的生物學(xué)樣品接觸；(c)測(cè)定與HLA四聚體結(jié)合的WT1-特異性CTLs的存在頻度或數(shù)量；和(d)判斷(c)的測(cè)定值相對(duì)于WT1疫苗施用前所獲得的生物學(xué)樣品是否高，并評(píng)價(jià)患者是否適于WT1疫苗治療。
(54)如上述(53)的確定方法，其中通過測(cè)定CD8-陽(yáng)性或CD8/CD3-陽(yáng)性CTLs中與HLA四聚體結(jié)合的細(xì)胞的比例進(jìn)行(53)中步驟(c)。
(55)如上述(53)或(54)中的確定方法，其中作為HLA四聚體組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(56)如上述(53)-(55)中任一項(xiàng)的鑒定方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
(57)如上述(50)-(56)中任一項(xiàng)的確定方法，其使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行。
(58)如上述(50)-(57)中任一項(xiàng)的確定方法，其中使用與給藥之前所獲得的樣品相比為1.5倍或更高的WT1-特異性CTLs的存在頻度或數(shù)量作為指標(biāo)評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗治療的適合性。
(59)一種用于確定對(duì)WT1疫苗適合性的臨床診斷試劑，其包含作為成分的、含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體。
(60)如上述(59)的臨床診斷試劑，其中作為HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(61)如上述(59)或(60)的臨床診斷試劑，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
(62)一種包含如上述(59)-(61)中任一項(xiàng)的臨床診斷試劑的試劑盒。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及下列各項(xiàng)(63)一種與上述提及的實(shí)施方案(1)有關(guān)的治療患者癌癥的方法，其包括通過下列(a)、(b)和(c)步驟選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答的患者(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)測(cè)定(a)中生物學(xué)樣品的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量；和(c)判斷(b)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答性；和用WT1或WT1-衍生的癌抗原肽治療所選擇的患者；和一種治療患者癌癥的方法，其中所述患者通過如上述(2)-(16)中任一項(xiàng)的方法進(jìn)行選擇。
(64)一種與上述提及的實(shí)施方案(33)有關(guān)的治療給定患者癌癥的方法，其包括施用WT1疫苗的靶分子，所述分子是患者特有的，并通過包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟的方法得到鑒定(a)從測(cè)試患者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將多個(gè)WT1疫苗的靶分子分別應(yīng)用于(a)的生物學(xué)樣品；(c)分別測(cè)定(b)的生物學(xué)樣品的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量，并相互比較結(jié)果；和(d)在(c)中獲得結(jié)果的基礎(chǔ)上鑒定對(duì)測(cè)試患者有效的WT1疫苗的靶分子；和一種治療給定患者癌癥的方法，其包括施用WT1疫苗的靶分子，所述分子對(duì)于患者是特有的，并通過(34)-(40)中任一項(xiàng)的方法得到鑒定。
(65)一種與上述提及的實(shí)施方案(50)有關(guān)的治療癌癥的方法，其包括用WT1或WT1-衍生的癌抗原肽治療患者，所述患者業(yè)已通過確定患者對(duì)WT1疫苗適合性的方法評(píng)價(jià)為適合的，包括下列(a)、(b)和(c)步驟(a)在WT1疫苗施用后從患者中分離含有CTLs的生物學(xué)樣品；(b)測(cè)定(a)的生物學(xué)樣品中WT1-特異性CTLs的存在頻度或數(shù)量；(c)判斷(b)的測(cè)定值相對(duì)于WT1疫苗施用前所獲得的生物學(xué)樣品是否高，并評(píng)價(jià)患者是否適于WT1疫苗治療；和一種治療患者癌癥的方法，所述患者通過上述(51)-(58)中任一項(xiàng)方法的評(píng)價(jià)是適合的。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了癌癥患者和健康個(gè)體中WT1-特異性CTL前體的存在頻度?？v軸表示CTL前體(前體細(xì)胞)的頻度?！把北硎緩腍LA-A2402-陽(yáng)性的造血惡性腫瘤患者中獲得的結(jié)果。術(shù)語(yǔ)“肺癌”表示從HLA-A2402-陽(yáng)性的肺癌患者中獲得的結(jié)果，以及術(shù)語(yǔ)“健康”表示從HLA-A2402-陽(yáng)性的健康個(gè)體中獲得的結(jié)果。
發(fā)明的最佳實(shí)施方式本發(fā)明提供一種選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的方法，包括下列(a)、(b)和(c)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)測(cè)定(a)中生物學(xué)樣品的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量；和(c)判斷(b)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答性，和一種治療由所述方法選擇的患者癌癥的方法。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)患者在疫苗施用前體內(nèi)的CTL前體細(xì)胞(WT1-特異性CTL前體細(xì)胞)頻度交較今所知道的都要高。因此，在WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的數(shù)量或頻度作為指標(biāo)的基礎(chǔ)上選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答的患者。
步驟(a)中的測(cè)試受試者指被懷疑或診斷患有癌癥的人，具體地說，是被懷疑或診斷患有包括血癌如白血病、骨髓增生異常綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤和惡性淋巴瘤和實(shí)體瘤如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、和卵巢癌的癌癥的人。優(yōu)選的實(shí)施例是被懷疑或診斷患有白血病、骨髓增生異常綜合癥和肺癌的人。
至于從步驟(a)的測(cè)試受試者中分離的生物學(xué)樣品并沒有限制，只要其含有CTL前體細(xì)胞即可。具體的例子包括血液、淋巴液或其培養(yǎng)物、分離自血液的外周血單核細(xì)胞(PBMCs)、或T細(xì)胞浸潤(rùn)的組織等等。生物學(xué)樣品可直接使用，或稀釋或濃縮后使用。優(yōu)選的例子是PBMC，可通過諸如Ficoll-Hypaque密度梯度離心的常規(guī)方法進(jìn)行分離。
可使用本領(lǐng)域任何已知可以測(cè)定CTL的存在頻度或數(shù)量的方法進(jìn)行步驟(b)中WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量的測(cè)定方法。具體的例子包括HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法、HLA五聚體方法、ELISPOT方法、實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)、有限稀釋方法等等。
在此所用的，HLA四聚體方法是一種其中使用通過生物素?；疕LA單體(通過用目標(biāo)抗原肽將HLA抗原α鏈與β2微球蛋白連接形成所述單體)，并使其與用于四聚化的熒光素標(biāo)記的抗生物素蛋白結(jié)合制備的HLA四聚體檢測(cè)抗原肽-特異性CTL的方法。具體地說，CTL數(shù)量可通過用所述HLA四聚體染色抗原肽-特異性CTL并用流式細(xì)胞儀分析得到測(cè)定。HLA四聚體的制備和CTLs的檢測(cè)均使用已知的方法，可根據(jù)例如文獻(xiàn)(Science 27494，1996)中描述的方法進(jìn)行。
HLA單體方法是一種其中使用在HLA四聚體制備中使用的HLA單體檢測(cè)抗原肽-特異性CTL的方法，該單體通過用抗原肽連接HLA抗原α鏈和β2微球蛋白，接著生物素?；纬伞?br> HLA二聚體方法是一種其中使用通過將HLA抗原α鏈和Ig(免疫球蛋白，例如，IgG1)融合，并使所產(chǎn)生的融合與β2微球蛋白、抗原肽結(jié)合制備的HLA二聚體檢測(cè)抗原肽-特異性CTL的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906671-6675(1993))?？赏ㄟ^例如允許標(biāo)記的抗-IgG1抗體與IgG1結(jié)合來(lái)檢測(cè)抗原肽-特異性CTLs與HLA二聚體的結(jié)合。
HLA五聚體方法是一種最近才開發(fā)的方法，其中使用五聚體檢測(cè)抗原肽-特異性CTL，五聚體中HLA抗原和抗原肽的五個(gè)復(fù)合分子通過卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域聚合。因?yàn)镠LA抗原-抗原肽復(fù)合體可用熒光或類似物標(biāo)記，因此可使用流式細(xì)胞儀或類似儀器進(jìn)行分析，如在HLA五聚體方法中所使用的(見http://www.proimmune.co.uk/)。
上述提及的HLA-單體、二聚體、四聚體或五聚體都可以通過制造商如ProImmune或BD Biosciences定制生產(chǎn)而獲得。
ELISPOT方法是一種其中通過將細(xì)胞因子如IFN-γ或GM-CAF的抗體固定在平板上，加入預(yù)定抗原或抗原肽刺激的生物學(xué)樣品，用針對(duì)生物學(xué)樣品中激活的CTL分泌的細(xì)胞因子的抗-細(xì)胞因子抗體以與上述固定的抗體結(jié)合的斑點(diǎn)的形式檢測(cè)生物學(xué)樣品中的CTL的方法。使用ELISPOT方法測(cè)定CTL的方法是已知的，可以根據(jù)文獻(xiàn)(例如，J.Immunol.Methods 11029，1988)中描述的方法進(jìn)行。
實(shí)時(shí)RT-PCR方法是一種其中通過RT-PCR的方式測(cè)定編碼通過激活CTL產(chǎn)生的諸如IFN-γ、GM-CA或類似物的細(xì)胞因子的基因來(lái)間接測(cè)定與目標(biāo)抗原或抗原肽反應(yīng)的CTL的頻度的方法。通過實(shí)時(shí)RT-PCR方法測(cè)定CTL的方法是已知的，可以根據(jù)文獻(xiàn)(例如，J.Immunol.Methods 210195，1997)中描述的方法進(jìn)行。
有限稀釋方法是一種其中通過將含有CTLs的生物學(xué)樣品根據(jù)不同的細(xì)胞密度平鋪在孔中，在目標(biāo)抗原或抗原肽刺激的同時(shí)培育平板，測(cè)定激活的CTLs產(chǎn)生的細(xì)胞因子的量或細(xì)胞毒性，以陽(yáng)性孔數(shù)目為基礎(chǔ)確定CTL頻度的方法。通過有限稀釋方法測(cè)定CTL的方法是已知的，可以根據(jù)文獻(xiàn)(例如，Br.J.Cancer771907，1998)中描述的方法進(jìn)行。
可以根據(jù)用于確定上述提及的CTL的已知方法測(cè)定WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的數(shù)量或頻度。
步驟(c)中對(duì)WT1疫苗應(yīng)答性的評(píng)價(jià)可通過比較步驟(b)中所獲得的測(cè)試受試者中WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量(此后，稱作“測(cè)試受試者值”)和健康受試者中的(此后，稱作“健康受試者值”)，并判斷兩者之間的差異來(lái)進(jìn)行。在該情況下，就需要從健康受試者中分離并制備生物學(xué)樣品(血液、淋巴液、PBMC等)，其可通過從不患癌癥的受試者中收集生物學(xué)樣品而獲得。在此所使用的“健康受試者”是指診斷不患癌癥的人。
測(cè)試受試者值和健康受試者值之間的比較可通過平行測(cè)定測(cè)試受試者的生物學(xué)樣品和健康受試者的生物學(xué)樣品進(jìn)行。當(dāng)無(wú)法進(jìn)行平行比較時(shí)，也可以使用在不變條件下通過測(cè)定多個(gè)(至少兩個(gè)，優(yōu)選三個(gè)或更多個(gè)，更優(yōu)選五個(gè)或更多個(gè))健康受試者的生物學(xué)樣品獲得的健康受試者值的平均值或統(tǒng)計(jì)中間值進(jìn)行比較。
進(jìn)行測(cè)試受試者是否對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答評(píng)價(jià)可使用一種指標(biāo)，即與健康受試者值相比測(cè)試受試者值為1.5倍或更高，優(yōu)選為2倍或更高。也就是說，當(dāng)測(cè)試受試者數(shù)值與健康受試者數(shù)值相比為1.5倍或更高，優(yōu)選的為2倍或更高時(shí)，對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答被評(píng)價(jià)為高的。當(dāng)患者對(duì)WT1疫苗應(yīng)答高時(shí)，則其適于WT1疫苗，換句話說，有可能優(yōu)選使用WT1疫苗對(duì)患者進(jìn)行治療。
在上述提及的測(cè)定CTL的方法中，從易用性和準(zhǔn)確度角度考慮HLA四聚體方法是最優(yōu)選的。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種選擇并治療對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的方法，其特征在使用了HLA四聚體方法。正如上述提及的，HLA單體方法、HLA二聚體方法和HLA五聚體方法與HLA四聚體方法的原理是一樣的，都是用于測(cè)定CTL的優(yōu)選方法。然而，本發(fā)明在此描述的是使用HLA四聚體方法作為例子。
該選擇并治療對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的方法使用了HLA四聚體方法，具體地說，包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將(a)中生物學(xué)樣品與含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA四聚體接觸；(c)測(cè)定與HLA四聚體結(jié)合的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量；和(d)判斷(c)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答性。
在這點(diǎn)上，步驟(a)中的“生物學(xué)樣品”和“測(cè)試受試者”與上述定義相同。
步驟(b)中使用的“HLA四聚體”指的是通過生物素酰化復(fù)合體(HLA單體)，并使其結(jié)合至用于四聚化的抗生物素蛋白而制備的四聚體，所述復(fù)合體通過用一種肽(抗原肽)連接HLA抗原α鏈和β2微球蛋白而獲得(Science 2792103-2106(1998)；和Science 27494-96(1996))。HLA四聚體優(yōu)選標(biāo)記有熒光以便CTL前體細(xì)胞可以容易地通過已知的方式例如流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡等等檢出或檢測(cè)。具體的例子包括用藻紅蛋白(PE)、熒光素異硫氰酸鹽(FITC)、多甲藻素葉綠素蛋白(PerCP)、異藻藍(lán)蛋白(APC)、藻紅蛋白-德克薩斯紅(也叫ECD)和藻紅蛋白-青色素5.1(也叫PC5)，或類似物標(biāo)記的HLA四聚體。
用作為上述HLA四聚體組分的WT1-衍生的癌抗原肽源自人WT1(Cell，60509，1990，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)XP_034418，SEQ ID NO1)，并能與HLA抗原形成復(fù)合體，因此起HLA-限制性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)誘導(dǎo)活性(免疫原性)。
已知HLA分子具有許多亞型，HLA分子結(jié)合的癌抗原肽的氨基酸序列遵循一定的規(guī)則(結(jié)合基序)(Immunogenetics，41，p178，1995；J.Immunol.，155p4749，1995)。例如，HLA-A24的結(jié)合基序是已知的，即由8-11個(gè)氨基酸殘基組成的肽，第2位的氨基酸是酪氨酸(Try)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)或色氨酸(Trp)，C末端的氨基酸是苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、色氨酸(Trp)或甲硫氨酸(Met)(J.Immunol.，152，p3913，1994，Immunogenetics，41，p178，1995，J.Immunol.，155，p4307，1994)。
關(guān)于HLA-A2的基序，下表1列出的基序是已知的(Immunogenetics，41，p178，1995；J.Immunol.，155，p4749，1994)。
表1

肽長(zhǎng)度＝8-11個(gè)氨基酸近來(lái)，可以使用BIMAS軟件；NIH(http://bimas.drct.nih.gov/molbio/hla bind/)在因特網(wǎng)中搜索預(yù)計(jì)能與HLA抗原結(jié)合的肽序列。也可以使用BIMAS HLA肽結(jié)合的預(yù)期分析(J.Immunol.，152，163，1994)進(jìn)行檢索。WT1-衍生肽的具體例子是以列于WO2000/18795的表II-表XLVI的那些的這樣一種方式已進(jìn)行搜索和鑒定的。
上述WT1-衍生肽可以通過替換、缺失和/或添加氨基酸殘基包括在肽N-和/或C-末端添加而部分改變，優(yōu)選地，是通過替換氨基酸殘基。替換優(yōu)選地考慮用上述提及基序中能獲得的氨基酸進(jìn)行。
可通過用已知用于癌抗原肽的分析方法篩選WT1-衍生肽(包括變體)獲得WT1-衍生的癌抗原肽，例如，WO02/47474或Int.J.Cancer100，565-570(2002)中所描述的方法。
WT1-衍生的癌抗原肽的具體例子包括下列肽。
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)Ser Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO6)Ala Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO7)Abu Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO8)Arg Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO9)Lys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO10)Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO11)Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu(SEQ ID NO12)Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu(SEQ ID NO13)Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu(SEQ ID NO14)Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu(SEQ ID NO15)Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO16)Arg Tyr Pro Ser Ala Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO17)Arg Tyr Pro Ser Abu Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO18)上述“Alu”指的是“α-氨基乙酸”。
其中，SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示的肽是HLA-A24抗原-和HLA-A2抗原結(jié)合肽，SEQ ID NO3、5、6-18所示的肽是HLA-A24抗原結(jié)合肽。
優(yōu)選的癌抗原肽可選自上述SEQ ID NO2、3、4和5所示的肽。
HLA四聚體可含有上述肽中的兩種或更多種。
可使用肽化學(xué)領(lǐng)域中常用的方法進(jìn)行肽的合成。這樣的方法可在下述文獻(xiàn)中找到，包括Peptide Synthesis，Interscience，New york，1966；The Proteins，第2卷，Academic Press Inc.，New York，1976；PeptideSynthesis，Maruzen，Inc.，1975；Peptide-Gosei no Kiso to Jikken，Maruzen，Inc.，1985；和Iyakuhin no Kaihatsu(Zoku)，第14卷，PeptideSynthesis，Hirokawa-syoten，1991。
同樣地，本發(fā)明包括其中上述肽的N-末端氨基酸的氨基或C-末端氨基酸的羧基被修飾的肽。這樣修飾得到的肽也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
用于修飾N-末端氨基酸氨基的基團(tuán)例子包括1-3個(gè)基團(tuán)，所述基團(tuán)選自C1-C6烷基、苯基、環(huán)烷基和酰基，特殊地，C1-C6烷酰基、苯基取代的C1-C6烷?；?、C5-C7環(huán)烷基取代的羰基、C1-C6烷基磺酰基、苯磺?；?、C2-C6烷氧羰基、苯基取代的烷氧羰基、C5-C7環(huán)烷氧基取代的羰基、苯氧基羰基等等。
用于修飾C-末端氨基酸羧基的基團(tuán)例子包括酯基和酰胺基。酯基具體地包括C1-C6烷基酯基團(tuán)、苯基取代的C0-C6烷基酯基團(tuán)和C5-C7環(huán)烷基酯基團(tuán)等等。酰胺基具體地包括酰胺基、通過一個(gè)或兩個(gè)C1-C6烷基取代的酰胺基、通過一個(gè)或兩個(gè)苯基取代的C0-C6烷基取代的酰胺基以及形成包括含酰胺基的氮原子的5-至7-元氮雜環(huán)烷的酰胺基等等。
至于作為HLA四聚體組分的HLA抗原(HLA抗原的α-鏈)，可以使用任何亞型的HLA抗原，然而，在診斷或選擇受試者中必須使用相同亞型的HLA抗原。HLA抗原的例子包括HLA-A24抗原例如HLA-A*2402，等等；HLA-A2抗原例如HLA-A*0201、-A*0204、-A*0205、-A*0206等等，HLA-A26抗原例如HLA-A*2601，等等；和HLA-A*3101、HLA-A*3103、HLA-A*1101等等。具體的例子包括HLA-A24抗原、HLA-A2抗原和HLA-A26抗原。這些HLA抗原的核苷酸和氨基酸的序列是已知的。例如，HLA-A24抗原的序列公開在Cancer Res.，554248-4252(1995)和Genbank登記號(hào)M64740；HLA-A2抗原在Genbank登記號(hào)M84379；和HLA-A26抗原的在Genbank登記號(hào)D14350。因此，在與這些已知堿基序列信息相關(guān)的基礎(chǔ)上用諸如PCR的常規(guī)方法很容易克隆得到HLA的α-鏈。
所述HLA的α-鏈優(yōu)選是可溶形式片段，以便容易地進(jìn)行CTL的結(jié)合和選擇。進(jìn)一步優(yōu)選的是所述HLAα-鏈的C-末端，其具有易于生物素?；慕Y(jié)構(gòu)，以便通過生物素結(jié)合而四聚化，也就是說，具有添加的生物素結(jié)合部分。
具體地說，就HLA-A2402(一種HLA-A24)而言，通過PCR反應(yīng)制備的重組可溶HLA-A*2402α-鏈的cDNA，其被設(shè)計(jì)以使得C-末端標(biāo)記中的特定賴氨酸殘基能夠通過BirA酶生物素?；琍CR反應(yīng)中使用的模板是HLA-A*2402(GenBank登記號(hào).M64740)表達(dá)質(zhì)粒，正向引物5’-CCATGGGCAGCCATTCTATGCGCTATTTTTCTACCTCCGT-3’(SEQ ID NO19)；反向引物5’-GGATCCTGGCTCCCATCTCAGGGTGAGGGGCTTGGGCAGACCCTC-3’(SEQ ID NO20)。
至于作為HLA四聚體組分的β2-微球蛋白，優(yōu)選的是人β2微球蛋白?？赏ㄟ^PCR反應(yīng)制備所述人β2微球蛋白的cDNA，使用的模板是人β2微球蛋白(GenBank登記號(hào).ABO21288)表達(dá)質(zhì)粒，正向引物5’-CATATGATCCAGCGTACCCCGAAAATTCAG-3’(SEQ ID NO21)；反向引物5’-GGATCCTTACATGTCTCGATCCCACTTAAC-3’(SEQ ID NO22)至于作為HLA四聚體組分的抗生物素蛋白，可以使用迄今所知的任何抗生物素蛋白。然而，所述抗生物素蛋白優(yōu)選帶有熒光標(biāo)記，有助于通過流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡等等進(jìn)行檢測(cè)。任何已知的熒光色素都可以不受限制地使用，例如，藻紅蛋白(PE)、熒光素異硫氰酸鹽(FITC)、多甲藻素葉綠素蛋白(PerCP)、異藻藍(lán)蛋白(APC)、藻紅蛋白-德克薩斯紅(也叫ECD)和藻紅蛋白-青色素5.1(也叫PC5)，或類似物。
制備包括已知的那些HLA四聚體組分的HLA四聚體的過程眾所周知，如在Science 2792103-2106(1998)，Science 27494-96(1996)等文獻(xiàn)中描述的。以下將簡(jiǎn)要描述該制備過程。
首先，用HLAα-鏈的表達(dá)載體和β2微球蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化諸如E.coli的合適的宿主細(xì)胞，或能夠表達(dá)蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并使其表達(dá)。在此優(yōu)選使用E.coli(例如，BL21)。然后將所產(chǎn)生的單體HLA復(fù)合體和抗原肽(WT1-衍生的癌抗原肽)混合形成可溶的HLA-肽復(fù)合體。用BirA酶將所產(chǎn)生的HLA-肽復(fù)合體的HLAα-鏈C-末端序列生物素酰化。當(dāng)生物素?；腍LA-肽復(fù)合體和熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白以4∶1的摩爾比率混合時(shí)，形成了HLA四聚體。在上述每一個(gè)步驟中優(yōu)選通過凝膠過濾或類似方法純化所產(chǎn)生的蛋白。
通過將如上述制備的HLA四聚體與分離自測(cè)試受試者的生物學(xué)樣品接觸(所述的生物學(xué)樣品中含有CTL前體細(xì)胞)進(jìn)行上述步驟(b)。接觸優(yōu)選在37℃下進(jìn)行。此外，接觸優(yōu)選地在常規(guī)的生物緩沖液例如含有血清的磷酸緩沖液(PBS)中進(jìn)行。
優(yōu)選的陰性對(duì)照是通過在平行進(jìn)行的相同過程中使用熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白取代HLA四聚體得到制備的。
在步驟(b)后的步驟(c)中，測(cè)定與HLA四聚體結(jié)合的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量?？墒褂萌魏纹褚阎姆椒ㄟM(jìn)行測(cè)定。當(dāng)HLA四聚體用熒光標(biāo)記時(shí)，與HLA四聚體結(jié)合的CTL前體細(xì)胞也被熒光素標(biāo)記了。因此通過流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡就可檢測(cè)或分離標(biāo)記的CTLs。
可通過，例如測(cè)定CD8-陽(yáng)性細(xì)胞(CD8-陽(yáng)性CTL前體細(xì)胞)或CD8/CD3-陽(yáng)性細(xì)胞(CD8/CD3-陽(yáng)性CTL前體細(xì)胞)中與HLA四聚體結(jié)合的細(xì)胞的比例(頻度)從而獲得與HLA四聚體結(jié)合的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度。
可使用，例如熒光標(biāo)記的鼠抗-人CD8單克隆抗體標(biāo)記并檢測(cè)CD8-陽(yáng)性細(xì)胞?？墒褂?，例如熒光標(biāo)記的鼠抗-人CD3單克隆抗體標(biāo)記并檢測(cè)CD3-陽(yáng)性細(xì)胞。
在此所用的熒光色素必須與HLA四聚體中所用的不同。也就是說，必須使用相互截然不同的熒光色素，例如，當(dāng)使用PE-標(biāo)記的HLA四聚體時(shí)，可使用FITC-標(biāo)記的鼠抗-人CD8單克隆抗體及PerCP-標(biāo)記的鼠抗-人CD3單克隆抗體。
具體過程包括，當(dāng)測(cè)定HLA四聚體結(jié)合細(xì)胞對(duì)CD8-陽(yáng)性細(xì)胞比例(頻度)時(shí)，例如，將PE-標(biāo)記的HLA四聚體與生物學(xué)樣品接觸，加入FITC-標(biāo)記的鼠抗-人CD8-單克隆抗體，使混合物發(fā)生反應(yīng)，并利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析染色的細(xì)胞。選擇CD8-陽(yáng)性細(xì)胞(CD8+)。WT1抗原肽特異性CTL前體細(xì)胞的比例(頻度)可通過在所選擇的CD8+細(xì)胞中四聚體陽(yáng)性細(xì)胞(CD8+四聚體+)比例減去作為陰性對(duì)照的抗生物素蛋白陽(yáng)性細(xì)胞(CD8+抗生物素蛋白+)的比例而計(jì)算得到，如下WT1抗原肽-特異性CTL前體細(xì)胞(％)＝100×{[(CD8+四聚體+細(xì)胞)/(CD8+細(xì)胞)]-[(CD8+抗生物素蛋白+細(xì)胞)/(CD8+細(xì)胞)]}當(dāng)測(cè)定HLA四聚體結(jié)合細(xì)胞對(duì)CD8-和CD3-陽(yáng)性細(xì)胞比例(頻度)時(shí)，例如，將PE-標(biāo)記的HLA四聚體與生物學(xué)樣品接觸，加入FITC-標(biāo)記的鼠抗-人CD8-單克隆抗體和PerCP-標(biāo)記的鼠抗-人CD3單克隆抗體，允許混合物發(fā)生反應(yīng)，并利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析染色的細(xì)胞。選擇CD3-和CD8-陽(yáng)性細(xì)胞(CD3+CD8+)。WT1抗原肽-特異性CTL前體細(xì)胞的比例(頻度)可通過在所選擇的CD3+CD8+細(xì)胞中四聚體陽(yáng)性細(xì)胞(CD3+CD8+四聚體+)比例減去作為陰性對(duì)照的抗生物素蛋白陽(yáng)性細(xì)胞(CD3+CD8+抗生物素蛋白+)的比例而計(jì)算得到，如下WT1抗原肽-特異性CTL前體細(xì)胞(％)＝100×{[(CD3+CD8+四聚體+細(xì)胞)/(CD3+CD8+細(xì)胞)]-[(CD3+CD8+抗生物素蛋白+細(xì)胞)/(CD3+CD8+細(xì)胞)]}在上述測(cè)定所獲得的結(jié)果基礎(chǔ)上評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答性。具體地說，可通過比較步驟(b)中獲得的測(cè)試受試者與健康受試者中WT-1特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量(此后，分別稱為“測(cè)試受試者值”和“健康受試者值”)，并判斷兩者的差異來(lái)進(jìn)行。在這樣情況下，就需要從健康受試者中分離并制備生物學(xué)樣品(血液、淋巴液、PBMC等)，其可通過從不患癌癥的受試者中收集生物學(xué)樣品而獲得。這里所使用的“健康受試者”是指診斷不患癌癥的人。
測(cè)試受試者值和健康受試者值的比較可通過平行測(cè)定測(cè)試受試者的生物學(xué)樣品和健康受試者的生物學(xué)樣品進(jìn)行。當(dāng)無(wú)法進(jìn)行平行比較時(shí)，也可以使用在不變條件下通過測(cè)定多個(gè)(至少兩個(gè)，優(yōu)選三個(gè)或更多個(gè)，更優(yōu)選五個(gè)或更多個(gè))健康受試者的生物學(xué)樣品獲得的健康受試者值的平均值或統(tǒng)計(jì)中間值進(jìn)行比較。
進(jìn)行測(cè)試受試者是否對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答評(píng)價(jià)可使用一種指標(biāo)，即與健康受試者值相比測(cè)試受試者值為1.5倍或更高，優(yōu)選為2倍或更高。也就是說，當(dāng)測(cè)試受試者數(shù)值與健康受試者數(shù)值相比為1.5倍或更高，優(yōu)選的為2倍或更高時(shí)，對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答被評(píng)價(jià)為高的。當(dāng)患者對(duì)WT1疫苗應(yīng)答高時(shí)，則其適于WT1疫苗，換句話說，有可能優(yōu)選使用WT1疫苗對(duì)患者進(jìn)行治療。
如上所述的本發(fā)明選擇患者的方法不僅可以用于在疫苗施用之前評(píng)價(jià)患者也可用于診斷或確定疫苗施用后的效果。
本發(fā)明也提供一種選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的方法，其包括下列(a)、(b)和(c)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)測(cè)定(a)中生物學(xué)樣品的效應(yīng)物型WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量；和(c)判斷(b)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答性，和一種治療用所述方法選擇的患者癌癥的方法。
本發(fā)明人根據(jù)相關(guān)的功能對(duì)WT1-特異性CTL前體細(xì)胞進(jìn)一步分類，并發(fā)現(xiàn)，特別是與健康個(gè)體相比，效應(yīng)物型CTL前體細(xì)胞以較高比例存在。因此，可在作為指標(biāo)的效應(yīng)細(xì)胞中WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的數(shù)量或頻度基礎(chǔ)上選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答的患者。當(dāng)使用CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量作為指標(biāo)通過選擇方法測(cè)定的測(cè)試受試者值與健康受試者值之間沒有/幾乎沒有差別時(shí)，可使用效應(yīng)物型CTL前體細(xì)胞作為指標(biāo)的選擇方法進(jìn)行更詳細(xì)的分析。
選擇方法的具體例子包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將(a)中生物學(xué)樣品與含有WT1-衍生的癌抗原肽、抗-CD8抗體、抗-CD45RA抗體和抗-CD27抗體的HLA四聚體接觸；(c)測(cè)定對(duì)CD8或CD8/CD3陽(yáng)性并對(duì)HLA四聚體結(jié)合陽(yáng)性的CTL前體細(xì)胞中CD45RA-陽(yáng)性和CD27-陰性效應(yīng)物型的CTL前體細(xì)胞比例；和(d)判斷(c)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答性，和一種治療用所述方法選擇的患者癌癥的方法。
在此所用的“效應(yīng)細(xì)胞”指的是CD45RA-陽(yáng)性和CD27-陰性的CTL前體細(xì)胞。通過測(cè)定CD45RA-陽(yáng)性和CD27-陰性的CTL前體細(xì)胞在CTL前體細(xì)胞中的比例獲得所述效應(yīng)細(xì)胞的頻度。具體地說，可通過將測(cè)試樣品與HLA四聚體、抗-CD8抗體、抗-CD45RA抗體和抗-CD27抗體接觸，測(cè)定CD45RA-陽(yáng)性和CD27-陰性的細(xì)胞在對(duì)CD8或CD8/CD3陽(yáng)性并對(duì)HLA四聚體結(jié)合陽(yáng)性的CTL前體細(xì)胞(WT1-特異性CTL前體細(xì)胞)中的比例。
可使用，例如熒光標(biāo)記的鼠抗-人CD45RA單克隆抗體標(biāo)記并測(cè)定CD45RA-陽(yáng)性細(xì)胞。可使用，例如熒光標(biāo)記的鼠抗-人CD27單克隆抗體標(biāo)記并測(cè)定CD27-陽(yáng)性細(xì)胞。在此所用的熒光色素必須與HLA四聚體、抗-CD8抗體或抗-CD3抗體中所用的不同。也就是說，必須使用相互截然不同的熒光色素，例如，當(dāng)使用PE-標(biāo)記的HLA四聚體時(shí)，可使用FITC-標(biāo)記的抗-CD8單克隆抗體和Per-標(biāo)記的抗-CD3單克隆抗體，ECD-標(biāo)記的鼠抗-人CD45RA單克隆抗體和PC5-標(biāo)記的鼠抗-人CD27單克隆抗體。這些標(biāo)記的抗體可從Beckman Coulter等處買到。
測(cè)定前體細(xì)胞或類似物的具體過程可通過與上述的選擇方法相似的方式進(jìn)行，其中CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量作為指標(biāo)。
上述選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的方法也可以用于診斷癌癥。也就是說，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)造血惡性腫瘤或肺癌患者與健康個(gè)體相比體內(nèi)的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞頻度更高。因此，使用WT1特異性CTL前體細(xì)胞或效應(yīng)物型WT1特異性CTL前體細(xì)胞的頻度作為指標(biāo)就有可能診斷癌癥?？梢栽\斷的癌癥包括血癌例如白血病、骨髓增生異常綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤和惡性淋巴瘤和實(shí)體瘤例如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、和卵巢癌。優(yōu)選的例子是白血病、骨髓增生異常綜合癥和肺癌。
本發(fā)明也提供了一種鑒定WT1疫苗的靶分子的方法，所述分子是患者特有的，包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從測(cè)試患者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將WT1疫苗的多個(gè)靶分子分別應(yīng)用于(a)的生物學(xué)樣品；
(c)分別測(cè)定(b)的生物學(xué)樣品的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量，并相互比較結(jié)果；和(d)在(c)中獲得結(jié)果的基礎(chǔ)上鑒定對(duì)測(cè)試患者有效的WT1疫苗的靶分子。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)患者在疫苗施用前體內(nèi)的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞頻度比迄今所知的都要高。因此，在WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的數(shù)量或頻度作為指標(biāo)的基礎(chǔ)上鑒定WT1疫苗的靶分子(治療用途的靶分子)，所述分子是患者特有的。
也就是說，上述鑒定方法可有效的用于鑒定對(duì)于治療患者最適合的靶分子(抗原肽)，所述患者業(yè)已評(píng)價(jià)為對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答。
具體地說，鑒定可以類似于選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的方法進(jìn)行，通過測(cè)定WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量，其中使用了HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法、HLA五聚體方法、ELISPOT方法、實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)或有限稀釋方法。優(yōu)選為HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法或HLA五聚體方法。下文中將HLA四聚體方法作為例子具體描述鑒定方法。
涉及HLA四聚體方法的方法包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從測(cè)試患者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將含有不同WT1衍生的癌抗原肽的多個(gè)HLA四聚體分別與(a)的生物學(xué)樣品接觸；(c)分別測(cè)定與HLA四聚體結(jié)合的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量，并相互比較結(jié)果；和(d)在(c)中獲得結(jié)果的基礎(chǔ)上鑒定對(duì)測(cè)試患者有效的WT1-衍生的癌抗原肽。
具體地說，制備了多個(gè)HLA四聚體，其中每一個(gè)都含有作為候選物的WT1-衍生的癌抗原肽。每一個(gè)HLA四聚體都與分離自測(cè)試患者的生物學(xué)樣品接觸，測(cè)定與HLA四聚體結(jié)合的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量。對(duì)HLA四聚體分別獲得的數(shù)值進(jìn)行比較，顯示最高數(shù)值的就是包含于HLA四聚體的癌抗原肽，其是最易被CTLs識(shí)別的癌抗原肽，被鑒定為患者的WT1疫苗治療的靶分子，即，該靶分子是患者特有的。
只要是衍生自WT1的任何癌抗原肽就可使用，例子包括SEQ IDNOs2-18所列的癌抗原肽。優(yōu)選的癌抗原肽是SEQ ID NOs2-5中所列的任何一種。
每一步驟的具體過程和每個(gè)組分的制備方法都可以在上面關(guān)于選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的部分內(nèi)容中找到。
根據(jù)鑒定WT1疫苗的靶分子的現(xiàn)有方法，可以鑒定能夠治療患者癌癥的靶分子。因此，在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于治療給定患者癌癥的藥物組合物，其包括通過所述患者特有的WT1疫苗的靶分子的鑒定方法鑒定的靶分子；和一種治療患者癌癥的方法，其包括施用患者由該鑒定方法所鑒定的靶分子。本發(fā)明的藥物組合物包含腫瘤疫苗并可包含本領(lǐng)域已知的佐劑等。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種可用于選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的臨床診斷試劑，其包含作為成分的、含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體。下文中將HLA四聚體方法作為例子描述的本發(fā)明臨床診斷試劑。
作為本發(fā)明臨床診斷試劑成分的“HLA四聚體”指的是，如上提及的，通過生物素酰化用WT1-衍生的癌抗原肽連接HLA抗原α鏈和β2微球蛋白獲得的復(fù)合體(HLA單體)，并使其與用于四聚化的抗生物素蛋白結(jié)合而制備的四聚體(Science 2792103-2106(1998)；和Science27494-96(1996))。
只要是衍生自WT1的任何癌抗原肽就可使用，例子包括SEQ IDNOs2-18所列的癌抗原肽。優(yōu)選的癌抗原肽是SEQ ID NOs2-5中所列的任何一種。
每一步驟的具體過程和每個(gè)組分的制備方法都可以在上面關(guān)于選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的部分內(nèi)容中找到。
本發(fā)明的臨床診斷試劑可作為選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的試劑盒的組分。該試劑盒可以只包含本發(fā)明的臨床診斷試劑，也可以包含本發(fā)明的臨床診斷試劑和其他成分。該試劑盒其他成分的例子包括熒光抗生物素蛋白、熒光標(biāo)記的鼠抗-人CD8單克隆抗體、熒光標(biāo)記的鼠抗-人CD3單克隆抗體、和類似物。在檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，該試劑盒可包含熒光標(biāo)記的鼠抗-人CD45RA單克隆抗體，熒光標(biāo)記的鼠抗-人CD27單克隆抗體。
熒光色素的例子包括藻紅蛋白(PE)、熒光素異硫氰酸鹽(FITC)、多甲藻素葉綠素蛋白(PerCP)、異藻藍(lán)蛋白(APC)、藻紅蛋白-德克薩斯紅(也叫ECD)和藻紅蛋白-青色素5.1(也叫PC5)，等等。
本發(fā)明的臨床診斷和試劑盒不僅都可以用于選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答的患者，也可以用于選擇WT1疫苗的靶分子(用于治療的靶分子)。另外，可用作癌癥臨床診斷試劑的試劑無(wú)需改變其組分。
本發(fā)明也提供了一種確定患者對(duì)WT1疫苗的適合性的方法，包括下列(a)、(b)和(c)步驟(a)在施用WT1疫苗后，從患者中分離含有CTLs的生物學(xué)樣品；(b)測(cè)定(a)中生物學(xué)樣品的WT1-特異性CTLs的存在頻度或數(shù)量；(c)判斷(b)的測(cè)定值相對(duì)于WT1疫苗施用前所獲得的生物學(xué)樣品是否高，并評(píng)價(jià)患者是否適于WT1疫苗治療，和一種治療患者癌癥的方法，其包括治療用WT1或WT1-衍生的癌抗原肽確定方法評(píng)價(jià)適合的患者。
如以下實(shí)施例中所描述的，本發(fā)明人測(cè)定了經(jīng)WT1-衍生的癌抗原肽(“WT1疫苗”)治療的患者中WT1-特異性CTLs的頻度，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于施用肽之前所獲得的CTL頻度，治療效果與施用肽以后的CTL頻度的增加相關(guān)。也就是說，施用肽以后WT1-特異性CTLs的存在頻度是施用肽之前獲得樣品的1.5倍或更高被定義為“陽(yáng)性免疫應(yīng)答”，并研究了免疫應(yīng)答和治療效果之間的關(guān)系。結(jié)果，在免疫應(yīng)答和治療效果之間具有正相關(guān)。該結(jié)果揭示了在上述提及的免疫應(yīng)答性(CTLs的頻度或數(shù)量增加)作為指標(biāo)的基礎(chǔ)上，有可能評(píng)價(jià)用WT1疫苗治療是否適合于被試患者。
因而，本發(fā)明的確定方法可有效地評(píng)價(jià)進(jìn)行WT1疫苗治療的患者的適合性，例如連續(xù)施用肽治療的適合性。
所述確定方法的步驟(a)和(b)的具體過程可以在上面關(guān)于“選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者方法”的部分中找到。具體地說，其可通過HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法、HLA五聚體方法、ELISPOT方法、實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)、有限稀釋方法或類似方法測(cè)定WT1-特異性CTLs的存在頻度或數(shù)量來(lái)進(jìn)行。
步驟(c)中評(píng)價(jià)患者是否適于WT1疫苗治療的是通過比較施用患者WT1疫苗以后和施用WT1疫苗之前獲得的WT1-特異性CTLs的存在頻度或數(shù)量(在下文中，分別稱作“施用后值”和“施用前數(shù)值”)，并判斷兩個(gè)值之間的差異來(lái)進(jìn)行。
在此所用的“施用后值”指的是一次或多次施用WT1疫苗后的任何時(shí)間(時(shí)間選擇)的值。然而，在兩周間隔的肽劑量給藥方案中，優(yōu)選的時(shí)間(時(shí)間選擇)是第一到第五次施用WT1疫苗后的時(shí)間，優(yōu)選地，在第一到第三次施用WT1疫苗后。
可使用指標(biāo)進(jìn)行是否用WT1疫苗治療合適的評(píng)價(jià)，該指標(biāo)是與施用前值相比，施用后值為其1.5倍或更高。也就是說當(dāng)施用后值是施用前值的1.5倍或更高時(shí)，適于WT1疫苗治療。以這些發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，本發(fā)明也提供了一種治療患者癌癥的方法，其包括治療已經(jīng)用本發(fā)明的確定患者對(duì)具有WT1或WT1-衍生的癌抗原肽的本發(fā)明的WT1疫苗適合性的方法評(píng)價(jià)過的適合的患者。
在上述提及的測(cè)定CTL的方法中，從易用性和準(zhǔn)確度角度考慮，主要優(yōu)選的是HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法和HLA五聚體方法。HLA四聚體方法將在下文中作為例子用于描述上述確定方法。
涉及HLA四聚體方法的該方法包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)在施用WT1疫苗后，從患者中分離含有CTLs的生物學(xué)樣品；(b)將含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA四聚體與(a)的生物學(xué)樣品接觸；(c)測(cè)定與HLA四聚體結(jié)合的WT1-特異性CTLs的存在頻度或數(shù)量；和(d)判斷(c)的測(cè)定值相對(duì)于WT1疫苗施用前所獲得的生物學(xué)樣品是否高，并評(píng)價(jià)患者是否適于WT1疫苗治療。
在此使用的作為HLA四聚體組分的HLA抗原包括HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
作為HLA四聚體組分的癌抗原肽包括Cys Met Thr Trp Asn GlnMet Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met AsnLeu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ IDNO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。如SEQID NO2-5所示的所有肽都是能與HLA-A24結(jié)合的肽，用在上述本發(fā)明確定方法中的HLA四聚體的例子包括含有如SEQ ID NO2-5所示的所有肽中任一種和HLA-A24的HLA四聚體。另外，如SEQ IDNO2和4所示的肽能與HLA-A2抗原結(jié)合。也包括含有SEQ ID NO2或4所示的肽和HLA-A2抗原的HLA四聚體。
在本發(fā)明確定或治療方法中，優(yōu)選使用HLA四聚體，其含有在該治療中所用的相同肽，或與CTLs顯示交叉反應(yīng)的肽，而所述的CTLs已被治療中所用肽誘導(dǎo)。例如，當(dāng)SEQ ID NO3所示的肽用于患者治療時(shí)，包含SEQ ID NO2或3所示肽和HLA-A24抗原的HLA四聚體是使用有效的。
本發(fā)明確定或治療方法的步驟(a)到(c)的具體過程可以在上面關(guān)于“選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者方法”的部分中找到。此外，步驟(d)中評(píng)價(jià)是以上述施用前值和施用后值比較為基礎(chǔ)進(jìn)行的。
本發(fā)明確定或治療方法的具體例子將在下文中描述。
首先，在施用WT1-衍生的癌抗原肽前從患者中收集血液，從中分離PBMC(施用前樣品)。然后，在施用肽治療后收集患者的血液并從中分離PBMC(施用后樣品)。分別在施用前和施用后樣品中加入HLA四聚體，測(cè)定肽-特異性CTLs的頻度，并根據(jù)上述關(guān)于“選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的方法”部分和實(shí)施例3描述的分析方法計(jì)算。當(dāng)施用后樣品中CTL頻度是施用前樣品的1.5倍或更高時(shí)，適于WT1疫苗治療(也就是說，WT1疫苗預(yù)計(jì)有療效)。
本發(fā)明也提供了一種用于確定WT1疫苗適合性的臨床診斷試劑，其中包括作為成分的HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體，它們分別含有WT1-衍生的癌抗原肽，以及一種含有所述臨床診斷試劑的試劑盒。所述臨床診斷試劑和試劑盒的成分如上文關(guān)于“用于選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答的患者的臨床診斷試劑”部分定義的。
實(shí)施例本發(fā)明進(jìn)一步通過下述實(shí)施例舉例說明，但在任何方面都并不受限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1
外周血單核細(xì)胞的制備在征得同意后，收集HLA-A*2402陽(yáng)性癌癥患者和HLA-A*2402陽(yáng)性健康個(gè)體的血液。在這些患者中，患有造血惡性腫瘤的患者有18位，其中包括急性髓細(xì)胞性白血病(AML)(n＝11)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)(n＝2)、慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)(n＝1)和骨髓增生異常綜合征(MDS)(n＝4)，患有肺癌有7位。有10位HLA-A*2402陽(yáng)性健康個(gè)體。
就患有造血惡性腫瘤患者而言，一次或多次診斷時(shí)或治療過程中在骨髓瘤和外周血樣品中證實(shí)了WT1基因顯著的高表達(dá)。就患肺癌的患者而言，活組織檢查或抽提的樣品中證實(shí)了WT1基因顯著的高表達(dá)。
通過密度梯度離心的方法(Ficoll-Hypaque)從收集的血液中分離外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，并在液氮中冷凍儲(chǔ)存。
實(shí)施例2制備HLA四聚體使用9-氨基酸肽(SEQ ID NO2)制備含有熒光色素(藻紅蛋白；PE)標(biāo)記的HLA-A*2402的四聚體，該肽包括根據(jù)Int.J.Cancer100，565-570，2002中描述的方法的WT1蛋白質(zhì)的235-243位置的氨基酸序列。
首先，通過PCR擴(kuò)增編碼重組HLA-A2402的cDNA，該P(yáng)CR使用HLA-A*2402表達(dá)質(zhì)粒(GenBank登記號(hào).M64740)作為模板，正向引物5’-CCATGGGCAGCCATTCTATGCGCTATTTTTCTACCTCCGT-3’(SEQ ID NO19)；反向引物5’-GGATCCTGGCTCCCATCTCAGGGTGAGGGGCTTGGGCAGACCCTC-3’(SEQ ID NO20)。
反向引物編碼BirA識(shí)別位點(diǎn)以便閱讀框架在C-末端一致。用限制性酶NcoI和BamH1酶切擴(kuò)增片段，并克隆到載體pET11d(Novagen)中。
然后使用人β2微球蛋白表達(dá)質(zhì)粒(GenBank登記號(hào).ABO21288)作為模板擴(kuò)增編碼重組可溶性人β2微球蛋白的cDNA，正向引物5’-CATATGATCCAGCGTACCCCGAAAATTCAG-3’(SEQ ID NO21)；反向引物5’-GGATCCTTACATGTCTCGATCCCACTTAAC-3’(SEQ ID NO22)用限制性酶NdeI和BamH1酶切擴(kuò)增片段，并克隆到載體pET11a(Novagen)中。
讓所產(chǎn)生的兩個(gè)載體在E.coli.BL21中表達(dá)，并以不溶性包涵體的形式回收。分別將包涵體溶解在8M尿素溶液中并用重折疊(refolding)緩沖液稀釋。將肽(SEQ ID NO2)加入到稀釋液中形成可溶的HLA-肽復(fù)合體。用BirA酶生物素?；疕LA-肽復(fù)合體C-末端序列，通過凝膠過濾技術(shù)純化所產(chǎn)生的生物素?；疕LA-肽復(fù)合體。生物素?；疕LA-肽復(fù)合體和PE標(biāo)記的抗生物素蛋白(分子探針)以4∶1的摩爾比率混合制備HLA四聚體。
實(shí)施例3用HLA四聚體分析WT1-特異性CTL前體細(xì)胞解凍實(shí)施例1中獲得的冷凍PBMCs，立即在含有0.5％小牛血清(FCS)磷酸鹽緩沖液(PBS)中重新懸浮至細(xì)胞密度為1×106細(xì)胞/毫升。懸浮液中加入實(shí)施例2中制備的四聚體溶液(500μg/μl，2μl)。懸浮液在37℃下溫育30分鐘。除PE-標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈霉素(Becton Dickinson)取代四聚體添加之外，通過類似的方式制備陰性對(duì)照樣品。在冰冷的水中淬滅后，加入FITC-標(biāo)記的鼠抗-人CD8單克隆抗體(15μl，BD Pharmigen)和PerCP-標(biāo)記的鼠抗-人CD3抗體(15μl，BD Pharmigen)，混合物在4℃下溫育30分鐘。用含有0.5％FCS(2X)緩沖液PBS離心沖洗著色的細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀FACSort(BectonDickinson)分析。選擇CD3-和CD8-陽(yáng)性細(xì)胞(CD3+CD8+)。從所選擇的CD3+CD8+細(xì)胞中四聚體陽(yáng)性細(xì)胞(CD3+CD8+四聚體+)比例減去作為陰性對(duì)照的PE標(biāo)記的抗生物素蛋白陽(yáng)性細(xì)胞(CD3+CD8+抗生物素蛋白+)的比例計(jì)算得到WT1-抗原肽特異性CTL前體細(xì)胞的比例，如下WT1抗原肽-特異性CTL前體細(xì)胞(％)＝100×{[(CD3+CD8+四聚體+細(xì)胞)/(CD3+CD8+細(xì)胞)]-[(CD3+CD8+抗生物素蛋白+細(xì)胞)/(CD3+CD8+細(xì)胞)]}癌癥患者和健康個(gè)體的PBMCs的分析結(jié)果列在表2中。結(jié)果對(duì)相應(yīng)疾病進(jìn)行繪圖，如附圖1所示。這些結(jié)果顯示CD3/CD8-陽(yáng)性細(xì)胞中WT1抗原肽-特異性CTL前體細(xì)胞的比例，對(duì)于健康個(gè)體是0.47-1.30％(平均為0.82％)，對(duì)于惡性造血腫瘤患者是1.04-29.45％(平均為5.24％)，以及對(duì)于肺癌患者是0.33-5.97％(平均為2.44％)。統(tǒng)計(jì)分析顯示與健康個(gè)體相比惡性造血腫瘤或肺癌患者，其比例顯著增加(p＜0.05)。
表2


AML急性髓細(xì)胞性白血病ALL急性淋巴細(xì)胞性白血病CML慢性髓細(xì)胞性白血病MDS骨髓增生異常綜合征實(shí)施例4施用肽之后WT1-特異性CTLs頻度的分析下述試驗(yàn)是在獲得大阪大學(xué)道德委員會(huì)、醫(yī)學(xué)院同意并征得癌癥患者同意之后進(jìn)行的。
將包含WT1的第235-243位的氨基酸序列的肽或包含SEQ IDNO3的其變異體，其中SEQ ID NO2中第2位的甲硫氨酸被酪氨酸取代，按每個(gè)個(gè)體0.3mg、1mg或3mg的量施用癌癥患者。用Montanide ISA51(SEPPIC)乳化肽，最終的乳劑以2周間隔進(jìn)行一次或多次皮內(nèi)注射。被試患者患有HLA-A*2402-陽(yáng)性和WT1-陽(yáng)性的肺癌、乳腺癌或白血病。
以與實(shí)施例3相似的HLA四聚體方法測(cè)定的CTL頻度為基礎(chǔ)進(jìn)行施用肽以后的免疫反應(yīng)的評(píng)價(jià)。與肽施用前獲得的相比，在肽施用后任何時(shí)段，肽-特異性CTLs頻度增加1.5倍或更高，則評(píng)價(jià)為“陽(yáng)性免疫應(yīng)答”。此外，在腫瘤標(biāo)記物值，腫瘤細(xì)胞的數(shù)量或腫瘤的體積縮小時(shí)，則評(píng)價(jià)為“治療有效”?？赏ㄟ^癌癥患者(n＝19)中的卡方試驗(yàn)評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答和治療效果之間的關(guān)系，所述患者都已對(duì)免疫應(yīng)答和肽施用后有治療效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果，治療效果陽(yáng)性的11個(gè)患者中有8個(gè)(73％)顯示陽(yáng)性免疫應(yīng)答，而治療效果陰性的8個(gè)患者中只有2個(gè)(25％)顯示陽(yáng)性免疫應(yīng)答，表明治療效果和免疫應(yīng)答是正相關(guān)的(P＝0.0397)。這些結(jié)果表明施用肽后CTLs特異性的誘導(dǎo)是治療效果的一個(gè)重要因素。另外，上述的免疫應(yīng)答可作為用于證明肽施用治療的有利進(jìn)程的指標(biāo)，或決定肽施用的治療是否應(yīng)該繼續(xù)。
實(shí)施例5WT1-特異性CTLs功能的分析已經(jīng)報(bào)道對(duì)HLA四聚體染色和CD8陽(yáng)性的抗原-肽特異性CTLs可進(jìn)一步可通過抗-CD45RA抗體和抗-CD27抗體(J.Exp.Med.，186，p1407，1997)染色而進(jìn)行再分類。CD45RA-陽(yáng)性和CD27陽(yáng)性細(xì)胞歸為原初實(shí)驗(yàn)型(naive type)；CD45RA-陰性和CD27-陽(yáng)性細(xì)胞，CD45RA-陰性和CD27-陰性歸為記憶型；CD45RA-陽(yáng)性和CD27-陰性細(xì)胞歸為效應(yīng)物型。效應(yīng)物型細(xì)胞代表了最強(qiáng)CTL活性的細(xì)胞種群。
在征得同意后，從HLA-A*2402-陽(yáng)性健康個(gè)體和肽施用之前的HLA-A*2402-陽(yáng)性癌癥患者(n＝24；14個(gè)血癌，10個(gè)實(shí)體瘤)中收集PBMCs，所述患者經(jīng)過實(shí)施例4中臨床研究的試驗(yàn)。PBMCs用于分析WT1-肽特異性CTL前體的功能，所述WT1-肽特異性CTL前體對(duì)HLA四聚體染色和CD8陽(yáng)性。對(duì)于流式細(xì)胞儀分析，細(xì)胞按實(shí)施例3相似的方式，用HLA四聚體、抗-CD8抗體、抗-CD45RA抗體和抗-CD27抗體染色。計(jì)算屬于CD45RA-陽(yáng)性/CD27-陰性的原初實(shí)驗(yàn)型，CD45RA-陰性的記憶型或CD45RA-陽(yáng)性/CD27-陰性的效應(yīng)物型的細(xì)胞在HLA四聚體-陽(yáng)性和CD8-陽(yáng)性細(xì)胞類群中的比例。對(duì)于癌癥患者，原初實(shí)驗(yàn)型、記憶型和效應(yīng)物型的比例分別為23.7％、45.5％和30.8％。對(duì)于健康個(gè)體的比例為35.9％，53.8％和8.9％。對(duì)癌癥患者和健康個(gè)體的比較顯示了效應(yīng)物型細(xì)胞的8比例在癌癥患者中明顯為高(P＜0.05)，而原初實(shí)驗(yàn)型和記憶型細(xì)胞的比例在癌癥患者和健康個(gè)體之間則沒有顯著差異。在實(shí)施例3中，癌癥患者顯示了WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的增加，并且在此，癌癥患者顯示了在CTLs中具有效應(yīng)物型功能的CTLs比例的增加。這些結(jié)果證實(shí)癌癥患者可以在效應(yīng)物型CTL前體細(xì)胞存在頻度基礎(chǔ)上得到診斷。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，提供了一種在作為指標(biāo)的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞基礎(chǔ)上選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的方法，一種利用相同方式治療癌癥的方法，和用于所述選擇的臨床診斷試劑等等。根據(jù)本發(fā)明的選擇方法，可選擇預(yù)期對(duì)WT1疫苗應(yīng)答的患者，使其能更適于治療癌癥。
序列表<110>Haruo，Sugiyama<120>選擇適于WT1疫苗患者的方法<130>664590<140>PCT/JP2004/009378<141>2004-06-25<150>JP 2003-184436<151>2003-06-27<150>JP 2004-070497<151>2004-03-12<160>22<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>449<212>PRT<213>智人<400>1Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro1 5 10 15Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala20 25 30Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr35 40 45Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro50 55 60Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly65 70 75 80Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
85 90 95Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe100 105 110Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe115 120 125Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile130 135 140Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr145 150 155 160Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe165 170 175Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln180 185 190Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser195 200 205Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp210 215 220Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln225 230 235 240Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser245 250 255Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu260 265 270Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile275 280 285His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro290 295 300Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys305 310 315 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys325 330 335Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro340 345 350Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp355 360 365Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln370 375 380Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr385 390 395 400His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys405 410 415Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val420 425 430Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala435 440 445Leu<210>2<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>2Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>3Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu1 5<210>4<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>4Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>5Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>6Ser Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu1 5<210>7
<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>7Ala Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu1 5<210>8<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<223>Xaa位于Abu鏈的位置1<400>8Xaa Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu1 5<210>9<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>9Arg Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>10
Lys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>11Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>12Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>13Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu1 5<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>14Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu1 5<210>15<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>15Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu1 5<210>16<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>16Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Lys Lys Phe1 5<210>17<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>17Arg Tyr Pro Ser Ala Gln Lys Lys Phe1 5
<210>18<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<223>Xaa位于Abu鏈的位置5<400>18Arg Tyr Pro Ser Xaa Gln Lys Lys Phe1 5<210>19<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>19ccatgggcag ccattctatg cgctattttt ctacctccgt40<210>20<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>20ggatcctggc tcccatctca gggtgagggg cttgggcaga ccctc 45<210>21<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>21catatgatcc agcgtacccc gaaaattcag 30
<210>22<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>22ggatccttac atgtctcgat cccacttaac 30
權(quán)利要求
1.一種選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答的患者的方法，包括下列(a)、(b)和(c)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)測(cè)定(a)中生物學(xué)樣品的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量；和(c)判斷(b)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的選擇方法，其中通過HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法、HLA五聚體方法、ELISPOT方法、實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)和有限稀釋方法的任一種進(jìn)行WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量的測(cè)定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的選擇方法，其中通過HLA四聚體方法進(jìn)行測(cè)定。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的選擇方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將(a)中生物學(xué)樣品與含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA四聚體接觸；(c)測(cè)定與HLA四聚體結(jié)合的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量；和(d)判斷(c)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的選擇方法，其中通過測(cè)定在CD8-陽(yáng)性或CD8/CD3-陽(yáng)性CTL前體細(xì)胞中HLA四聚體結(jié)合細(xì)胞的比例進(jìn)行權(quán)利要求4中步驟(c)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的選擇方法，其中作為HLA四聚體組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的選擇方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的選擇方法，其使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的選擇方法，其中使用與健康受試者相比為1.5倍或更高的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量作為指標(biāo)評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答性。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的選擇方法，其中CTL前體細(xì)胞是效應(yīng)物型CT L前體細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的選擇方法，其使用HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法、HLA五聚體方法、ELISPOT方法、實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)和有限稀釋方法的任一種測(cè)定效應(yīng)物型的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的選擇方法，其使用HLA四聚體方法。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的選擇方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將(a)中生物學(xué)樣品與含有WT1-衍生的癌抗原肽、抗CD8-抗體、抗-CD45RA抗體和抗-CD27抗體的HLA四聚體接觸；(c)測(cè)定對(duì)CD8或CD8/CD3陽(yáng)性并與HLA四聚體結(jié)合的CTL前體細(xì)胞中CD45RA-陽(yáng)性和CD27-陰性的效應(yīng)物型CTL前體細(xì)胞的比例；和(d)判斷(c)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答性。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的選擇方法，其中作為HLA四聚體組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的選擇方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
16.根據(jù)權(quán)利要求10-15中任一項(xiàng)的選擇方法，其使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行。
17.一種診斷癌癥的方法，包括下列(a)、(b)和(c)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)測(cè)定(a)中生物學(xué)樣品的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量；和(c)判斷(b)的測(cè)定數(shù)值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)測(cè)試受試者是否患癌癥。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的診斷方法，其中通過HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法、HLA五聚體方法、ELISPOT方法、實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)和有限稀釋方法的任一種進(jìn)行WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量的測(cè)定。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的診斷方法，其中通過HLA四聚體方法進(jìn)行測(cè)定。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的診斷方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將(a)中生物學(xué)樣品與含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA四聚體接觸；(c)測(cè)定與HLA四聚體結(jié)合的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量；和(d)判斷(c)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)測(cè)試受試者是否患癌癥。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的診斷方法，其中通過測(cè)定CD8-陽(yáng)性或CD8/CD3-陽(yáng)性CTL前體細(xì)胞中HLA四聚體結(jié)合細(xì)胞的比例進(jìn)行權(quán)利要求20中步驟(c)。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21的診斷方法，其中作為HLA四聚體組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)的診斷方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
24.根據(jù)權(quán)利要求17-23中任一項(xiàng)的診斷方法，其使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行。
25.根據(jù)權(quán)利要求17-24中任一項(xiàng)的診斷方法，其中使用與健康受試者相比為1.5倍或更高的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量作為指標(biāo)診斷癌癥。
26.根據(jù)權(quán)利要求17的診斷方法，其中CTL前體細(xì)胞是效應(yīng)物型CTL前體細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的診斷方法，其使用HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法、HLA五聚體方法、ELISPOT方法、實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)和有限稀釋方法的任一種測(cè)定WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的診斷方法，其使用HLA四聚體方法進(jìn)行測(cè)定。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的診斷方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將(a)中生物學(xué)樣品與含有WT1-衍生的腫瘤性抗原肽、抗-CD8抗體、抗-CD45RA抗體和抗-CD27抗體的HLA四聚體接觸；(c)測(cè)定對(duì)CD8或CD8/CD3陽(yáng)性并與HLA四聚體結(jié)合的CTL前體細(xì)胞中CD45RA-陽(yáng)性和CD27-陰性的效應(yīng)物型CTL前體細(xì)胞的比例；和(d)判斷(c)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)測(cè)試受試者是否患癌癥。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的診斷方法，其中作為HLA四聚體組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30的診斷方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
32.根據(jù)權(quán)利要求26-31中任一項(xiàng)的診斷方法，其使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行。
33.一種鑒定WT1疫苗的靶分子的方法，所述分子對(duì)于患者是特有的，包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將WT1疫苗的多個(gè)靶分子分別應(yīng)用于(a)的生物學(xué)樣品；(c)分別測(cè)定(b)的生物學(xué)樣品中的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量，并相互比較結(jié)果；和(d)在(c)中獲得結(jié)果的基礎(chǔ)上鑒定對(duì)測(cè)試患者有效的WT1疫苗的靶分子。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的鑒定方法，其中使用HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法、HLA五聚體方法、ELISPOT方法、實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)和有限稀釋方法的任一種進(jìn)行WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量的測(cè)定。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的鑒定方法，其中使用HLA四聚體方法進(jìn)行測(cè)定。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的鑒定方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)將含有不同WT1-衍生的癌抗原肽的多個(gè)HLA四聚體分別與(a)的生物學(xué)樣品接觸；(c)分別測(cè)定與HLA四聚體結(jié)合的WT1-特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量，并相互比較結(jié)果；和(d)在(c)中獲得結(jié)果的基礎(chǔ)上鑒定對(duì)測(cè)試患者有效的WT1-衍生的癌抗原肽。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的鑒定方法，其中通過測(cè)定CD8-陽(yáng)性或CD8/CD3-陽(yáng)性CTL前體細(xì)胞中與HLA四聚體結(jié)合的細(xì)胞的比例進(jìn)行權(quán)利要求36中步驟(c)。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或37的鑒定方法，其中作為HLA四聚體組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
39.根據(jù)權(quán)利要求36-38中任一項(xiàng)的鑒定方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
40.根據(jù)權(quán)利要求33-39中任一項(xiàng)的鑒定方法，其使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行。
41.一種用于選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的臨床診斷試劑，其包含作為成分的、含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的臨床診斷試劑，其中作為HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或42的臨床診斷試劑，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
44.一種包含根據(jù)權(quán)利要求41-43中任一項(xiàng)的臨床診斷試劑的試劑盒。
45.一種用于在給定患者中治療癌癥的藥物組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求33-40中任一項(xiàng)的WT1疫苗的靶分子的鑒定方法鑒定的靶分子，所述靶分子是患者特有的。
46.一種用于癌癥的診斷試劑，其包含作為成分的、含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的診斷試劑，其中作為HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體的組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
48.根據(jù)權(quán)利要求46或47的診斷試劑，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
49.一種試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求46-48中任一項(xiàng)的診斷試劑。
50.一種確定患者對(duì)WT1疫苗適合性的方法，包括下列(a)、(b)和(c)步驟(a)從接受了WT1疫苗后的測(cè)試受試者中分離含有CTL的生物學(xué)樣品；(b)測(cè)定(a)中生物學(xué)樣品的WT1-特異性CTLs的存在頻度或數(shù)量；和(c)判斷(b)的測(cè)定值相對(duì)于WT1疫苗施用前所獲得的生物學(xué)樣品是否高，并評(píng)價(jià)患者是否適于WT1疫苗治療。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的確定方法，其中使用HLA單體方法、HLA二聚體方法、HLA四聚體方法、HLA五聚體方法、ELISPOT方法、實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)和有限稀釋方法的任一種進(jìn)行WT1-特異性CTLs的存在頻度或數(shù)量的測(cè)定。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的確定方法，其中使用HLA四聚體方法進(jìn)行測(cè)定。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的確定方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步驟(a)從接受了WT1疫苗后測(cè)試受試者中分離含有CTLs的生物學(xué)樣品；(b)將含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA四聚體與(a)的生物學(xué)樣品接觸；(c)測(cè)定與HLA四聚體結(jié)合的WT1-特異性CTLs的存在頻度或數(shù)量；和(d)判斷(c)的測(cè)定值相對(duì)于WT1疫苗施用前所獲得的生物學(xué)樣品是否高，并評(píng)價(jià)患者是否適于WT1疫苗治療。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的確定方法，其中通過測(cè)定CD8-陽(yáng)性或CD8/CD3-陽(yáng)性CTLs中與HLA四聚體結(jié)合的細(xì)胞的比例進(jìn)行權(quán)利要求53中步驟(c)。
55.根據(jù)權(quán)利要求53或54的確定方法，其中作為HLA四聚體組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
56.根據(jù)權(quán)利要求53-55中任一項(xiàng)的鑒定方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
57.根據(jù)權(quán)利要求50-56中任一項(xiàng)的確定方法，其使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行。
58.根據(jù)權(quán)利要求50-57中任一項(xiàng)的確定方法，其中使用與給藥之前所獲得的樣品相比為1.5倍或更高的WT1-特異性CTLs的存在頻度或數(shù)量作為指標(biāo)評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗治療的適合性。
59.一種用于確定對(duì)WT1疫苗適合性的臨床診斷試劑，其包含作為成分的、含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的臨床診斷試劑，其中作為HLA單體、HLA二聚體、HLA四聚體或HLA五聚體的組分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
61.根據(jù)權(quán)利要求59或60的臨床診斷試劑，其中WT1-衍生的癌抗原肽選自下列肽Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO5)。
62.一種包含根據(jù)權(quán)利要求59-61中任一項(xiàng)的臨床診斷試劑的試劑盒。
全文摘要
提供了一種選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的方法和包括所述選擇方法的用于治療癌癥的治療方法，該選擇對(duì)WT1疫苗高應(yīng)答患者的方法包括(a)從測(cè)試受試者中分離含有CTL前體細(xì)胞的生物學(xué)樣品；(b)測(cè)定(a)中生物學(xué)樣品的WT1－特異性CTL前體細(xì)胞的存在頻度或數(shù)量；和(c)判斷(b)的測(cè)定值相對(duì)于健康受試者是否高，并評(píng)價(jià)對(duì)WT1疫苗的應(yīng)答性。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1842603SQ200480024559
公開日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2004年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月27日
發(fā)明者杉山治夫 申請(qǐng)人:杉山治夫