專利名稱：針對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及單克隆抗體(mAb)和用于開發(fā)新生物制劑的重組DNA技術(shù)的組合，更具體的是，例如，涉及結(jié)合并中和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的單克隆抗體的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是由間葉細(xì)胞產(chǎn)生的一種多功能異型二聚多肽。已顯示HGF刺激血管新生、形態(tài)發(fā)生和有絲分裂(motogenesis)，以及各種細(xì)胞類型的生長(zhǎng)和擴(kuò)散(Bussolino等，J.Cell.Biol.119629，1992；Zarnegar和Michalopoulos，J.Cell.Biol.1291177，1995；Matsumoto等，Ciba.Found.Symp.212198，1997；Birchmeier和Gherardi，Trends Cell.Biol.8404，1998；Xin等Am.J.Pathol.1581111，2001)。HGF的多效性活性通過其受體，一種由原癌基因cMet編碼的跨膜酪氨酸激酶介導(dǎo)的。除調(diào)節(jié)多種正常的細(xì)胞功能外，已顯示HGF及其受體c-Met參與腫瘤的引發(fā)、侵入和轉(zhuǎn)移(Jeffers等，J.Mol.Med.74505，1996；Comoglio和Trusolino，J.Clin.Invest.109857，2002)。HGF/cMet在多種人類實(shí)體腫瘤，包括源自肺、結(jié)腸、直腸、胃、腎、卵巢、皮膚、多發(fā)性骨髓瘤和甲狀腺組織的腫瘤上共表達(dá)，通常過量表達(dá)(Prat等，Int.J.Cancer 49323，1991；Chan等，Oncogene 2593，1988；Weidner等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8229，1993；Derksen等，Blood 991405，2002)。HGF作為這些腫瘤的自分泌(Rong等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 914731，1994；Koochekpour等，Cancer Res.575391，1997)和旁分泌生長(zhǎng)因子(Weidner等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8229，1993)及抑制細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)劑(Gao等，J.Biol.Chem.27647257，2001)。
HGF是一個(gè)102 kDa的蛋白質(zhì)，其序列和結(jié)構(gòu)類似于血纖維蛋白溶酶原和其他凝血酶(Nakamura等，Nature 342440，1989；Weidner等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8229，1993，每篇在此處引入作為參考)(圖1)。人類HGF以728個(gè)氨基酸前體(preproHGF)合成，其經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)剪切形成無活性的單鏈形式(proHGF)(Nakamura等，Nature342440，1989；Rosen等，J.Cell.Biol.1271783，1994)。通過細(xì)胞外分泌后，proHGF被剪切產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的二硫鍵連接的異型二聚分子，由α-亞基和β-亞基組成(Nakamura等，Nature 342440，1989；Naldini等，EMBO J.114825，1992)。α-亞基包含440個(gè)殘基(糖基化69 kDa)，由N-末端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)域和4個(gè)環(huán)餅(kringle)結(jié)構(gòu)域組成。β-亞基包含234個(gè)殘基(34 kDa)，并具有一個(gè)絲氨酸蛋白酶類結(jié)構(gòu)域，其缺乏蛋白水解活性。HGF的剪切對(duì)于受體的激活是必需的，但對(duì)于受體的結(jié)合不是必需的(Hartmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8911574，1992；Lokker等，J.Biol.Chem.26817145，1992)。HGF包含4個(gè)推測(cè)的N-糖基化位點(diǎn)，1個(gè)位于α-亞基中，3個(gè)位于β-亞基中。HGF具有2個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞特異性結(jié)合位點(diǎn)一個(gè)cMet受體的高親和力(Kd＝2×10-10M)結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)發(fā)夾硫酸蛋白多糖(HSPG)的低親和力結(jié)合位點(diǎn)(Kd＝10-9M)，其存在于細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)上(Naldini等，Oncogene 6501，1991；Bardelli等，J.Biotechnol.37109，1994；Sakata等，J.Biol.Chem，2729457，1997)。NK2(包括α-亞基的N-末端和前兩個(gè)環(huán)餅結(jié)構(gòu)域的一種蛋白質(zhì))足以結(jié)合到cMet并激活活動(dòng)性的信號(hào)級(jí)聯(lián)，然而全長(zhǎng)蛋白質(zhì)對(duì)于促有絲分裂的應(yīng)答是必需的(Weidner等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8229，1993)。HSPG通過與HGF的N末端互作而結(jié)合到HGF(Aoyama等，Biochem.3610286，1997；Sakata等，J.Biol.Chem.2729457，1997)。假定HSPG-HGF互作的功能包括HGF生物利用率、生物學(xué)活性和寡聚化的增強(qiáng)(Bardelli等，J.Biotechnol.37109，1994；Zioncheck等，J.Biol.Chem.27016871，1995)。
cMet為IV類蛋白質(zhì)酪氨酸激酶受體家族的一個(gè)成員。全長(zhǎng)cMet基因已被克隆，并被鑒定為cMet原癌基因(Cooper等，Nature 31129，1984；Park等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 846379，1987)。cMet受體最初以單鏈的部分糖基化的前體P170(MET)(圖1)合成(Park等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 846379，1987；Giordano等，Nature 339155，1989；Giordano等，Oncogene 41383，1989；Bardelli等，J.Biotechnol.37109，1994)。通過進(jìn)一步的糖基化作用，蛋白質(zhì)被水解剪切為一個(gè)異型二聚的190 kDa成熟蛋白質(zhì)(1385個(gè)氨基酸)，由50 kDaα-亞基(殘基1-307)和145 kDa β-亞基組成。β-亞基的細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
研究了幾種不同方法以獲得HGF/cMet互作的拮抗分子截短的HGF蛋白，例如NK1(N-末端結(jié)構(gòu)域加環(huán)餅結(jié)構(gòu)域1；Lokker等，J.Biol.Chem.26817145，1993)，NK2(N末端結(jié)構(gòu)域加環(huán)餅結(jié)構(gòu)域1和2；Chan等，Science 2541382，1991)和NK4(N-末端結(jié)構(gòu)域加4個(gè)環(huán)餅結(jié)構(gòu)域；Kuba等，Cancer Res.606737，2000)，抗-cMet mAbs(Dodge，Master’s Thesis，San Francisco State University，1998)和抗-HGF mAbs(Cao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 987443，2001，在此處引入作為參考)。
NK1和NK2可有效地與HGF競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合其受體，但已顯示在體外具有部分的激動(dòng)活性(Cioce等，J.Biol.Chem.27113110，1996；Schwall等，J.Cell Biol.133709，1996)，并非如期望的單純的拮抗活性。最近，Kuba等，Cancer Res.606737，2000，在一個(gè)裸鼠模型中，通過NK4的連續(xù)灌輸，證明NK4可部分抑制鼠的肺腫瘤LLC的原位生長(zhǎng)(圖2)和轉(zhuǎn)移。NK4必須被連續(xù)施用以獲得原發(fā)腫瘤的部分生長(zhǎng)抑制的事實(shí)，表明NK4分子具有潛在的短半衰期和/或缺乏效力。與NK4相比，使用抗體的方法將受益于其有利的藥物代謝動(dòng)力學(xué)及獲得具有更高效力的抗體的可能性。
作為另一個(gè)方法，Dodge(Master’s Thesis，San Francisco StateUniversity，1998)生成了拮抗性的抗-cMet單克隆抗體(mAbs)。一種mAb，5D5，在ELISA中顯示強(qiáng)烈的拮抗活性，但是誘導(dǎo)表達(dá)cMet的BAF-3細(xì)胞的增殖應(yīng)答，推測(cè)由膜受體的二聚作用引起。Prat等，J.CellSci.111237，1998也報(bào)道了抗-cMet mAbs的這種拮抗活性。Zaccolo等，Eur.J.Immunol 27618，1997利用噬菌體顯示法，確實(shí)開發(fā)了抗鼠和人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人Fab片段。這些Fab片段當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)，對(duì)HGF的活性沒有影響。當(dāng)其中一個(gè)抗-人類HGF Fab片段與結(jié)合到Fab片段本身的抗體相結(jié)合時(shí)，在一個(gè)生物學(xué)分析中確實(shí)增強(qiáng)了HGF的活性。
Cao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 987443，2001，證明施用三種抗-HGF mAbs的混合物在異種移植裸小鼠模型中(圖3)能夠抑制人腫瘤的生長(zhǎng)，所述抗-HGF mAbs是基于它們?cè)隗w內(nèi)抑制HGF的擴(kuò)散活性的能力進(jìn)行選擇的。他們假設(shè)識(shí)別HGF上的三個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)的三種mAbs是在體內(nèi)抑制HGF的生物活性所必需的兩種mAbs抑制HGF結(jié)合到cMet，一種mAbs抑制HGF結(jié)合到發(fā)夾。然而，因?yàn)樯虡I(yè)和受規(guī)章限制的原因，開發(fā)三種新mAbs組合的藥物是不切實(shí)際的，例如，因?yàn)樾枰獑为?dú)地證明每種抗體的一些臨床活性。
因此，需要在體外和體內(nèi)阻斷HGF生物學(xué)活性的單一的單克隆抗體。本發(fā)明滿足這個(gè)和其他的需要。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供針對(duì)人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的中和mAb。該mAb抑制HGF的至少一種，并優(yōu)選幾種或所有生物學(xué)活性，包括結(jié)合到其受體cMet，誘導(dǎo)細(xì)胞如Madin-Darby犬腎細(xì)胞的擴(kuò)散，誘導(dǎo)4MBr-5猴上皮細(xì)胞和/或肝細(xì)胞和/或HUVEC的增殖，并誘導(dǎo)血管新生。當(dāng)抗-HGF mAb用作單一藥劑時(shí)，可抑制這樣的活性。優(yōu)選的抗-HGF mAb抑制，最優(yōu)選完全抑制人類腫瘤異種移植物在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。本發(fā)明的mAb優(yōu)選為嵌合的、人源化的、似人類的或人類的。示例性的抗體為L(zhǎng)2G7及其嵌合和人源化的形式。也提供了產(chǎn)生這種抗體的細(xì)胞系。在另一個(gè)實(shí)施方案中提供了一種藥物組合物，包括一種中和抗HGF-抗體，例如，嵌合或人源化L2G7。在第三個(gè)實(shí)施方案種，將該藥物組合物施用于病人以治療癌癥或其他疾病。


圖1.HGF和cMet的圖示模型。
圖2.圖示了NK4部分抑制裸鼠鼠肺腫瘤LLC的原位生長(zhǎng)(來自Kuba等，Cancer Res.606737，2000)。在腫瘤s.c.移植到裸鼠后第四天開始，用NK4連續(xù)灌輸14天。
圖3.圖示了需要三種抗-HGF mAbs的混合物來抑制裸鼠人腦瘤U-118細(xì)胞的生長(zhǎng)(來自Cao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 987443，2001)。U-118腫瘤細(xì)胞被s.c.注射到裸鼠。從第一天開始施用抗-HGFmAbs A-1，-5和-7或mAbs 7-2和-3，200μg/注射，2次/周，共10周。
圖4.用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ELISA，確定mAbs L1H4，L2C7，L2G7的相關(guān)結(jié)合表位。板用重組HGF(rHGF)進(jìn)行涂層，用脫脂牛奶封閉，并用亞最佳濃度的生物素酰化mAbs在100×過量未標(biāo)記的mAbs存在在溫育。通過加入HRP-鏈霉親和素檢測(cè)結(jié)合的生物素酰化mAb。
圖5.在直接HGF結(jié)合ELISA中測(cè)定抗-HGF mAbs與rHGF的結(jié)合。板用含有rHGF的HI-F11上清進(jìn)行涂層，以2％脫脂牛奶封閉并用mAbs溫育，隨后加入HRP-GαMIgG(如以下實(shí)施例所述)。
圖6.抗-HGF mAbs捕獲溶液中rHGF-Flag的能力。抗-HGF mAbs被捕獲在用山羊抗-小鼠IgG涂層的ELISA板上。然后板用2％脫脂牛奶封閉并用rHGF-Flag溫育，隨后用HRP-M2抗-Flag mAb溫育(如以下實(shí)施例所述)。
圖7.在捕獲ELISA中，抗-HGF mAbs抑制rHGF-Flag結(jié)合到cMet-Fc。在山羊抗人IgG涂層的板上捕獲的cMet-Fc用HGF-Flag溫育，所述HGF-Flag用/不用mAbs進(jìn)行預(yù)溫育。通過加入HRP-M2抗-FlagmAb檢測(cè)結(jié)合的rHGF-Flag(如以下實(shí)施例所述)。
圖8.抗-HGF mAb L2G7中和誘導(dǎo)MDCK擴(kuò)散的HGF。(A)不做任何處理的對(duì)照。(B)rHGF+IgG。(C)rHGF+mAb L2G7。在10μg/ml的mAbs存在下，MDCK細(xì)胞用H1-F11培養(yǎng)物上清的1∶20稀釋物溫育(～3μg/ml HGF)。照片在100×放大倍數(shù)下拍攝。
圖9.L2G7 mAb抑制HGF誘導(dǎo)的Mv 1 LU細(xì)胞增殖。水平軸表示mAb超過HGF的摩爾倍數(shù)，垂直軸表示結(jié)合的cpm×10-2。數(shù)據(jù)點(diǎn)通過三個(gè)重復(fù)獲得。
圖10.L2G7 mAb和對(duì)照小鼠抗體(mIgG)抑制HGF-誘導(dǎo)的HUVEC增殖。數(shù)據(jù)點(diǎn)通過三個(gè)重復(fù)獲得。
圖11.L2G7和L1H4抗體對(duì)HGF-誘導(dǎo)的HCT 116結(jié)腸腫瘤細(xì)胞增殖的影響。數(shù)據(jù)點(diǎn)通過三個(gè)重復(fù)獲得。
圖12.在NIH III Beige/裸鼠組(n＝6)中，用L2G7 mAb或PBS(對(duì)照)處理對(duì)U-118腫瘤生長(zhǎng)的影響。箭頭指出注射開始的時(shí)間。(A)腫瘤大小對(duì)從腫瘤移植開始的天數(shù)。(B)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的腫瘤質(zhì)量。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了中和抗-HGF單克隆抗體，包含其的藥物組合物以及使用其治療疾病的方法。
1.抗體抗體是具有復(fù)雜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的很大的復(fù)合分子(分子量為～150,000或大約1320個(gè)氨基酸)。天然的抗體分子包含兩對(duì)相同的多肽鏈，每對(duì)具有一條輕鏈和一條重鏈。每條輕鏈和重鏈依次由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成一個(gè)參與結(jié)合靶抗原的可變(“V”)區(qū)域和一個(gè)與免疫系統(tǒng)其他成分互作的恒定(“C”)區(qū)域。輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域在3-維空間折疊在一起，形成結(jié)合抗原(例如，細(xì)胞表面的受體)的可變結(jié)構(gòu)域。在每條輕鏈或重鏈可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)有三個(gè)短的片段(長(zhǎng)度平均為10個(gè)氨基酸)，稱互補(bǔ)決定區(qū)域(“CDRs”)。一個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域的6個(gè)CDRs(三個(gè)來自輕鏈，三個(gè)來自重鏈)在3-D空間折疊在一起，形成實(shí)際的抗體結(jié)合位點(diǎn)，其鎖到靶抗原上。已經(jīng)精確地闡述了CDRs的位置和長(zhǎng)度。Kabat，E.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Health and Human Services，1983，1987。不包含于CDRs的可變區(qū)域部分稱為構(gòu)架，其形成CDRs的環(huán)境。
單克隆抗體(mAB)是抗體的一種單分子種類，因此不包含通過為動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，兔子或山羊)注射抗原并從動(dòng)物血清中提取而生產(chǎn)的多克隆抗體。人源化抗體是基因工程(單克隆的)化抗體，其中來自小鼠抗體的CDRs(“供體抗體”，其也可以是大鼠，倉(cāng)鼠或其他類似種)被移植到人抗體(“受體抗體”)。人源化抗體也可用來自小鼠抗體的少于完全CDRs來制造(例如，Pascalis等，J.Immunol.1693076，2002)。因此，人源化抗體是具有來自供體抗體的CDRs和來自人抗體的可變區(qū)域構(gòu)架和恒定結(jié)構(gòu)域的抗體。因此，一般地，人源化抗體包括(i)一條輕鏈，包括來自小鼠抗體例如L2G7的三個(gè)CDRs和來自人抗體的一個(gè)可變區(qū)域構(gòu)架以及一個(gè)人類恒定區(qū)域，和(ii)一條重鏈，包括來自小鼠抗體例如L2G7的三個(gè)CDRs和來自人抗體的一個(gè)可變區(qū)域構(gòu)架以及一個(gè)人恒定區(qū)域。另外，為了保持高結(jié)合親和力，至少兩種另外的結(jié)構(gòu)元件之一可被利用。見美國(guó)專利5,530,101和5,585,089，在此處它們均被引入作為參考，其為人源化抗體的構(gòu)建提供了詳細(xì)的說明書。
在第一個(gè)結(jié)構(gòu)元件中，通過從許多已知的人類抗體中適當(dāng)?shù)剡x擇受體抗體，選擇人源化抗體的重鏈可變區(qū)域構(gòu)架從而與供體抗體的重鏈可變區(qū)域構(gòu)架具有最大的序列同一性(在65％和95％之間)。當(dāng)被比抗體序列按照Kabat編號(hào)規(guī)則進(jìn)行比對(duì)時(shí)，可確定序列同一性。在第二個(gè)結(jié)構(gòu)元件中，在構(gòu)建人源化抗體時(shí)，根據(jù)具體的規(guī)則，選擇的人受體抗體構(gòu)架中的氨基酸(在CDRs之外)被來自供體抗體的相應(yīng)氨基酸替代。具體而言，構(gòu)架中被替代的氨基酸基于它們與CDRs互作的能力進(jìn)行選擇。例如，被替代的氨基酸可鄰近供體抗體序列的一個(gè)CDR，或在3-維空間測(cè)量的人源化抗體的一個(gè)CDR的4-6埃之內(nèi)。
嵌合的抗體是小鼠(或其他嚙齒動(dòng)物)抗體的可變區(qū)域與人抗體的不變結(jié)構(gòu)域組合的一種抗體；通過基因工程方法構(gòu)建它們是公知的。這樣的抗體雖然具有大約三分之二的人抗體部分，但保持了小鼠抗體的結(jié)合特異性。存在于小鼠、嵌合和人源化抗體中的非人類序列部分，表明嵌合抗體的免疫原性介于小鼠和人源化抗體之間。相對(duì)于小鼠抗體可能具有降低的免疫原性的其他基因工程抗體類型包括用噬菌體顯示法(Dower等，WO9/17271；McCafferty等，WO92/001047；Winter，WO92/20791；和Winter，F(xiàn)EBS Lett.2392，1998，每篇在此處均引入作為參考)或用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(Lonberg等，WO93/12227；KucherlapatiWO91/10741，每篇在此處均引入作為參考)制造的人抗體。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“似人類的”抗體指其中一條或兩條鏈氨基酸序列的主要部分(例如大約50％或更多)起源于人類免疫球蛋白基因的一種mAb。因此，似人類的抗體包括但不限制于嵌合的、人源化的和人抗體。在此使用的“免疫原性降低的”抗體是期望當(dāng)施用于人類病人時(shí)比小鼠抗體具有顯著減少的免疫原性的抗體。這樣的抗體包括嵌合、人源化和人抗體，以及通過替換小鼠抗體中的特定的氨基酸而制造的抗體，這些氨基酸可能決定B-或T-細(xì)胞表位，例如暴露的殘基(Padlan，Mol.Immunol28489，1991)。在此使用的“基因工程化”抗體是在重組DNA技術(shù)的幫助下，基因被構(gòu)建或放到一個(gè)非天然的環(huán)境中(例如小鼠或噬菌體中的人基因)的抗體，因此，例如，不包括用傳統(tǒng)的雜交細(xì)胞技術(shù)制造的鼠mAb。
mAb的表位是與mAb結(jié)合的其抗原區(qū)域。如果每個(gè)抗體競(jìng)爭(zhēng)地抑制(阻斷)其他的抗體與抗原的結(jié)合，則兩個(gè)抗體結(jié)合到同一個(gè)或重疊的表位。那就是，與缺乏競(jìng)爭(zhēng)抗體的對(duì)照相比，在一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析中測(cè)量到一種抗體的1×，5×，10×，20×或100×過量，抑制其他抗體的結(jié)合達(dá)到至少50％，但優(yōu)選75％，90％，或甚至99％(參見，例如Junghans等，Cancer Res.501495，1990，在此處引入作為參考)?；蛘撸绻乖薪档突蛳环N抗體的結(jié)合的基本上所有氨基酸突變降低或消除其他抗體的結(jié)合，則這兩種抗體具有相同的表位。
2.中和抗-HGF抗體如果結(jié)合可部分地或完全地抑制HGF的一種或多種生物學(xué)活性(即當(dāng)mAb作為單一藥劑使用時(shí))，結(jié)合HGF的單克隆抗體(mAb)(即，抗-HGF mAb)將中和HGF，或中和HGF。中和抗體可能抑制的HGF的生物學(xué)特性如下結(jié)合到其cMet受體，引起某些細(xì)胞系例如Mardin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞的擴(kuò)散；刺激某些細(xì)胞，包括肝細(xì)胞，4MBr-5猴上皮細(xì)胞和多種人類腫瘤細(xì)胞的增殖(即，致有絲分裂)；或刺激血管新生，例如，通過刺激人類血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖或?qū)Ч苄纬?，或?dāng)應(yīng)用于雞胚胎絨(毛)膜尿囊膜(CAM)時(shí)誘導(dǎo)血管測(cè)定的。本發(fā)明的抗體優(yōu)選結(jié)合到人類HGF，即由目錄號(hào)為D90334的GenBank序列編碼的蛋白質(zhì)(引入作為參考)。
當(dāng)用以下實(shí)施例中描述的或本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行分析時(shí)，本發(fā)明的中和mAb在濃度為例如，0.01，0.1，0.5，1，2，5，10，20或50μg/ml時(shí)將抑制HGF的生物學(xué)功能(例如刺激增殖或擴(kuò)散)達(dá)到大約至少50％，但優(yōu)選75％，更優(yōu)選90％或95％或甚至99％，且最優(yōu)選接近100％(基本上完全)。對(duì)于缺乏HGF的陰性對(duì)照，如果活性水平在誤差范圍內(nèi)，則抑制被認(rèn)為是完全的。一般地，當(dāng)使用的HGF數(shù)量剛好足以完全刺激生物學(xué)活性，或?yàn)?.05，0.1，0.5，1，3，或10μg/ml時(shí)，測(cè)量抑制程度。優(yōu)選，當(dāng)抗體與HGF的摩爾比為0.5×，1×，2×，3×，5×，或10×?xí)r，獲得至少50％，75％，90％，或95％或基本上完全的抑制。優(yōu)選，當(dāng)作為單一藥劑使用時(shí)，mAb具中和性，即抑制生物學(xué)活性，但可能需要兩種mAb共同提供抑制。最優(yōu)選mAb不但中和上面列出的一種而是幾種的生物學(xué)活性；為了此目的，作為單一藥劑使用的抗-HGF mAb中和HGF的所有生物學(xué)活性稱“完全中和”，這樣的mAb是最優(yōu)選的。本發(fā)明的mAb優(yōu)選對(duì)HGF具有特異性，即它們將不結(jié)合，或僅以更小的程度(例如Ka至少小于10倍)結(jié)合到與HGF相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。優(yōu)選的抗體缺乏針對(duì)HGF的激動(dòng)活性。即抗體不直接刺激具有HGF的細(xì)胞就阻斷HGH與cMet的互作。本發(fā)明的mAbs通常具有對(duì)HGF的結(jié)合親和力(K2)至少107M-1，但優(yōu)選108M-1或更高，且最優(yōu)選109M-1或更高或甚至1010M-1或更高。
本發(fā)明的mAbs包括天然四聚體形式的抗-HGF抗體(2條輕鏈和2條重鏈)，且可以是任一已知的同種型IgG，IgA，IgM，IgD和IgE及它們的亞型，即人IgG1，IgG2，IgG3，IgG4和小鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，和IgG3。本發(fā)明的mAbs也意味著包括抗體例如Fv，F(xiàn)ab和F(ab’)2的片段；雙功能雜交抗體(例如Lanzavecchia等，Eur.J.Immunol.17105，1987)，單鏈抗體(Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879，1988；Bird等，Science 242423，1988)；和具有改變的恒定區(qū)域的抗體(例如美國(guó)專利5,624,821)。mAbs可以是動(dòng)物(例如小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠或雞)來源，或由基因工程構(gòu)建。嚙齒動(dòng)物mAbs可通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法制造，包括用在適當(dāng)佐劑中的HGF的i.p.，i.v.多重免疫或?qū)δ_墊進(jìn)行免疫，隨后提取脾臟或淋巴結(jié)細(xì)胞，并與適當(dāng)?shù)挠郎?xì)胞系進(jìn)行融合，然后選擇產(chǎn)生結(jié)合HGF的抗體的雜交瘤，例如見下面的實(shí)施例。通過上述在本領(lǐng)域已知的方法制造的嵌合和人源化的抗體是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。例如通過噬菌體顯示法或轉(zhuǎn)基因小鼠法制造的人抗體也是優(yōu)選的(例如見上述的Dower等，McCafferty等，Winter，Lonberg等，Kucherlapati)。更廣泛地，如在此定義的似人類的、降低免疫原性的和基因工程的抗體都是優(yōu)選的。
下文所述的中和抗-HGF mAbs L1H4，L2C7和L2G7 mAbs是本發(fā)明的實(shí)施例，L2G7為優(yōu)選實(shí)施例。與任何這些mAbs具有相同或重疊表位的中和mAbs，例如L2G7，提供了其他的實(shí)施例。L2G7或與LGF的嵌合或人源化形式是特別優(yōu)選的實(shí)施方案。在此描述的至少一個(gè)，并優(yōu)選所有的體外或體內(nèi)分析中，與L2G7競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HGF和中和HGF的mAb(包括嵌合的、人源化的和人抗體)也是優(yōu)選的。本發(fā)明包括在氨基酸序列中，至少在CDRs中，與L2G7具有90％、95％、99％或100％同一性(通過按照Kabat規(guī)則抗體序列比對(duì)來確定的)的mAbs。優(yōu)選這種抗體通過少數(shù)功能上不重要的氨基酸的取代(例如保守取代)、缺失、或插入而與L2G7不同。優(yōu)選這種抗體保留L2G7的功能特征，即，這種抗體在此處描述的至少一個(gè)，并優(yōu)選所有的體外或體內(nèi)分析中，中和HGF。為了將氨基酸取代分為保守的或非保守的，氨基酸可被分組如下組I(疏水側(cè)鏈)正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；組II(中性親水側(cè)鏈)cys，ser，thr；組III(酸性側(cè)鏈)asp，glu；組IV(堿性側(cè)鏈)asn，gln，his，lys，arg；組V(影響鏈方向的殘基)gly，pro；和組VI(芳香側(cè)鏈)trp，tyr，phe。保守取代包括相同類群內(nèi)的氨基酸之間的替換。非保守替換指將其中一類群的一個(gè)成員替換為另一類群的一個(gè)成員。
本發(fā)明的天然mAbs可從它們的雜交瘤生產(chǎn)?；蚬こ蘭Abs，例如嵌合或人源化mAbs，可通過多種本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行表達(dá)。例如，編碼它們的輕鏈和重鏈V區(qū)域的基因可從重疊的寡核苷酸合成，并連同可得到的C區(qū)域共同插入到表達(dá)載體(例如，商業(yè)上可從Invitrogen獲得)，其提供必需的調(diào)節(jié)區(qū)域，例如，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，多聚A位點(diǎn)等。優(yōu)選使用CMV啟動(dòng)子-增強(qiáng)子。然后利用多種本領(lǐng)域公知的方法，例如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔法，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系例如CHO或非生產(chǎn)骨髓瘤，包括Sp2/0和NSO，并用適當(dāng)?shù)目股剡x擇法選擇表達(dá)這些抗體的細(xì)胞。見，例如美國(guó)專利5,530,101。更大量的抗體可通過在商業(yè)上可得的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)這些細(xì)胞來生產(chǎn)。
一經(jīng)表達(dá)，本發(fā)明的mAbs或其他抗體可按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)程序例如微孔過濾、超濾、蛋白A或G親和層析法、大小排阻色譜法、陰離子交換層析法、陽(yáng)離子交換層析法和/或基于有機(jī)染料的其他形式的親和層析法等方法進(jìn)行純化。對(duì)于藥用，優(yōu)選至少大約90％或95％勻質(zhì)性的基本上純的抗體，最優(yōu)選98％或99％或更高的勻質(zhì)性。
3.治療方法在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)包括在此所述抗體的藥物制劑。即抗體可以用于治療疾病的藥劑的生產(chǎn)?？贵w的藥物制劑(即藥劑)包含在生理上可接受的載體中的mAb，任選連同賦形劑或穩(wěn)定劑，使用凍干或水溶液的形式?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在應(yīng)用的劑量和濃度對(duì)于接受者是無毒的，并包括pH通常為5.0到8.0，最常為6.0到7.0的緩沖液，例如磷酸鹽，檸檬酸鹽，或醋酸鹽；鹽例如氯化鈉、氯化鉀等維持等滲壓；抗氧化劑、防腐劑、低分子量多肽、蛋白質(zhì)、親水聚合物例如聚山梨醇酯80、氨基酸、碳水化合物、鰲合劑、蔗糖、及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他標(biāo)準(zhǔn)成分(Remington’sPharmaceutical Science 16thedition，Osol，A.Ed.1980)。mAb通常以1-100mg/ml，例如10mg/ml的濃度存在。
本發(fā)明的抗體中不受歡迎的污染物通常相當(dāng)少。這意味著抗體通常至少具有大約50％w/w(質(zhì)量/質(zhì)量)的純度，并且基本上不含干擾蛋白質(zhì)和污染物。優(yōu)選抗體的純度至少90％、95％或99％w/w。腸胃外施用的藥物組合物通常是無菌的、基本上等滲壓的，并根據(jù)FDA或類似團(tuán)體的Good Manufacturing Practices進(jìn)行制備。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了利用在藥物制劑中的抗-HGF mAb治療有疾病的病人的方法。配制在藥物制劑中的mAb可通過任一適當(dāng)?shù)耐緩?，尤其通過靜脈灌輸，或肌肉內(nèi)或皮下加強(qiáng)注射施用于病人。靜脈灌輸可在15分鐘這么少的時(shí)間內(nèi)給完藥，但更常為30分鐘，或多于1、2或甚至3小時(shí)。mAb也可被直接注射到疾病部位(例如腫瘤)，或封裝入載體藥劑例如脂質(zhì)體的膠囊中。給藥的劑量應(yīng)足以減輕被治療的疾病(“治療有效劑量”)，且可能為0.1到5mg/kg體重，例如1，2，3，或4mg/kg，但可能高達(dá)10mg/kg或者甚至15或20mg/kg。也可給固定的單位劑量，例如，50，100，200，500，或1000mg，或可基于病人表面積的劑量，例如，100mg/m2。通常1和8個(gè)劑量之間(例如1、2、3、4、5、6、7或8)被施用于治療癌癥，但可給10、20或更多個(gè)劑量。mAb可每天一次、每?jī)芍芤淮巍⒚恐芤淮?、每隔一周一次，每月一次或在一些其他的時(shí)間間隔，取決于例如mAb的半衰期，施用1周，2周，4周，8周，3-6個(gè)月或更長(zhǎng)。由于是長(zhǎng)期施用，重復(fù)的療程也是可能的。減輕或至少部分地抑制疾病癥狀(生化的，組織學(xué)的和/或臨床的)，包括其并發(fā)癥和該疾病發(fā)展的中間病理表型的施用劑量和間隔方案被認(rèn)為是治療有效的方案。
本發(fā)明的藥物組合物也可用于對(duì)在癌癥危險(xiǎn)中的病人進(jìn)行預(yù)防。這樣的病人包括那些對(duì)癌癥具有遺傳易感性的病人，經(jīng)歷暴露于致癌劑例如輻射或毒素的病人，及以前經(jīng)歷癌癥治療且具有復(fù)發(fā)危險(xiǎn)的病人。預(yù)防劑量是足以消除或減少危險(xiǎn)，減輕嚴(yán)重性，或延緩疾病發(fā)作，包括疾病的生化、組織學(xué)和/或臨床的癥狀，其并發(fā)癥和在疾病發(fā)展期間出現(xiàn)的中間病理表型的量。藥物組合物以有效實(shí)現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)這些目標(biāo)的量和間隔施用，被稱作預(yù)防有效的方案。
尤其易受用本發(fā)明的抗-HGF mAbs治療影響的疾病包括已知或設(shè)想需要血管新生或同提高的HGF水平聯(lián)系在一起的實(shí)體腫瘤，例如兒童或成人的卵巢癌、乳腺癌、肺癌(小細(xì)胞或非小細(xì)胞)，結(jié)腸癌，前列腺癌、胰腺癌、腎癌、胃癌、肝癌、腦頸腫瘤、惡性黑素瘤、肉瘤和腦瘤(例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)。治療也可施用于具有白血病或淋巴瘤的病人。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗-HGF mAb可連同其他的抗-癌治療劑共同施用(即之前，同時(shí)或之后)。例如，抗-HGF mAb可與腫瘤學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任一種或多種化療藥物共同施用，例如紫杉醇(Taxol)[太平洋紫杉醇(paclitaxel)]或其衍生物，鉑化合物例如卡鉑(carboplatin)或順鉑(cisplatin)，anthrocyclines(小紅莓)例如阿霉素(doxorubicin)，烷基化劑例如環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)，抗代謝物例如5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)，或依托泊苷(etoposide)?？?HGFmAb可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的化療方案，結(jié)合兩種、三種或多種這些藥劑施用，例如用于治療乳腺癌和卵巢癌的紫杉醇(Taxol)和卡鉑(carboplatin)?？?HGF mAb可結(jié)合施用的其他藥劑包括生物制劑例如單克隆抗體，包括抗HER2抗原的HercepinTM，抗VEGF的AvastinTM，或EGF受體的抗體，也包括抗-血管新生的小分子或EGF受體拮抗藥物。另外，抗-HGFmAb可與放療或手術(shù)共同使用。
與同樣但不用抗-HGF mAb的治療(例如化療)相比，包括抗-HGFmAb抗體的治療(例如標(biāo)準(zhǔn)化療)可增加具有這些腫瘤(例如卵巢、乳腺、肺、胰臟、腦和結(jié)腸，尤其是當(dāng)舊病復(fù)發(fā)或難以控制時(shí))的病人的中位無進(jìn)展生存期(median progression-free survival)或總存活時(shí)間達(dá)至少30％或40％但優(yōu)選50％、60％到70％或甚至100％或更長(zhǎng)。另外或者，與同樣但不用抗-HGF mAb的治療(例如化療)相比，包括抗-HGF mAb抗體的治療(例如標(biāo)準(zhǔn)化療)可增加具有這些腫瘤(例如卵巢、乳腺、肺、胰臟、腦和結(jié)腸，尤其是當(dāng)舊病復(fù)發(fā)或難以控制時(shí))的病人的完全應(yīng)答率、部分應(yīng)答率、或目標(biāo)應(yīng)答率(完全+部分)至少達(dá)30％或40％但優(yōu)選50％、60％到70％或甚至100％。治療可任選抑制腫瘤侵入或轉(zhuǎn)移。
通常在臨床試驗(yàn)中(例如階段II，階段II/III或階段III試驗(yàn))，前述以化療加抗-HGF mAb進(jìn)行治療的病人的中位無進(jìn)展生存期和/或應(yīng)答率的增加，相對(duì)于單獨(dú)接受化療(或加安慰劑)的病人對(duì)照群，例如在p＝0.05或0.01或甚至0.001的水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。技術(shù)人員也可理解完全和部分應(yīng)答率是由在癌癥臨床試驗(yàn)中普遍使用的客觀標(biāo)準(zhǔn)確定的，例如由National Cancer Institute和/或Food and DrugAdministration列出或接受的一樣。
4.其他方法本發(fā)明的抗-HGF mAb在診斷、預(yù)防和實(shí)驗(yàn)室方法上也有用途。它們可被用來測(cè)量腫瘤中或具有腫瘤的病人血液中的HGF，因此追蹤和指導(dǎo)腫瘤的治療。例如，與高水平HGF關(guān)聯(lián)的腫瘤將尤其對(duì)用抗-HGF mAb治療有響應(yīng)。在特定的實(shí)施方案中，mAbs可被用于ELISA或放射性免疫分析中測(cè)量HGF的水平，例如，在腫瘤活組織檢查標(biāo)本或血清或細(xì)胞培養(yǎng)中HGF-分泌細(xì)胞的培養(yǎng)基上清中。結(jié)合到不同表位的兩種抗-HGF mAbs的應(yīng)用(即不競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合)在開發(fā)敏感的“三明治”ELISA用于檢測(cè)HGF上尤其有用。對(duì)于各種分析而言，mAb可用熒光分子、旋轉(zhuǎn)標(biāo)記分子、酶或放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記，并且可連同所有必需的試劑以試劑盒的形式提供，用于實(shí)行HGF的分析。在其他的用途中，抗-HGF mAb可用于純化HGF，例如通過親和層析法。
實(shí)施例1.抗-HGF mAbs的產(chǎn)生為產(chǎn)生結(jié)合人類HGF并阻斷其活性的mAbs，首先在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)重組人HGF(rHGF)。編碼重組人HGF(rHGF)或rHGF-Flag肽(連接到HGF的C-末端的Flag的8個(gè)氨基酸殘基)的cDNAs被構(gòu)建在一個(gè)pIND-誘導(dǎo)的表達(dá)載體中(No等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.933346，1996)。然后用Fugene轉(zhuǎn)染劑(Roche)將這些cDNA轉(zhuǎn)染到EcR-293人類腎成纖維細(xì)胞(Invitrogen)中。600μg/ml G418和400μg/ml Zeocin(Invitrogen)存在時(shí)，選擇穩(wěn)定的細(xì)胞系H1-F11和24.1，其分別分泌HGF和HGF-Flag。在沒有血清的含有谷氨酰胺和抗生素的DMEM中，通過用4μM Ponasterone A(Invitrogen)處理4-5天，誘導(dǎo)H1-F11和24.1分泌HGF和HGF-Flag。在4℃，15,000rpm離心30min除去聚集物后，用帶有截?cái)郙W 50,000的過濾器[amiconCentriprep YM-50過濾器，隨后用microcon YM-50過濾器(Millipore)]的膜超濾濾筒將分泌到培養(yǎng)物上清的HGF濃縮將近100倍。這樣濃縮的H1F11培養(yǎng)物上清含有～100μg/ml的HGF和～120μg/ml的牛血清白蛋白。
用重懸于MPL-TDM(Ribi Immunochem.Research)的1-2μg純化的rHGF(Pepro Tech)或1-2μg rHGF加1-2μg BSA(濃縮的H1-F11培養(yǎng)上清)，每周對(duì)Balb/c鼠的每個(gè)后腳墊進(jìn)行免疫一次，共＞10次。在最后一次加強(qiáng)免疫完成后3天，用35％聚乙二醇將腿彎部的淋巴結(jié)細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞P3X63AgU.1(ATCC CRL1597)融合。如前所述在HAT培養(yǎng)基中選擇雜交瘤(Chuntharapai和Kim，J.Immunol.163766，1997，在此處引入作為參考)。融合后10天，雜交瘤培養(yǎng)物上清在直接的HGF結(jié)合ELISA及HGF-Flag捕獲ELISA中進(jìn)行篩選。后一個(gè)檢測(cè)被用于進(jìn)一步證實(shí)用直接HGF結(jié)合ELISA選擇的抗-HGF mAb的特異性，并選擇在溶液相(solution phase)中能結(jié)合HGF的mAbs。然后如所描述的(Jeffers等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9514417，1998)HGF-Flag/cMet-Fc結(jié)合ELISA和MDCK擴(kuò)散分析中測(cè)定所選mAbs的阻斷活性。用限制稀釋技術(shù)將所選的雜交瘤克隆兩次。用同種型試劑盒(Zymed)確定mAbs的同種型。用ImmunoPure(A/G)IgG純化試劑盒(Pierce)培養(yǎng)和純化所選mAbs的腹水。根據(jù)Pierce提供的說明書用EZ-sulfo-NHS-LC-Biotin制備生物素酰化mAbs。在下面更詳細(xì)描述這里所指的每一個(gè)分析。對(duì)于直接的HGF結(jié)合ELISA，將用PBS以1∶2的HGF/PBS比例稀釋的含有rHGF的H1-F11培養(yǎng)物上清以50μl/孔對(duì)微量滴定板(Maxisorb；Nune)進(jìn)行涂層，在4℃過夜。在洗滌板之后，用含有2％脫脂牛奶的PBS對(duì)非特異性結(jié)合位點(diǎn)在室溫(RT)進(jìn)行封閉1hr。洗滌板后，將純化的mAbs或雜交瘤培養(yǎng)物上清以50μl/孔加入每孔中1hr。洗滌后，然后用1μg/ml HRP-山羊抗-小鼠IgG(HRP-GαMIgG，Capple)以50μl/孔將板溫育1hr。通過加入四甲基聯(lián)苯胺底物(Sigma)檢測(cè)結(jié)合的HRP-GαMIgG。加入1N H2SO4中止反應(yīng)，然后用ELISA板讀數(shù)機(jī)在450nm讀板。在洗滌緩沖液(含0.05％Tween20的PBS)洗滌3次。
對(duì)于HGF-Flag捕獲ELISA，用在PBS中2μg/ml的對(duì)小鼠IgG(GαMIgG-Fc)的Fc部分具有特異性的山羊抗體，以50μl/孔對(duì)微量滴定板進(jìn)行涂層，在4℃過夜，并用2％脫脂牛奶在室溫封閉1hr。洗滌后，用純化的mAbs或雜交瘤培養(yǎng)物上清以50μl/孔對(duì)板溫育1hr。洗滌后，然后用含有rHGF-Flag的24.1細(xì)胞培養(yǎng)物上清以50μl/孔對(duì)板進(jìn)行培養(yǎng)。洗滌后，然后用含有15μg/ml小鼠IgG的HRP-M2抗-Flag mAb(Invitrogen)以50μl/孔對(duì)板進(jìn)行溫育。通過加入如上所述的底物檢測(cè)結(jié)合的HRP-抗-Flag M2。在洗滌緩沖液中洗滌3次。
從如前所述通過用在濃縮的H1-F11培養(yǎng)物上清中的rHGF免疫Balb/c小鼠而產(chǎn)生的雜交瘤獲得的至少三種稱為L(zhǎng)1H4、L2C7和L2G7的mAbs，在直接rHGF結(jié)合ELISA和HGF-Flag捕獲ELISA中都顯示結(jié)合，并被選出作進(jìn)一步研究。然后這些雜交瘤被克隆兩次，通過標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)小鼠的腹水，用蛋白質(zhì)G/A柱純化mAbs。用同種型試劑盒(Zymed Lab)測(cè)定mAbs的同種型。在2003年4月29日將L2G7雜交瘤保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection，P.O.Box 1549 Manassas，VA20108)，根據(jù)布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)保藏號(hào)為ATCC PTA-5162。這些保藏物將被保存在經(jīng)權(quán)威認(rèn)可的保藏處，并且當(dāng)發(fā)生突變、無活力或毀壞事件時(shí)將被替換，保存時(shí)期為在樣品釋放的最近要求被保藏處接受后至少五年，自存放之日起至少三十年，或相關(guān)專利強(qiáng)行有效時(shí)期，由最長(zhǎng)的那個(gè)時(shí)期決定。在申請(qǐng)的專利授權(quán)后，這些細(xì)胞系對(duì)于公眾的可獲得性的所有限制將不可撤回的去除。
具有此處所描述的在體外中和HGF和/或在體內(nèi)抑制(例如完全地)腫瘤生長(zhǎng)的期望性質(zhì)的單一原型(archtypal)抗-人-HGF mAb例如L2G7一經(jīng)被分離，通過使用本領(lǐng)域公知的方法可直接產(chǎn)生其他的具有相似性質(zhì)的mAbs。例如，小鼠可用如上所述的HGF進(jìn)行免疫，產(chǎn)生雜交瘤，根據(jù)與原型mAb競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HGF的能力篩選得到的mAbs?；蛘撸诖艘胱鳛閰⒖嫉腏espers等，Biotechnology 12899，1994的方法，可被用于指導(dǎo)與原型mAb例如L2G7具有相同表位，從而具有相似性質(zhì)的mAbs的選擇。利用噬菌體顯示，首先將原型抗體的重鏈與所有輕鏈(優(yōu)選人類)的進(jìn)行配對(duì)，以選擇HGF-結(jié)合mAb，然后將新的輕鏈與所有重鏈(優(yōu)選人)進(jìn)行配對(duì)以選擇(優(yōu)選人)與原型mAb具有相同表位的HGF-結(jié)合mAb。
2.抗-HGF mAbs的體外表征通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ELISA，其中100×過量的未標(biāo)記mAb被用于與HGF結(jié)合ELISA中相同的或其他生物素?；痬Ab進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，部分表征抗體的結(jié)合表位。圖4顯示抗-HGF mAbs、L1H4和L2C7的結(jié)合僅受自身抑制，表明它們識(shí)別獨(dú)特的表位。L2C7的結(jié)合被L2G7抑制，但不被L1H4抑制。這表明L2C7的表位與L2G7的表位重疊，但與L1H4不重疊。然而，L2C7不能抑制L2G7的結(jié)合，表明L2C7和L2G7表位重疊但是有區(qū)別的，和/或L2C7的親和力比L2G7的低得多。L1H4、L2C7和L2G7的表位分別稱作A、B和C。
用純化的抗體在直接HGF結(jié)合ELISA中測(cè)量了三種抗-HGF mAbs的相對(duì)結(jié)合能力，其中rHGF首先結(jié)合到板上。在這個(gè)分析中，L2C7和L2G7比L1H4(圖5)結(jié)合得更好。用HGF-Flag捕獲ELISA也測(cè)定了mAbs結(jié)合溶液中rHGF-Flag的能力。所有三種mAbs在溶液相中都能夠捕獲rHGF-Flag，但mAb L2G7比其他的更有效(圖6)。這些結(jié)果表明mAb L2G7在這三個(gè)mAbs中對(duì)HGF具有最高的結(jié)合親和力。
HGF的生物學(xué)活性之一是結(jié)合其受體cMet的能力，因此分析了抗-HGF mAbs抑制HGF與cMET結(jié)合的能力。對(duì)于這個(gè)分析，首先用pDisplay表達(dá)載體(Invitrogen)中編碼與人IgG1的Fc部分(殘基216到446)連接的cMet的1-929 ECD殘基的cDNA轉(zhuǎn)染人成纖維293細(xì)胞，用于生產(chǎn)cMet-Fc，如Mark等，J.Biol.Chem.26726166，1992所述。用在PBS中的2μg/ml對(duì)人IgG的Fc部分(GαHIgG-Fc)具有特異性的上羊抗體以50μl/孔對(duì)微量滴定板進(jìn)行涂層，在4℃過夜，并用2％BSA在室溫封閉1hr。對(duì)板進(jìn)行洗滌后，將cMet-Fc cDNA轉(zhuǎn)染的50μl 293培養(yǎng)物上清加入到每孔中，在室溫1hr。對(duì)板進(jìn)行洗滌后，用不同濃度mAbs進(jìn)行預(yù)溫育的，含有rHGF-Flag的24.1細(xì)胞培養(yǎng)物上清以50μl/孔加入每孔中1hr。洗滌，然后用HRP-M2抗-Flag mAb(Invitrogen)以50μl/孔在板上進(jìn)行溫育。通過加入如上所述的底物檢測(cè)結(jié)合的HRP-抗-Flag M2。在洗滌緩沖液中洗滌三次。
在這個(gè)HGF-Flag/cMet-Fc結(jié)合抑制分析中，證明所有三種mAbs具有某種程度的抑制，而Ig對(duì)照抗體無抑制(圖7)。mAb L2G7在≥1μg/ml和mAb L1H4在50μg/ml時(shí)可完全消除rHGF-Flag與cMet-Fc的結(jié)合；mAb L2C7甚至在50μg/ml時(shí)僅提供85％的抑制。因此，mAbL2G7在抑制rHGF-Flag與cMet-Fc的互作上比其他抗體更有效(因此推測(cè)對(duì)于HGF與其受體cMet也一樣)，這與推斷的其對(duì)HGF具有更大親和力是一致的。
由于在cMet-Fc/HGF-Flag結(jié)合ELISA中使用的受體蛋白是可溶性受體蛋白，其構(gòu)型可能與天然的膜結(jié)合受體的構(gòu)型不同。而且，HGF除結(jié)合到cMet外，可結(jié)合到HSPG，并且已知HSPG-HGF互作能提高各種HGF的活性。因此，阻斷HGF與可溶性cMet互作的mAbs不一定具有中和細(xì)胞上HGF生物學(xué)活性的能力。因此，在選擇生物學(xué)系統(tǒng)中進(jìn)一步確定mAbs的阻斷活性是重要的。已知HGF是一個(gè)有效的擴(kuò)散因子。因此，也用Madin-Darby犬腎(MDCK細(xì)胞來自ATCC)擴(kuò)散分析測(cè)定了抗-HGF mAbs的中和活性，如所描述的一樣(Jeffers等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9514417，1998)。在添加了5％FCS的DMEM中生長(zhǎng)的MDCK細(xì)胞以103細(xì)胞/100μl/孔接種在板上，rHGF以預(yù)先確定的濃度存在，在添加了5％FCS的DMEM中含有或不含有mAbs。在5％CO2中，37℃下培養(yǎng)2天，然后將細(xì)胞在PBS中進(jìn)行洗滌，于室溫在2％甲醛中固定10min。在PBS中洗滌后，用50％乙醇(v/v)中的0.5％結(jié)晶紫在室溫對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色10min。通過顯微鏡檢查測(cè)定擴(kuò)散活性。
如上所述分泌HGF的H1-F11克隆的培養(yǎng)物上清，被用作擴(kuò)散分析中的HGF來源。用1∶80這么小的稀釋度的H1-F11培養(yǎng)物上清就能誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞的擴(kuò)散和生長(zhǎng)。然而，用1∶20稀釋度的H1-F11培養(yǎng)物上清(～3μg/ml)進(jìn)行擴(kuò)散分析。mAb L2G7甚至在HGF/mAb的摩爾比為1∶5時(shí)抑制HGF本身誘導(dǎo)的MDCK擴(kuò)散(圖8)，最后證明mAb L2G7的確是中和抗體。mAb L1H4在≥20μg/ml也可中和HGF誘導(dǎo)的MDCK擴(kuò)散，而mAb L2C7甚至在20μg/ml僅提供部分的中和活性(數(shù)據(jù)未顯示)。
上面分析中測(cè)定的三種抗-HGF抗體的各種特性概括于表1中。
表1.針對(duì)HGF的mAbs的表征

HGF是肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子家族的一個(gè)成員，包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。而且，HGF與血纖維蛋白溶酶原具有～40％的總序列同源性(Nakamura等，Nature.342440，1989)，且與巨噬細(xì)胞刺激蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)(MSF，Wang等，Scand.J.Immunol.56545，2002)。因此，必須測(cè)定抗-HGF抗體的結(jié)合特異性。用類似于上述HGF測(cè)定的直接結(jié)合ELISA來分析抗-HGFmAbs對(duì)這些HGF相關(guān)蛋白質(zhì)(可從R&D系統(tǒng)得到)的結(jié)合。mAb L2G7，mAb L2C7和mAb L1H4不會(huì)顯著結(jié)合到這些蛋白質(zhì)，證明它們對(duì)HGF的特異性。
3.抗-HGF mAbs抑制HGF的促腫瘤生物學(xué)活性的能力HGF具有許多生物學(xué)活性，使得它很可能在某些人腫瘤的生長(zhǎng)和侵入中起作用。HGF的其中一個(gè)這種活性是作為肝細(xì)胞和其他上皮細(xì)胞的有效分裂素(Rubin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88415，1991)。因此，為進(jìn)一步證明抗-HGF mAbs的中和活性，測(cè)定了mAbs對(duì)HGF-誘導(dǎo)的4MBr-5猴上皮細(xì)胞(ATCC)或大鼠肝細(xì)胞的增殖的作用。肝細(xì)胞根據(jù)Garrison和Haynes，J.Biol.Chem.2694264，1985所述的方法進(jìn)行分離。細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重懸于含有5％FCS的DMEM中，并用預(yù)先確定濃度的HGF連同各種濃度的mAbs進(jìn)行刺激。在5％CO2中，于37℃下溫育2天后，通過加入3H-胸苷4hr測(cè)定細(xì)胞的增殖水平。用自動(dòng)化的細(xì)胞收獲機(jī)收獲細(xì)胞，在閃爍計(jì)數(shù)器上測(cè)定摻入的3H-胸苷水平。在足夠的濃度下，mAb L2G7可以大量地或完全地抑制這些細(xì)胞的HGF-誘導(dǎo)的增殖，且mAbs L2C7和L1H4可至少部分地抑制增殖。這些抗體也可抑制其他上皮細(xì)胞系的HGF-誘導(dǎo)的增殖。
例如，測(cè)定了L2G7對(duì)貂肺Mv 1 Lu細(xì)胞的HGF-誘導(dǎo)的增殖的抑制活性(Borset等，J.Immunol.Methods 18959，1996)。生長(zhǎng)在含有10％FCS的DMEM中的細(xì)胞通過用EDTA/trysin處理進(jìn)行收獲。洗滌后，細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重懸于不含血清的DMEM中，其中含有預(yù)先確定濃度(50ng/ml)的HGF+/-各種濃度的mAb。在5％CO2中，于37℃下溫育1天后，通過加入1μCi3H-胸苷進(jìn)行另外24hr，測(cè)定細(xì)胞的增殖水平。用自動(dòng)細(xì)胞收獲機(jī)將細(xì)胞收獲到玻璃纖維過濾器上，在閃爍計(jì)數(shù)器上測(cè)定摻入的3H-胸苷水平。圖9顯示加入高于100倍摩爾濃度的L2G7 mAb完全抑制Mv 1 Lu細(xì)胞的增殖應(yīng)答。實(shí)際上，L2G7甚至在mAb比HGF為3倍摩爾比值時(shí)，顯示了完全抑制，而對(duì)照IgG甚至在100倍摩爾過量時(shí)不顯示抑制。
也報(bào)道HGF是有效的血管新生因子(Bussolino等，J.Cell Biol.119629，1992；Cherrington等，Adv.Cancer Res.791，2000)，而血管新生，即新血管的形成，被認(rèn)為對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)是必需的。因此，在三個(gè)分析中顯示了抗-HGF mAbs具有抑制HGF的血管新生功能的能力(i)人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖，(ii)HUVEC的導(dǎo)管形成，和(iii)在雞胚胎絨(毛)膜尿囊膜(CAM)上新血管的發(fā)育。由于已知HGF與VEGF能協(xié)同加強(qiáng)血管新生(Xin等，Am.J.Pathol.1581111，2001)，在VEGF存在和缺乏的情況下都要進(jìn)行這些分析。
根據(jù)經(jīng)改良后的描述的方法(Conn等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA871323，1990)進(jìn)行HUVEC增殖分析。來自Clonetics的HUVEC細(xì)胞在含有10％FCS的內(nèi)皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基(EMB-2)中生長(zhǎng)，其中添加了由Clonetics提供的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑。優(yōu)選來自4到7代的細(xì)胞用于本研究。細(xì)胞在含有抗生素、10mM HEPES和10％FCS的培養(yǎng)基-199(分析培養(yǎng)基)中重懸為105個(gè)細(xì)胞/ml。HUVEC細(xì)胞(50μl/孔)被加入含有適當(dāng)濃度HGF連同各種濃度抗-HGF mAbs的微量滴定孔中，于37℃1hr。細(xì)胞在5％CO2中，于37℃下溫育72hr后，通過摻入3H-胸苷4hr來測(cè)定細(xì)胞的增殖水平。在足夠的濃度，mAb L2G7將大量地或完全地抑制HUVEC的HGF-誘導(dǎo)的增殖，而且mAbs L2C7和L1H4可至少部分抑制增殖。
或者，細(xì)胞增殖的水平可通過公知的比色MTT分析來測(cè)定。HUVEC(104個(gè)細(xì)胞/100μl/孔)在不含血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24hr，然后用50ng/ml的HGF(預(yù)先確定為亞最佳量)100μl，連同各種濃度的mAb L2G7溫育72hr。MTT溶液(5mg/ml)被加入每孔中(20μl/100μl培養(yǎng)基)4hr。然后100μl培養(yǎng)基/孔被移去，并與100μl/孔酸化的異丙醇(異丙基中含有0.04N HCl)混合。板在ELISA讀數(shù)機(jī)上在560nm下讀數(shù)。最大應(yīng)答的％按如下公式計(jì)算[HGF+mAb處理細(xì)胞的OD值-未處理細(xì)胞的OD值]/[HGF處理細(xì)胞的OD值-未處理細(xì)胞的OD值]×100。圖10顯示甚至2倍摩爾過量的L2G7 mAb可大量地阻斷HUVEC對(duì)HGF的增殖應(yīng)答。
內(nèi)皮導(dǎo)管分析基本上根據(jù)所描述的(Matsumura等，J.Immunol.1583408，2001；Xin等，Am.J.Pathol.1581111，2001)來實(shí)行。來自4-7代的HUVEC(Clonetics)在添加10％FBS和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑的Clonetics EGM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。根據(jù)廠家的說明書，用Matrigel(BDBiosciences)在37℃對(duì)板進(jìn)行涂層30min，并在加入HGF和各種濃度抗-HGF mAbs的1×基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以濃度為3×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞進(jìn)行接種。在低放大倍數(shù)(10×)顯微鏡下評(píng)價(jià)導(dǎo)管形成。在足夠濃度，mAb L2G7將大量地或完全地抑制HGF-誘導(dǎo)的內(nèi)皮導(dǎo)管形成，mAbsL2C7和L1H4可至少部分地抑制它。
雞胚胎絨(毛)膜尿囊膜(CAM)分析基本上根據(jù)所描述的(Kim等，Nature 362841，1992)實(shí)行。將三日齡的雞胚胎從其殼中移去，并在皮氏培養(yǎng)皿中，在5％CO2中于37℃培育。7天后，含有HGF連同不同濃度抗-HGF mAbs的干燥的甲基纖維素圓片被分層堆積到CAM上。甲基纖維素圓片通過混合5μl PBS中的1.5％甲基纖維素與5μl用mAbs預(yù)溫育的HGF進(jìn)行配制。三天后檢查甲基纖維素圓片周圍血管的發(fā)育。在足夠的濃度，mAb L2G7將大量地或完全地抑制這樣的血管形成，且mAbs L2C7和L1H4可至少部分地抑制它。
也報(bào)道HGF能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)(Comoglio和Trusolino，J.Clin.Invest.109857，2002)。在兩個(gè)步驟中顯示了抗-HGF抗體抑制這種活性的能力。首先，檢查大量腫瘤細(xì)胞系分泌HGF的能力和應(yīng)答HGF的增殖能力，因?yàn)镠GF可能是其中一些細(xì)胞的自分泌生長(zhǎng)因子。這些細(xì)胞系包括一組已知表達(dá)HGF和cMet的人腫瘤細(xì)胞系(Koochekpour等，Cancer Res.575391，1997；Wang等，J.Cell Bio1.1531023，2001)。被測(cè)試的特定細(xì)胞系包括U-118神經(jīng)膠質(zhì)瘤，HCT116結(jié)腸癌，A549肺癌和A431表皮狀癌細(xì)胞，均可從ATCC獲得。這些腫瘤細(xì)胞系一經(jīng)確定，則使用類似于那些上述的方法，來測(cè)定抗-HGF mAbs對(duì)這些細(xì)胞對(duì)HGF的增殖應(yīng)答的作用。在足夠的濃度，mAb L2G7將大量地或完全地抑制許多或所有這些細(xì)胞系的HGF-誘導(dǎo)的增殖，且mAbs L2C7和L1H4可至少部分地抑制增殖。
例如，人類HCT116腫瘤細(xì)胞在200μl添加5％FCS的DMEM中以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種到96-孔微量滴定板中。在5％CO2中于37℃下溫育24hr后，用PBS洗滌細(xì)胞，并在不含血清的DMEM中培養(yǎng)48hr。然后細(xì)胞用含有100ng/ml HGF+/-20μg/ml mAbs的DMEM另外培養(yǎng)20hr。而在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞在單獨(dú)的DMEM中或添加5％FCS的DMEM中溫育。在溫育結(jié)束時(shí)，通過摻入3H-胸苷4hr測(cè)定細(xì)胞增殖水平。通過三個(gè)重復(fù)得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示于圖11。HGF誘導(dǎo)HCT116的中度增殖，其通過加入L2G7抗體被完全地消除(但不能通過加入效力較低的L1H4抗體而被消除)。
在上述所有分析中，每個(gè)抗-HGF抗體在沒有其他HGF拮抗劑而單獨(dú)使用，即作為單一藥劑時(shí)可中和或抑制活性，但可通過聯(lián)合施用其他抗-HGF抗體或其他活性劑而獲得加和的或協(xié)同的作用。
4.抗-HGF mAbs在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力抗-HGF抗體抑制人類腫瘤生長(zhǎng)的能力在免疫缺陷小鼠或其他嚙齒動(dòng)物例如大鼠的異種移植模型中被證明?？捎玫男∈竺庖呷毕葜甑睦C性但并非限制性的例子為裸小鼠例如CD-1裸小鼠、Nu/Nu，Balb/c裸鼠，NIH-III(NIH-bg-nu-xid BR)；scid小鼠例如Fox Chase SCID(C.B-17 SCID)，F(xiàn)ox Chase遠(yuǎn)交SCID和SCID Beige；RAG酶缺陷小鼠；以及裸大鼠(nude rat)。實(shí)驗(yàn)如前所述實(shí)行(Kim等，Nature 362841，1992，在此處引入作為參考)。于HBSS中收獲在完全DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞。免疫缺陷的雌性，例如無胸腺的裸鼠(4-6周齡)，通常被用0.2ml HBSS中的5×106個(gè)細(xì)胞在脊背區(qū)域進(jìn)行s.c.注射。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到50-100mm3時(shí)，小鼠被隨機(jī)分組，并i.p.施用在例如0.1ml體積中的適量抗-HGF和對(duì)照mAbs(通常在0.1和1.0mg之間，例如0.5mg)，每周一次、兩次或三次，共1、2、3、或4周或?qū)嶒?yàn)期間。通過測(cè)量二維[長(zhǎng)(a)和寬(b)]，通常每周測(cè)定兩次腫瘤大小。根據(jù)V＝ab2/2計(jì)算腫瘤體積，并被表達(dá)為平均腫瘤體積±SEM。每個(gè)處理組中小鼠的數(shù)量至少為3，但時(shí)常在5和10之間，例如7。用例如Student’s檢驗(yàn)實(shí)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)更改實(shí)驗(yàn)中，與腫瘤細(xì)胞同時(shí)或在注射腫瘤細(xì)胞之后立刻開始施用抗體。也可通過小鼠存活時(shí)間的延長(zhǎng)，或小鼠存活百分率的增加來估量抗體的作用。
在不同實(shí)驗(yàn)中，使用已知分泌或?qū)GF應(yīng)答的各種腫瘤細(xì)胞系，例如U118人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞，和/或HCT116人結(jié)腸腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)選抗體，例如似人類的和免疫原性降低的抗體和L2G7抗體及其嵌合的和人源化的形式和與L2G7具有相同表位的抗體當(dāng)作為單一藥劑使用時(shí)，將抑制至少25％，但可能40％或50％，和差不多75％或90％或更多腫瘤生長(zhǎng)，或在一段時(shí)間后甚至完全抑制腫瘤生長(zhǎng)或引起腫瘤衰退或消失。當(dāng)對(duì)不產(chǎn)生響應(yīng)抗注射抗體的中和抗體的一種或多種免疫缺陷小鼠株進(jìn)行測(cè)試時(shí)，其對(duì)于在至少一個(gè)小鼠株例如NIHIII Beige/Nude中的至少一個(gè)腫瘤細(xì)胞系例如U118發(fā)生抑制，但優(yōu)選對(duì)于一種特定的(例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤)或任何類型的2個(gè)、3個(gè)、幾個(gè)、許多、或甚至基本上所有表達(dá)HGF的腫瘤細(xì)胞系發(fā)生抑制。在一個(gè)或多個(gè)異種移植模型中，用一些優(yōu)選的抗體治療導(dǎo)致50％，75％，90％或甚至基本上所有鼠的不限期存活，否則它們將由于腫瘤的生長(zhǎng)而死亡或需要被處死。
例如，用在含有FCS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)并在HBSS中收獲的U-118成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行了這樣的試驗(yàn)。用在0.2ml HBSS中的106個(gè)細(xì)胞在脊背區(qū)域?qū)Υ菩訬IH III Beige/Nude小鼠(4-6周齡)進(jìn)行s.c.注射。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到～50mm3時(shí)，小鼠被隨機(jī)分為2組，每組6只，i.p.供給在0.1ml體積中的200μg的L2G7 mAb(處理組)或PBS(對(duì)照組)，每周2次。腫瘤大小如上所述每周測(cè)定兩次。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，腫瘤被切除并稱重。圖12顯示用L2G7處理能完全抑制腫瘤生長(zhǎng)。
用抗-HGF抗體聯(lián)合預(yù)期腫瘤類型能對(duì)其作出響應(yīng)的一種或多種化療劑例如5-FU(5-氟尿嘧啶)或CPT-11(Camptosar)的施用實(shí)行了類似的腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)，如Ashkenize等，J.Clin.Invest.104155，1999所述?？贵w與化療藥物的聯(lián)合比單獨(dú)任一藥劑可對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制作用。其作用可能是加和或協(xié)同的，且強(qiáng)烈抑制生長(zhǎng)，例如達(dá)到80％或90％或更多，或甚至引起腫瘤衰退或消失?？?HGF抗體也可與針對(duì)另一種生長(zhǎng)或血管新生因子的抗體例如抗-VEGF結(jié)合施用，預(yù)期具有加和或協(xié)同的生長(zhǎng)抑制作用和/或使腫瘤衰退或消失。
雖然參考當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，應(yīng)理解為在不背離本發(fā)明的情況下可作各種改動(dòng)。除非與上下文明顯不同，本發(fā)明的任何步驟、要素、實(shí)施方案、特征或方面可和任何其他的一起使用。
所有引用的所有公開物、專利和專利申請(qǐng)?jiān)诖巳囊胱鳛橥ㄓ媚康牡膮⒖?，與每一篇公開物、專利和專利申請(qǐng)被具體和單獨(dú)全文引入作為通用目的的參考的程度是相同的。
權(quán)利要求
1.結(jié)合并中和人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的單克隆抗體(mAb)。
2.權(quán)利要求1的mAb，其是嵌合的。
3.權(quán)利要求1的mAb，其是人源化的。
4.權(quán)利要求1的mAb，其是人的。
5.權(quán)利要求1的mAb，其抑制至少50％的HGF與cMet的結(jié)合。
6.權(quán)利要求1的mAb，其抑制Madin-Darby犬腎細(xì)胞的HGF-誘導(dǎo)的擴(kuò)散。
7.權(quán)利要求1的mAb，其抑制HUVEC細(xì)胞的HGF-誘導(dǎo)的增殖。
8.權(quán)利要求1的mAb，其抑制HGF-誘導(dǎo)的血管新生。
9.權(quán)利要求1的mAb，其中和HGF的所有生物學(xué)活性。
10.權(quán)利要求1的mAb，其抑制小鼠的人腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)。
11.權(quán)利要求10的mAb，其完全抑制小鼠的人腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)。
12.權(quán)利要求1的mAb，其是Fab或F(ab’)2片段或單鏈抗體。
13.權(quán)利要求1的mAb，其以至少108M-1的結(jié)合親和力特異性結(jié)合HGF。
14.一種嵌合或人源化的L2G7mAb。
15.與權(quán)利要求14的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到人HGF的抗體。
16.產(chǎn)生權(quán)利要求1的mAb的細(xì)胞系。
17.包括權(quán)利要求14的mAb的藥物組合物。
18.治療病人癌癥的方法，包括給病人施用包含中和抗-HGF mAb的藥物組合物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述癌癥為成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述mAb為嵌合的或人源化的L2G7mAb。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的中和單克隆抗體，一種包括該單克隆抗體的藥物組合物，以及包括將這種藥物組合物對(duì)病人進(jìn)行施用，例如用于抑制成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的治療方法。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1964738SQ200480042750
公開日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2004年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月15日
發(fā)明者金京珍, 蘇怡綺 申請(qǐng)人:加拉克西生物技術(shù)有限責(zé)任公司