專利名稱：針對angptl3的單克隆抗體的制作方法
技術領域：
提供了特異性結合血管生成素(angiopoietin)樣蛋白3 (ANGPTL3)的單克隆抗 體。提供了使用特異性結合血管生成素樣蛋白3(ANGPTL3)的單克隆抗體的方法。還提供 了包含特異性結合血管生成素樣蛋白3(ANGPTL3)的單克隆抗體的藥物組合物。
II.介紹血管生成素樣蛋白3(ANGPTL3)在幾種哺乳動物物種中是保守的。Li，C. (2006) JE 代脂學觀點(Curr. Qpin. Lipidol.) 17 (2) :152_156。ANGPTL3含有N-末端卷曲螺旋結構域 和C-末端血纖蛋白原樣結構域。Conklin，D.等(1999)基因組(Genomics)62 :477_482。 N-末端卷曲螺旋結構域介導ANGPTL3的寡聚化。Ge等(2005)脂質研究雜志(L Lipid Res.) 46 (7) 1484-1490.寡聚的ANGPTL3在體內經歷蛋白水解加工，導致血纖蛋白原樣結 構域的裂解。0no M.等(2003)牛物化學雜志(L Biol. Chem.) 278 (43) :41804_41809。ANGPTL3 主要表達在肝中。Koishi，R.等(2002)自然遺傳學(Nat. Genet. ) 30 (2) 151-157。ANGPTL3似乎抑制脂蛋白脂肪酶(LPL)活性并減少極低密度脂蛋白(VLDL)清 除。Shimizugawa T.等(2002)牛物化學雜志(T. Biol. Chem.) 277 (37) :33742_33748。 KK/San自發(fā)突變小鼠在Angptl3基因的外顯子6中含有插入，并顯示出明顯的血清低脂 血癥。Koishi等(2002)自然遺傳學(Nat. Genet.), 30 (2) :151_157。腺病毒-介導的 ANGPTL3表達或直接施用ANGPTL3逆轉KK/San小鼠中的低脂血癥。Koishi等(2002)1 然遺傳學(Nat. Genet.) 30 (2) :151_157。Angptl3敲除小鼠顯示出在喂飼的雄性小鼠和 在喂飼或禁食的雌性小鼠中具有降低的甘油三酯水平。Koster，A.等，(2005)內分泌學 (Endocrinol.) 146 :4943_4950。那些小鼠還顯示出在喂飼和禁食的雄性和雌性小鼠中具有 降低的膽固醇水平。Koster, A.等，(2005)內分泌學(Endocrinol.) 146 :4943_4950。在 鏈佐星糖尿病小鼠中，在db/db小鼠中，和在ob/ob小鼠中均顯示出Angptl3表達的增加。 Inukai，K.等，(2004)牛物化學牛物物理研究通信(Biochem. Biophys. Res. Comm.) 317 (4) 10751079 ；Shimamura, M.等(2004)牛物化學牛物物理研究通信(Biochem. Biophys. Res. Comm.)322(3) 1080-1085。
III.概述在一些實施方案中，提供了結合ANGPTL3并且中和ANGPTL3的至少一種活性的單 克隆抗體。在一些實施方案中，該單克隆抗體是小鼠單克隆抗體。在一些實施方案中，該單 克隆抗體是人源化的單克隆抗體。在一些實施方案中，該單克隆抗體是人單克隆抗體。在 一些實施方案中，該單克隆抗體降低體內至少一種血清脂質的水平。在一些實施方案中，該單克隆抗體結合具有SEQ ID NO :59的氨基酸序列的
7ANGPTL3的表位。在一些實施方案中，該單克隆抗體結合具有SEQ ID NO :60的氨基酸序列 的ANGPTL3的表位。在一些實施方案中，該單克隆抗體結合具有SEQ ID NO :9的氨基酸序 列的ANGPTL3的表位。在一些實施方案中，該單克隆抗體結合具有SEQ ID N0:10的氨基酸 序列的ANGPTL3的表位。在一些實施方案中，該單克隆抗體包括包含SEQ ID NO :20的氨基酸序列的重鏈可 變區(qū)和包含SEQ ID NO :28的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，該單克隆抗體 包括包含SEQ ID NO :22的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO :30的氨基酸序列的 輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，該單克隆抗體包括包含SEQ ID NO :24的氨基酸序列的重 鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO :32的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，該單克隆 抗體包括包含SEQ ID NO :64的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID N0:68的氨基酸序 列的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，該單克隆抗體包括包含SEQ ID N0:66的氨基酸序列 的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO 70的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，該單克隆抗體與抗體4. 7. 1特異性結合相同的表位。在一些 實施方案中，該單克隆抗體與抗體4. 8. 3特異性結合相同的表位。在一些實施方案中，該單 克隆抗體與抗體4. 9.1特異性結合相同的表位。在一些實施方案中，該單克隆抗體與抗體 1.315. 1特異性結合相同的表位。在一些實施方案中，該單克隆抗體與抗體5. 35特異性結 合相同的表位。在一些實施方案中，該單克隆抗體與抗體5. 50特異性結合相同的表位。在一些實施方案中，單克隆抗體是抗體片段。在一些實施方案中，單克隆抗體是 scFv片段。在一些實施方案中，單克隆抗體是Fab片段。在一些實施方案中，單克隆抗體是 F(ab' )2片段。在一些實施方案中，單克隆抗體是Fab’片段。在一些實施方案中，提供特異性結合ANGPTL3的分離的抗體，其包括重鏈和輕鏈， 其中所述重鏈包括a)如SEQ ID NOs 19-26和63-66中任一個所示氨基酸序列；b)如SEQ ID NOs :35，36，和37所示的至少一個氨基酸序列；c)如SEQ ID NOs :38，39，和40所示的至 少一個氨基酸序列；d)如SEQ ID NOs :41，42，或43所示的至少一個氨基酸序列；e)如SEQ ID NOs :53，54，和55所示的至少一個氨基酸序列；f)如SEQ IDNOs :71，72，和73所示的至 少一個氨基酸序列；或g)如SEQ ID NOs :74，75，和76所示的至少一個氨基酸序列；其中所 述抗體中和ANGPTL3的至少一種活性。在一些實施方案中，抗體的重鏈包括如SEQ ID NO: 35所示的CDR1，如SEQ ID NO :36所示的CDR2，和如SEQ ID NO :37所示的CDR3。在一些實 施方案中，抗體的重鏈包括如SEQ ID NO :38所示的⑶R1，如SEQ ID NO :39所示的⑶R2，和 如SEQ ID NO 40所示的⑶R3。在一些實施方案中，抗體的重鏈包括如SEQ ID NO 41所示 的CDR1，如SEQ ID NO :42所示的CDR2，和如SEQ ID NO :43所示的CDR3。在一些實施方案 中，抗體的重鏈包括如SEQ ID NO 53所示的CDR1，如SEQ IDN0 54所示的CDR2，和如SEQ ID NO :55所示的⑶R3。在一些實施方案中，抗體的重鏈包括如SEQ ID N0:71所示的⑶Rl， 如SEQ ID NO 72所示的⑶R2，和如SEQ ID NO 73所示的⑶R3。在一些實施方案中，抗體 的重鏈包括如SEQ ID N0:74所示的CDR1，如SEQ ID NO :75所示的CDR2，和如SEQ ID NO: 76所示的CDR3。在一些實施方案中，提供特異性結合ANGPTL3的分離的抗體，其包括重鏈和輕鏈， 其中所述重鏈包括a)如SEQ ID NOs 19-26和63-66中任一個所示氨基酸序列；b)至少 一個如SEQ ID NOs 35，36，和37所示的氨基酸序列；c)至少一個如SEQ ID NOs :38，39，和
840所示的氨基酸序列；d)至少一個如SEQ ID NOs :41，42，或43所示的氨基酸序列；e)至 少一個如SEQ ID NOs :53，54，和55所示的氨基酸序列；f)至少一個如SEQ ID NOs =71,72, 和73所示的氨基酸序列；或g)至少一個如SEQID NOs :74，75，和76所示的氨基酸序列；其 中所述抗體中和ANGPTL3的至少一種活性；且其中所述輕鏈包括a)如SEQ ID NOs :27_34 和67-70中任一個所示氨基酸序列；b)至少一個如SEQ ID NOs :44，45，和46所示的氨基酸 序列；c)至少一個如SEQ ID NOs :47，48，和49所示的氨基酸序列；d)至少一個如SEQ ID NOs :50，51，或52所示的氨基酸序列；e)至少一個如SEQ ID NOs :56，57，和58所示的氨基 酸序列；f)至少一個如SEQ ID NOs :77，78，和79所示的氨基酸序列；或g)至少一個如SEQ IDNOs :80，81，和82所示的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體的重鏈包括如SEQ ID NO: 35所示的CDR1，如SEQ ID NO 36所示的CDR2，和如SEQ ID NO 37所示的CDR3 ；且抗體的 輕鏈包括如SEQ ID NO 44所示的CDR1，如SEQ ID NO 45所示的CDR2，和如SEQ ID NO 46 所示的⑶R3。在一些實施方案中，抗體的重鏈包括如SEQ ID NO :38所示的⑶R1，如SEQ ID NO 39所示的CDR2，和如SEQ ID NO 40所示的CDR3 ；且抗體的輕鏈包括如SEQ ID NO 47 所示的⑶R1，如SEQ ID N0:48所示的⑶R2，和如SEQ ID NO :49所示的⑶R3。在一些實施 方案中，抗體的重鏈包括如SEQ ID NO :41所示的⑶R1，如SEQ ID NO :42所示的⑶R2，和 如SEQ ID NO :43所示的⑶R3 ；且抗體的輕鏈包括如SEQ IDN0 :50所示的⑶R1，如SEQ ID NO :51所示的⑶R2，和如SEQ ID NO :52所示的⑶R3。在一些實施方案中，抗體的重鏈包 括如 SEQ ID NO :53 所示的 CDR1，如 SEQ ID NO :54 所示的 CDR2，和如 SEQ ID NO :55 所示 的CDR3 ；且抗體的輕鏈包括如SEQ ID NO 56所示的CDR1，如SEQ IDN0 57所示的CDR2，和 如SEQ ID N0:58所示的⑶R3。在一些實施方案中，抗體的重鏈包括如SEQ ID NO :71所示 的CDR1，如SEQ ID NO :72所示的CDR2，和如SEQ ID NO :73所示的⑶R3 ；且抗體的輕鏈包 括如SEQ ID NO 77所示的CDR1，如SEQ ID NO 78所示的CDR2，和如SEQID NO 79所示的 ⑶R3。在一些實施方案中，抗體的重鏈包括如SEQ IDN0:74所示的CDR1，如SEQ ID NO 75 所示的⑶R2，和如SEQ ID NO 76所示的⑶R3 ；且抗體的輕鏈包括如SEQ ID NO 80所示的 CDR1，如 SEQ ID NO 81 所示的 CDR2，和如 SEQ ID NO 82 所示的 CDR3。
在一些實施方案中，提供特異性結合ANGPTL3的分離的抗體，其包括重鏈和輕鏈， 其中所述輕鏈包括a)如SEQ ID NOs :27_34和67-70中任一個所示氨基酸序列；b)至少 一個如SEQ ID NOs :44，45，和46所示的氨基酸序列；c)至少一個如SEQ ID NOs :47，48，和 49所示的氨基酸序列；d)至少一個如SEQ ID NOs :50，51，或52所示的氨基酸序列；e)至 少一個如SEQ ID NOs :56，57，和58所示的氨基酸序列；f)至少一個如SEQ ID NOs =77,78, 和79所示的氨基酸序列；或g)至少一個如SEQID NOs :80，81，和82所示的氨基酸序列；其 中所述抗體中和ANGPTL3的至少一種活性。在一些實施方案中，抗體的輕鏈包括如SEQ ID NO 44 所示的 CDR1，如 SEQ ID NO 45 所示的 CDR2,和如 SEQ ID NO 46 所示的 CDR3。在 一些實施方案中，抗體的輕鏈包括如SEQ ID NO 47所示的⑶R1，如SEQ ID NO 48所示的 ⑶R2，和如SEQ ID NO :49所示的⑶R3。在一些實施方案中，所述輕鏈包括如SEQ ID NO 50 所示的CDR1,如SEQ ID NO :51所示的CDR2，和如SEQ ID NO :52所示的CDR3。在一些實施 方案中，所述輕鏈包括如SEQ ID NO :56所示的CDR1，如SEQID NO :57所示的CDR2，和如SEQ ID N0:58所示的⑶R3。在一些實施方案中，所述輕鏈包括如SEQ ID N0:77所示的⑶Rl， 如SEQ ID NO 78所示的⑶R2，和如SEQ ID NO :79所示的⑶R3。在一些實施方案中，所述輕鏈包括如SEQ ID NO :80所示的CDR1，如SEQ ID NO :81所示的CDR2，和如SEQ ID NO 82 所示的⑶R3。在一些實施方案中，提供結合ANGPTL3并中和ANGPTL3的至少一種活性的單克隆 抗體，其中所述抗體對具有SEQ ID NO :9的氨基酸序列的肽的親和性至少是該抗體對具有 SEQ ID NO84,SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO :87，SEQ ID NO:88，SEQ ID NO 90，和SEQID NO 92中任一氨基酸序列的肽的親和性的至少3倍。在一些實施方案中，所述 抗體對具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列的肽的親和性至少是該抗體對SEQ ID NO :85，SEQ ID NO 86, SEQ ID N0:87，SEQ ID N0:88，和 SEQ ID NO :90 中每一種的親和性的至少 3 倍。 在一些實施方案中，提供結合ANGPTL3并中和ANGPTL3的至少一種活性的單克隆抗體，其 中所述抗體以小于50nM的KD結合具有SEQ ID NO :9的氨基酸序列的肽。在一些實施方案 中，所述抗體以小于30nM的KD結合具有SEQ ID NO :9的氨基酸序列的肽。在一些實施方 案中，所述抗體以小于lOnM的KD結合具有SEQ ID NO :9的氨基酸序列的肽。在一些實施 方案中，所述抗體以小于5nM的Kd結合具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列的肽。在一些實施方案中，提供包括如上所述的抗體的藥物組合物。在一些實施方案中， 提供治療脂質代謝病癥的方法，其中所述方法包括對患者施用有效量的該藥物組合物。在 一些實施方案中，提供降低一種或多種血清脂質水平的方法，其中所述方法包括對患者施 用有效量的該藥物組合物。在一些實施方案中，提供了治療高甘油三酯血癥的方法，其中該 方法包括對患者施用有效量的該藥物組合物。在一些實施方案中，提供了治療高膽固醇血 癥的方法，其中該方法包括對患者施用有效量的該藥物組合物。在一些實施方案中，提供了 治療肥胖癥的方法，其中該方法包括對患者施用有效量的該藥物組合物。在一些實施方案 中，提供了治療糖尿病的方法，其中該方法包括對患者施用有效量的該藥物組合物。在一些 實施方案中，提供了治療缺血性心臟病的方法，其中該方法包括對患者施用有效量的該藥 物組合物。在一些實施方案中，提供了治療代謝綜合征的方法，其中該方法包括對患者施用 有效量的該藥物組合物。
IV.附圖簡述

圖1顯示注射抗體1.315. 1,4. 7. 1,4. 8.3,4. 9. 1，和對照抗體抗-KLH后4天時，小 鼠中的喂飼和禁食血清甘油三酯水平，如實施例J中所述。圖2顯示注射抗體1.315. 1,4. 7. 1,4. 8.3,4. 9. 1，和對照抗體抗-KLH后4天時，小 鼠中的喂飼和禁食血清膽固醇水平，如實施例J中所述。圖3顯示注射抗-ANGPTL3抗體4. 8. 3、抗-ANGPTL4抗體14D12、和對照抗體抗-KLH 后4天時，小鼠中的喂飼和禁食血清甘油三酯水平，如實施例J中所述。圖4顯示注射抗-ANGPTL3抗體4. 8. 3、抗-ANGPTL4抗體14D12、和對照抗體抗-KLH 后4天時，小鼠中的喂飼和禁食血清膽固醇水平，如實施例J中所述。圖 5 顯示注射抗-ANGPTL3 抗體 4. 7. 1,4. 8. 3,4. 9. 1，抗-ANGPTL4 抗體 14D12，和 對照抗體抗-KLH后4天時，小鼠中的喂飼和禁食血清甘油三酯水平，如實施例J中所述。圖 6 顯示注射抗-ANGPTL3 抗體 4. 7. 1,4. 8. 3,4. 9. 1，抗-ANGPTL4 抗體 14D12，和 對照抗體抗-KLH后4天時，小鼠中的喂飼和禁食血清膽固醇水平，如實施例J中所述。圖 7 顯示注射抗體 1. 125. 1，1. 132. 1，1. 173. 2，1. 315. 1，1. 424. 1，1. 431. 1，和對
10照抗體抗-KLH后4天(上版)和8天(下版)時，小鼠中的血清甘油三酯水平，如實施例 J中所述。圖8顯示注射不同劑量的Ad5-hAngptl3T病毒或2X 109vp對照病毒后，小鼠中的 血清甘油三酯水平，如實施例B中所述。圖9 顯示抗體 4. 1. 1，4. 4. 1,4. 6. 3,4. 7. 1,4. 8. 1,4. 8. 2,4. 8. 3，和 4. 9. 1 對 ANGPTL3 SP1，ANGPTL3T，和對照蛋白BTS324的結合，如實施例H中所述。圖 10 顯示抗體 4. 7. 1 (SEQ ID NO 19)，4. 8. 3 (SEQ ID NO :21)，和 4. 9. 1 (SEQ ID NO 23)的重鏈可變區(qū)的對比。還顯示了重鏈共有序列(SEQ ID NO :25)，以及與信號肽 (SP)、構架區(qū)1 (FWR1)、互補性決定區(qū)1 (CDR1)、構架區(qū)2(FWR2)、互補性決定區(qū)2 (⑶R2)、構 架區(qū)3(FWR3)、互補性決定區(qū)3(CDR3)、和構架區(qū)4(FWR4)對應的重鏈序列區(qū)域。圖 11 顯示抗體 4. 7. 1(SEQ ID NO 27)，4. 8. 3 (SEQ ID NO 29)，和 4. 9. 1 (SEQ ID N0:31)的輕鏈可變區(qū)的對比。還顯示了輕鏈共有序列(SEQ ID N0:33)，以及與信號肽 (SP)、構架區(qū)1 (FWR1)、互補性決定區(qū)1 (CDR1)、構架區(qū)2(FWR2)、互補性決定區(qū)2 (⑶R2)、構 架區(qū)3(FWR3)、互補性決定區(qū)3(CDR3)、和構架區(qū)4(FWR4)對應的輕鏈序列區(qū)域。圖12 顯示用小鼠單克隆抗-ANGPTL3 抗體 4. 9. 1,4. 8. 3,1. 315. 1,4. 7. 1，和 1. 173. 2處理后的體外LPL活性，如實施例L中所述。圖13顯示一些小鼠單克隆抗-ANGPTL3抗體的體內藥物代謝動力學，如實施例N 中所述。圖14顯示抗體4. 7. 1,4. 8.3,4. 9. 1，5. 35，和5. 50對SP1肽的丙氨酸分區(qū)突變體 的結合，如實施例H中所述。圖15顯示注射抗體5. 35或5. 50后4天(上版)和7天(下版)時，小鼠中的血 清甘油三酯水平，如實施例J中所述。圖16顯示注射抗體5. 35或5. 50后4天(上版)和7天(下版)時，小鼠中的血 清膽固醇水平，如實施例J中所述。圖17顯示抗體5. 35和5. 50的體內藥物代謝動力學，如實施例N中所述。圖18顯示抗體4. 7. 1,4. 9. 1，5. 35和5. 50的體內藥物代謝動力學，如實施例N中 所述。圖19顯示注射了抗體5. 35和5. 50和對照抗體抗-KLH的ApoE小鼠中血清甘油 三酯和血清膽固醇的減少。
V.不同實施方案詳述在本申請中，除非另外指出，單數(shù)的使用包括復數(shù)。在本申請中，詞語“一個”或 “一種”指“至少一個”，除非特別相反指出。在本申請中，除非指出相反意思，“或”的使用指 “和/或”。此外，術語“包含(including)”以及其它形式諸如“包括(includes) ”和“含有 (included)”的使用不是限定性的。而且，術語如“成分”或者“組分”涵蓋包括一個單位的 成分或組分和包含一個以上單位的成分或組分，除非另外特別指出。本文使用的章節(jié)標題僅用于組織目的，并且不理解為限定所描述的主題。本申請 中引用的所有文件，或者文件的部分，包括但不限于，專利、專利申請、文章、書籍和論文都 特別為了任何目的完整引入本文作為參考。對于引入的文獻和相似材料的一種或多種對術
11語的定義與本申請中對該術語的定義相矛盾的情況，以本申請為準。 A. 一些定義術語“多肽”、“肽”、和“蛋白質”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該 術語應用于含有天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物以及其中一個或多個氨基酸殘基是對 應的天然存在的氨基酸的人工化學類似物的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物可以是任一長度。本文使用的術語“抗體”指完整抗體或者與該完整抗體競爭抗原結合的抗體片 段?？贵w片段包括，但不限于Fab、Fab，、F(ab' )2、Fv、scFv、Fd、雙抗體和保留完整抗體的 可變區(qū)的至少一部分的其他抗體片段。見例如，Hudson等(2003)自然醫(yī)學(Nat. Med.) 9 129-134。在一些實施方案中，通過完整抗體的酶促或者化學裂解產生抗體片段。在一些實 施方案中，通過重組DNA技術產生抗體片段。術語“天然多肽”指天然存在的多肽。術語“天然抗體”指天然存在的抗體。術語“單克隆抗體”指來自特異性結合同一表位的基本上同質的抗體群體的抗體。 在一些實施方案中，單克隆抗體由雜交瘤分泌。在一些此類實施方案中，根據(jù)本領域技術人 員已知的一些方法產生雜交瘤。見例如，Kohler和Milstein(1975)自然(Nature), 256 495-499)。在一些實施方案中，使用重組DNA方法(見例如，美國專利號4，816，567)產生 單克隆抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體指從噬菌體展示文庫分離的抗體片段(見 例如，Clackson 等(1991)自然(Nature) 352 :624_628，和 Marks 等(1991)分子生物學雜 志(J.Mol. Biol.) 222 :581-597)。關于多種其他單克隆抗體產生技術，見例如，Harlow和 Lane (1988)抗體實驗室手冊(Antibody :A Laboratory Manual)(冷泉港實驗室(Cold Spring HarborLaboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，NY)?！扒逗峡贵w”指由來自至少兩種不同來源的組分組成的抗體。在一些實施方案中， 嵌合抗體包含來自第一種物種的抗體的部分，其與另一分子，例如，來自第二種物種的抗體 的部分融合。在一些此類實施方案中，嵌合抗體包含來自非人動物的抗體的部分，其與來自 人的抗體的部分融合。在一些此類實施方案中，嵌合抗體包含來自來自非人動物的抗體的 可變區(qū)的全部或者部分，其與來自人的抗體的恒定區(qū)融合?！叭嗽椿笨贵w指被修飾使得它更密切匹配(在氨基酸序列中)人抗體的非人抗 體。從而，人源化抗體是一類嵌合抗體。在一些實施方案中，修飾非人抗體的可變區(qū)的抗原 結合殘基外的氨基酸殘基。在一些實施方案中，通過將人抗體的互補性決定區(qū)(CDR)的全 部或者部分用具有合乎需要的抗原結合特異性的另一抗體如非人抗體的CDR的全部或部 分替換，而構建人源化抗體。在一些實施方案中，人源化抗體包含可變區(qū)，其中所有或基本 上所有CDRs對應于非人抗體的CDRs，并且所有或基本上所有構架區(qū)(FRs)對應于人抗體的 FRs。在一些此類實施方案中，人源化抗體還包含人抗體的恒定區(qū)(Fc)。術語“人抗體”指單克隆抗體，其含有人抗體序列并且不含有來自非人動物的抗體 序列。在一些實施方案中，人抗體可以含有天然抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的合成序列。該術語不受 到制備抗體的方式的限制。例如，在多種實施方案中，人抗體可以在轉基因小鼠中，通過噬 菌體展示、通過人B淋巴細胞或通過重組方法制備。術語“中和抗體”或者“中和...的抗體”指這樣的抗體，其減小包含該抗體特異性結合的表位的多肽的至少一種活性。在一些實施方案中，中和抗體在體外和/或體內減 小活性。術語“抗原結合部位”指能夠特異性結合抗原的抗體的一部分。在一些實施方案 中，通過一個或多個抗體可變區(qū)提供抗原結合位點。術語“表位”指能夠特異性結合免疫球蛋白或者T細胞受體的任何多肽決定子。在 一些實施方案中，表位是抗原的被抗體特異性結合的區(qū)域。在一些實施方案中，表位可以包 括分子的化學活性表面基團如氨基酸、糖側鏈、磷酰基或磺?；?。在一些實施方案中，表位 可以具有特定三維結構特征(例如，“構象”表位)和/或特定電荷特征。如果特定抗體特異性結合兩個表位，將一個表位定義為與另一個表位“相同”。在 一些實施方案中，具有不同一級氨基酸序列的多肽可以包含相同的表位。在一些實施方案 中，相同的表位可以具有不同的一級氨基酸序列。如果不同的抗體競爭特異性結合同一表 位，那么說它們結合該相同表位。當抗體優(yōu)先識別蛋白質和/或大分子的復雜混合物中抗原時，該抗體“特異性結 合”該抗原。在一些實施方案中，抗體包含特異性結合特定表位的抗原結合位點。在一些 此類實施方案中，抗體能夠結合不同的抗原，只要不同的抗原包含該特定表位。在一些情況 下，例如，來自不同物種的同源蛋白質可以包含相同表位。在一些實施方案中，當解離常數(shù) (Kd) ( lyM，在一些實施方案中，當解離常數(shù)(Kd) ( lOOnM，在一些實施方案中，當解離常 數(shù)(Kd) ^ lOnM時，說抗體特異性結合抗原。術語“ANGPTL3”指具有來自任一脊椎動物或哺乳動物來源的氨基酸序列的血管生 成素樣蛋白3，除非另外指出，所述脊椎動物或哺乳動物來源包括，但不限于，人、牛、雞、嚙 齒動物、小鼠、大鼠、豬、羊、靈長類動物、猴、和豚鼠。該術語還指天然ANGPTL3的片段和變 體，其保持天然ANGPTL3的至少一種體內或體外活性。該術語包括ANGPTL3的全長未加工 的前體形式以及翻譯后切割信號肽得到的成熟形式以及血纖蛋白原結構域的蛋白水解加 工得到的形式。在一些實施方案中，全長的、未加工的小鼠ANGPTL3具有SEQ ID NO 1中 給出的氨基酸序列(Genbank登記號NP_038941)。在一些實施方案中，全長的、未加工的人 ANGPTL4具有SEQ ID NO 3中給出的氨基酸序列(Genbank登記號NP_055310)。術語“Angptl3”指編碼ANGPTL3的核酸。術語“LPL”指具有來自任一脊椎動物或哺乳動物來源的氨基酸序列的脂蛋白脂肪 酶，所述脊椎動物或哺乳動物來源包括，但不限于，人、牛、雞、嚙齒動物、小鼠、大鼠、豬、羊、 靈長類動物、猴、和豚鼠。在一些實施方案中，脂蛋白脂肪酶催化乳糜微粒和極低密度脂蛋 白(VLDL)中的三酰基甘油水解成二?；视秃陀坞x脂肪酸陰離子。在一些實施方案中，脂 蛋白脂肪酶還能夠水解二?；视?。術語“試劑”指化學化合物、化學化合物的混合物、生物大分子、或者由生物材料制 備的提取物。術語“ANGPTL3的拮抗劑”指降低ANGPTL3活性的試劑。術語“ANGPTL3的激動劑”指增加ANGPTL3活性的試劑。術語“患者”包括人和動物受試者。在一些實施方案中，患者是哺乳動物。在一些 此類實施方案中，患者是人。參考多肽的“片段”指來自參考多肽的任一部分的一段連續(xù)氨基酸序列。片段可
13以是小于參考多肽的長度的任一長度。參考多肽的“變體”指相對于參考多肽具有一個或多個氨基酸替代、缺失或插入的 多肽?！氨Ｊ亍卑被崽娲笇⒍嚯闹邪被嵊镁哂邢嗨菩再|，如大小或電荷的另一氨基 酸替代。在一些實施方案中，包含保守氨基酸替代的多肽保持未替代的多肽的至少一種活 性。保守氨基酸替代可以包含非天然存在的氨基酸殘基，它們典型地通過化學肽合成而不 是通過生物系統(tǒng)中的合成摻入。這些非天然存在的氨基酸殘基包括，但不限于肽模擬物和 氨基酸部分的其他逆轉或者顛倒的形式。天然存在的殘基可以基于共同的側鏈性質分類1)疏水的正亮氨酸，Met, Ala, Val，Leu，Ile ；2)中性親水的Cys，Ser，Thr，Asn，Gin ；3)酸性的:Asp，Glu ；4)堿性的His， Lys, Arg ；5)影響鏈取向的殘基Gly，Pro ；和6)芳香族Trp，Tyr，Phe。例如，非保守替代可以涉及這些類別之一的成員交換另一類別的成員。此類替代 的殘基可以引入人抗體的與非人抗體同源的區(qū)域中，或者引入所述分子的非同源區(qū)中。根據(jù)一些實施方案，在進行替代中，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。每個氨基酸基 于它的疏水和電荷特征分配一個親水指數(shù)。它們?yōu)楫惲涟彼?+4.5)；纈氨酸(+4.2)； 亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸 (+1. 8)；甘氨酸(-0. 4)；蘇氨酸(-0. 7)；絲氨酸(-0. 8)；色氨酸(-0. 9)；酪氨酸(-1. 3)；脯 氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰 胺("3. 5)；賴氨酸(-3. 9)；和精氨酸(-4. 5)。本領域中理解，在一些情況下，親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白質的相互作用生物功 能中的重要性。Kyte等，分子生物學雜志(J. Mol. Biol.)，157 105-131 (1982)。理解在一 些情況下，某些氨基酸可以替代具有相似親水指數(shù)或者得分的其他氨基酸并且仍然保留相 似的生物活性。在基于親水指數(shù)進行改變時，在一些實施方案中，包括親水指數(shù)在士2內的 氨基酸替代。在一些實施方案中，包括親水指數(shù)在士 1內的氨基酸替代，在一些實施方案 中，包括親水指數(shù)在士 0. 5內的氨基酸替代。本領域中還理解可以基于親水性有效進行相似氨基酸的替代，尤其當由此產生的 生物學功能蛋白質或者肽預期用于免疫學實施方案時，如本發(fā)明中的情況。在一些實施方 案中，蛋白質的最大的局部平均親水性受到它的相鄰氨基酸的親水性的控制，與它的免疫 原性和抗原性，即與蛋白質的生物學性質相關。已經為這些氨基酸殘基分配了下面的親水指數(shù)精氨酸(+3. 0)；賴氨酸(+3. 0)； 天冬氨酸(+3.0士1)；谷氨酸(+3.0士1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺 (+0. 2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0. 4)；脯氨酸(-0. 5 士 1)；丙氨酸(-0. 5)；組氨酸(-0. 5)；半 胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨 酸(-2. 3)；苯丙氨酸(-2. 5)和色氨酸(-3. 4)。在基于類似親水性值進行改變時，在一些實 施方案中，包括親水性值在士2內的氨基酸替代，在一些實施方案中，包括親水性值在士 1 內的氨基酸替代，在一些實施方案中，包括親水性值在士0. 5內的氨基酸替代。還可以基于 親水性從一級氨基酸序列鑒定表位。這些區(qū)域已被稱作“表位核心區(qū)”。示例性氨基酸替代在表1中給出。表1 氨基酸替代 技術人員使用公知的技術將能夠確定如本文給出的多肽的合適的變體。在一些實 施方案中，本領域技術人員通過靶向認為對于活性不重要的區(qū)域，可以鑒定分子的可以被 改變而不破壞活性的合適區(qū)域。在一些實施方案中，可以鑒定分子的在相似多肽中保守的 殘基和部分。在一些實施方案中，甚至對于生物活性或者結構重要的區(qū)域也可以進行保守 氨基酸替代而不破壞生物活性或不會不利地影響多肽結構。此外，在一些實施方案中，本領域技術人員可以考慮鑒定相似多肽中對于活性或 結構重要的殘基的結構-功能研究?？紤]到這種比較，在一些實施方案中，可以預測蛋白質 中對應于在相似蛋白質中對于活性或結構重要的氨基酸殘基的氨基酸殘基的重要性。在一 些實施方案中，本領域技術人員可以為此類預測的重要氨基酸殘基選擇化學上相似的氨基 酸替代。在一些實施方案中，本領域技術人員還可以關于相似多肽中的結構分析三維結構 和氨基酸序列。在一些實施方案中，考慮到這種信息，本領域技術人員可以預測抗體的氨基 酸殘基關于其三維結構的對比。在一些實施方案中，本領域技術人員可以選擇不對預測位 于蛋白質表面上的氨基酸殘基進行根本改變，因為此類殘基可能參與與其他分子的重要的 相互作用。此外，在一些實施方案中，本領域技術人員可以產生測試變體，其在每個合乎需 要的氨基酸殘基上含有一個氨基酸替代。在一些實施方案中，然后可以使用本領域技術人 員已知的活性測定法篩選變體。在一些實施方案中，此類變體可以用于收集關于合適的變 體的信息。例如，在一些實施方案中，如果發(fā)現(xiàn)對特定氨基酸殘基的改變導致破壞的、不希 望的降低的或者不合適的活性，那么可以避免具有此類改變的變體。換句話說，在一些實施 方案中，基于從此類常規(guī)實驗收集的信息，本領域技術人員可以容易確定這樣的氨基酸，其 中應該避免單獨的進一步替代或者還避免其他突變。許多科學出版物致力于預測二級結構。見，例如，Moult J.，現(xiàn)代生物技 術觀點(Curr. Op. in Biotech.)，(1996)7(4) :422_427 ;Chou 等，(1974)生物化學 (Biochemistry)，13(2) 222-245 ；Chou 等(1974)生物化學(Biochemistry)113(2) 211-222 ；Chou等(1978)酶學和分子生物學相關領域的進展(Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol.) 47 :45_148 ；Chou 等(1976)生物化學年度綜述(Ann. Rev. Biochem.) 47 251-276 ；和Chou等(1979)生物物理學雜志(Biophys. J.) 26 :367_384。此外，當前，可以用 計算機程序輔助預測二級結構。預測二級結構的一種方法是基于同源性建模。例如，具有大 于30%的序列同一性或者大于40%的相似性的兩個多肽或蛋白質通常具有相似的結構拓 撲學。蛋白質結構數(shù)據(jù)庫(PDB)的增長已經提供了對二級結構，包括多肽結構內潛在的折 疊數(shù)的增強可預測性。見例如，Holm等(1999)核酸研究(Nucl. Acid. Res.) 27 (1) 244-2470 已經提出(Brenner等(1997)現(xiàn)代結構生物學觀點(Curr. Op. Struct. Biol.) 7 (3)369-376)在給定多肽或蛋白質中存在有限數(shù)目的折疊并且一旦確定了臨界數(shù)目的結構，那 么結構預測將變得明顯更準確。預測二級結構的其他方法包括"蛋白質結構預測線索法(threading)“(見例 如，Jones, D. (1997)現(xiàn)代結構牛物學觀點(Curr. 0d. Struct. Biol.) 7 (3) :377_387 ；Sippl 等(1996)結構(Structure)4(1) :15_19)，“模式分析(見例如，Bowie 等，(1991) Ji 學(Science) 253 164-170 ；Gribskov 等，(1990)酶學方法(Meth. Enzym.) 183 146-159 ； Gribskov 等(1987)美國國家科學院學報(Proc. Nat. Acad. Sci. USA) 84 (13) :4355_4358)， 和"進化連鎖〃(見例如，Holm 等(1999)核酸研究(Nucl. Acid. Res.) 27(1) 244-247 ；和 Brenner 等(1997)現(xiàn)代結構牛物學觀點(Curr. 0d. Struct. Biol.) 7 (3) :369_376 (1997))。在一些實施方案中，參考抗體的變體包括糖基化變體，其中已經相對于參考抗體 的氨基酸序列改變了糖基化位點的數(shù)目和/或類型。在一些實施方案中，多肽的變體包含 相對于天然多肽的或多或少數(shù)目的N-連接的糖基化位點。N-連接的糖基化位點的特征是 序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中表示為X的氨基酸殘基可以是除了脯氨酸外的任一氨基 酸殘基。為了產生該序列的氨基酸殘基替代為加入N-連接的糖鏈提供了潛在的新位點。備 選地，除去該序列的替代將除去存在的N-連接的糖鏈。在一些實施方案中，提供了 N-連接 的糖鏈的重排，其中除去了一個或多個N-連接的糖基化位點(通常天然存在的那些)并且 產生了一個或多個新的N-連接的位點。示例性抗體變體包括半胱氨酸變體，其中相對于參 考抗體的氨基酸序列，缺失了 一個或多個半胱氨酸殘基或者用另一氨基酸(例如，絲氨酸) 替代。在一些實施方案中，當抗體必須再折疊成生物活性構象時，如分離不溶性包含體后， 半胱氨酸變體可以是有用的。在一些實施方案中，半胱氨酸變體具有比天然多肽更少的半 胱氨酸殘基。在一些實施方案中，半胱氨酸變體具有偶數(shù)個半胱氨酸殘基以使不配對半胱 氨酸引起的相互作用最小化。根據(jù)一些實施方案，氨基酸替代為這樣的氨基酸替代(1)減小對蛋白水解的敏 感性，(2)減小對氧化的敏感性，(3)改變形成蛋白質復合體的結合親和性，(4)改變結合親 和性，和/或(4)對此類多肽賦予或者修飾其他理化或者功能性質。根據(jù)一些實施方案，可 以在天然存在的序列(在一些實施方案中，在多肽的形成分子間接觸的結構域外部分中) 中進行單個或多個氨基酸替代(在一些實施方案中，保守氨基酸替代)。在一些實施方案 中，保守氨基酸替代通?？梢圆粚嵸|改變參考序列的結構特征(例如，在一些實施方案中， 置換氨基酸將不傾向于斷裂在參考序列中存在的螺旋，或者破壞表征參考序列的其他類型 的二級結構)。某㈣本領域中公知的多肽二級和三級結構的實例在例如蛋白質、結構和分 子原貝[I (Proteins, Structures and Molecular Principles) (Creighton 編，W. H. Freeman 禾口 Company， M 救(1984))；胃白 M g 豐勾入 1、二 (Introduction to ProteinStructure) (C. Branden 和 J. Tooze 編，Garland Publishing，紐約，N. Y. (1991))；和 Thornton，J. M.等 (1991)自然(Nature) 354 105-106 中描述。關于核酸序列，“百分比同一性”或者“ ％同一性”指使用基本局部對比搜索工具 (Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST)引擎，在比對的至少兩個多核苷酸序列 之間相同核苷酸的百分比。見Tatusova等(1999)FEMS微生物學通訊(FEMS Microbiol Lett.) 174 :247_250。BLAST 引擎(2. 2. 10版)由國家生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information) (NCBI)，Bethesda，MD 向公眾提供。為了比對兩個多核苷酸序列，使用“Blast 2 Sequences”工具，其使用“blastn”程序，使用如下的設置為默認值 的參數(shù)矩陣(Matrix)不適用(not applicable)匹配得分(Reward for match) :1錯配罰 分(Penalty for mismatch) :_2打開缺口(Open gap) :5罰分延伸缺口(Extension gap) 2 罰分 Gap_x dropoff :50 期望值(Expect) :10. 0 字長(Word size) :11 濾器(Filter)打 開(on)關于多肽序列，“百分比同一性”或者“ ％同一性”指使用基礎局部對比搜索工具 (BLAST)引擎比對的至少兩個多肽序列之間相同氨基酸的百分比。見Tatusova等(1999) FEMS 微牛物學通訊(FEMSMicrobiol Lett.) 174 :247_250。BLAST 引擎(2. 2. 10 版)由 國家生物技術信息中心(NCBI)，Bethesda，MD向公眾提供。為了比對兩個多肽序列，使用 "Blast 2 Sequences”工具，其使用“blastp”程序，使用如下的設置為默認值的參數(shù)矩陣 BL0SUM62打開缺口 11罰分延伸缺口 1罰分Gap_x dropoff 50期望值10. 0字長3濾 器打開術語“有效劑量”或者“有效量”指導致患者中癥狀減輕或者導致需要的生物學結 果的試劑，例如中和抗體的量。在一些實施方案中，有效劑量或者有效量足以減小ANGPTL3 的至少一種活性。在一些實施方案中，如下V.G部分所述確定有效劑量或者有效量。除非另外指出，術語“治療”包括治療和預防/防止性措施。需要治療的那些包括 但不限于，已經患有特定疾病或者病癥的個體以及處于獲得特定疾病或者病癥的危險中的 個體(例如，需要預防/防止性措施的那些)。術語“治療”指為了治療和/或預防/防止 性目的，對患者施用試劑?！爸委焺敝缚梢泽w內施用以引起治療和/或預防/防止性效果的試劑。“治療抗體”指可以體內施用以引起治療和/或預防/防止性效果的抗體。術語“分離的核酸”和“分離的多核苷酸”可以互換使用。分離的多核苷酸的實 例包括，但不限于，基因組DNA、RNA、cDNA、合成DNA或RNA或其一些組合?！胺蛛x的多核苷 酸”(1)不與其中天然存在該“分離的多核苷酸”的多核苷酸的全部或部分結合，(2)連接于 它天然不相連的多核苷酸，或(3)天然地，不作為更大的序列的部分存在。
B.天然抗體和某些抗體片段的結構天然抗體通常具有四聚體結構。四聚體通常包含兩個相同對的多肽鏈，每對具有 一條輕鏈(在一些實施方案中，約25kDa)和一條重鏈(在一些實施方案中，約50-70kDa)。 在天然抗體中，重鏈包含可變區(qū)VH，和三個恒定區(qū)CH1、Ch2和Ch3。Vh結構域在重鏈的氨基 末端，CH3結構域在羧基末端。在天然抗體中，輕鏈包含可變區(qū)\，和恒定區(qū)Q。輕鏈的可 變區(qū)在輕鏈的氨基末端。在天然抗體中，每條輕/重鏈對的可變區(qū)通常形成抗原結合位點。 恒定區(qū)通常負責效應子功能。通常將天然人輕鏈分類成K和入輕鏈。天然人重鏈通常分類成y、S、Y、a 或￡，并將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有亞類，包括但不限 于，IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亞類，包括但不限于，IgMl和IgM2。IgA具有亞類， 包括但不限于，IgAl和IgA2。在天然人輕鏈和重鏈中，可變區(qū)和恒定區(qū)通常通過約12或者 更多氨基酸的“J”區(qū)連接，重鏈還包括約10或更多氨基酸的“D”區(qū)。見例如，基礎免疫學 (Fundamental Immunology) (1989)第 7 章(Paul，ff.編，第 2 版.Raven 出版社，N. Y.)。
在天然抗體中，可變區(qū)通常顯示出相同的一般結構，其中相對保守的構架區(qū)(FR) 通過三個高變區(qū)連接，這些高變區(qū)也稱作互補性決定區(qū)(CDR)。來自每對的兩條鏈的CDR通 常與構架區(qū)對比，其可以使得結合特定表位。從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈可變區(qū)都通 常包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重鏈上的CDRs稱作HI、H2和H3, 而輕鏈上的⑶Rs通常稱作LI、L2和L3。通常，⑶R3是抗原結合部位中分子多樣性的最大 的來源。例如，在一些情況中，H3可以短至兩個氨基酸殘基或者大于26。通常根據(jù)Kabat 等(1991)免,疫學目的蛋白序歹 1丨(Seauences of Proteins of Immunological Interest) (國家健康學會(National Institutes of Health)，公開號 91-3242，卷 1-3，Bethesda， MD) ； Chothia, C.，和 Lesk，A.M. (1987)分子牛物學雜志(T. Mol. Biol.) 196 :901_917 ；或 Chothia, C.等自然(Nature)342 878~883(1989)的定義將氨基酸分配給每個結構域。在 本申請中，除非另外指出，術語“CDR”指來自輕鏈或重鏈的CDR?！癋ab”片段包含一條輕鏈以及一條重鏈的CH1和可變區(qū)。Fab分子的重鏈不能與 另一重鏈分子形成二硫鍵?！癋ab’”片段包含一條輕鏈和一條重鏈，該重鏈包含另外的恒定 區(qū)，其在CH1和Ch2結構域之間延伸?？梢栽贔ab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以 形成“F(ab，)2 “分子?！癋v”片段包含來自重鏈和輕鏈的可變區(qū)，但是缺少恒定區(qū)。單鏈Fv(SCFv)片段包 含重鏈和輕鏈可變區(qū)，它們通過柔性接頭連接形成具有抗原結合區(qū)的一條多肽鏈。示例性 單鏈抗體在W0 88/01649和美國專利號4，946，778和5，260, 203中詳細討論。在一些情況 中，單可變區(qū)(即，重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū))可以具有識別并結合抗原的能力。本文使用的術語“重鏈”指多肽，其包含足夠的重鏈可變區(qū)序列以單獨或者與輕鏈 組合賦予抗原特異性。本文使用的術語“輕鏈”指多肽，其包含足夠的輕鏈可變區(qū)序列以單獨或者與重鏈 組合賦予抗原特異性。
C.某些抗體在一些實施方案中，提供了特異性結合ANGPTL3的單克隆抗體。在一些此類實施 方案中，單克隆抗體是中和性單克隆抗體，其減小體內和/或體外ANGPTL3的至少一種活 性。在一些實施方案中，抗ANGPTL3的中和性單克隆抗體降低了體內至少一種血清脂 質水平。在一些實施方案中，抗ANGPTL3的中和性單克隆抗體降低了體內血清甘油三酯水 平。在一些實施方案中，中和性單克隆抗體減少了體內總膽固醇水平。在一些實施方案中， 抗ANGPTL3的中和性單克隆抗體降低了體內游離脂肪酸(FFA)水平。在一些實施方案中， 抗ANGPTL3的中和性單克隆抗體降低了體內那些水平中的至少兩種。在一些實施方案中， 抗ANGPTL3的中和性單克隆抗體降低了體內那些水平中的至少三種。在一些實施方案中，抗ANGPTL3的中和性單克隆抗體在體內降低了 LDLr敲除小 鼠中的血清甘油三酯。在一些實施方案中，抗ANGPTL3的中和性單克隆抗體在體內降低了 LDLr敲除小鼠中的總膽固醇。在一些實施方案中，抗ANGPTL3的中和性單克隆抗體在體內 降低了 ApoE敲除小鼠中的血清甘油三酯。在一些實施方案中，抗ANGPTL3的中和性單克隆 抗體在體內降低了 ApoE敲除小鼠中的總膽固醇。在一些實施方案中，抗ANGPTL3的中和性
19單克隆抗體在體內降低了 db/db小鼠中血清甘油三酯。在一些實施方案中，抗ANGPTL3的 中和性單克隆抗體在體內降低了 db/db小鼠中的總膽固醇。在一些實施方案中，提供了特異性結合小鼠ANGPTL3的中和性單克隆抗體。在一 些實施方案中，提供了特異性結合人ANGPTL3的中和性單克隆抗體。在一些實施方案中， 提供了特異性結合來自不同物種的ANGPTL3中相同表位的中和性單克隆抗體(即，顯示 出交叉反應性的抗體)。在一些此類實施方案中，所述抗體特異性結合小鼠ANGPTL3和人 ANGPTL3。在一些實施方案中，提供了特異性結合ANGPTL3的N_末端卷曲螺旋結構域內的表 位的中和性單克隆抗體。在一些實施方案中，提供了特異性結合小鼠ANGPTL3的N-末端卷 曲螺旋結構域內的表位的中和性單克隆抗體。在一些實施方案中，中和性單克隆抗體特異 性結合小鼠ANGPTL3從SEQ ID NO 1殘基17到殘基240的區(qū)域(SEQ ID NO 59)內表位。 在一些實施方案中，中和性單克隆抗體特異性結合小鼠ANGPTL3從SEQ ID NO :1殘基32到 殘基57的SP1區(qū)域(SEQ ID NO 9)。在一些實施方案中，中和性單克隆抗體特異性結合小 鼠ANGPTL3的包括SEQ IDN0 1的氨基酸34-37和40的SP1區(qū)域內的表位(SEQ ID NO 9 的氨基酸3-6和9)。在一些實施方案中，中和性單克隆抗體特異性結合小鼠ANGPTL3的包 括SEQ ID NO 1的氨基酸33-37和40的SP1區(qū)域內的表位(SEQ ID NO 9的氨基酸2-6和 9)。在一些實施方案中，中和性單克隆抗體特異性結合小鼠ANGPTL3的包括SEQ ID N0:1 的氨基酸34-37、40、和42的SP1區(qū)域內的表位(SEQ ID NO 9的氨基酸3_6、9、和11)。在 一些實施方案中，中和性單克隆抗體特異性結合小鼠ANGPTL3的包括SEQID NO :1的氨基酸 34-37和40-42的SP1區(qū)域內的表位(SEQ ID NO 9的氨基酸3-6和9-11)。 在一些實施方案中，提供了特異性結合人ANGPTL3的N_末端卷曲螺旋結構域內的 表位的中和性單克隆抗體。在一些實施方案中，中和性單克隆抗體特異性結合人ANGPTL3 的從SEQ ID NO 3的殘基20到殘基143的區(qū)域(SEQ ID NO 60)內表位。在一些實施方案 中，中和性單克隆抗體特異性結合人ANGPTL3從SEQ ID NO 3殘基32到殘基57的SP1區(qū) 域(SEQ ID N0:10)。在一些實施方案中，中和性單克隆抗體特異性結合小鼠ANGPTL3的包 括SEQ ID NO 3的氨基酸34-37和40的SP1區(qū)域內的表位(SEQ ID NO 10的氨基酸3_6 和9)。在一些實施方案中，中和性單克隆抗體特異性結合小鼠ANGPTL3的包括SEQ ID NO 3 的氨基酸33-37和40的SP1區(qū)域內的表位(SEQ ID NO 10的氨基酸2_6和9)。在一些實 施方案中，中和性單克隆抗體特異性結合小鼠ANGPTL3的包括SEQ IDN0 3的氨基酸34-37、 40、和42的SP1區(qū)域內的表位(SEQ ID NO :10的氨基酸3_6、9、和11)。在一些實施方案中， 中和性單克隆抗體特異性結合小鼠ANGPTL3的包括SEQ ID NO 3的氨基酸34-37和40-42 的SP1區(qū)域內的表位(SEQ ID NO 10的氨基酸3-6和9-11)。 在不同的實施方案中，中和性單克隆抗體結合具有SEQ IDN0 9的氨基酸序列的 肽的親和性是該中和性單克隆抗體結合具有SEQID N0 84, SEQ ID NO 85, SEQ ID NO :86， SEQ ID NO =87, SEQ ID NO :88，SEQ ID NO :90，禾口 SEQ ID NO 92 中任一氨基酸序列的肽的 親和性的至少2-倍、至少3-倍、至少4-倍、至少5-倍、至少7-倍、或至少10-倍。在不 同的實施方案中，中和性單克隆抗體結合具有SEQ ID NO :9的氨基酸序列的肽的親和性是 該中和性單克隆抗體分別結合 SEQ ID NO :84，SEQ ID NO :85，SEQ ID NO :86，SEQ ID NO 87, SEQ ID NO 88, SEQ IDN0:90，和SEQ ID NO :92的親和性的至少2-倍、至少3-倍、至少4_倍、至少5-倍、至少7-倍、或至少10-倍。在一些實施方案中，如實施例H(2)中所述地 確定親和性。在一些實施方案中，中和性單克隆抗體是非人單克隆抗體。在一些此類實施方案 中，中和性單克隆抗體是嚙齒動物單克隆抗體。在一些此類實施方案中，中和性單克隆抗體 是小鼠單克隆抗體。在一些實施方案中，中和性單克隆抗體是嵌合單克隆抗體。在一些實 施方案中，中和性單克隆抗體是人源化單克隆抗體。在一些實施方案中，中和性單克隆抗體 是人單克隆抗體。在一些實施方案中，嵌合的、人源化和/或人單克隆抗體用作人中的治療 抗體。在一些實施方案中，中和性單克隆抗體是抗體片段。示例性抗體片段包括，但不限 于，F(xiàn)ab、Fab，、F (ab ‘ ) 2、Fv、scFv、Fd、雙抗體，和其他抗體片段。在不同的實施方案中，中和性單克隆抗體以小于liiM，小于500nM，小于300nM，小 于200nM，小于100nM，小于75nM，小于50nM，小于30nM，小于25nM，小于20nM，小于15nM，小 于10nM，小于5nM，小于4nM，小于3nM，或小于2nM的KD結合人ANGPTL3。在不同的實施方 案中，中和性單克隆抗體以小于1 P M,小于500nM，小于300nM，小于200nM，小于100nM，小于 75nM,小于50nM，小于30nM，小于25nM，小于20nM，小于15nM，小于10nM，小于5nM，小于4nM， 小于3nM，或小于2nM的KD結合人SP1肽。在不同的實施方案中，中和性單克隆抗體以小于 1 u M,小于500nM，小于300nM，小于200nM，小于100nM，小于75nM，小于50nM，小于30nM，小 于25nM，小于20nM，小于15nM，小于10nM，小于5nM，小于4nM，小于3nM，或小于2nM的KD結 合具有SEQ ID NO :9的氨基酸序列的肽。在不同的實施方案中，中和性單克隆抗體以小于 1 u M,小于500nM，小于300nM，小于200nM，小于100nM，小于75nM，小于50nM，小于30nM，小 于25nM，小于20nM，小于15nM，小于10nM，小于5nM，小于4nM，小于3nM，或小于2nM的KD結 合具有SEQ ID NO 10的氨基酸序列的肽。在不同的實施方案中，抗ANGPTL3的中和性單克隆抗體結合小鼠ANGPTL3(SEQ ID N0:1)，其具有是其結合小鼠ANGPTL4(SEQID NO 107)的至少10-倍的親和性，至少15-倍 的親和性，至少20-倍的親和性，至少25-倍的親和性，至少30-倍的親和性，至少40-倍的 親和性，至少50-倍的親和性，至少100-倍的親和性，或至少200-倍的親和性。在不同的實 施方案中，抗ANGPTL3的中和性單克隆抗體結合人ANGPTL3(SEQ ID NO :3)，其具有是其結 合人ANGPTL4 (SEQ ID NO 108)的至少10-倍的親和性，至少15-倍的親和性，至少20-倍 的親和性，至少25-倍的親和性，至少30-倍的親和性，至少40-倍的親和性，至少50-倍的 親和性，至少100-倍的親和性，或至少200-倍的親和性。在不同的實施方案中，抗ANGPTL3 的中和性單克隆抗體結合具有小鼠ANGPTL3 SP1區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO 9)的肽，其具 有是其結合具有小鼠ANGPTL4 SP1區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO 109)的肽的至少10-倍的親 和性，至少15-倍的親和性，至少20-倍的親和性，至少25-倍的親和性，至少30-倍的親和 性，至少40-倍的親和性，至少50-倍的親和性，至少100-倍的親和性，或至少200-倍的親 和性。在不同的實施方案中，抗ANGPTL3的中和性單克隆抗體結合具有人ANGPTL3 SP1區(qū) 氨基酸序列(SEQ ID NO 10)的肽，其具有是其結合具有人ANGPTL4 SP1區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO 110)的肽的至少10-倍的親和性，至少15-倍的親和性，至少20-倍的親和性，至 少25-倍的親和性，至少30-倍的親和性，至少40-倍的親和性，至少50-倍的親和性，至少 100-倍的親和性，或至少200-倍的親和性。
21
提供了示例性中和性單克隆抗體，稱作4. 7. 1,4. 8.3,4. 9. 1，1.315. 1，5. 35，和 5. 50。抗體 4. 7. 1,4. 8. 3,4. 9. 1,5. 35，和 5. 50 結合小鼠 ANGPTL3 或人 ANGPTL3 的殘基 32 到57內的表位(SEQ ID NO 9和10)。在一些實施方案中，抗體4. 7. 1和4. 9. 1結合小鼠 ANGPTL3 或人 ANGPTL3 的包括 SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO 3 的氨基酸 33-37 和 40 的 SP1 區(qū)內的表位(SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 10的氨基酸2_6和9)。在一些實施方案中，抗 體5. 35和5. 50結合小鼠ANGPTL3或人ANGPTL3的包括SEQID N0 2或SEQ ID NO 3的氨 基酸序列34-37和40-42的SP1區(qū)內的表位(SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 10的氨基酸3_6 和9-11)。在一些實施方案中，抗體4. 8. 3結合小鼠ANGPTL3或人ANGPTL3的包括SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO 3 的氨基酸 34-37、40、和 42 的 SP1 區(qū)內的表位(SEQ ID NO :9 或 SEQ ID NO :10 的氨基酸 3-6、9、和 11)?？贵w 1. 315. 1 結合小鼠 ANGPTL3 的殘基 42-116(SEQ ID NO 61)內的表位?？贵w4. 7. 1,4. 8. 3,4. 9. 1，1. 315. 1,5. 35，和 5. 50 中和至少一種 ANGPTL3 的活性。 因此，將預期結合與抗體4. 7. 1,4. 8. 3,4. 9. 1,1. 315. 1,5. 35，和5. 50中的至少一種結合的 表位(例如，在人或者小鼠ANGPTL3中)的抗體也具有中和活性。某些抗ANGPTL3的中和性 單克隆抗體結合選自SEQ ID NOs :9，10，12，13，和61中的一種或多種肽。某些抗ANGPTL3 的中和性單克隆抗體結合選自SEQ ID NOs :9和10中的一種或多種肽。在一些實施方案中， 抗ANGPTL3的中和性單克隆抗體結合具有SEQ ID NO 61的序列的肽。在一些實施方案中， 抗ANGPTL3的中和性單克隆抗體結合具有SEQ ID NO 12的序列的肽和具有SEQ ID NO 13 的序列的肽。在一些實施方案中，提供了與單克隆抗體4. 7. 1結合相同表位的中和性單克隆抗 體。在一些實施方案中，提供了與單克隆抗體4. 8. 3結合相同表位的中和性單克隆抗體。在 一些實施方案中，提供了與單克隆抗體4. 9. 1結合相同表位的中和性單克隆抗體。在一些 實施方案中，提供了與單克隆抗體5. 35結合相同表位的中和性單克隆抗體。在一些實施方 案中，提供了與單克隆抗體5. 50結合相同表位的中和性單克隆抗體。在一些實施方案中， 提供了與單克隆抗體1. 315. 1結合相同表位的中和性單克隆抗體。某些中和抗體包含重鏈，該重鏈包含如SEQ ID NO 20給出的氨基酸序列。某些中 和抗體包含重鏈，該重鏈包含如SEQ ID NO :22給出的氨基酸序列。某些中和抗體包含重 鏈，該重鏈包含如SEQ ID NO :24給出的氨基酸序列。某些中和抗體包含輕鏈，該輕鏈包含 如SEQ ID NO :28給出的氨基酸序列。某些中和抗體包含輕鏈，該輕鏈包含如SEQ ID NO: 30給出的氨基酸序列。某些中和抗體包含輕鏈，該輕鏈包含如SEQ ID N0:32給出的氨基 酸序列。某些中和抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含如SEQ ID NO :20給出的氨基酸序 列，所述輕鏈包含如SEQ ID NO :28給出的氨基酸序列。某些中和抗體包含重鏈和輕鏈，所 述重鏈包含如SEQ ID NO :22給出的氨基酸序列，所述輕鏈包含如SEQ ID N0:30給出的氨 基酸序列。某些中和抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含如SEQ ID NO :24給出的氨基酸序 列，所述輕鏈包含如SEQ ID NO 32給出的氨基酸序列。
1.嵌合的和人源化單克隆抗體在一些實施方案中，非人抗體是嵌合的。在一些實施方案中，特異性結合人ANGPTL3的小鼠單克隆抗體是嵌合的。提供了制備嵌合抗體的某些示例性方法，例如在 Morrison 等(1984)美國國家科學院學報(Proc. Nat’ 1 Acad. Sci. USA) 81 6851-6855 ； Neuberger 等(1984)自然(Nature) 312 :604_608 ；Takeda 等(1985)自然(Nature) 314 452-454 ；和美國專利號6，075，181和5，877，397中提供。在一些實施方案中，非人抗體是“人源化的”。在一些實施方案中，特異性結合人 ANGPTL3的小鼠單克隆抗體是人源化的。在一些實施方案中，針對小鼠ANGPTL3產生但是與 人ANGPTL3特異性結合(例如，交叉反應)的小鼠單克隆抗體是人源化的。在一些實施方 案中，人源化抗體保留它們的結合特異性并且當施用于人時具有減小的免疫原性(例如， 減小的人抗小鼠抗體(HAMA)應答)。在一些實施方案中，通過如下詳述的包括但不限于CDR 移植(⑶R grafting)和人工程化的方法實現(xiàn)了人源化。在人源化抗體的一些實施方案中，將來自具有理想的結合特異性的抗體(“供體” 抗體)的輕鏈和重鏈可變區(qū)的一個或多個互補性決定區(qū)(CDRs)移植到“受體”抗體中的 人構架區(qū)(FRs)。示例性CDR移植在例如美國專利號6，180，370，5，693，762，5，693，761， 5，585，089，和 5，530, 101 ；Queen 等(1989)美國國家科學院學報(Proc. Nat’ 1 Acad. Sci. USA) 86 =10029-10033中描述。在一些實施方案中，將來自輕鏈和重鏈可變區(qū)的一個或多個 ⑶Rs移植到受體抗體的共有人FRs上。為了產生共有人FRs，在一些實施方案中，將來自一 些人重鏈或輕鏈氨基酸序列的FRs進行比對以鑒定共有氨基酸序列。在一些實施方案中，用來自供體抗體的FR氨基酸替換受體抗體中某些FR氨 基酸。在一些此類實施方案中，來自供體抗體的FR氨基酸是促進供體抗體對靶抗原的 親和性的氨基酸。見，例如，美國專利號6，180，370，5，693，762，5，693，761，5，585，089， 和 5，530, 101 ；Queen 等(1989)美國國家科學院學報(Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA)86 10029-10033。在一些實施方案中，用計算機程序對供體和/或受體抗體建模以鑒定可能涉 及結合抗原和/或對抗原結合位點的結構有貢獻的殘基，從而輔助選擇將在供體抗體中被 替換的殘基如FR殘基。在一些實施方案中，將來自供體抗體的⑶Rs移植到包含人恒定區(qū)的受體抗體上。 在一些此類實施方案中，還將FRs移植到受體上。在一些實施方案中，來自供體抗體的CDRs 來自單鏈Fv抗體。在一些實施方案中，來自供體抗體的FRs來自單鏈Fv抗體。在一些實 施方案中，進一步修飾(例如，通過氨基酸替代、缺失或插入)人源化抗體中移植的CDRs以 增加該人源化抗體對靶抗原的親和性。在一些實施方案中，進一步修飾(例如，通過氨基酸 替代、缺失或插入)人源化抗體中移植的FRs以增加該人源化抗體對靶抗原的親和性。在一些實施方案中，可以用“人工程化，，方法人源化非人抗體。見例如，美國專利 號5，766，886和5，869，619。在人工程化的一些實施方案中，關于抗體可變結構域的結構的 信息(例如，從晶體結構和/或分子建模得到的信息)用于評估可變區(qū)中的給定氨基酸殘 基(a)參與抗原結合，(b)暴露于抗體表面上(即，可接近溶劑)，或者(c)埋在抗體可變區(qū) 內(即，參與保持可變區(qū)的結構)的可能性。此外，在一些實施方案中，產生人可變區(qū)共有 序列來鑒定在人可變區(qū)中保守的殘基。在一些實施方案中，該信息提供了關于是否應該替 代非人抗體的可變區(qū)中氨基酸殘基的教導。某些中和性抗體包含重鏈，該重鏈包含4. 7. 1的⑶R1、⑶R2和⑶R3。某些中和性 抗體包含重鏈，該重鏈包含4. 8. 3的⑶R1、⑶R2和⑶R3。某些中和性抗體包含重鏈，該重
23鏈包含4. 9. 1的⑶R1、⑶R2和⑶R3。某些中和性抗體包含重鏈，該重鏈包含5. 35的⑶R1、 ⑶R2和⑶R3。某些中和性抗體包含重鏈，該重鏈包含5. 50的⑶R1、⑶R2和⑶R3。某些中 和性抗體包含重鏈，該重鏈包含1. 315. 1的⑶R1、⑶R2和⑶R3。某些中和性抗體包含重鏈， 該重鏈包含4. 7. 1的至少一個⑶R。某些中和性抗體包含重鏈，該重鏈包含4. 8. 3的至少 一個⑶R。某些中和性抗體包含重鏈，該重鏈包含4. 9. 1的至少一個⑶R。某些中和性抗體 包含重鏈，該重鏈包含5. 35的至少一個CDR。某些中和性抗體包含重鏈，該重鏈包含5. 50 的至少一個⑶R。某些中和性抗體包含重鏈，該重鏈包含1. 315. 1的至少一個⑶R。某些中 和性抗體包含重鏈，該重鏈包含4. 7. 1的至少兩個CDRs。某些中和性抗體包含重鏈，該重 鏈包含4. 8. 3的至少兩個⑶Rs。某些中和性抗體包含重鏈，該重鏈包含4. 9. 1的至少兩個 ⑶Rs。某些中和性抗體包含重鏈，該重鏈包含5. 35的至少兩個⑶Rs。某些中和性抗體包含 重鏈，該重鏈包含5. 50的至少兩個⑶Rs。某些中和性抗體包含重鏈，該重鏈包含1. 315. 1 的至少兩個⑶Rs。某些中和性抗體包含輕鏈，該輕鏈包含4. 7. 1的⑶R1、⑶R2和⑶R3。某些中和性 抗體包含輕鏈，該輕鏈包含4. 8. 3的⑶R1、⑶R2和⑶R3。某些中和性抗體包含輕鏈，該輕 鏈包含4. 9. 1的⑶R1、⑶R2和⑶R3。某些中和性抗體包含輕鏈，該輕鏈包含5. 35的⑶R1、 ⑶R2和⑶R3。某些中和性抗體包含輕鏈，該輕鏈包含5. 50的⑶R1、⑶R2和⑶R3。某些中 和性抗體包含輕鏈，該輕鏈包含1. 315. 1的⑶R1、⑶R2和⑶R3。某些中和性抗體包含輕鏈， 該輕鏈包含4. 7. 1的至少一個⑶R。某些中和性抗體包含輕鏈，該輕鏈包含4. 8. 3的至少 一個⑶R。某些中和性抗體包含輕鏈，該輕鏈包含4.9. 1的至少一個⑶R。某些中和性抗體 包含輕鏈，該輕鏈包含5. 35的至少一個CDR。某些中和性抗體包含輕鏈，該輕鏈包含5. 50 的至少一個⑶R。某些中和性抗體包含輕鏈，該輕鏈包含1. 315. 1的至少一個⑶R。某些中 和性抗體包含輕鏈，該輕鏈包含4. 7. 1的至少兩個CDRs。某些中和性抗體包含輕鏈，該輕 鏈包含4. 8. 3的至少兩個⑶Rs。某些中和性抗體包含輕鏈，該輕鏈包含4. 9. 1的至少兩個 ⑶Rs。某些中和性抗體包含輕鏈，該輕鏈包含5. 35的至少兩個⑶Rs。某些中和性抗體包含 輕鏈，該輕鏈包含5. 50的至少兩個⑶Rs。某些中和性抗體包含輕鏈，該輕鏈包含1. 315. 1 的至少兩個⑶Rs。
2.抗體同種型在一些實施方案中，抗ANGPTL3的抗體是選自IgM、IgD、IgG、IgA、和IgE的任一同 種型。在一些實施方案中，抗ANGPTL3的抗體是IgG同種型。在一些此類實施方案中，抗體 是亞類IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的抗體。在一些實施方案中，抗ANGPTL3的抗體是IgM同 種型的抗體。在一些此類實施方案中，抗體是亞類IgMl或IgM2的抗體。在一些實施方案 中，抗ANGPTL3的抗體是IgA同種型的抗體。在一些此類實施方案中，抗體是亞類IgAl或 IgA2的抗體。在一些實施方案中，抗ANGPTL3的抗體包含人k輕鏈和人IgGl或IgG2重 鏈。在一些實施方案中，抗ANGPTL3的抗體包含小鼠k輕鏈和小鼠IgGl或IgG2重鏈。
3.經修飾的抗體在多種實施方案中，修飾抗體以改變它的一種或多種性質。在一些實施方案中，經 修飾的抗體可以相對于未經修飾的抗體具有優(yōu)點，如增加的穩(wěn)定性、延長的循環(huán)時間，或者降低的免疫原性(見例如，美國專利號4，179，337)。在一些實施方案中，通過將抗體連接到 非蛋白質部分對其修飾。在一些實施方案中，通過改變抗體的糖基化狀態(tài)，如通過改變抗體 上糖鏈的數(shù)目、類型、連接和/或位置修飾該抗體。在一些實施方案中，改變抗體使得它不 是糖基化的。在一些實施方案中，將一個或多個化學部分連接到抗體的氨基酸主鏈和/或糖 殘基。將化學部分連接到抗體的某些示例性方法是本領域技術人員已知的。此類方法包 括，但不限于，酰化反應或烷基化反應。見例如，EP 0 401 384 :Malik等(1992),實驗血 液學(Exp. Hematol.) ,20 1028-1035 :Francis (1992),聚焦牛長因子(Focus on Growth Factors),3(2) :4_10, Mediscript 出版，Mountain Court, Friern Bamet Lane,倫敦 N200LD, UK ；EP 0 154 316 ；EP 0 401 384 ；W0 92/16221；W0 95/34326 ；W095/13312；W0 96/11953 ；W0 96/19459和W0 96/19459。在一些實施方案中，用這些反應中任一種產生在 它的氨基末端化學修飾的抗體。在一些實施方案中，抗體連接到可檢測的標記，如酶的、熒光的、同位素的或者親 和標記。在一些此類實施方案中，可檢測的標記允許檢測或分離抗體。在一些實施方案中， 可檢測的標記允許檢測抗體結合的抗原。在一些實施方案中，通過將抗體連接到一種或多種聚合物進行修飾。在一些實施 方案中，抗體連接到一種或多種水溶性聚合物。在一些此類實施方案中，連接到水溶性聚合 物減小了抗體將在水性環(huán)境如生理環(huán)境中沉淀的可能性。在一些實施方案中，將治療性抗 體連接到水溶性聚合物。在一些實施方案中，本領域技術人員可以基于如下考慮選擇合適 的水溶性聚合物，這些考慮包括但不限于，該聚合物/抗體綴合物是否將用于治療患者，和 如果是，該抗體的藥理學模式(例如，半衰期、劑量、活性、抗原性和/或其他因素)。某些示例性的臨床上可接受的水溶性聚合物包括但不限于，聚乙二醇(PEG)；聚 乙二醇丙醛；乙二醇/丙二醇的共聚物；單甲氧基-聚乙二醇；羧甲基纖維素；葡聚糖；聚 乙烯醇(PVA)；聚乙烯吡咯烷酮；聚-1，3-二氧戊環(huán)；聚-1，3，6-三噁烷；乙烯/馬來酸酐 共聚物；聚氨基酸(均聚物或者隨機共聚物) ’聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇 ’聚 丙二醇均聚物(PPG)和其他聚環(huán)氧烷；聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物；聚氧乙烯化多元醇 (P0G)(例如，甘油)和其他聚氧乙烯化多元醇；聚氧乙烯化山梨糖醇、聚氧乙烯化葡萄糖、 colonic酸或其他糖類聚合物；和聚蔗糖、葡聚糖或其混合物。某些示例性PEGs包括，但不 限于本領域中已知用于抗體修飾的某些形式，如單-(CfCj烷氧基-或芳氧基-PEG。在一 些實施方案中，PEG丙醛由于其在水中的穩(wěn)定性可以在生產中具有優(yōu)點。在一些實施方案中，水溶性聚合物為任一分子量。在一些實施方案中，水溶性聚合 物為分枝或未分枝的。在一些實施方案中，水溶性聚合物具有約2kDa到約lOOkDa的平均 分子量，包括該范圍終點之間的所有點。在一些實施方案中，水溶性聚合物具有約5kDa到 約40kDa的平均分子量。在一些實施方案中，水溶性聚合物具有約lOkDa到約35kDa的平 均分子量。在一些實施方案中，水溶性聚合物具有約15kDa到約30kDa的平均分子量。在一些實施方案中，抗體連接到PEG(即，抗體被“加入聚乙二醇”)。在多種實 施方案中，PEG在哺乳動物中具有低毒性。見Carpenter等(1971)毒物學和應用藥理學 (Toxicol. Appl. Pharmacol.)，18，35_40。值得注意的是，腺苷脫氨酶的PEG加合物在美國 被批準用于人類治療嚴重聯(lián)合免疫缺陷綜合征。在多種實施方案中，PEG可以減小抗體的免疫原性。例如，在一些實施方案中，PEG與具有非人序列的抗體的連接當施用于人時可以 降低該抗體的抗原性。在一些實施方案中，將聚合物連接到抗體中的一個或多個反應性氨基酸殘基。一 些示例性反應性氨基酸殘基包括，但不限于，氨基末端氨基酸的a氨基、賴氨酸側鏈的￡ 氨基、半胱氨酸側鏈的巰基、天冬氨酰和谷氨酰側鏈的羧基、羧基末端氨基酸的a羧基、酪 氨酸側鏈和連接到某些天冬酰胺、絲氨酸或者蘇氨酸殘基的活化的糖基鏈。適于直接與蛋 白質反應的PEG的某些示例性活化形式(“PEG試劑”)是本領域技術人員已知的。例如，在一 些實施方案中，適于連接到氨基的PEG試劑包括，但不限于，羧酸的活性酯或者PEG的碳酸 酯衍生物，例如，其中離去基團為N-羥基琥珀酰亞胺、對硝基苯酚、咪唑或者1-羥基-2-硝 基苯-4-磺酸酯的碳酸酯衍生物。在一些實施方案中，含有馬來酰亞胺基或者鹵代乙?；?的PEG試劑用于修飾巰基。在一些實施方案中，含有氨基、胼基和/或酰胼基的PEG試劑可 以用于與通過蛋白質中糖基的高碘酸鹽氧化產生的醛反應。在一些實施方案中，水溶性聚合物具有至少一個反應基。在一些實施方案中，通 過將水溶性聚合物與活化基團反應產生水溶性聚合物如PEG的活化衍生物。在一些實施 方案中，活化基團可以是單功能的、雙功能的或者多功能的?？梢杂糜趯⑺苄跃酆衔镞B 接到兩個或多個抗體的某些示例性活化基團包括，但不限于下面的基團砜(例如，氯代 砜、乙烯砜和二乙烯砜)、馬來酰亞胺、巰基、硫羥、三氟甲磺酸酯(triflate)、tresylate, azidirine、環(huán)氧乙烷和5_吡啶基。在一些實施方案中，PEG衍生物通常在約11或者更小 的PH的水性環(huán)境下在長時期內對水解穩(wěn)定。在一些實施方案中，連接到另一分子如抗體的 PEG衍生物賦予該分子對水解的穩(wěn)定性。一些示例性同雙功能PEG衍生物包括，但不限于， PEG- 二 -氯代砜和 PEG- 二 -乙烯砜(見 W0 95/13312)。
D.制備單克隆抗體的一些方法
1. 一些雜交瘤方法在一些實施方案中，通過標準技術產生單克隆抗體。在一些實施方案中，通過基于 雜交瘤的方法產生單克隆抗體。一些此類方法是本領域技術人員已知的。見例如，Kohler 等(1975)自然(Nature) 256 :495_497 ；Harlow 和 Lane (1988)抗體實驗室手冊(抗體A Laboratory Manual)第 6 章(冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港 (Cold SpringHarbor)，NY)。在一些此類實施方案中，用免疫原免疫合適的動物，如小鼠、大 鼠、倉鼠、猴或者其他哺乳動物以產生分泌抗體的細胞。在一些實施方案中，分泌抗體的細 胞是B細胞，如淋巴細胞或脾細胞。在一些實施方案中，在體外免疫淋巴細胞(例如，人淋巴 細胞)以產生分泌抗體的細胞。見例如，Borreback等(1988)美國國家科學院學報(Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA)85 :3995_3999。在一些實施方案中，將分泌抗體的細胞與“永生化”細胞系，如骨髓型細胞系融合， 以產生雜交瘤細胞。在一些實施方案中，例如，通過ELISA鑒定了產生所需要的抗體的雜交 瘤細胞。在一些實施方案中，然后可以使用標準方法亞克隆此類細胞并培養(yǎng)。在一些實施方 案中，還可以在合適的動物宿主中在體內作為腹水腫瘤培養(yǎng)此類細胞。在一些實施方案中， 使用標準分離步驟，如親和層析從雜交瘤培養(yǎng)基、血清或者腹水分離單克隆抗體。產生根據(jù)一些實施方案的雜交瘤和純化單克隆抗體的指導例如在Harlow和Lane (1988)抗體實驗 室手冊(Antibodies :A LaboratoryManual)第 8 章(冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor), NY)中提供。在一些實施方案中，通過用免疫原免疫遺傳改變的小鼠產生小鼠單克隆抗體。在 一些此類實施方案中，小鼠是ANGPTL3缺陷小鼠，其部分或者完全缺乏ANGPTL3功能。在一 些此類實施方案中，小鼠是“敲除”小鼠，其缺少編碼ANGPTL3的基因的全部或部分。在一 些實施方案中，用小鼠ANGPTL3免疫此類敲除小鼠。在一些實施方案中，用人ANGPTL3免疫 此類敲除小鼠。在一些實施方案中，在能夠產生人抗體的轉基因動物(例如，小鼠)中產生人單 克隆抗體。見例如，美國專利號6，075，181 A和6，114，598A;和W0 98/24893 A2。例如， 在一些實施方案中，將人免疫球蛋白基因引入(例如，使用酵母人工染色體、人染色體片段 或者種系整合)其中內源Ig基因已經失活的小鼠中。見例如，Jakobovits等(1993)自然 (Nature) 362 :255_258 ；Tomizuka 等(2000)美國國家科學院學報(Proc. Nat’l Acad. Sci. USA) 97 -.122-121 ；和 Mendez 等(1997)自然遺傳學(Nat. Genet.) 15 146-156 (描述轉基因 小鼠的XenoMouse II 品系)。在一些實施方案中，用免疫原免疫此類轉基因小鼠。在一些此類實施方案中，得 到來自小鼠的表達抗體的淋巴細胞(如B細胞)。在一些此類實施方案中，將此類回收的 細胞與“永生化”的細胞系，如骨髓型細胞系融合，以產生雜交瘤細胞。在一些此類實施方 案中，篩選和選擇雜交瘤細胞以鑒定產生對目的抗原特異的抗體的那些。適于產生人單克 隆抗體的一些示例性方法和轉基因小鼠在例如Jakobovits等(1993)自然(Nature) 362 255-258 Jakobovits (1995)現(xiàn)代牛物技術觀點(Curr. Opin. Biotechnol.) 6 :561_566 ； Lonberg 等(1995)國際免疫學綜述(Int. Rev. Immunol.) 13 65-93 ；Fishwild 等(1996) 自然生物技術(Nat. Biotechnol.) 14 :845_851 ；Mendez 等(1997)自然遺傳學(Nat. Genet.) 15 146-156 ;Green(1999)免疫學方法雜志(J. Immunol. Methods) 231 :11_23 ； Tomizuka 等(2000)美國國家科學院學報(Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA)97 -.122-121 中描 述；在 Little 等(2000)今日免疫學(Immunol. Today) 21 :364_370 和 W098/24893 中綜述。 在一些實施方案中，抗ANGPTL3的人單克隆抗體適于用作治療抗體。見下面的部分V.G.。
2.某些基于展示的方法在一些實施方案中，使用基于展示的方法，如例如下述任一種方法產生人單克隆 抗體。在一些實施方案中，使用噬菌體展示技術產生人單克隆抗體。一些示例性抗 體噬菌體展示方法是本領域技術人員已知的，并且例如在H00genb00m，縱覽抗體噬菌 體—展 技術及其應用(Overview ofAntibodyPhage-Di splay Technology and Its Applications),來自分子生物學方法抗體噬菌體展示方法和流程(Methods in Molecular Biology Antibody PhageDisplay :Methods and Protocols) (2002) 178 1-37(0，Brien 和 Aitken 編，Human Press,Totowa,NJ)中描述。例如，在一些實施方案中， 在絲狀噬菌體、如非裂解性絲狀噬菌體fd或M13的表面上展示抗體文庫。在一些實施方案 中，抗體是抗體片段，如sCFVS、FabS、FVS，其具有工程化的分子間二硫鍵以穩(wěn)對，和雙抗體。在一些實施方案中，接著可以選擇具有需要的結合特異性的抗體。在下面進一步 描述抗體噬菌體展示方法的一些示例性實施方案。在一些實施方案中，可以使用本領域技術人員已知的一些方法制備抗體噬菌體展 示文庫。見例如，Hoogenboom,縱覽抗體噬菌體-展示技術及其應用(Overview ofAntibody Phage-Display Technology and ItsApplications),來自分子牛物學方法抗體噬菌 體展示方法禾口流程(Methods in Molecular BioloRy 抗體 PhaRe Display :Methods andProtocols) (2002) 178 :1—37(0，Brien 禾口 Aitken 編，Human Press, Totowa, NJ)。在一 些實施方案中，通過基因組DNA或者從分泌抗體的細胞的mRNA衍生的cDNA的PCR擴增，制 備可變基因所有組成成分。例如，在一些實施方案中，從B細胞的mRNA制備cDNA。在一些 實施方案中，例如，通過PCR擴增編碼重鏈和輕鏈的可變區(qū)的cDNA。在一些實施方案中，將重鏈cDNA和輕鏈cDNA克隆到合適的載體中。在一些實施 方案中，重鏈cDNA和輕鏈cDNA在克隆過程中隨機組合，從而導致編碼多種scFvs或Fabs 的cDNA文庫的裝配。在一些實施方案中，重鏈cDNA和輕鏈cDNA在克隆到合適的載體前連 接。在一些實施方案中，重鏈cDNA和輕鏈cDNA通過逐步克隆到合適的載體中連接。在一些實施方案中，將cDNA克隆到噬菌體展示載體，如噬菌粒載體中。一些示例 性噬菌粒載體，如PCES1，是本領域技術人員已知的。在一些實施方案中，將編碼重鏈和輕鏈 的cDNA呈遞在相同載體上。例如，在一些實施方案中，將編碼scFvs的cDNA與編碼小噬菌 體外殼蛋白Pill的基因III的全部或者部分符合讀框地克隆。在一些此類實施方案中，噬 菌粒指導scFv-pIII融合物在噬菌體表面的表達。備選地，在一些實施方案中，將編碼重鏈 (或輕鏈)的cDNA與基因III的全部或者部分一起符合讀框地克隆，并將編碼輕鏈(或重 鏈)的cDNA克隆在相同載體中信號序列的下游。該信號序列指導輕鏈(或重鏈)在宿主 細胞的周質中的表達，其中重鏈和輕鏈裝配成Fab片段。備選地，在一些實施方案中，編碼 重鏈的cDNA和編碼輕鏈的cDNA存在于不同的載體上。在一些此類實施方案中，分別克隆 重鏈和輕鏈cDNA，一種克隆到噬菌粒中，另一種克隆到噬菌體載體中，其都含有用于體內重 組到宿主細胞的信號。在一些實施方案中，將重組噬菌?；蛘呤删w載體引入合適的細菌宿主，如大腸 桿菌(E. coli)中。在一些使用噬菌粒的實施方案中，用輔助噬菌體感染宿主以提供噬菌體 結構蛋白，從而允許攜帶抗體-pill融合蛋白的噬菌體顆粒在噬菌體表面表達。在一些實施方案中，使用在體外重排的可變基因的所有組成成分構建“合成的”抗 體文庫。例如，在一些實施方案中，使用PCR隨機組合編碼重鏈或輕鏈的各基因區(qū)段(分別 為V-D-J或V-J)。在一些此類實施方案中，例如通過易錯PCR，向⑶Rs和可能地FRs中引 入另外的序列多樣性。在一些此類實施方案中，向CDR3，例如，重鏈的H3中引入另外的序列 多樣性。在一些實施方案中，使用來自未免疫的動物的核酸，如上述構建“幼稚(naive) ”或 者“通用的”噬菌體展示文庫。在一些實施方案中，未免疫的動物是人。在一些實施方案中， 使用來自經免疫的動物的核酸，如上述構建“免疫的”噬菌體展示文庫。在一些實施方案中， 經免疫的動物是人、大鼠、小鼠、倉鼠或者猴。在一些此類實施方案中，用下述免疫原的任一 種免疫動物。一些示例性通用人抗體噬菌體展示文庫可以從商業(yè)來源得到。一些示例性文庫包
28括，但不限于，來自MorphoSys AG(Martinstreid/慕尼黑，德國)的HuCAL 系列文庫；使 用MAbstract 技術的來自Oucell (萊頓(Leiden)，荷蘭)的文庫；來自Biolnvent (Lund， 瑞典)的n-CoDeR Fab文庫；和可從劍橋抗體技術(CambridgeAntibody Technology)(劍 橋，UK)得到的文庫。在一些實施方案中，通過連續(xù)淘選步驟實現(xiàn)從噬菌體展示文庫選擇具有需要的結 合特異性的抗體。在淘選的一些實施方案中，將文庫噬菌體制備物暴露于抗原。在一些此類 實施方案中，洗滌噬菌體-抗原復合物，并丟棄未結合的噬菌體。在一些此類實施方案中， 回收結合的噬菌體并隨后通過感染大腸桿菌擴增。在一些此類實施方案中，可以通過挑選 單個噬菌斑克隆產生單克隆抗體的噬菌體。在一些實施方案中，重復上述方法。在一些實施方案中，淘選中使用的抗原是下述免疫原的任一種。在一些實施方案 中，將抗原固定到固相支持體以允許通過親和層析純化結合抗原的噬菌體。在一些實施方 案中，將抗原生物素化，從而允許使用鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠分離結合的噬菌體與 未結合的噬菌體。在一些實施方案中，可以將抗原固定在細胞(用于直接淘選)上、在組織 冷凍切片中，或者在膜上(例如，尼龍膜或者硝化纖維素)。本領域技術人員可以常規(guī)地確 定一些淘選步驟的其他變體方案。在一些實施方案中，用酵母展示系統(tǒng)產生單克隆抗體。在一些此類系統(tǒng)中，將抗體 表達為具有酵母AGA2蛋白的全部或者部分的融合蛋白，其在酵母細胞壁的表面上展示。在 一些此類實施方案中，然后通過將細胞暴露于熒光標記的抗原，可以鑒定表達具有所需要 的結合特異性的抗體的酵母細胞。在一些此類實施方案中，然后通過流式細胞術分離結合 抗原的酵母細胞。見例如，Boder等(1997)自然生物技術(Nat. Biotechnol.) 15 :553_557。
3. 一些親和力成熟方法在一些實施方案中，通過在體外將抗體進行親和力成熟(或者“定向進化”)，增加 抗體對特定抗原的親和性。在體內，天然抗體通過體細胞高度突變接著通過選擇進行親和 性成熟。一些體外方法模擬該體內過程，從而允許產生具有等于或者超過天然抗體的親和 性的抗體。在親和性成熟的一些實施方案中，將突變引入編碼具有需要的結合特異性的抗體 的可變區(qū)的核酸序列。見例如,Hudson等(2003)自然醫(yī)學(Nat.Med.)9 129-134 ；Brekke 等(2002)自然綜述(Nat. Reviews) 2 :52_62。在一些實施方案中，將突變引入重鏈、輕鏈或 者兩者的可變區(qū)中。在一些實施方案中，將突變引入一個或多個⑶Rs中。在一些此類實施 方案中，將突變引入H3、L3或者兩者中。在一些實施方案中，將突變引入一個或多個FRs中。 在一些實施方案中，例如，在噬菌體、核糖體或者酵母展示文庫中產生突變文庫，從而，可以 通過標準篩選方法鑒定具有增強的親和性的抗體。見例如，Boder等(2000)美國國家科學 院學報(Proc. Nat，lAcad. Sci. USA) 97 :10701-10705 ；Foote 等(2000)美國國家科學院學 報(Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA) 97 :10679-10681 ;HooRenboom,縱覽抗體噬菌體-展示技 術及其應用(Overview ofAntibody Phage-Display Technology and Its Applications), 來自分子生物學方法抗體噬菌體展示方法和流程(Methods in Molecular BIoIory AntibodyPhaRe Display :Methods andProtocols)(2002) 178 :1_37 (0，Brien 禾口 Aitken 編， Human Press, Totowa, NJ)；和 Hanes 等(1998)美國國家科學院學報(Proc. Nat’ 1 Acad.Sci.USA)95 :14130-14135。在一些實施方案中，基于抗體的結構，如抗原結合位點的信息，通過位點特異性誘 變引入突變。在一些實施方案中，使用組合的CDRs誘變引入突變。在一些實施方案中，例 如，使用大腸桿菌增變株細胞、同源基因重排或者易錯PCR，隨機誘變可變區(qū)編碼序列的全 部或者部分。在一些實施方案中，使用“DNA改組”引入突變。見例如，Crameri等(1996) 自然醫(yī)學(Nat. Med.) 2 100-102 ；Fermer 等(2004)腫瘤生物學(Tumor Biol.) 25 :7_13。在一些實施方案中，用“鏈改組”產生具有增加的親和性的抗體。在鏈改組的一些 實施方案中，將一條鏈，如輕鏈，用輕鏈的所有組成成分替換，而另一條鏈，如重鏈不變，從 而提供特異性。在一些此類實施方案中，產生鏈改組抗體的文庫，其中未改變的重鏈與來自 輕鏈所有組成成分的每條輕鏈組合表達。在一些實施方案中，然后對此類文庫篩選具有增 加的親和性的抗體。在一些實施方案中，順序替換重鏈和輕鏈。在一些實施方案中，僅僅替 換重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)。在一些實施方案中，僅僅替換重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)的一部 分，如 CDR。見例如，Hudson 等(2003)自然醫(yī)學(Nat. Med.) 9 :129_134 ；Brekke 等(2002)^ 然綜沭(Nat. Reviews) 2 52~62 ；Kang 等(1991)美國國家科學院學報(Proc. Nat’ 1 Acad. Sci. USA) 88 11120-11123 ；Marks 等(1992)牛物技術(Biotechnology) 10 :779_83。在一些實施方案中，對特異性結合人ANGPTL3的小鼠單克隆抗體(包括，但不限 于，針對小鼠ANGPTL3產生但是特異性結合(即，交叉反應于)人ANGPTL3的小鼠單克隆抗 體)進行連續(xù)的鏈改組。在一些實施方案中，例如，將給定小鼠單克隆抗體的重鏈與人輕鏈 的新的所有組成成分組合，并選擇具有需要的親和性的抗體。在一些此類實施方案中，然后 將所選抗體的輕鏈與人重鏈的新的所有組成成分組合，并選擇具有需要的親和性的抗體。 從而，在一些實施方案中，選擇具有所需要的抗原結合特異性和親和性的人抗體。備選地，在一些實施方案中，將給定小鼠單克隆抗體的重鏈與人輕鏈的新的所有 組成成分組合，并從該第一輪改組選擇具有需要的親和性的抗體。在一些實施方案中，將最 初的小鼠單克隆抗體的輕鏈與人重鏈的新的所有組成成分組合，并從該第二輪改組選擇具 有需要的親和性的抗體。在一些實施方案中，來自第一輪改組中選擇的抗體的人輕鏈然后 來自在第二輪改組中選擇的抗體的人重鏈組合。從而，在一些實施方案中，選擇具有需要的 抗原結合特異性和親和性的人抗體。在一些實施方案中，使用“核糖體展示”方法，其交替進行抗體選擇和親和性成熟。 在核糖體展示方法的一些實施方案中，在選擇步驟之間通過RT-PCR擴增編碼抗體的核酸。 從而，在一些實施方案中，可以用易錯聚合酶向核酸中引入突變。此類方法的非限制性實例 在 Hanes 等(1998)美國國家科學院學報(Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA)95 :14130_14135 中 詳細描述。
4. 一些重組方法在一些實施方案中，通過重組技術產生單克隆抗體。見例如，美國專利號 4，816，567。在一些此類實施方案中，克隆編碼單克隆抗體鏈的核酸并在合適的宿主細胞中 表達。例如，在一些實施方案中，使用標準方法，可以從表達需要的抗體的細胞，如成熟B細 胞或雜交瘤細胞制備RNA。在一些實施方案中，然后使用標準方法，可以用RNA制備cDNA。 在一些實施方案中，例如，使用特定寡核苷酸引物，通過PCR擴增編碼重鏈或者輕鏈多肽的cDNA。在一些實施方案中，將cDNA克隆到合適的表達載體中。在一些實施方案中，然后將 表達載體轉化或者轉染到合適的宿主細胞，如不內源性產生抗體的宿主細胞中。一些示例 性宿主細胞包括，但不限于，大腸桿菌、COS細胞、中國倉鼠卵巢(CH0)細胞、和骨髓瘤細胞。 在一些實施方案中，其中重鏈和輕鏈在相同宿主中共表達，可以分離重建的抗體。在一些實施方案中，可以修飾編碼重鏈或輕鏈的cDNA。例如，在一些實施方案中， 可以將小鼠重鏈或輕鏈的恒定區(qū)用人重鏈或輕鏈的恒定區(qū)替換。以這種方式，在一些實施 方案中，可以產生嵌合抗體，其具有人抗體恒定區(qū)，但是保留小鼠抗體的結合特異性。在一些實施方案中，可以在一些細胞系中表達重組抗體。在一些實施方案中，編碼 特定抗體的序列可以用于轉化合適的哺乳動物宿主細胞。根據(jù)一些實施方案，可以通過用 于向宿主細胞中引入多核苷酸的任一種已知方法進行轉化。一些示例性方法，包括，但不 限于，在病毒(或者向病毒載體中)包裝多核苷酸并用病毒(或者載體)轉導宿主細胞， 和使用本領域中已知的一些轉染方法，如美國專利號4，399，216,4, 912，040,4, 740，461、和 4，959，455示例。在一些實施方案中，使用的轉化方法可以依賴于轉化的宿主。用于向哺乳 動物細胞引入異源多核苷酸的一些示例性方法是本領域中已知的，并且包括但不限于，葡 聚糖介導的轉染、磷酸鈣沉淀、1，5_ 二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物介導的轉染、 原生質體融合、電穿孔、多核苷酸在脂質體中的包封、和直接顯微注射DNA到細胞核中?？捎米鞅磉_宿主的一些示例性哺乳動物細胞系是本領域中已知的并且包括，但不 限于，可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)得到的許多永生化細胞系，包括，但不限于， 中國倉鼠卵巢(CH0)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細 胞(例如，Hep G2)，和許多其他細胞系。在一些實施方案中，通過確定哪些細胞系產生高水 平的特異性結合ANGPTL3的抗體，可以選擇細胞系。
E—些多肽免疫原在一些實施方案中，為了產生抗體，用免疫原免疫動物。在一些實施方案中，免疫 原是包含ANGPTL3的多肽。在一些實施方案中，免疫原是包含ANGPTL3的片段的多肽。在 一些實施方案中，免疫原是包含ANGPTL3的N-末端卷曲螺旋結構域的多肽。在一些實施方 案中，免疫原是包含ANGPTL3的SP1區(qū)的多肽。在一些實施方案中，免疫原包含小鼠ANGPTL3。在一些實施方案中，免疫原包含人 ANGPTL3。在一些實施方案中，免疫原包含小鼠ANGPTL3，其包含SEQ ID NO :1的氨基酸序 列。在一些實施方案中，免疫原包含人ANGPTL3，其包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列。在一 些實施方案中，免疫原包含小鼠ANGPTL3的片段。在一些實施方案中，免疫原包含SEQ ID NO 1的從殘基17到殘基240的片段。在一些實施方案中，免疫原包含SEQ ID NO 59的氨 基酸序列。在一些實施方案中，免疫原包含SEQ ID NO :1的從殘基32到殘基57的片段。 在一些實施方案中，免疫原包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列。在一些實施方案中，免疫原包 含SEQ ID NO 61的氨基酸序列。在一些實施方案中，免疫原包含人ANGPTL3的片段。在一 些實施方案中，免疫原包含SEQ ID NO :3的從殘基20到殘基243的片段。在一些實施方案 中，免疫原包含SEQ ID NO :60的氨基酸序列。在一些實施方案中，免疫原包含SEQ ID NO: 1的從殘基32到殘基57的片段。在一些實施方案中，免疫原包含SEQ ID NO 10的氨基酸 序列。
31CN
在一些實施方案中，免疫原包含SEQ ID N0:1的從殘基17到殘基240的約10-20 個連續(xù)氨基酸的任一肽。在一些實施方案中，免疫原包含SEQ ID NO :3的從殘基20到殘基 243的約10-20個連續(xù)氨基酸的任一肽。在一些實施方案中，免疫原包含選自SEQ ID NOs 9，10，12，13，59，60，和61中的一種或多種肽。在一些實施方案中，免疫原包含肽，該肽選自 SEQ ID NOs :9和10。在一些實施方案中，免疫原包含肽，該肽包含選自SEQ ID NOs :59和 60的一種或多種氨基酸序列。在一些實施方案中，免疫原包含肽，該肽包含SEQ ID N0s:12、 13和61。在一些此類實施方案中，選擇可能是免疫原性的肽。在一些此類實施方案中，選 擇預測為親水的和/或可能暴露于折疊狀態(tài)的天然ANGPTL3表面上的肽。選擇合適的免疫 原性肽的示例性指導在例如Ausubel等(1989)現(xiàn)代分子牛物學流稈(Current Protocols in Molecular Biology)第 11. 14 章(John Wiley & Sons，NY)；和 Harlow 和 Lane (1988) 抗體實驗室手冊(Antibody :A LaboratoryManual)第5章(冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor), NY)中提供。本領域技術人員已知一些示例性算法用于預測蛋白質的肽片段是否為親水的并 且因此可能暴露于蛋白質的表面上。一些此類算法使用蛋白質的一級序列信息進行這種預 測。一些此類算法基于例如，Hopp和Woods (1981)美國國家科學院學報(Proc. Nat ’ 1 Acad. Sci. USA) 78 :3824-3828，或 Kyte 和 Doolittle (1982)分子牛物學雜志(T. Mol. Biol.) 157 105-132的方法。本領域技術人員已知一些示例性算法用于基于蛋白質的一級氨基酸序 列預測蛋白質的二級結構。見例如，Corrigan等(1982)牛物醫(yī)學計算機稈序(Coirout. Programs Biomed.) 3 163-168。一㈣此類算法基于例如Chou和Fasman (1978)牛物化學年 度綜沭(Ann. Rev. Biochem.) 47 25-276的方法。在一些實施方案中，預測形成0轉角并因 此可能暴露于蛋白質的表面的肽區(qū)段可以被選擇作為免疫原。在一些實施方案中，用免疫原和一種或多種佐劑免疫動物。在一些實施方案中，取 決于宿主種類，用佐劑增強免疫應答。一些示例性佐劑包括，但不限于弗氏佐劑(完全和不 完全的)、礦物鹽，如氫氧化鋁或者磷酸鋁、表面活性物質、脫乙酰殼多糖、溶血卵磷脂、泊洛 沙姆多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、和潛在有用的人佐劑，如BCG(卡介苗)和短小棒桿菌 (Corynebacterium parvum)。在一些實施方案中，通過將免疫原偶聯(lián)到另一免疫原性分子 或者“載體蛋白”，增強對免疫原例如肽免疫原的免疫應答。一些示例性載體蛋白包括，但 不限于，匙孔血藍蛋白(KLH)、破傷風毒素、白喉類毒素、卵清蛋白、霍亂類毒素、和其免疫原 性片段。關于將肽免疫原偶聯(lián)到載體蛋白的示例性教導，見例如，Ausubel等(1989)現(xiàn)代 分子生物學流程(Current Protocols in Molecular BioloRy)第 11. 15 章(John Wiley & Sons，NY)；和 Harlow 和 Lane (1988)抗體實驗室手冊(Antibodies :A Laboratory Manual)第 5 章(冷泉港實驗室(ColdSpring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，NY)。在一些實施方案中，使用標準重組方法可以產生上述免疫原的任一種。例如，在一 些實施方案中，可以將編碼小鼠或者人ANGPTL3的多核苷酸或者該多核苷酸的片段克隆到 合適的表達載體中。在一些實施方案中，該多核苷酸包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6的 核酸序列。在一些實施方案中，然后將重組載體引入合適的宿主細胞。在一些實施方案中， 接著通過標準方法從宿主細胞分離多肽。關于重組蛋白質表達的一些示例性方法，見例如， Ausubel 等(1991)現(xiàn)代分子生物學流程(Current Protocolsin Molecular BioloRy)第
3216 章(John Wiley & Sons，NY)。 F. 一些測定法 1. 一些結合測定法在一些實施方案中，使用檢測抗體與抗原結合的一些常規(guī)方法，篩選抗體對 ANGPTL3的結合。例如，在一些實施方案中，通過標準免疫印跡方法，如蛋白質印跡，測定單 克隆抗體結合ANGPTL3的能力。見例如，Ausubel等(1992)現(xiàn)代分子牛物學流稈(Current Protocols inMolecular BioloRy)第 10. 8 章(John Wiley & Sons, NY) ；Harlow 禾口 Lane (1988)抗體實騎室手冊(Antibodies :A Laboratory Manual)(冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor), NY) 在一些實施方案中，將 用于此類測定法中的ANGPTL3可以是分離的或者可以存在于蛋白質和/或大分子的復雜混 合物中。在一些實施方案中，使用競爭結合測定法測定單克隆抗體結合ANGPTL3的能力， 該測定法評價候選抗體與已知的抗ANGPTL3抗體競爭結合ANGPTL3的能力。在一些此類實 施方案中，已知的抗ANGPTL3抗體是下面部分VI. J中描述的單克隆抗體的任一種。在一些 實施方案中，使用ELISA進行競爭性結合測定。見例如，Harlow和Lane (1988)抗體實驗室 手冊(Antibodies :A Laboratory Manual)第 14 章(7令泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory), 7令泉港(Cold Spring Harbor), NY)。在一些實施方案中，用結合測定法定量抗ANGPTL3的抗體的結合動力學(例如， 速率常數(shù))或者結合親和性(例如，締合或者解離常數(shù))。在一些實施方案中，通過將抗原 (例如，ANGPTL3)固定在固體支持體上，在“固相”中確定結合動力學或者親和性。固定的 抗原從溶液中“捕獲”抗體。在一些實施方案中，通過將抗體(例如，抗ANGPTL3的抗體) 固定在固體支持體上，在“固相”中確定結合動力學或者親和性。固定的抗體從溶液中“捕 獲”抗原。在一些實施方案中，使用基于ELISA的方法確定結合動力學或者結合親和性。 在一些實施方案中，使用基于生物傳感器的技術，如Biacore表面等離子體共振技術 (Biacore, Piscataway, NJ)，確定結合動力學或者結合親和性。一些此類方法是本領域 技術人員已知的。見例如，McCafferty等(編)(1996)抗體工程實踐方法(Antibody EnRineerinR :APractical Approach) (IRL, Oxford, UK) ；Goldberg 等(1993)現(xiàn)代免疫學 觀點(Curr. Opin. Immunol.) 5 :278_281 ；Karlsson 等(1991)免疫學方法雜志(J. Immunol. Methods) 145 229-240 ;Malmqvist (1993)現(xiàn)代免疫學觀點(Curr. Opin. Immunol.) 5 282-286 綜述見Hoogenboom，縱覽抗體噬菌體-展示技術及其應用(Overview ofAntibody PhaRe-Pisplay Technology and ItsApplications)，來自分子生物學方法抗體噬菌體 展示方法禾口、流禾呈(Methods in Molecular BioloRy :AntibodyPhaRe Display :Methods andProtocols) (2002) 178 :1—37，在 19(0，Brien 禾口 Aitken 編，Human Press, Totowa，NJ)。在一些實施方案中，確定特異性結合ANGPTL3的Fab片段的結合動力學或者結 合親和性。在一些實例中，F(xiàn)ab片段具有不多聚化的性質。在一些實例中，多聚化可以 使得“固相”方法中的結合動力學和結合親和性的測量復雜化。見例如，Hoogenboom,M覽抗體噬菌體-展示技術及其應用(Overview ofAntibody Phage-Display Technology and ItsADDlications),來自分子牛物學方法抗體噬菌體展示方法和流稈(Methods in Molecular Biology :Antibody Phage Display :Methods andProtocols)(2002) 178 :1_37， 在19(0，Brie和Aitken編，Human Press, Totowa, NJ)。從而，在一些實施方案中，特異性 結合ANGPTL3的Fab片段適于用于其中抗原固定在固相支持體上的結合測定法，如例如基 于ELISA的測定法或者Biacore測定法。在一些實施方案中，使用酶促方法，從特異性結合 ANGPTL3的完整抗體產生Fab片段。在一些實施方案中，通過在重組表達系統(tǒng)，如上面部分 V. D. 3中描述的重組表達系統(tǒng)中表達編碼Fab片段的核酸產生Fab片段。在一些實施方案中，使用“溶液相”方法測定抗體對ANGPTL3的結合動力學或者結 合親和性。在這些方法中，在溶液中測量抗體_抗原復合體的結合動力學或結合親和性。 此類方法是本領域技術人員已知的。這種方法的非限制性實例是“動力學排除測定法”，或 者"KinExA”。見例如，Blake 等(1996)牛物化學雜志(L Biol. Chem.) 271 :27677_27685 ； Drake 等(2004)分析牛物化學(Anal. Biochem. )328 35-43 (比較 Biacore “固相” 和KinExA “溶液相”方法)。在一些實施方案中，由Sapidyne儀器公司(Sapidyne Instruments, Inc.) (Boise, ID)提供了進行 KinExA 的儀器。在一些實施方案中，使用溶液相方法確定多價抗體或者多聚化抗體的結合動力學 或者結合親和性。在一些實例中，多價抗體或者多聚化抗體的結合動力學或者結合親和性 的測量適合于溶液相分析。在一些實施方案中，如通過其KD測量的，抗ANGPTL3抗體的結合親和性為約10_6M 或更小。在一些實施方案中，抗ANGPTL3抗體的結合親和性為約10_7M、約10_8M或約10_9M 或更小。在一些此類實施方案中，抗ANGPTL3抗體可以用作治療抗體。見例如，Hudson等 (2003)自然醫(yī)學(Nat. Med.) 9 :129_134。在一些實施方案中，例如，使用親和力成熟技術， 可以實現(xiàn)小于10_9M的結合親和性(例如，約500pM到約0. 5pM的結合親和性，包括但不 限于，約100pM到約5pM的結合親和性)。見例如，Boder等(2000)美國國家科學院學報 (Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA) 97 :10701_10705。在一些實施方案中，抗 ANGPTL3 抗體的結 合親和性小于約5X10_8M。在一些實施方案中，對針對小鼠ANGPTL3產生的單克隆抗體使用一些常規(guī)檢測方 法，如諸如本文描述的方法篩選對人ANGPTL3的特異性結合。單克隆抗體結合小鼠和人 ANGPTL3(S卩，表現(xiàn)“交叉反應性”)的能力表明在小鼠和人ANGPTL3中存在相同表位。在使 用變性條件的檢測方法(如蛋白質印跡)的一些實施方案中，交叉反應性表明小鼠單克隆 抗體結合小鼠和人ANGPTL3中相同的“線性”表位。在使用非變性條件的檢測方法的一些 實施方案中，交叉反應性表明小鼠單克隆抗體結合小鼠和人ANGPTL3中相同的表位(例如， 線性表位或構象表位)。
2.表位作圖的一些方法在多種實施方案中，通過多種測定法的任一種鑒定單克隆抗體結合的表位。一些 示例性測定法例如在例如Morris，分子生物學方法(Methods in Molecular BIoIory)卷 66 表位作圖流程(Epitope MappinRProtocols) (1996) (Humana Press, Totowa, NJ)中描 述。例如，通過基因片段表達測定法或者基于肽的測定法可以實現(xiàn)表位作圖。在基因片段表達測定法的一些實施方案中，例如，在原核細胞中表達編碼ANGPTL3的片段的核酸并且 分離。在一些此類實施方案中，然后例如，通過免疫沉淀或免疫印跡評估單克隆抗體結合 這些片段的能力。在一些實施方案中，在放射性氨基酸的存在下，在體外轉錄和翻譯編碼 ANGPTL3的片段的核酸。然后測試ANGPTL3的放射性標記的片段對單克隆抗體的結合。在 一些實施方案中，通過蛋白水解片段化產生ANGPTL3的片段。在一些實施方案中，使用在噬 菌體或酵母表面上展示的隨機肽的文庫鑒定表位。在一些實施方案中，通過測試ANGPTL3 的重疊的合成肽片段的文庫對單克隆抗體的結合，鑒定表位。在一些實施方案中，使用如下 文描述的競爭測定法鑒定表位。在一些實施方案中，還可以使用如下文描述的丙氨酸-分 區(qū)誘變法定義表位。
3.一些競爭測定法在一些實施方案中，鑒定與目的單克隆抗體結合ANGPTL3的相同表位的單克隆 抗體。在一些實施方案中，通過例如上述的表位作圖鑒定此類單克隆抗體。在一些實施 方案中，通過常規(guī)競爭測定法鑒定此類單克隆抗體。見例如，Harlow和Lane (1988)抗體: 實驗室手冊(Antibodies :A Laboratory Manual)第 14 章(冷泉港實驗室(Cold Spring HarborLaboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，NY)。在非限制性示例性競爭測定法 中，將ANGPTL3或者其片段固定到多孔板的孔中。在一些此類實施方案中，通過標準方法用 熒光標記(在一些實施方案中，異硫氰酸熒光素)標記目的單克隆抗體。在一些此類實施方 案中，向孔中加入標記的目的單克隆抗體和未標記的測試單克隆抗體的混合物。在一些此 類實施方案中，定量每孔中的熒光以確定未標記的測試單克隆抗體阻斷標記的目的單克隆 抗體的結合的程度。在一些實施方案中，如果每種單克隆抗體阻斷另一單克隆抗體的結合 達50%或者以上，那么認為這些單克隆抗體共有一個表位。示例性競爭性測定法還在例如 Morris，分子生物學方法(Methodsin Molecular Biology)卷 66 表位作圖流程(Epitope Mapping Protocols) (1996) (Humana Press, Totowa, NJ)中描述。非限制性示例性競爭測 定法在下面的部分VI. 0中提供。
4.用于鑒定中和抗體的一些測定法在一些實施方案中，對單克隆抗體篩選作為中和抗體的那些，即在體內和/或體 外降低ANGPTL3的活性的那些。在一些實施方案中，ANGPTL3的活性是ANGPTL3抑制LPL的 能力。從而，在一些實施方案中，通過在ANGPTL3存在下，中和抗體增加LPL的活性的能力 來鑒定中和抗體。在一些此類實施方案中，相對于對照抗體，中和抗體增加LPL活性至少約 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。用于體內和體外測量LPL活性的一 些示例性測定法是本領域中已知的。在一些實施方案中，在體內減小ANGPTL3的活性的中和抗體通過它降低至少一種 血清脂質的水平的能力來鑒定。一些示例性血清脂質包括，但不限于，甘油三酯、膽固醇和 游離脂肪酸。在一些此類實施方案中，相對于對照抗體，中和抗體降低至少一種血清脂質的 水平至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 95%。在一些實施方案 中，在體內減小ANGPTL3的活性的中和抗體通過它抵消或者賦予對含有脂肪飲食的某些影 響的保護的能力來鑒定。一些示例性效果包括，但不限于，體重增加、肥胖癥、葡萄糖不耐性(高血糖癥)、胰島素不敏感性(高胰島素血癥)、肝臟脂肪變性(脂肪肝)、和肌細胞內 (intramyocellular)月旨質禾只累。
G. 一些藥物組合物和使用中和性單克隆抗體的治療方法在一些實施方案中，中和抗體可以用作治療抗體。將用作治療抗體的一些示例性 中和抗體包括，但不限于，嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。本領域技術人員熟悉此類抗體 作為治療劑的用途。例如，從20世紀80年代中期以來FDA已經批準了十二種以上的抗體 用作治療劑。見例如，Hudson 等(2003)自然醫(yī)學(Nat. Med.)9 :129_134 ；Gura(2002)^. 然(Nature) 417 :584_586 ；Brekke 等(2002)自然綜沭(Nat. Reviews) 2 :52_62。一些 FDA 批準的抗體包括用于治療多種癌癥、炎癥和病毒感染和預防移植物排斥的那些。見，例如， Gura(2002)自然(Nature) 417 584-586 ；Brekke 等(2002)自然綜沭(Nat. Reviews) 2 52-62。此外，十二種以上的抗體當前正處于臨床試驗中。見例如，Brekke等(2002)自然 綜沭(Nat. Reviews) 2 52-62。在一些實施方案中，提供了治療脂質代謝病癥的方法，其包括施用有效量的抗 ANGPTL3的中和抗體。在一些實施方案中，提供了治療脂質代謝的急性病癥的方法，其包 括施用有效量的抗ANGPTL3的中和抗體。在一些實施方案中，提供了治療脂質代謝的慢性 病癥的方法，其包括施用有效量的抗ANGPTL3的中和抗體。在一些實施方案中，治療脂質 代謝病癥的方法還包括施用有效量的抗ANGPTL4的中和抗體。參見，例如，PCT公開號W0 2006/074228。如本文使用的，“脂質代謝的病癥”包括，但不限于，可以導致繼發(fā)性高脂血癥(包 括高甘油三酯血癥和高膽固醇血癥)的病癥。脂質代謝的一些示例性病癥包括，但不限于， 動脈粥樣硬化、血脂障礙、高甘油三酯血癥(包括藥物誘導的高甘油三酯血癥、利尿劑誘導 的高甘油三酯血癥、醇誘導的高甘油三酯血癥、0 -腎上腺素能阻斷劑誘導的高甘油三酯血 癥、雌激素誘導的高甘油三酯血癥、糖皮質激素誘導的高甘油三酯血癥、類視色素誘導的高 甘油三酯血癥、西咪替丁誘導的高甘油三酯血癥、和家族性高甘油三酯血癥)、與高甘油三 酯血癥有關的急性胰腺炎、乳糜微粒綜合征、乳糜微粒血癥、Apo-E不足、LPL不足或者低活 性、高脂血癥(包括家族性聯(lián)合高脂血癥)、高膽固醇血癥、與高膽固醇血癥相關的痛風、黃 瘤病(皮下膽固醇沉積)、冠狀動脈病(也稱作缺血性心臟病)、與冠狀動脈病相關的炎癥、 再狹窄、外周血管病，和中風。脂質代謝的一些示例性病癥包括，但不限于，與體重相關的病 癥，如肥胖癥、代謝綜合征，包括代謝綜合征的獨立組分(例如，向心性肥胖癥、FBG/前驅糖 尿病/糖尿病/高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥和高血壓)、甲狀腺功能減退、尿毒癥和與體 重增加有關的其他狀況(包括快速體重增加)、體重減輕、體重減輕的維持、或者體重減輕 后體重再次增加的危險。脂質代謝的一些示例性病癥包括，但不限于，相關的血糖病癥，如 糖尿病、高血壓和與胰島素耐受性相關的多囊卵巢綜合征。脂質代謝的一些示例性病癥包 括，但不限于，腎臟移植、腎病綜合征、庫欣綜合征、肢端肥大癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血內球蛋 白異常、脂質營養(yǎng)不良、I型糖原病和艾迪生病。脂質代謝的病癥包括，但不限于，繼發(fā)性高甘油三酯血癥(HTG，包括但不限于I、V 和IV型)，包括但不限于由于飲食引起的HTG(包括，但不限于，過量酒精攝入、體重增加和 肥胖癥)、藥物(包括但不限于，外源雌激素、他莫昔芬、類視色素、噻嗪類、氯噻酮、阻滯
36劑、蛋白酶抑制劑(包括但不限于利托那韋)、異丙酚輸注和腸胃外脂質輸注)引起的HTG， 代謝病癥(包括但不限于，糖尿病、妊娠、慢性腎衰竭、甲狀腺功能減退、家族性高脂血癥和 胰腺炎)。脂質代謝的病癥包括，但不限于，與血管通路功能異常有關的脂質病癥、與增生性 疾病包括但不限于，瘤形成(包括但不限于，前列腺癌、腎癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌 和胰腺癌)有關的脂質病癥，響應炎癥發(fā)生的病癥，包括但不限于，與例如感染性疾病、傷 口愈合、免疫缺陷綜合征(艾滋病和其他疾病，包括但不限于與異常發(fā)育有關的那些綜合 征)、瘢痕形成、動脈粥樣硬化、再狹窄和移植排斥、自身免疫病和慢性炎性疾病和病癥，其 包括但不限于，包括但不限于類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡的疾病和病癥，包括但不限 于局限性回腸炎、結腸炎、炎性腸病、反應性關節(jié)炎、包括萊姆病、依賴胰島素的糖尿病、器 官特異性自身免疫、多發(fā)性硬化、橋本甲狀腺炎和格雷夫斯病、斯耶格倫綜合征、接觸性皮 炎、牛皮癬、硬皮病、移植物抗宿主病、結節(jié)病、瘧疾、膿毒病、胰腺炎、特應性疾病，包括但不 限于哮喘和變態(tài)反應，包括但不限于，變應性鼻炎、胃腸道變態(tài)反應，包括但不限于，食物變 態(tài)反應、嗜酸粒細胞增多、結膜炎和腎小球腎炎、血液凝固病癥、內毒素性休克和其他炎癥 介導的病癥，如睡眠性呼吸暫停和嗜睡。在一些實施方案中，提供了治療脂質代謝病癥的方法，其包括施用有效量的抗 ANGPTL3的抗體和至少另外一種治療劑。在一些此類實施方案中，以有效量施用另外的治 療劑。在一些實施方案中，另外的治療劑是針對ANGPTL3的另一抗體。在一些實施方案中， 另外的治療劑是抗ANGPTL4的中和性抗體。參見，例如，PCT公開號W0 2006/074228。在 一些實施方案中，另外的治療劑是非抗體劑。在一些實施方案中，另外的治療劑是降低一種 或多種血清脂質的水平的試劑。一些示例性的另外治療劑包括，但不限于，膽固醇合成抑制 劑(他汀類藥物)，如HMG-CoA還原酶抑制劑(如洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀和氟伐地 汀)；膽汁螯合劑，如考來烯胺和其他樹脂；VLDL分泌抑制劑，如煙酸；親脂性抗氧化劑，如 普羅布考；酰基輔酶A膽固醇?；D移酶抑制劑；法尼醇X受體拮抗劑；留醇調節(jié)性結合蛋 白裂解激活蛋白(SCAP)激活劑；微粒體甘油三酯轉移蛋白(MTP)抑制劑；和ApoE相關肽。 在一些實施方案中，另外的治療劑是升高高密度脂蛋白(HDL)的試劑。此類試劑的非限制 性實例包括，但不限于，膽固醇酯轉移蛋白(CETP)抑制劑。在一些實施方案中，提供了藥物組合物，其包含有效量的抗ANGPTL3的抗體和藥 用稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑。在一些實施方案中，提供了藥物組合 物，其包含有效量的抗ANGPTL3的抗體和有效量的至少一種另外的治療劑，以及藥用稀釋 劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑。在一些實施方案中，至少一種另外的治療劑 選自如上述的那些治療劑。在一些實施方案中，藥物組合物的制劑材料在使用的劑量和濃度下對受者是無毒 的。在一些實施方案中，藥物組合物包含用于修飾、保持或者維持例如組合物的pH、滲 透性、粘度、澄清度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩(wěn)定性、溶解速率或者釋放速率、吸附或者 滲透的制劑材料。在一些實施方案中，合適的制劑材料包括，但不限于，氨基酸(例如，甘氨 酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和賴氨酸)；抗微生物劑；抗氧化劑(例如，抗壞血酸、亞硫 酸鈉和亞硫酸氫鈉)；緩沖劑(例如，硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽和其他有機酸)；膨脹劑(例如，甘露醇和甘氨酸)；螯合劑(例如，乙二胺四乙酸(EDTA))；絡合劑 (例如，咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、環(huán)糊精和羥丙基環(huán)糊精)；填充劑；單糖、二糖 和其他糖類(例如，葡萄糖、甘露糖和糊精)；蛋白質(例如，血清白蛋白、明膠和免疫球蛋 白)；著色劑、調味劑和稀釋劑；乳化劑；親水聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多 肽；成鹽抗衡離子(例如鈉)；防腐劑(例如，苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對 羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和過氧化氫)；溶劑(例如，甘油、丙二醇和 聚乙二醇)；糖醇(例如，甘露醇和山梨醇)；懸浮劑；表面活性劑或者增濕劑(例如，泊洛 沙姆、PEG、山梨坦酯、聚山梨酯(例如，聚山梨酯20和聚山梨酯80)、triton、氨丁三醇、卵 磷脂、膽固醇和泰洛沙泊)；穩(wěn)定性增強劑(例如，蔗糖和山梨醇)；張力增強劑(例如，堿金 屬鹵化物(例如，氯化鈉或氯化鉀)、甘露醇和山梨醇)；遞送載體；稀釋劑；賦形劑；和藥物 佐劑(雷明頓制藥科學(Remington' sPharmaceutical Sciences)，第 18 版，A. R. Gennaro 編，馬克出版社(MackPublishing Company) (1990)。在一些實施方案中，抗ANGPTL3的抗體或者其他治療分子連接到延長半衰期的載 體。一些示例性延長半衰期的載體是本領域中已知的。一些此類載體包括，但不限于，F(xiàn)c結 構域、聚乙二醇和葡聚糖。一些此類載體描述于例如公布的PCT申請?zhí)朩0 99/25044中。在一些實施方案中，本領域技術人員將根據(jù)，例如預期的施用途徑、遞送形 式和需要的劑量確定最佳的藥物組合物。見例如，雷明頓制藥科學(Remington' s Pharmaceutical Sciences)，如上文。在一些實施方案中，此類組合物可以影響中和抗體的 物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內釋放速率、或者體內清除速率。在一些實施方案中，藥物組合物中的基本賦形劑或載體的性質可以是水性或非水 性的。例如，在一些實施方案中，合適的賦形劑或載體可以是注射用水、生理鹽溶液或者人 工腦脊液，可能補充腸胃外施用的組合物中常見的其他物質。一些示例性賦形劑包括，但不 限于，中性緩沖鹽水和與血清白蛋白混合的鹽水。在一些實施方案中，藥物組合物包含約PH 7. 0-8. 5的Tris緩沖液，或者約pH 4. 0-5. 5的乙酸鹽緩沖液，其可以還包括山梨醇或者其 合適的替代物。在一些實施方案中，包含針對ANGPTL3的抗體與或不與至少一種另外的治 療劑的組合物可以如下制備用于保存將所選的具有所需要的純度的組合物與任選的配制 試劑(雷明頓制藥科學(Remington' s Pharmaceutical Sciences)，上文)以凍干餅或者 水溶液的形式混合。在一些實施方案中，包含針對ANGPTL3的抗體與或不與至少一種另外 的治療劑的組合物可以用合適的賦形劑如蔗糖配制成凍干物。在一些實施方案中，選擇藥物組合物用于腸胃外遞送。在一些實施方案中，選擇藥 物組合物用于吸入或者通過消化道如經口遞送。用于制備藥用組合物的一些示例性技術在 本領域技術人員能力之內。在一些實施方案中，制劑組分以施用部位可接受的濃度存在。在一些實施方案中， 用緩沖劑保持組合物在生理PH或者稍低的pH，典型地在約5到約8的pH范圍內。在一些實施方案中，當預期腸胃外施用時，藥物組合物可以是無致熱原的、腸胃 外可接受的水溶液，其可在藥用賦形劑中包含需要的針對ANGPTL3的抗體，與或者不與另 外的治療劑一起。在一些實施方案中，用于腸胃外注射的賦形劑是無菌蒸餾水，其中抗 ANGPTL3的抗體，與或者不與至少一種另外的治療劑一起配制為無菌的等滲溶液，適當保 存。在一些實施方案中，制備物可以包括所需要的分子與試劑的制劑，所述試劑如可注射的微球體、可生物蝕解的顆粒、聚合物化合物(如聚乳酸或者聚乙醇酸)、珠或者脂質體，其可 以提供產品的控釋或者緩釋，該產品可以接著通過長效制劑注射遞送。在一些實施方案中， 還可以使用透明質酸，其可以具有促進循環(huán)中延長的持續(xù)時間的作用。在一些實施方案中， 可以用可植入的藥物遞送裝置引入需要的分子。在一些實施方案中，可以配制藥物組合物用于吸入。在一些實施方案中，抗 ANGPTL3的抗體，與或者不與至少一種另外的治療劑一起可以配制為用于吸入的干燥粉劑。 在一些實施方案中，包含抗ANGPTL3的抗體與或者不與至少一種另外的治療劑一起的吸入 溶液可以與用于氣溶膠遞送的推進劑一起配制。在一些實施方案中，可以霧化溶液。在一些實施方案中，可以經口施用制劑。在一些實施方案中，以這種方式施用的抗 ANGPTL3的抗體與或者不與至少一種另外的治療劑可以與或不與通常用于調劑固體劑型如 片劑和膠囊劑的載體配制。在一些實施方案中，可以將膠囊劑設計成在胃腸道中生物利用 率最大化并且系統(tǒng)前降解最小的時候釋放制劑的活性部分。在一些實施方案中，可以包括 至少一種另外的試劑以方便與或者不與任何一種另外的治療劑一起的抗ANGPTL3的抗體 的吸收。在一些實施方案中，還可以使用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮 劑、片劑崩解劑和/或粘合劑。在一些實施方案中，藥物組合物包含有效量的抗ANGPTL3的抗體與或者不與至少 一種另外的治療劑，其與適于生產片劑的無毒賦形劑混合。在一些實施方案中，通過將片劑 溶解在無菌水，或者另一種合適的賦形劑中，可以以單位劑型制備溶液劑。一些示例性賦形 劑包括，但不限于，惰性稀釋劑(例如，碳酸鈣、碳酸鈉、碳酸氫鈉、乳糖和磷酸鈣)；粘合劑 (例如，淀粉、明膠和阿拉伯膠)；和潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸和滑石粉)。另外的藥物組合物將是本領域技術人員已知的，包括在持續(xù)或受控遞送劑型中 包含抗ANGPTL3的抗體與或者不與至少一種另外的治療劑的制劑。一些示例性緩釋或控 制遞送劑型包括，但不限于，脂質體載體、可生物蝕解的微粒、多孔珠、和長效注射劑。用 于制備某些劑型的一些示例性技術是本領域技術人員已知的。在一些實施方案中，緩釋 制劑可以包括成形制品，例如薄膜或者微囊劑形式的半透性聚合物基質。一些示例性 緩釋基質包括，但不限于，聚酯、水凝膠、聚交酯(見例如，美國專利號3，773，919和EP 058,481)、L-谷氨酸和、乙基-L-谷氨酸的共聚物(見例如，Sidman等(1983)生物聚 合物(Bi0p0lymerS)22 :547_556)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(見例如，Langer等 (1981)生物醫(yī)學材料研究雜志(J. Biomed. Mater. Res.) 15 :167_277 和 Larger (1982)化學 技術(Chem. Tech.) 12 :98_105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，上文)，和聚-D (-) -3-羥基丁 酸(EP 133, 988) 0在一些實施方案中，緩釋組合物可以包括脂質體，其可以在一些實施方 案中，通過本領域中已知數(shù)種的方法的任一種制備。見例如，Eppstein等(1985)美國國家 科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，82 :3688_3692 ；EP 036，676 ；EP 088，046 ；和 EP 143，949。在一些實施方案中，將用于體內施用的藥物組合物典型地是無菌的。在一些實施 方案中，這可以通過無菌濾膜過濾來完成。在一些實施方案中，當凍干組合物時，使用該方 法除菌可以在凍干和重構之前或之后進行。在一些實施方案中，用于腸胃外施用的組合物 可以以凍干形式或者溶液保存。在一些實施方案中，通常將腸胃外組合物置于具有無菌入 口的容器中，例如具有塞子的靜脈內溶液包或者瓶子中，通過皮下注射針頭可以刺穿塞子。，一旦已經配制了藥物組合物，就可以將它作為溶液劑、混懸 劑、凝膠劑、乳劑、固體或者作為脫水或者凍干的粉劑保存在無菌瓶中。在一些實施方案中， 這種制劑可以以即用的形式或者以施用前重構的形式(例如，凍干的形式)保存。在一些實施方案中，提供了用于產生單劑量施用單位的試劑盒。在一些實施方案 中，試劑盒可以每種含有具有干燥蛋白質的第一容器和具有水性制劑的第二容器。在一些 實施方案中，包括含有單個或多個腔的預先填充的注射器(例如，液體注射器和凍干注射 器(lyosyringes))的試劑盒。在一些實施方案中，將治療使用的包含抗ANGPTL3的抗體與或者不與至少一種另 外的治療劑的藥物組合物的有效量將取決于例如治療的背景和目的。本領域技術人員將明 白根據(jù)一些實施方案，用于治療的合適的劑量水平將從而部分隨著遞送的分子、與或者不 與至少一種另外的治療劑的抗ANGPTL3抗體所適用的適應癥、施用途徑和患者的大小(體 重、體表或者器官大小)和/或狀況(年齡和一般健康)而變。在一些實施方案中，臨床醫(yī) 生可以確定劑量和修改施用途徑以得到最佳的治療效果。在一些實施方案中，典型的劑量 可以為約0. liig/kg患者體重，高達約100mg/kg或以上，這取決于上述因子。在一些實施 方案中，劑量可以為0. 1 u g/kg到高達約100mg/kg ；lu g/kg到高達約100mg/kg ；或g/ kg到高達約100mg/kg，包括前面端點任一個之間的所有點(包括分數(shù))。在一些實施方案 中，劑量為約10mg/kg體重到約60mg/kg體重。在一些實施方案中，劑量為約10mg/kg體重、 約20mg/kg體重、約30mg/kg體重、約40mg/kg體重、約50mg/kg體重，或約60mg/kg體重。在一些實施方案中，抗ANGPTL3的中和性抗體的人劑量基于相同抗體在小 鼠中的有效劑量確定。在一些實施方案中，抗ANGPTL3的中和性抗體的人劑量利 用“工業(yè)指導在成年健康志愿者中評估治療劑的初始臨床實驗中最大安全起始劑量 (Guidance for Industry-Estimating theMaximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics inAdult Healthy Volunteers)，，美國健康禾口公 共事業(yè)部(U. S. D印artment ofHealth and Human Services)，食品和藥物管理局(Food and DrugAdministration),禾口藥物評估禾口研究中心(Center for Drug Evaluation andResearch) (CDER)，2005 年 7 月(藥理學和毒物學(Pharmacology andToxicology))確 定。在一些實施方案中，抗ANGPTL3的中和性抗體的人劑量是0.07mg/kg-7mg/kg。在一些 實施方案中，抗ANGPTL3的中和性抗體的人劑量是0. lmg/kg-5mg/kg。在一些實施方案中， 抗ANGPTL3的中和性抗體的人劑量是0. lmg/kg-2mg/kg。在不同的實施方案中，每周2次， 每周1次，每兩周1次，或每月1次地對患者施用抗ANGPTL3的中和性抗體。 在一些實施方案中，合適的劑量可以由本領域中的技術人員，例如，基于動物研究 確定。 在一些實施方案中，給藥頻率將考慮所用的制劑中針對ANGPTL3的抗體和如果適 用，任一另外的治療劑的藥物代謝動力學參數(shù)。在一些實施方案中，臨床醫(yī)生將施用該組合 物直到劑量達到實現(xiàn)需要的效果。在一些實施方案中，組合物可以因此作為單次劑量或者 作為兩次或者多次劑量(其可以含有或不含有相同量的需要的分子)隨時間施用，或者通 過植入裝置或者導管作為連續(xù)輸注施用。在一些實施方案中，對合適劑量的進一步完善通 過本領域技術人員常規(guī)地進行并且在他們進行的常規(guī)任務的范圍內。在一些實施方案中， 通過使用合適的劑量反應數(shù)據(jù)，可以確定合適的劑量。在一些實施方案中，患者接受一劑包
40含抗ANGPTL3抗體的藥物組合物。在一些實施方案中，患者每天接受1、2、3或者4劑包含 抗ANGPTL3抗體的藥物組合物。在一些實施方案中，患者每周接受1、2、3、4、5或6劑包含 抗ANGPTL3抗體的藥物組合物。在一些實施方案中，患者每月接受1或2劑包含抗ANGPTL3 抗體的藥物組合物。在一些實施方案中，藥物組合物的施用途徑是按照已知的方法，例如，經口、通過 靜脈內注射、腹膜內、腦內(實質內)、腦室內、肌內、眼內、動脈內、肝門內或者病灶內途徑； 通過緩釋系統(tǒng)或者通過植入裝置進行。在一些實施方案中，可以通過快速濃注或者通過連 續(xù)輸注或者通過植入裝置施用組合物。在一些實施方案中，可以通過已經吸收或者包封了目的分子的膜、海綿或者另一 合適的材料的植入，局部施用組合物。在一些實施方案中，當使用植入裝置時，可以將該裝 置植入任一合適的組織或者器官中，并且可以通過擴散、定時釋放的丸劑或者連續(xù)施用遞 送目的分子。在一些實施方案中，可以希望以離體方式使用包含與或者不與至少一種另外的治 療劑一起的抗ANGPTL3的抗體的藥物組合物。在一些此類實例中，已經從患者移去的細胞、 組織和/或器官接觸包含與或者不與至少一種另外的治療劑一起的抗ANGPTL3的抗體的藥 物組合物，之后將該細胞、組織和/或器官植入回到患者體內。在一些實施方案中，通過植入某些細胞遞送與或者不與至少一種另外的治療劑一 起的抗ANGPTL3的抗體，所述細胞已經用如上述的方法進行基因工程改造，以表達和分泌 所述多肽。在一些實施方案中，此類細胞可以是動物或者人細胞，并且可以是自體的、異源 的或者異基因的。在一些實施方案中，細胞可以是永生化的。在一些實施方案中，為了減小 免疫應答的機會，可以將細胞包封以避免周圍組織的浸潤。在一些實施方案中，包封材料典 型地是生物相容的、半透性聚合物包裹物(enclosure)或者膜，其允許蛋白質產物的釋放， 但是阻止患者免疫系統(tǒng)或者來自周圍組織的其他有害因子對細胞的破壞。
H.—些檢測和診斷方法在一些實施方案中，用抗ANGPTL3的抗體在體內或體外檢測ANGPTL3的存在。在 一些實施方案中，體內ANGPTL3的水平與醫(yī)學狀況，如脂質代謝的疾病相關，從而允許診斷 該醫(yī)學?？梢酝ㄟ^抗ANGPTL3的抗體診斷的一些示例性醫(yī)學病癥在上面給出。一些示例性檢測方法是本領域中已知的并且包括，但不限于，ELISA、放射性免疫 測定、免疫印跡、蛋白質印跡、免疫熒光、和免疫沉淀。在一些實施方案中，修飾抗ANGPTL3 的抗體使得它們可以例如，通過將抗體連接到標記而直接檢測。一些示例性標記包括，但不 限于，熒光團、生色團、放射性原子、密電子試劑、酶和配體。在一些實施方案中，使用結合一 類抗體的經標記的“次級”抗體(例如，山羊抗小鼠抗體)檢測抗ANGPTL3的抗體。
I.針對ANGPTL3拮抗劑和激動劑的一些篩選方法在一些實施方案中，提供了結合ANGPTL3的試劑的篩選方法。在一些實施方案中， 篩選方法包括將ANGPTL3在合適條件下暴露于一種或多種候選試劑，并評估ANGPTL3與該 一種或多種候選試劑的結合。在一些實施方案中，篩選方法包括在競爭性結合測定中使用 抗ANGPTL3的抗體。在一些此類實施方案中，使用包含抗ANGPTL3的抗體和ANGPTL3的第一結合混合物。測量第一結合混合物中ANGPTL3和抗體之間結合的量(M0)。還使用第二結合 混合物，其包含抗體、ANGPTL3和將篩選的試劑。測量第二結合混合物中ANGPTL3和抗體之 間結合的量(MD。例如通過計算虬/%的比率，比較第一結合混合物中結合的量和第二結合 混合物中結合的量。如果第二結合混合物中抗ANGPTL3的抗體的結合量小于第一結合混合 物中抗ANGPTL3的抗體的結合量，那么認為試劑能夠結合ANGPTL3。在一些實施方案中，結 合ANGPTL3的試劑將抗體與ANGPTL3的結合降低了至少約10% (即，Mi/M。< 0. 9)、至少約 30% (即，Mi/Mo < 0. 7)、至少約 50% (即，Mi/Mo < 0. 5)、至少約 70% (即，M^Mo < 0. 3)、 至少約80% (即，M/M。< 0. 2)、至少約90% (即，M/M。< 0. 1)或至少約95% (即，M^Mo < 0. 05)。在一些實施方案中，將用于上述篩選方法任一種中的ANGPTL3是ANGPTL3的N-末 端卷曲螺旋結構域或者其片段?；谏暾埲说挠^察，即結合在ANGPTL3的N-末端卷曲螺旋 結構域內的一些抗體可以在體內降低血清甘油三酯和血清膽固醇水平，通過篩選方法鑒定 為結合ANGPTL3的N-末端卷曲螺旋結構域的試劑(例如，抗體或者非抗體試劑)是ANGPTL3 活性的候選拮抗劑。在一些實施方案中，通過篩選方法鑒定為結合ANGPTL3的N-末端卷曲 螺旋結構域中SP1區(qū)的試劑(例如，抗體或者非抗體試劑)是ANGPTL3活性的候選拮抗劑。在一些實施方案中，拮抗劑活性通過如下驗證證明候選拮抗劑在體內或體外測 定中中和ANGPTL4活性。一些示范性測定記述在本文中。本領域中的技術人員可以從本文 中所述的那些和/或本領域中已知的那些中選擇和/或改進合適的測定。在一些實施方案 中，ANGPTL3的拮抗劑用于治療脂質代謝病癥。在一些實施方案中，提供了篩選結合ANGPTL3的血纖蛋白原結構域的試劑的方 法。在一些實施方案中，在ANGPTL3的血纖蛋白原結構域內結合的試劑可以增強ANGPTL3 活性。因此，通過篩選方法鑒定為結合ANGPTL3的血纖蛋白原結構域的試劑(例如，抗體或 者非抗體試劑)是ANGPTL3活性的候選激動劑。在一些實施方案中，激動劑活性通過如下 驗證證明候選激動劑在體外或體內測定中增強ANGPTL3活性。本領域中的技術人員可基 于本領域中已知的測定法和/或本文中所述的測定法選擇和/或改進合適的測定法。在一 些實施方案中，ANGPTL3的激動劑用于治療與過量體重減輕有關的一些病癥，如神經性厭食 癥、神經性貪食癥和與疾病如癌癥、囊性纖維病和艾滋病相關的惡病質(消瘦)?？梢院Y選對ANGPTL3的結合的一些示例性試劑包括，但不限于，抗體、小分子(例 如，有機化合物、有機金屬化合物、有機化合物和有機金屬化合物的鹽、糖類、氨基酸、核苷、 和核苷酸)、適體、肽和肽模擬物。一些示例性肽包括可溶性肽，其包括但不限于，隨機肽 文庫的成員(見例如，Lam 等(1991)自然(Nature) 354 82~84 ;HouRhten 等(1991)自然 (Nature) 354 :84_86)和由D-和/或L-構型氨基酸組成的組合化學原理衍生的分子文庫的 成員；和磷酸肽，其包括，但不限于，隨機或者部分簡并的定向磷酸肽文庫的成員(見例如， Songyang (1993) MB, (Cell) 72 767-778)。在一些實施方案中，計算機建模和檢索技術允許鑒定結合ANGPTL3的化合物，或 者改進已經鑒定的化合物。一些示例性分子建模系統(tǒng)包括，但不限于，CHARMM和QUANTA程 序(Polygen公司，Waltham，MA)。CHARMM執(zhí)行能量最小化和分子動力學函數(shù)。QUANTA執(zhí)行 分子結構的構建、圖形建模和分析。QUANTA允許相互作用構建、修飾、可視化和分析分子相 互的行為。
42J. ANGPTL3的核酸拮抗劑在一些實施方案中，提供了降低編碼ANGPTL3的核酸的表達的分離的核酸。在一 些實施方案中，編碼ANGPTL3的核酸編碼小鼠ANGPTL3。在一些實施方案中，編碼ANGPTL3 的核酸編碼人ANGPTL3。在一些實施方案中，分離的核酸是反義核酸。在一些此類實施方案 中，反義核酸是單鏈DNA分子，其通過基于RNaseH的機理促進靶mRNA的降解。在一些實施 方案中，反義核酸是長約8-30個(包括端點之間的所有點)核苷酸的寡核苷酸。在一些實 施方案中，反義核酸是約18-26個核苷酸長度的寡核苷酸。在一些實施方案中，反義核酸包含RNA分子，其通過基于RNA干擾(RNAi)的機理 降低靶核酸的表達。適于RNAi的一些示例性RNA分子包括，但不限于，短干擾RNA (siRNAs)、 微RNA(mRNAs)、小的非編碼RNA(tncRNAs)和小調節(jié)RNA(smRNA)。關于一些示例性RNAi機 理和用于RNAi中的RNA分子的綜述，見例如，Novina等(2004)Nature430 :161_164。在一些實施方案中，提供了降低編碼ANGPTL3的核酸的表達的siRNA。在一些實施 方案中，siRNA是長約18-26個(包括端點之間的所有點)核苷酸的寡核苷酸。在一些實施 方案中，siRNA是長約20-24個核苷酸的寡核苷酸，或者長約21-23個核苷酸的寡核苷酸。 在一些實施方案中，siRNA是雙鏈RNA。在一些實施方案中，siRNA將誘導與該siRNA的反 義鏈互補的靶mRNA分子的降解。見例如，Novina等(2004)自然(Nature) 430 161-164。反義核酸，如反義DNA分子或者siRNA的活性通常受到靶mRNA的二級結構的影 響。見例如，Vickers 等(2003)牛物化學雜志(T. Biol. Chem.) 278 :7108_7118。從而，在一 些實施方案中，選擇與靶mRNA的可以用于堿基配對的區(qū)域互補的反義核酸。在一些實施方 案中，通過進行“基因步移(gene walk) ”，例如，通過經驗測試許多反義寡核苷酸與沿著靶 mRNA的多個區(qū)域雜交和/或減小靶mRNA表達的能力，鑒定靶mRNA的合適區(qū)域。見例如， Vickers 等(2003)牛物化學雜志(L Biol. Chem.) 278 :7108_7118 ；Hill 等(1999)美國呼 吸細胞和分子牛物學雜志(Am. T. Respir. Cell Mol. Biol.) 21 :728_737。在一些實施方案 中，使用mRNA 二級結構預測程序或者相關的算法鑒定不與靶mRNA的任何其他區(qū)域雜交的 靶mRNA的區(qū)域，來鑒定靶mRNA的合適區(qū)域。見例如，Hill等(1999)美國呼吸細胞和分子 生物學雜志(Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.) 21 :728_737。在一些實施方案中，上面兩種方 法組合用于鑒定靶mRNA的合適區(qū)域。見例如，Hill等(1999)美國呼吸細胞和分子生物學 雜志(Am. J. Respir. CellMol. Biol.) 21 :728_737。在一些實施方案中，提供了通過減小編碼ANGPTL3的核酸的表達，減小ANGPTL3活 性的方法。在一些實施方案中，該方法包括在體外或體內減小細胞中編碼ANGPTL3的核酸 的表達。在一些實施方案中，該方法包括在體外或體內對細胞施用減小編碼ANGPTL3的核 酸的表達的反義核酸。在一些實施方案中，編碼ANGPTL3的核酸編碼人ANGPTL3。在一些實 施方案中，編碼ANGPTL3的核酸編碼小鼠ANGPTL3。在一些實施方案中，提供了治療脂質代謝的疾病的方法，如上述任一種方法。在一 些實施方案中，該方法包括對患者施用有效量的減小編碼ANGPTL3的核酸的表達的反義核 酸。在一些實施方案中，將反義核酸遞送到表達編碼ANGPTL3的核酸的器官。ANGPTL3主要在肝臟中表達。Oike，Y.等(2005)分子醫(yī)學趨勢(TRENDS Mol. Med.) 11 (10) :473-479。在小鼠中，表達明顯不受短期禁食的影響。Oike，Y.等(2005)1子醫(yī)學趨勢(TRENDS Mol.Med.)ll(lO) :473_479。然而，用膽固醇喂飼和在一些肥胖和糖 尿病的小鼠模型(例如db/db和ob/ob小鼠)，和患有鏈佐星-誘導的I型糖尿病小鼠中， 表達增加，這提示ANGPTL3可以促成糖尿病的血脂障礙和代謝綜合征。0ike，Y.等(2005) 分子醫(yī)學趨勢(TRENDS Mol. Med.) 11(10) :473_479。因此，在一些實施方案中，將反義核酸 遞送到肝臟中。例如，在Khan等(2004)藥物靶標雜志(T. Drug Targeting) 12 :393_404中 提供了體內施用反義核酸和持續(xù)體內遞送反義核酸，包括持續(xù)遞送到特定器官如肝臟的一 些示例性教導。在一些實施方案中，通過施用被封或者包含在生物可降解的聚合物中的反 義核酸，實現(xiàn)持續(xù)遞送。例如，在一些實施方案中，反義核酸可以包含在聚(乙醇酸)(PLGA) 微球體(例如，O.SIOymdOOOMW)內。在一些實施方案中，反義核酸綴合到親脂部分。見 Khan 等(2004)藥物靶標雜志(T. Drug Targeting) 12 :393_404。
VI.實施例
A.小鼠照料和飲食研究根據(jù)聯(lián)邦政府的指導進行小鼠研究。將小鼠飼養(yǎng)在24°C下固定12小時光照/12 小時暗周期并且隨意獲得水和嚙齒動物標準飲食(Chow) (22%卡路里來自脂肪)(產品號 5021 ；Purina, St. Louis, M0)，如下述。在下文中稱作“禁食狀態(tài)”的小鼠被剝奪食物16小 時。
B.小鼠中人ANGPTL3的體內過表達將編碼全長人ANGPTL3(SEQ ID NO 6)的cDNA插入到腺病毒載體pFAD的Ad El缺 失的區(qū)域中，從而將cDNA置于巨細胞病毒啟動子的控制下。見Hitt等，“構建和增殖人腺 病毒，，(“Construction andpropagation of human adenovirus vectors,")在細胞生物 學實驗室手冊(CellBiology :A Laboratory Handbook)卷 1，第 500-512 頁中(J. E. Celis 編，第2版，1998)。得到的構建體Ad5-mAngptl-4T用于感染CH0細胞?？誂d5病毒也作為 對照用于感染CH0細胞。通過受感染的CH0細胞提取物的蛋白質印跡證實人ANGPTL3的表 達。通過尾部靜脈血管將下列劑量的Ad5-hAngptl3T注射到C57BL/6J小鼠中 2X109vp, 1 X 109vp,5X108vp,2X108vpo 作為對照，將 2X109vp 的空 Ad5 載體通過尾部靜 脈注射到C57BL/6J小鼠中。每組中存在5只小鼠。4天后，收集來自腺病毒-感染小鼠的 血液樣品，在此期間正常喂飼(不禁食)小鼠。利用Cobas Integra 500(羅氏(Roche)，巴 塞爾(Basel)，瑞士)測量血清甘油三酯水平。結果顯示在圖8中。在該實驗中，注射了 2X109vp或lX109vp的Ad5-hAngptl3T 的小鼠與注射了空Ad5載體對照的小鼠相比較時，具有顯著增加的血清甘油三酯水平。
C.生成和純化小鼠和人ANGPTL3為了表達重組的小鼠ANGPTL3，用1. 5X10nvp的重組腺病毒Ad5_mAngptlT感染 CH0細胞。Ad5-mAngptlT表達在C-末端具有His6標記物的小鼠ANGPTL3 (在ANGPTL3和 His6標記物之間包括甘氨酸殘基)，稱為mANGPTL3T (SEQ ID NO :2)。16-24小時后，將培養(yǎng)基改變?yōu)闊o血清培養(yǎng)基(EX-CELL 325-PF CH0 培養(yǎng)基，14335，JRH, Lenexa, KS)。每 24-36 小時收獲條件培養(yǎng)基，并替換為新鮮無血清培養(yǎng)基，總共收獲5次。將條件培養(yǎng)基(1L)加載到10_12ml的鎳-螯合樹脂柱(R801-01，Invitrogen, Carlsbad，CA)上。用 5倍柱體積的清洗緩沖液(10mM咪唑，20mM Tris pH 7. 8,500mM NaCl) 清洗該柱。結合的mANGPTL3T由洗脫緩沖液(500mM咪唑，20mM Tris pH 7. 8,500mM NaCl) 洗脫，并收集在一系列1.5ml的組分中。通過蛋白質印跡和僅僅藍色染色確定收集的組分 中存在mANGPTL3T。將包含mANGPTL3T的組分匯集在一起，等分試樣，并冷凍在_70°C。為了表達重組人ANGPTL3，用1. 5X10nvp的重組腺病毒Ad5_mAngptlT感染CH0細 胞。Ad5-hAngptlT表達在C-末端具有His6標記物的人ANGPTL3 (在ANGPTL3和His6標記 物之間包括甘氨酸殘基)，稱為hANGPTL3T (SEQ ID NO 4)。如上關于mANGPTL3T所述地，表 達和純化hANGPTL3T。
D.生成和純化 rN，-mANGPTL3T 和 rN，-hANGPTL3T將編碼小鼠ANGPTL3的氨基酸17-240的多核苷酸序列克隆到表達載體pET22b (+) (Novagen)中。該載體編碼N_末端pelB前導序列，以及C_末端His標記物。由此生成的 表達載體稱為pET-N’ -mANGPTL3T。在翻譯蛋白質和除去除pelB序列的11個氨基酸外的 全部氨基酸后，N，-mANGPTL3T具有SEQ ID NO 7中所示的序列。該序列包含來自pelB序 列的11個氨基酸，隨后是小鼠ANGPTL3的氨基酸17-240 (在表7中加下劃線)，隨后是具有 2個氨基酸的接頭和His6標記物。類似地，將編碼人ANGPTL3的氨基酸20-243的多核苷酸序列克隆到表達載體 pET22b (+) (Novagen)中。該載體編碼N-末端pelB前導序列，以及C-末端His標記物。由 此生成的表達載體稱為pET-N’ -hANGPTL3T。在翻譯蛋白質和除去除pelB序列的11個氨 基酸外的全部氨基酸后，N’-hANGPTL3T具有SEQ ID NO :8中所示的序列。該序列包含來自 pelB序列的11個氨基酸，隨后是人ANGPTL3的氨基酸20-243 (在表7中加下劃線)，隨后 是具有2個氨基酸的接頭和His6標記物。由大腸桿菌(E. coli)表達和純化N’-mANGPTL3T或N’-hANGPTL3T，如下。向包含 50 u g/ml氯霉素和100 u g/ml羧芐青霉素的10ml LB中接種一個用pET_N，-mANGPTL3T轉 化的大腸桿菌菌落。培養(yǎng)物在37°C溫育過夜。然后，將10ml培養(yǎng)物轉移到500ml無抗生 素的LB中，并在37°C溫育直到0D_達到0. 6 (約2小時)。加入IPTG至最終濃度為ImM， 并在30°C，以200rpm搖動溫育培養(yǎng)物4小時。然后將培養(yǎng)物置于冰上5分鐘。細胞通過 在JLA16. 25轉子中以SOOOrpm離心15分鐘沉淀。然后將沉淀重新混懸在50ml裂解緩 沖液(50mM Tris, pH 7. 5,0. 5M NaCl, 1% Triton X-100，lx 蛋白酶抑制劑混合物(羅氏 (Roche))和0. 25ml PMSF(以0. 1M存在于異丙酮中))中。裂解的細胞再在JA25. 5轉子中 以9700rpm離心30分鐘。除去上清液，并通過在SW28轉子中以28，OOOrpm對其離心30分 鐘進一步凈化。然后，可以利用ProboncKNi)層析法(Invitrogen)，從凈化的上清液中純化 重組 N，-mANGPTL3T 或 N，_hANGPTL3T。為了從離心裂解的細胞后剩余的不溶性沉淀中純化重組N’ -mANGPTL3T或 N，-hANGPTL3T,用30ml裂解緩沖液清洗沉淀，并在JA25. 5轉子中以9700rpm離心。清洗 步驟重復2次，總共清洗3次。然后，將來自沉淀的不溶性蛋白質溶解在10ml變性緩沖液
45(50mM Tris，pH8. 0，6M鹽酸胍)中。然后在JA25. 5轉子中以28，OOOrpm離心該溶液30分 鐘。再將上清液加載到5ml Probond樹脂柱上。用50ml清洗緩沖液(50mMTris，pH 8.0， 1M NaCl,8M尿素，15mM咪唑)清洗該柱。重組蛋白在具有50ml從清洗緩沖液到復性緩沖 液(50mM Tris, pH 8. 0，1M NaCl，0. 5%吐溫20)的梯度的柱中重折疊。然后用洗脫緩沖 液(具有250mM咪唑的復性緩沖液)洗脫重組蛋白。收集并針對儲存緩沖液(50mM Tris, pH 8. 0，100mMNaCl,0. 2%吐溫20)透析包含重組蛋白的組分。對純化的N’ -mANGPTL3T或 N，-hANGPTL3T進行等分，并保存在_70°C。
E.生成和純化SP1和SP2-KLH純化的SP1(SEQ ID N0S 9 禾口 10)禾口 SP2_KLH(SEQ IDN0 62)商購自 Sigma Genosys (The Woodlands，德克薩斯州)。ANGPTL3的SP1區(qū)的序列在小鼠和人中是相同的。 SP2-KLH是通過下列步驟制備的將半胱氨酸加入到SP1的C00H-末端，然后利用本領域中 已知的標準方法使匙孔血藍蛋白通過該半胱氨酸綴合于所述肽。
F.在Angpt13敲除小鼠中產生針對ANGPTL3的單克隆抗體利用三個5-8只小鼠的組，在Angptl3敲除小鼠中生成與人和小鼠的ANGPTL3交 叉-反應的單克隆抗體，每組小鼠接受不同系列的抗原注射。用如上所述生成和純化的 mANGPTL3T (SEQ ID NO 2)激發(fā)(prime)組1。還用mANGPTL3T強化組1四次。收獲淋巴組 織前的最后強化使用mANGPTL3T。用如上所述生成和純化的rN，_hANGPTL3T (SEQ ID NO 8) 激發(fā)組2。用如上所述生成和純化的rN，-mANGPTL3T(SEQ ID NO 7)強化組2—次，然后用 mANGPTL3T(SEQ ID NO 2)強化三次。收獲淋巴組織前的最后強化使用hANGPTL3T(SEQ ID N0:4)。用如上所述生成和純化的hANGPTL3T(SEQ ID NO :4)激發(fā)組3，然后用hANGPTL3T 強化一次和再用如上所述生成和純化的合成肽SP2-KLH(SEQ ID NO 62)強化兩次。在收獲 淋巴組織前，使用SP2-KLH(SEQ ID NO 62)對組3中的2只高滴度動物進行最后強化。用 如上所述生成和純化的合成肽SP2-KLH(SEQ ID NO 62)另外強化組3中剩余的動物(稱為 組4)四次。收獲淋巴組織前對組4進行的最后強化使用SP2-KLH(SEQ ID NO :62)。對每只小鼠進行激發(fā)和強化，如下。用40 y g處于完全弗氏佐劑中的純化抗原腹 膜內激發(fā)每只小鼠。2周后用30 y g處于不完全弗氏佐劑(IFA)中的純化抗原腹膜內強化小 鼠，并且在另外2周后再用20y g處于IFA中的純化抗原腹膜內進行強化。備選地，可以使 用基于脫乙酰殼多糖的佐劑。見，例如，美國專利號5，912，000 ；5, 965，144 ；和5，980，912。 第二次強化后一周，利用mANGPTL3作為包被抗原的板，通過ELISA測定血清滴定，如下所 述。第二次強化后兩周，用lOyg處于IFA中的純化抗原腹膜內強化小鼠。第三次強化后 一周，再次如上通過ELISA測量血清滴度。對于組4，繼續(xù)腹膜內強化，直到獲得高滴度。當 高滴度產生時，利用激發(fā)抗原(組1和2)或強化的抗原(組3和4)進行最后的強化。最 后的強化在倒數(shù)第二次強化后約2周半進行，并用10 y g純化的抗原靜脈內進行。最后強化后三天時，從免疫的小鼠中收獲脾細胞，并利用PEG1500作為融合劑使 其與骨髓瘤細胞(NSI)融合。將由此產生的細胞融合產物稀釋到雜交瘤培養(yǎng)基中，并接種 到96-孔組織培養(yǎng)板中。1天后，將HAT培養(yǎng)基加入到雜交瘤培養(yǎng)物中。需要時，每3或4 天改變培養(yǎng)基。
選擇和培養(yǎng)10-14天后，通過ELISA篩選雜交瘤。來自組1的雜交瘤利用 mANGPTL3T, hANGPTL3T,和 N，-hANGPTL3T 篩選。來自組 2 的雜交瘤利用 mANGPTL3T 和 hANGPTL3T篩選。來自組3和4的雜交瘤利用hANGPTL3T和代表ANGPTL3的SP1區(qū)的合成 肽篩選。如下所示進行ELISA。
G.EL ISA 法利用ELISA篩選與抗原結合的抗體。篩選來自各組的抗體，以獲得與mANGPTL3T， hANGPTL3T，N’-hANGPTL3T，和/或hANGPTL3SPl肽的結合。通過添加50 u 1/孔的處于包被 緩沖液(BupH 碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，Pierce #28382，Rockford，IL)中的2. 5iig/ml mANGPTL3T，hANGPTL3T，N，hANGPTL3T,和 / 或 hANGPTL3 SP1 肽溶液，在 4°C包被 96 孔 Nunc Maxi-Sorp ImmunoPlates (Nunc #446612，Roskilde，Denmark)過夜。除去包被緩沖液，并 通過添加250 ill/孔的封閉緩沖液(1% Blocker BSA, Pierce #37525，在PBS中)在室溫 下封閉該板2小時。將50 yl雜交瘤上清液(未稀釋的或稀釋在封閉緩沖液中的)或分離 的抗-ANGPTL3抗體(未稀釋的或稀釋在封閉緩沖液中的)加入到所述孔中，并在室溫下溫 育至少1小時。用PBS/吐溫20清洗孔四次。將100 u 1稀釋(1 5，000-1 10，000)的 HRP-綴合山羊抗-小鼠IgG(PierCe#31446)加入到該孔中，并在37°C溫育1小時。用PBS/ 吐溫20清洗孔六次。通過將50 yl的TMB (四甲基聯(lián)苯胺)溶液(ImmunoPure TMB底物 試劑盒，Pierce#34021)添加到所述孔中5_10分鐘檢測抗-ANGPTL3抗體。利用微量培養(yǎng) 板讀數(shù)器(分子裝置(Molecular Devices), Sunnyvale, CA)，在450nm處通過分光光度法 對板進行讀數(shù)。
H.單克隆抗體的表位繪圖
I.結合某些ANGPTL3肽的抗體通過抗體捕獲ELISA測試來自組1的6種抗體，以獲得與從小鼠ANGPTL3的N_末 端到N’ -mANGPTL3T的三種不同的50個氨基酸的肽的結合。測試的抗體稱為1. 251. 1， 1. 132. 1,1. 173. 2,1. 315. 1，1.424. 1，和 1.431. 1。測試那些抗體，以獲得與 S17_G66 肽(SEQ ID NO 11), D42-E91 肽(SEQ ID NO 12)，Q67_M116 肽(SEQ ID NO :13)，禾口 N，-mANGPTL3T (SEQ ID NO 7)的結合。該實驗的結果顯示在表2中。表2.結合ANGPTL3肽的抗體 測試的抗體中沒有與S17-G66肽結合的?？贵w1.251. 1,1. 173. 1，1.315. 1，和
1.424. 1 結合 D42-E91 肽和 N，-mANGPTL3T?？贵w 1. 173. 1 還結合 Q67_M116 肽?？贵w 1. 132. 1 和1. 431. 1不結合任何測試的肽或N’-mANGPTL3T，這提示那些抗體結合mANGPTL3的S17和 D24°之間的區(qū)域外的表位。通過抗體捕獲ELISA測試來自組(cohort) 3的8種抗體，以獲得與具有ANGPTL3 的 SP1 區(qū)序列的合成肽(稱為 ANGPTL3 SP1) EPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGL (SEQ ID N0S 9 禾口 10)和全長 HIS-標記的人 ANGPTL3T :MFTIKLLLFIVPLVISSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAML DDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVK匪S LELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHS QIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFH VYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYS FYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGffffffHDECGENNLNGKYNKPRAKSK PERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFEGHHHHHH(SEQ ID NO 4)和全長人 ANGPTL3 (利用 ANGPTL3T，如上所述生成的)(SEQ ID NO 3)的結合。無關的重組蛋白作為對照使用。該實驗的結果顯示在圖9中?？贵w4. 1. 1，4. 4. 1，4. 8. 1，和4. 8. 3結合ANGPTL3 SP1優(yōu)于結合全長ANGPTL3T?？贵w4. 7. 1和4. 9. 1結合ANGPTL3 SP1和ANGPTL3T?？贵w 4.6. 3結合全長ANGPTL3T，但不結合ANGPTL3 SP1。最后，抗體4. 8. 2結合所有測試的蛋白， 包括對照蛋白。測試來自組4的抗體，以獲得與hANGPTL3T和hANGPTL3SPl肽的結合(數(shù)據(jù)未顯 示)。抗體5. 35和5. 50結合這兩種抗原并選擇用于進一步的分析。
2.SP1肽的丙氨酸-分區(qū)誘變法利用SP1肽的丙氨酸-分區(qū)誘變法進一步定義抗體4. 7. 1,4. 8.3,4. 9. 1，5. 35，和 5. 50 的表位。野生型 SP1 肽具有序列 EPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGL (SEQ ID NO 9)。制成 一系列26種突變體，其中將野生型SP1肽的26個氨基酸的每一個改變?yōu)楸彼?，如?中 所示表3:突變SP1肽
48 “突變體7”和“突變體16”將野生型序列中的丙氨酸“替換”為丙氨酸。那些“突 變體”因此具有野生型SP1肽序列并且因此不進行制備。通過抗體捕獲￡1^15六測試抗體4.7. 1,4. 8.3,4. 9. 1,5. 35,和5.50，以獲得與 表3中所示的合成肽(除“突變體7”和“突變體16”肽以外)的結合，如下所示。利用 Flag-SUMO-SPl基因盒，通過點誘變PCR，生成丙氨酸突變體?！癋lag”是flag標記物并且 “SUM0”是小的遍在蛋白相關的調節(jié)物。每種突變體在體外翻譯，并且通過蛋白質印跡，使用 抗-flagMl單克隆抗體標準化濃度。通過ELISA方法確定結合每種突變體的抗體如下。野 生型SP1肽和每種突變體肽分別捕獲在由抗-flag Ml單克隆抗體包被的ELISA板的孔中。 然后，將生物素化的抗體(4. 7. 1,4. 8.3,4. 9. 1,5. 35，或5. 50)加入到孔中。用HRP-綴合的 鏈霉抗生物素蛋白(Pierce #21124)檢測抗體與肽的結合，其是如實施例G中所討論地，利 用TMB顯影的。該實驗的結果顯示在圖14中。在該圖的每幅柱狀圖中，野生型SP1肽命名為“0”， 且位于每幅柱狀圖的最右端。在該實驗中，抗體4. 7. 1和4. 9. 1的表位包括SP1肽的氨基酸 2-6和9 (小鼠ANGPTL3氨基酸33-37和40 ；人ANGPTL3氨基酸33-37和40)。在該實驗中， 抗體5. 35和5. 50的表位包括SP1肽的氨基酸3-6和9-11 (小鼠ANGPTL3氨基酸34-37和 40-42 ；人ANGPTL3氨基酸34-37和40-42)。在該實驗中，抗體4. 8. 3的表位包括SP1肽的 氨基酸 3-6、9、和 11 (小鼠 ANGPTL3 氨基酸 34-37、40、和 42 ；人 ANGPTL3 氨基酸 34-37、40、 和42)。因此，中和性抗體4. 7. 1,4. 8. 3,4. 9. 1,5. 35，和5. 50全部結合ANGPTL3的SP1區(qū) 內的表位，所述表位包括ANGPTL3的氨基酸34-37和40。
I.同種型確定通過標準方法確定了抗體4. 7. 1,4. 8.3,4. 9. 1，5. 35，5. 50，和1.315. 1的同種型。4. 7. 1 和 5. 50 為 IgG2b 同種型；4. 8. 3，1. 315. 1，和 5. 35 為 IgG2a 同種型；且 4. 9. 1 是 IgGl 同種型。IgG2b抗體在血清中的預測半衰期是3-3. 5天。IgG2a抗體在血清中的預測半衰 期是6-12天。IgGl抗體在血清中的預測半衰期是8-11天。
J.體內施用針對ANGPTL3的單克隆抗體將針對ANGPTL3的單克隆抗體施用于小鼠，從而確定所述抗體是否可以有效降低 小鼠中甘油三酯和/或膽固醇的水平。在第一個實驗中，對喂飼標準飲食的8周齡C57白 化小鼠(“喂飼標準飲食”的小鼠)注射處于lOyl/g體重的體積中的30iig單克隆抗體。 在該實驗中測試的抗-ANGPTL3抗體是1.315. 1,4. 7. 1,4. 8.3,4. 9. 1?？?KLH抗體作為對 照施用。對于每種抗體，注射5只小鼠。4天后測量甘油三酯和膽固醇的喂飼和禁食血清水 平。該實驗的結果顯示在圖1和2中。圖1顯示施用1.315. 1，4. 7. 1，4. 8. 3，4. 9. 1， 和抗-KLH的小鼠中4天后的喂飼和禁食甘油三酯水平。當純化抗體4. 7. 1時，收集到2個 峰。將那些峰中的每一個分別施用于小鼠(4. 7. 1-P1和4. 7. 1-P2)。當與施用抗KLH的小 鼠相比較時，全部四種抗ANGPTL3抗體導致處于喂飼狀態(tài)的小鼠中的血清甘油三酯水平在 統(tǒng)計學上顯著降低。然而，在該實驗中，沒有抗ANGPTL3抗體導致處于禁食狀態(tài)的小鼠中的 血清甘油三酯水平降低。事實上，在該實驗中，抗體4. 7. 1導致禁食小鼠中血清甘油三酯水 平增高。圖2顯示施用1.315. 1,4. 7. 1,4. 8.3,4. 9. 1，和抗-KLH的小鼠中4天后的喂飼和 禁食膽固醇水平。如上，在該實驗中測試抗體4. 7. 1的2個分別的峰。此外，當與施用抗KLH 的小鼠相比較時，所有抗體導致處于喂飼狀態(tài)的小鼠中的血清膽固醇水平在統(tǒng)計學上顯著 降低。然而，在該實驗中，沒有抗ANGPTL3抗體導致處于禁食狀態(tài)的小鼠中的血清膽固醇水 平降低。在第二個實驗中，對喂飼標準飲食的8周齡C57白化小鼠注射處于10 u 1/g體重 的體積中的30 iig單克隆抗體。在該實驗中測試抗-ANGPTL3抗體4.8.3?？?KLH抗體 作為對照施用。另外，測試抗ANGPTL4抗體14D12，以進行比較。見，例如PCT公開號TO 2006/074228。對于每種抗體，注射5只小鼠。4天后測量甘油三酯和膽固醇的喂飼和禁食 血清水平。該實驗的結果顯示在圖3和4中。圖3顯示施用抗ANGPTL3抗體4. 8. 3、抗ANGPTL4 抗體14D12、或抗-KLH抗體的小鼠中的喂飼和禁食甘油三酯水平。在該實驗中，4. 8. 3在喂 飼和禁食小鼠中，均以統(tǒng)計學顯著程度降低血清甘油三酯水平。在另一方面，在該實驗中， 抗體14D12僅在禁食小鼠中以統(tǒng)計學顯著程度降低血清甘油三酯水平。圖4顯示施用抗ANGPTL3抗體4. 8. 3，抗ANGPTL4抗體14D12，或抗KLH抗體的小 鼠中的喂飼和禁食血清膽固醇水平。在該實驗中，4. 8. 3在喂飼和禁食小鼠中，均以統(tǒng)計學 顯著程度降低血清膽固醇水平。在另一方面，在該實驗中，抗體14D12僅在禁食小鼠中以統(tǒng) 計學顯著程度降低血清膽固醇水平。在第三個實驗中，對喂飼標準飲食的8周齡C57白化小鼠(“喂飼標準飲食”的小 鼠)注射處于10 u 1/g體重的體積中的30 y g單克隆抗體。在該實驗中測試的抗-ANGPTL3抗體是4. 7. 1，4.8.3，和4.9. 1?？?KLH抗體作為對照施用。另外，測試抗ANGPTL4抗體 14D12，以進行比較。對于每種抗體，注射10只小鼠。4天后測量甘油三酯和膽固醇的喂飼 和禁食血清水平。該實驗的結果顯示在圖5和6中。圖5顯示施用4.7. 1，4.8.3，4.9. 1，14D12，和抗 KLH的小鼠中4天后的喂飼和禁食甘油三酯水平。在該實驗中，抗ANGPTL3抗體4. 8. 3和 4.9. 1導致處于喂飼狀態(tài)的小鼠中的血清甘油三酯水平在統(tǒng)計學上顯著降低?？贵w4. 7. 1 未能減少喂飼狀態(tài)中的甘油三酯可以部分地歸因于它是IgG2b抗體，其在血清中的預測半 衰期僅為3-3. 5天。在該實驗中，抗ANGPTL3抗體4. 7. 1，4. 8. 3，和4. 9. 1，以及抗ANGPTL4 抗體14D12導致處于禁食狀態(tài)的小鼠中的血清甘油三酯水平降低。圖6顯示施用4.7. 1,4. 8.3,4. 9. 1，14D12，和抗KLH的小鼠中4天后的喂飼和禁 食膽固醇水平。在該實驗中，抗ANGPTL3抗體4. 7. 1，4. 8. 3，和4. 9. 1，以及抗ANGPTL4抗 體14D12導致處于喂飼狀態(tài)的小鼠中的血清膽固醇水平的降低。然而，在該實驗中，只有抗 ANGPTL3抗體4. 9. 1和抗ANGPTL4抗體14D12導致處于禁食狀態(tài)的小鼠中的血清膽固醇水 平的降低。在第四個實驗中，對喂飼標準飲食的8周齡C57白化小鼠(“喂飼標準飲食”的小 鼠)注射處于10 u 1/g體重的體積中的30 y g單克隆抗體。在該實驗中測試的抗-ANGPTL3 抗體是 1. 125. 1,1. 132. 1,1. 173. 2，1.315. 1，1.424. 1，和 1.431. 1。抗-KLH 抗體作為對照 施用。每組中存在5只小鼠。4天后和8天后測量甘油三酯的喂飼和禁食血清水平。該實驗的結果顯示在圖7中。在該實驗中，1. 315. 1在4天和8天后均以統(tǒng)計學顯 著程度減少血清甘油三酯。在第五個實驗中，對喂飼標準飲食的8-10周齡C57白化小鼠(“喂飼標準飲食”的 小鼠)注射處于10111/^體重的體積中的011§，311§，1011§，3011§，或90118單克隆抗體。 在該實驗中測試的抗-ANGPTL3抗體是5. 35和5. 50。對于處于各種劑量的各種抗體，注射 5只小鼠。4天后和7天后測量甘油三酯和膽固醇的喂飼血清水平。該實驗的結果顯示在圖15和16中。圖15顯示注射了不同量的抗體5. 35和5. 50 的小鼠中4天和7天后的血清甘油三酯。在該實驗中，抗體5. 35和5. 50均在4天后減少 注射了 30mg/kg或90mg/kg抗體的小鼠中的血清甘油三酯。在該實驗中，抗體5. 50還在4 天后減少注射了 3mg/kg或10mg/kg抗體的小鼠中的血清甘油三酯。在該實驗中，7天后，在 注射了 10mg/kg，30mg/kg，或90mg/kg抗體5. 50的小鼠中的血清甘油三酯仍減少，而只有注 射了 90mg/kg抗體5. 35的小鼠在7天后繼續(xù)具有減少的血清甘油三酯。圖16顯示注射不同量的抗體5. 35和5. 50的小鼠中的血清膽固醇水平。在該實 驗中，注射了 30mg/kg 或 90mg/kg 的抗體 5. 35，或 10mg/kg，30mg/kg，或 90mg/kg 抗體 5. 50 的小鼠在4天后具有降低的血清膽固醇水平。注射了 90mg/kg抗體5. 35或90mg/kg抗體 5. 50的小鼠在7天后繼續(xù)具有降低的血清膽固醇水平。
K.在ApoE敲除小鼠中施用針對ANGPTL3的單克隆抗體已經發(fā)現(xiàn)ApoE敲除小鼠患自發(fā)性高膽固醇血癥。見例如，Piedrahita等人(1992) 美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 89 (10) :4471_5 ；和 Zhang 等人(1992)科 學(Science) 258 (5081) :468_71。為了確定某些抗ANGPTL3的單克隆抗體是否可以降低
52ApoE敲除小鼠中血清膽固醇和甘油三酯水平，進行下面的實驗。用30mg/kg抗KLH，30mg/ kg抗體5. 35，或30mg/kg抗體5. 50腹膜內注射3組每組8只14周齡的ApoE敲除小鼠 (Taconic 動物模型(Taconic Aminal Models)，品系 B6. 129P2_Apoetml Unc Nil)。每只小鼠 在第0天接受一次注射，并在第4天接受一次注射。所有小鼠喂飼標準飲食(“喂飼標準飲 食”)。在第0天(注射前)、第4天、第8天、和第12天，在每只小鼠中測量喂飼血清甘油 三酯水平和喂飼膽固醇水平。該實驗的結果顯示在圖19中?？贵w5. 35在第4天時降低血清甘油三酯水平36%。 該降低持續(xù)到第8天，但在第12天時消失。抗體5. 50在第4天時降低血清甘油三酯水平 60%。該降低持續(xù)到第8天，且直到第12天，剩余的血清甘油三酯顯著減少。在該實驗中，抗體5. 35降低血清膽固醇水平17 %，盡管該降低直到第8天才完成， 且該降低在第12天時略微減小?？贵w5. 50在第4天時降低血清膽固醇水平，并在直到第 8天和第12天時繼續(xù)降低血清膽固醇水平，直到在該實驗結束時總共降低30%。那些結果顯示抗體5. 35和5. 50在ApoE小鼠中降低血清甘油三酯水平和血清膽 固醇水平。在該實驗中，抗體5. 50更有效降低血清甘油三酯水平和血清膽固醇水平，這可 能歸因于該抗體較長的半衰期。
L.體外施用針對ANGPTL3的單克隆抗體利用體外測定測試小鼠單克隆抗ANGPTL3對LPL活性的影響。為了獲得LPL-條 件培養(yǎng)基，用LPL表達載體轉染HEK293F細胞(FreeStyle 293表達系統(tǒng))(Invitrogen， Carlsbad，CA)，所述 LPL 表達載體在 IRES puro 質粒(Clontech，Mountain View, CA)中包 括編碼具有C-末端FLAG標記物的LPL的DNA。轉化的細胞生長在選擇培養(yǎng)基(增補了 IX青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺 (Invitrogen, Carlsbad, CA)和 2. 4 u g/ml 嘌呤霉素的 FreeStyle 293 系統(tǒng)培養(yǎng)基(GIBC0 BRL,Gaithersburg,MD))中。計數(shù)并通過離心沉淀細胞。將由此生成的細胞沉淀以1 X 106 細胞/ml的濃度，重新混懸在包含1XGPS，無嘌呤霉素的新鮮FreeStyle 293培養(yǎng)基中。 48小時溫育后，由細胞收獲包含LPL的條件培養(yǎng)基，將其分配在5ml的等分試樣中，并且然 后冷凍在-70°C直至使用。通過將200mg/dL Intralipid (Pharmacia & Upjohn)，12mM 葡萄糖，5 單位 /ml 肝 素和200 yl 5%小鼠血清(作為Apo C-II的來源)加入到條件培養(yǎng)基的等分試樣中，測 定條件培養(yǎng)基中的LPL活性。然后在37°C溫育該培養(yǎng)基。在2小時，4小時，和6小時收獲 樣品，并立即冷凍在-70°C，直至進行測定。通過利用未稀釋的條件培養(yǎng)基和1 2，1 4， 1 8，1 16，和1 32的稀釋物測量FFA水平，測定LPL條件培養(yǎng)基的LPL活性。利用 ffako FFA 試劑盒(美國 ffako 化學公司(ffako Chemical USA, Inc.)，Richmond, VA)，在 2 小 時，4小時和6小時確定FFA水平。還確定單克隆抗體在關于LPL活性的體外測定中中和ANGPTL3活性的能力。關于 LPL活性體外測定利用Wako FFA試劑盒(美國Wako化學公司(Wako Chemical USA，Inc.)， Richmond, VA)測量FFA水平。在存在25nM小鼠ANGPTL3和5種單克隆抗體(抗體4. 9. 1， 4. 8. 3，1.315. 1，4. 7. 1，和 1. 173.2)中每一種的四種濃度(0. 8 ii g/ml，2 ii g/ml，10 ii g/ml 和50 y g/ml)的條件下，進行獨立的LPL活性測定。結果顯示在圖12中。對于每種抗體，中和活性通過抗體增加LPL活性，即“拯救” LPL免受ANGPTL3抑制的能力證明。將拯救活 性確定為存在ANGPTL3和抗ANGPTL3抗體條件下的LPL活性相對于僅存在ANGPTL3條件下 LPL活性的百分比增加。四種抗體(4.9. 1，4.8.3，1.315. 1和4. 7. 1)根據(jù)它們的濃度，能夠 拯救LPL活性超過50%。該結果說明那些抗體能夠通過中和ANGPTL3活性拯救LPL活性。 相反，抗體1. 173. 2不證明顯著拯救LPL活性，并由此起內部陰性對照的作用。
M.針對ANGPTL3的單克隆抗體的結合親和性利用BIACORE 3000系統(tǒng)(GE 健康護理(GE Healthcare)，Uppsala，瑞典)確定 抗體4. 7. 1，4. 8. 3，和4. 9. 1對于N，_hANGPTL3T和hANGPTL3T的親合性常數(shù)和抗體4. 7. 1， 4. 9. 1,5. 35，和5. 50對SP1肽的親合性常數(shù)。BIACORE 3000是用于利用表面等離子體 共振技術檢測和量化蛋白質-蛋白質相互作用的實時生物分子分析系統(tǒng)。按照生產商關于 BIACORE 3000的說明確定下列親合性常數(shù)平衡解離常數(shù)(Kd)，締合率常數(shù)(k。n)，和解 離率常數(shù)(k。ff)。分別確定4. 7. 1，4. 8. 3，和 4. 9. 1 抗體對于 N，_hANGPTL3T 和 hANGPTL3T 蛋白抗原 的親合常數(shù)，如下。用蛋白質抗原包被BIACORE CM5芯片表面，這是通過利用胺偶聯(lián)試劑 盒(Amine Coupling Kit)(產品號BR-1000_50，GE 健康護理(GE Healthcare), Uppsala 瑞典)使10 ii g/ml N，-hANGPTL3T或20 y g/ml hANGPTL3T偶聯(lián)于該芯片表面實現(xiàn)的。 通過第一次以30 iU/min的流速，注射抗體的Fab片段(利用Fab制備試劑盒(產品號 44885，Pierce, Rockford, IL 61105)，按照生產商的說明生成的)進入具有包被的芯片 表面的BIACORE 3000系統(tǒng)2分鐘，形成締合相和解離相，其用于確定k。n和k。ff常數(shù)。 測試的 Fab 片段的濃度是 200nM，100nM，50nM，25nM，12. 5nM，6. 25nM, 3. 125nM, 1. 5625nM, 0.78125nM，和OnM。注射階段用于確定締合率常數(shù)，或k。n。每次注射后，通過使BIACORE HBS-EP 緩沖液(產品號:BR-1001-88，GE 健康護理(GE Healthcare)，Uppsala 瑞典)流過 BIACORE CM5芯片表面上的抗原-Fab復合物5分鐘，從蛋白質抗原中解離Fab片段。該解 離相用于確定解離率常數(shù)，或k。ff。在下一次注射前，通過以lOOiU/min的流速注射10mM HC1 30秒，復原BIACORE芯片表面。通過從4. 7. 1，4. 8. 3，和4. 9. 1表面的Fab-特異性結 合特征中減去參考表面(用相等水平的無關蛋白質固定的)的非特異性結合特征，生成用 于數(shù)據(jù)分析的BIACORE傳感圖。通過利用BIA評估軟件版本3. 0 (BIAevalution Software Version 3.0) (GE健康護理(GE Healthcare)，Uppsala瑞典)，使締合和解離數(shù)據(jù)組完全擬 合具有質量轉移校正的1 1的結合模型，來確定親和性參數(shù)，包括KD，k。n，和k。ff值。分別確定4. 7. 1,4. 9. 1,5. 35，和5. 50抗體對于SP1肽抗原的親和性常數(shù)，如下。 用抗小鼠IgG F。包被BIACORE CM5芯片表面，這是通過利用胺偶聯(lián)試劑盒(Amine Coupling Kit)(產品號:BR-1000-50, GE 健康護理(GE Healthcare)，Uppsala 瑞典)使 90 ii g/ml 免 疫純山羊抗小鼠IgG F。(產品號=31170,Pierce,Rockford, IL 61105)偶聯(lián)于該芯片表面實 現(xiàn)的。然后，通過以10 u 1/min的流速注射抗體30秒，在抗小鼠IgG FcBIAC0RE芯片表面上 捕獲抗體。通過第一次以30 iU/min的流速，注射SP1肽進入具有抗體-包被的芯片表面的 BIACORE 3000系統(tǒng)2分鐘，來形成締合和解離相，其用于確定k。n* k。ff常數(shù)。測試的 SP1 肽的濃度是 200nM，100nM, 50nM, 25nM, 12. 5nM，6. 25nM, 3. 125nM, 1. 5625nM，0. 78125nM, 和OnM。注射階段用于確定締合率常數(shù)，或k。n。每次注射后，通過使BIACORE HBS-EP緩沖液(產品號BR-1001-88，GE健康護理(GEHealthcare)，Uppsala瑞典)流過BIACORE CM5 芯片 表面上的肽_抗體復合物5分鐘，從抗體中解離SP1肽。該解離階段用于確定解離率常數(shù)， 或k。ff。在下一次注射前，通過以100 u 1/min的流速注射10mM HC1 30秒，復原BIACORE芯 片表面。通過從4. 7. 1,4. 9. 1,5. 35，和5. 50表面的抗原-特異性結合特征中減去參考表面 (用相等水平的無關小鼠IgG捕獲的)的非特異性結合特征，生成用于數(shù)據(jù)分析的BIACORE 傳感圖。通過利用BIA評估軟件版本3. 0(BIAevalution Software Version 3. 0) (GE健康 護理(GE Healthcare)，Uppsala瑞典)，使締合和解離數(shù)據(jù)組完全擬合具有質量轉移校正 的1 1的結合模型，來確定親和性參數(shù)，包括KD，k。n，和k。ff值。該實驗的結果顯示在表4、5、和6中。一式兩份地測試每種抗體，并顯示關于每個 實驗的結果。表4.抗體對N，-hANGPTL3T的親和性 表5.抗體對hANGPTL3T的親和性 表6.抗體對SP1肽的親和性
N. 一些針對ANGPTL3的單克隆抗體的體內藥物代謝動力學為了確定這些抗體(抗體4. 7. 1,4. 8. 3，和4. 9. 1)在體內的藥物代謝動力學，以 30mg/kg的劑量，分別將各種抗體通過腹膜內注射施用于四只不同的小鼠。在圖13中顯示 的不同時間點時，對小鼠取血，并獲得血清。通過將由抗體捕獲ELISA確定的滴度和利用在 抗體捕獲ELISA中注射到小鼠中的相同抗體的系列稀釋物構建的標準曲線進行比較，確定 血清中存在的抗ANGPTL3抗體的水平?？贵w捕獲ELISA如實施例G中所述實施。結果可見 圖13中。為了確定抗體5. 35和5. 50在體內的藥物代謝動力學，在實施例J的第5個實驗 中所述的小鼠中，在注射后4天、7天、和12天確定抗體水平。血清中存在的抗ANGPTL3抗 體的水平通過利用重組人ANGPTL3-包被的板的抗體捕獲ELISA確定。血清中的抗體濃度 通過與利用在抗體捕獲ELISA中注射到小鼠中的相同抗體的系列稀釋物構建的標準曲線 相比較確定。ELISA如實施例G中所述實施。該實驗的結果顯示在圖17中。在該實驗中，抗體5. 50具有比抗體5. 35更長的體 內半衰期。該較長的半衰期與實施例J中所討論的實驗中抗體5. 50與抗體5. 35相比增高 的體內功效有關，并且如圖15和16中所示。單次30mg/kg抗體注射后，抗體4. 7. 1,4. 9. 1,5. 35，和5. 50在C57小鼠中的藥物 代謝動力學顯示在圖18中?？贵w濃度通過抗體捕獲ELISA確定，如實施例G中所述實施。 血清中的抗體濃度通過與利用在抗體捕獲ELISA中注射到小鼠中的相同抗體的系列稀釋 物構建的標準曲線確定。在該實驗中，抗體5. 50和4. 9.1具有大致相同的半衰期。另外， 抗體5. 50和4. 9. 1的半衰期比抗體5. 35和4. 7. 1的半衰期更長，抗體5. 35和4. 7. 1的半 衰期在該實驗中彼此大致相同。此外，在該實驗中，抗體5. 35和5. 50的Cmax大致相同，比 抗體4. 9. 1的Cmax更大，其又高于抗體4. 7. 1的Cmax。
0. 一些針對ANGPTL3的單克隆抗體的序列確定了抗體4. 7. 1,4. 8.3,4. 9. 1，5. 35，和5. 50的重鏈和輕鏈可變區(qū)?？贵w4. 7. 1 的重鏈可變區(qū)顯示在SEQ ID NO 19 (有N-末端信號肽)中和SEQ ID N0:20(無N-末端信 號肽)中?？贵w4. 7. 1的輕鏈可變區(qū)顯示在SEQ ID NO 27 (有N-末端信號肽)中和SEQ ID NO :28(無N-末端信號肽)中?？贵w4. 8. 3的重鏈可變區(qū)顯示在SEQ ID N0:21(有 N_末端信號肽)中和SEQ ID NO 22 (無N-末端信號肽)中?？贵w4. 8. 3的輕鏈可變區(qū)顯示在SEQ ID NO :29(有N-末端信號肽)中和SEQ ID NO :30 (無N-末端信號肽)中?？?體4. 9. 1的重鏈可變區(qū)顯示在SEQ ID NO :23 (有N-末端信號肽)中和SEQ ID NO :24 (無 N-末端信號肽)中?？贵w4. 9. 1的輕鏈可變區(qū)顯示在SEQ ID N0:31(有N-末端信號肽) 中和SEQ ID NO :32(無N-末端信號肽)中?？贵w5. 35的重鏈可變區(qū)顯示在SEQ ID NO: 63 (有N-末端信號肽)中和SEQ ID N0:64(無N-末端信號肽)中?？贵w5. 35的輕鏈可 變區(qū)顯示在SEQ ID NO :67(有N-末端信號肽)中和SEQ IDN0 :68 (無N-末端信號肽)中。 抗體5. 50的重鏈可變區(qū)顯示在SEQ ID NO :65(有N-末端信號肽)中和SEQ ID N0:66(無 N_末端信號肽)中?？贵w5. 50的輕鏈可變區(qū)顯示在SEQ ID NO :69 (有N-末端信號肽)中 和SEQ IDN0 :70 (無N-末端信號肽)中。抗體4. 7. 1，4. 8. 3，和4. 9. 1的重鏈可變區(qū)的對比顯示在圖10中。還顯示了重鏈 可變區(qū)的共有序列(SEQ ID NO :25)。無信號肽的重鏈可變區(qū)的共有序列顯示在表7中(SEQ ID NO 26)。抗體4. 7. 1，4. 8. 3，和4. 9. 1的輕鏈可變區(qū)的對比顯示在圖11中。還顯示了輕鏈 可變區(qū)的共有序列(SEQ ID NO :33)。無信號肽的輕鏈可變區(qū)的共有序列顯示在表7中(SEQ ID NO 34)。
P.人源化一些針對ANGPTL3的單克隆抗體下列流程描述抗體4. 7. 1的人源化。抗體4. 8. 3，4. 9. 1，5. 35，5. 50，和1.315. 1 可以通過相同的方法人源化。抗體4. 7. 1的人源化模式稱為“hu4. 7. 1。”抗體4. 8.3， 4. 9. 1,5. 35，5. 50，和 1. 315. 1 的人源化模式分別稱為 “hu4. 8. 3”、“hu4. 9. I”、“hu5. 35”、 "hu5. 50 Hi. 315. 1”。每種重鏈和輕鏈的人構架區(qū)基于其與抗體4. 7. 1中存在的小鼠構架區(qū)的同源性 選自一組家族-特異性共有人構架區(qū)中。選擇的人構架區(qū)的特異性氨基酸位置是多樣的， 從而反映選擇的V-基因家族中構架的多樣性。將編碼抗體4. 7. 1的重鏈的CDR1、CDR2、和 CDR3的多核苷酸克隆到編碼重鏈的多樣化人構架區(qū)的多核苷酸文庫中。由此產生的文庫 稱為人源化4. 7. 1重鏈可變區(qū)文庫。將編碼抗體4. 7. 1的輕鏈的⑶R1、⑶R2、和⑶R3的多 核苷酸克隆到編碼輕鏈的多樣化人構架區(qū)的多核苷酸文庫中。由此產生的文庫稱為人源化 4. 7. 1輕鏈可變區(qū)文庫。將人源化4. 7. 1重鏈可變區(qū)文庫和人源化4. 7. 1輕鏈可變區(qū)文庫 克隆到處于單鏈Fv(SCFv)形式的噬菌體展示載體中。然后，針對靶抗原，例如，人ANGPTL3，通過2_3輪結合來，篩選scFv噬菌體展示文 庫以選擇高親和性scFv。然后，以可溶形式表達scFv，并測試靶親和性和/或體外中和性 特性。然后，將針對合適的親和性和潛力選擇的scFv的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)表達為全 長IgG或ScFv-CL-PEG(CL是人恒定輕鏈)，并測試體內活性，例如，小鼠中血清甘油三酯和 /或血清膽固醇的減少。PEG通過半胱氨酸附著在CL基團上。
Q. 一些針對ANGPTL3的單克隆抗體的親和力成熟下列流程描述抗體4.7. 1的親和力成熟。抗體4.8.3，4.9.1，5.35，5.50，和 1. 315. 1的親和力成熟可以利用相同的方法執(zhí)行。類似地，hu4. 7. 1，hu4. 8. 3，hu4. 9. 1， hu5. 35，hu5. 50，和hul. 315. 1的親和力成熟可以利用相同的方法執(zhí)行。
例如，利用傾向差錯PCR，對編碼抗體4. 7. 1的重鏈的多核苷酸進行隨機誘變。利 用GeneMorph II隨機誘變試劑盒(Stratagene，Lajolla, CA)，按照生產商的說明，執(zhí)行 傾向差錯PCR。例如，利用傾向差錯PCR，也對編碼抗體4. 7. 1的輕鏈的多核苷酸進行隨機誘變。 利用GeneMorph II隨機誘變試劑盒(Stratagene，Lajolla, CA)，按照生產商的說明，執(zhí) 行傾向差錯PCR。將隨機突變的重鏈多核苷酸和隨機突變的輕鏈多核苷酸克隆到處于單鏈 Fv(scFv)形式的噬菌體展示載體中。然后，針對靶抗原，例如，人ANGPTL3，通過2_3輪結合來，篩選scFv噬菌體展示文 庫以選擇高親和性scFv。然后，以可溶形式表達scFv，并測試靶親和性和/或體外中和性 潛力。然后，將針對合適的親和性和潛力選擇的scFv的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)表達為全 長IgG或scFv-CL-PEG，并測試體內活性，例如，小鼠中血清甘油三酯和/或血清膽固醇的減 少。選擇的親和力成熟抗體如果不是已經人源化的，則如實施例P中所述地對其進行 人源化。雖然以上實施例特別描述一些針對小鼠ANGPTL3的中和性單克隆抗體以及那些 抗體在小鼠中的體內作用，本領域中的技術人員應該容易公認可以生成針對人ANGPTL3的 中和性單克隆抗體，并且所述抗體應該在人中具有相同或相似的體內作用。該結論部分地 基于這樣的觀察，即人和小鼠ANGPTL3是進化保守蛋白，其共享結構和功能特性。Conklin， D.，等(1999)基因組(Genomics)62 :477_482。例如，人和小鼠ANGPTL3共享約76%的氨基 酸序列同一性。人和小鼠ANGPTL3還共享共同的次級結構元件，例如，N-末端卷曲螺旋結構 域和C-末端血纖蛋白原樣結構域。此外，人ANGPTL3與小鼠ANGPTL3具有相似的功能，這 是通過人ANGPTL3在小鼠中過表達時提高血清脂質水平的能力證明的。Koishi等(2002) 自然遺傳學(Nat. Genet.) 30 (2) :151_157。本領域中通常公認小鼠常規(guī)用作利用中和性抗體治療多種病癥和疾病的模型。例 如，中和性抗體已經被用于在小鼠中治療朊病毒疾病、糖尿病、和炎癥。參見，例如，White等 (2003)自然(Nature) 422 :80_83 ；Cailleau 等(1997)糖尿病(Diabetes) 46 :937_940 ；和 Lochner等(2002)免疫學方法雜志(J. Immunol. Methods) 259 :149_157。在后者的研究中， 中和小鼠IL-18的單克隆抗體在IL-18缺陷性小鼠中形成。那些小鼠單克隆抗體能夠在野 生型小鼠中抑制脂多糖-誘導的炎性應答。因此，本領域中的技術人員應該斷定前述實施 例支持針對人ANGPTL3的中和性單克隆抗體在治療人醫(yī)學病癥中的用途。表7 序列表
(
權利要求
結合ANGPTL3并中和ANGPTL3的至少一種活性的單克隆抗體。
2.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是小鼠單克隆抗體。
3.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是人源化的單克隆抗體。
4.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是人單克隆抗體。
5.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體降低體內至少一種血清脂質水平。
6.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體結合具有SEQIDN0:59的氨基酸序 列的ANGPTL3的表位。
7.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體結合具有SEQIDN0:60的氨基酸序 列的ANGPTL3的表位。
8.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體結合具有SEQIDN0 9的氨基酸序 列的ANGPTL3的表位。
9.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體結合具有SEQIDN0:10的氨基酸序 列的ANGPTL3的表位。
10.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包括包含SEQIDN0:20的氨基酸 序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO :28的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
11.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包括包含SEQIDN0:22的氨基酸 序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
12.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包括包含SEQIDN0:24的氨基酸 序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO :32的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
13.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包括包含SEQIDN0 64的氨基酸 序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO 68的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
14.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包括包含SEQIDN0 66的氨基酸 序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO :70的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
15.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體與抗體4.7. 1特異性結合相同的表位。
16.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體與抗體4.8. 3特異性結合相同的表位。
17.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體與抗體4.9. 1特異性結合相同的表位。
18.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體與抗體1.315.1特異性結合相同的 表位。
19.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體與抗體5.35特異性結合相同的表位。
20.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體與抗體5.50特異性結合相同的表位。
21.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是抗體片段。
22.權利要求21的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是scFv片段。
23.權利要求21的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是Fab片段。
24.權利要求21的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是F(ab’)2片段。
25.權利要求21的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是Fab’片段。
26.特異性結合ANGPTL3的單克隆抗體，其包括重鏈和輕鏈，其中所述重鏈包括a)如 SEQIDNOs19-26和63-66中任一個所示氨基■浚序列；b)如 SEQIDNOs35，36，和37所示的至少--個氨基■1序列；c)如 SEQIDNOs38，39，和40所示的至少--個氨基■1序列；d)如 SEQIDNOs:41，42，和43所示的至少--個氨基■1序列；e)如 SEQIDNOs:53，54，和55所示的至少--個氨基■1序列；f)如 SEQIDNOs:71，72，和73所示的至少--個氨基■1序列；或g)如 SEQIDNOs:74，75，和76所示的至少--個氨基■1序列；其中所述抗體中和ANGPTL3的至少一種活性。
27.權利要求26的單克隆抗體，其中所述重鏈包括如SEQID NO :35中所示的⑶R1，如 SEQ ID NO 36 所示的 CDR2，和如 SEQ ID NO 37 所示的 CDR3。
28.權利要求26的單克隆抗體，其中所述重鏈包括如SEQID NO :38所示的⑶R1，如 SEQ ID NO 39 所示的 CDR2，和如 SEQ ID NO 40 所示的 CDR3。
29.權利要求26的單克隆抗體，其中所述重鏈包括如SEQID NO :41所示的⑶R1，如 SEQ ID NO 42 所示的 CDR2，和如 SEQ ID NO 43 所示的 CDR3。
30.權利要求26的單克隆抗體，其中所述重鏈包括如SEQID NO :53所示的⑶R1，如 SEQ ID NO 54 所示的 CDR2，和如 SEQ ID NO 55 所示的 CDR3。
31.權利要求26的單克隆抗體，其中所述重鏈包括如SEQID N0:71所示的⑶R1，如 SEQ ID NO 72 所示的 CDR2，和如 SEQ ID NO 73 所示的 CDR3。
32.權利要求26的單克隆抗體，其中所述重鏈包括如SEQID NO 74所示的⑶R1，如 SEQ ID NO 75 所示的 CDR2，和如 SEQ ID NO 76 所示的 CDR3。
33.權利要求26的單克隆抗體，其中所述輕鏈包括a)如SEQID NOs :27_34和67-70中任一個所示氨基酸序列；b)如SEQID NOs :44，45，禾口 46所示的至少-c)如SEQID NOs :47，48，禾口 49所示的至少-d)如SEQID NOs :50，51，和52所示的至少-e)如SEQID NOs :56，57，禾口 58所示的至少-f)如SEQID NOs :77，78，和79所示的至少一個氨基酸序列；或g)如SEQID NOs :80，81，和82所示的至少-
34.權利要求33的單克隆抗體，其中所述重鏈包括如SEQID NO :35所示的⑶R1，如SEQ ID NO :36所示的CDR2，和如SEQ ID NO 37所示的CDR3 ；且所述輕鏈包括如SEQ ID NO 44 所示的CDR1，如SEQ IDN0 45所示的CDR2，和如SEQ ID NO 46所示的CDR3。
35.權利要求33的單克隆抗體，其中所述重鏈包括如SEQID NO :38所示的⑶R1，如SEQ ID NO :39所示的CDR2，和如SEQ ID NO :40所示的CDR3 ；且所述輕鏈包括如SEQ ID NO 47 中所示的CDR1，如SEQ IDN0 48所示的CDR2，和如SEQ ID NO 49所示的CDR3。
36.權利要求33的單克隆抗體，其中所述重鏈包括如SEQID NO 41中所示的⑶R1， 如SEQ ID NO :42所示的CDR2，和如SEQ ID NO :43所示的CDR3 ；且所述輕鏈包括如SEQ ID NO 50 中所示的 CDR1，如 SEQID NO 51 所示的 CDR2，和如 SEQ ID NO 52 所示的 CDR3。-個氨基酸序列 -個氨基酸序列 -個氨基酸序列 -個氨基酸序列 -個氨基酸序列 -個氨基酸序列
37.權利要求33的單克隆抗體，其中所述重鏈包括如SEQID NO :53所示的CDR1，如SEQ ID NO :54所示的CDR2，和如SEQ ID NO 55所示的CDR3 ；且所述輕鏈包括如SEQ ID NO 56 所示的CDR1，如SEQ IDN0 57所示的CDR2，和如SEQ ID NO 58所示的CDR3。
38.權利要求33的單克隆抗體，其中所述重鏈包括如SEQID NO :71所示的⑶R1，如SEQ ID NO 72所示的CDR2，和如SEQ ID NO 73所示的CDR3 ；且所述輕鏈包括如SEQ ID NO 77 所示的CDR1，如SEQ IDN0 78所示的CDR2，和如SEQ ID NO 79所示的CDR3。
39.權利要求33的單克隆抗體，其中所述重鏈包括如SEQID NO :74所示的CDR1，如SEQ ID NO 75所示的CDR2，和如SEQ ID NO 76所示的CDR3 ；且所述輕鏈包括如SEQ ID NO 80 所示的CDR1，如SEQ IDN0 81所示的CDR2，和如SEQ ID NO 82所示的CDR3。
40.特異性結合ANGPTL3的單克隆抗體，其包括重鏈和輕鏈，其中所述輕鏈包括a)如SEQID NOs :27_34和67-70中任一個所示氨基酸序列；b)如SEQID NOs :44，45，和46所示的至少一個氨基酸序列；c)如SEQID NOs :47，48，和49所示的至少一個氨基酸序列；d)如SEQID NOs :50，51，或52所示的至少一個氨基酸序列；e)如SEQID NOs :56，57，和58所示的至少一個氨基酸序列；f)如SEQID NOs :77，78，和79所示的至少一個氨基酸序列；或g)如SEQID NOs :80，81，和82所示的至少一個氨基酸序列；其中所述抗體中和ANGPTL3的至少一種活性。
41.權利要求40的單克隆抗體，其中所述輕鏈包括如SEQID NO 44所示的⑶R1，如 SEQ ID NO 45 所示的 CDR2，和如 SEQ ID NO 46 所示的 CDR3。
42.權利要求40的單克隆抗體，其中所述輕鏈包括如SEQID NO :47所示的⑶R1，如 SEQ ID NO 48 所示的 CDR2，和如 SEQ ID NO 49 所示的 CDR3。
43.權利要求40的單克隆抗體，其中所述輕鏈包括如SEQID NO :50中所示的⑶R1，如 SEQ ID NO 51 所示的 CDR2，和如 SEQ ID NO 52 所示的 CDR3。
44.權利要求40的單克隆抗體，其中所述輕鏈包括如SEQ SEQ ID NO 57 所示的 CDR2，和如 SEQ ID NO 58 所示的 CDR3。
45.權利要求40的單克隆抗體，其中所述輕鏈包括如SEQ SEQ ID NO 78 所示的 CDR2，和如 SEQ ID NO 79 所示的 CDR3。
46.權利要求40的單克隆抗體，其中所述輕鏈包括如SEQ SEQ ID NO 81 所示的 CDR2，和如 SEQ ID NO 82 所示的 CDR3。
47.權利要求26、33、和40中任一項的單克隆抗體，其中所述抗體是小鼠單克隆抗體。
48.權利要求26、33、和40中任一項的單克隆抗體，其中所述抗體是人源化單克隆抗體。
49.權利要求26、33、和40中任一項的單克隆抗體，其中所述抗體是人單克隆抗體。
50.權利要求26、33、和40中任一項的單克隆抗體，其中所述抗體降低體內至少一種血 清脂質水平。
51.權利要求26、33、和40中任一項的單克隆抗體，其中所述抗體結合具有SEQID NO 59的氨基酸序列的ANGPTL3的表位。
52.權利要求26、33、和40中任一項的單克隆抗體，其中所述抗體結合具有SEQID NOID NO :56所示的CDR1，如 ID NO :77所示的CDR1，如 ID NO :80所示的CDR1，如60的氨基酸序列的ANGPTL3的表位。
53.權利要求26、33、和40中任一項的單克隆抗體，其中所述抗體結合具有SEQID NO 9的氨基酸序列的ANGPTL3的表位。
54.權利要求26、33、和40中任一項的單克隆抗體，其中所述抗體結合具有SEQID NO 10的氨基酸序列的ANGPTL3的表位。
55.權利要求26、33、和40中任一項的單克隆抗體，其中所述抗體與抗體4.7. 1特異性 結合相同的表位。
56.權利要求26、33、和40中任一項的單克隆抗體，其中所述抗體與抗體4.8. 3特異性 結合相同的表位。
57.權利要求26、33、和40中任一項的單克隆抗體，其中所述抗體與抗體4.9. 1特異性 結合相同的表位。
58.權利要求26、33、和40中任一項的單克隆抗體，其中所述抗體與抗體1.315. 1特異 性結合相同的表位。
59.權利要求26、33、和40中任一項的單克隆抗體，其中所述抗體與抗體5.35特異性 結合相同的表位。
60.權利要求26、33、和40中任一項的單克隆抗體，其中所述抗體與抗體5.50特異性 結合相同的表位。
61.權利要求26、33、和40中任一項的單克隆抗體，其中所述抗體是抗體片段。
62.權利要求61的單克隆抗體，其中所述抗體片段是scFv片段、Fab片段、F(ab’)2片 段、或Fab，片段。
63.結合ANGPTL3并中和ANGPTL3的至少一種活性的單克隆抗體，其中所述抗體對具 有SEQ ID NO :9的氨基酸序列的肽的親和性至少是所述抗體對具有SEQ ID NO :84,SEQ ID NO :85，SEQ ID NO :86，SEQ ID NO :87，SEQ ID NO :88，SEQ ID NO :90，和 SEQ ID NO 92 中 任一氨基酸序列的肽的親和性的至少3倍。
64.權利要求63的單克隆抗體，其中所述抗體對具有SEQID NO :9的氨基酸序列的肽 的親和性至少是所述抗體對 SEQ ID NO :85，SEQ IDNO :86，SEQ ID NO :87，SEQ ID NO :88， 和SEQ ID NO 90中每一種的親和性的至少3倍。
65.結合ANGPTL3并中和ANGPTL3的至少一種活性的單克隆抗體，其中所述抗體以小于 50nM的Kd結合具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列的肽。
66.權利要求65的單克隆抗體，其中所述抗體以小于30nM的Kd結合具有SEQID NO 9的氨基酸序列的肽。
67.權利要求65的單克隆抗體，其中所述抗體以小于IOnM的Kd結合具有SEQID NO 9的氨基酸序列的肽。
68.權利要求65的單克隆抗體，其中所述抗體以小于5nM的Kd結合具有SEQID NO 9 的氨基酸序列的肽。
69.包括權利要求1-68中任一項的單克隆抗體的藥物組合物。
70.治療脂質代謝病癥的方法，其包括對患者施用有效量的權利要求69的藥物組合物。
71.降低一種或多種血清脂質水平的方法，其包括對患者施用有效量的權利要求69的藥物組合物。
72.治療高甘油三酯血癥的方法，其包括對患者施用有效量的權利要求69的藥物組合物。
73.治療高膽固醇血癥的方法，其包括對患者施用有效量的權利要求69的藥物組合物。
74.治療肥胖癥的方法，其包括對患者施用有效量的權利要求69的藥物組合物。
75.治療糖尿病的方法，其包括對患者施用有效量的權利要求69的藥物組合物。
76.治療缺血性心臟病的方法，其包括對患者施用有效量的權利要求69的藥物組合物。
77.治療代謝綜合征的方法，其包括對患者施用有效量的權利要求69的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了特異結合ANGPTL3的單克隆抗體。本發(fā)明提供了中和ANGPTL3的至少一種活性的單克隆抗體。本發(fā)明還提供了使用中和的單克隆抗體治療脂質代謝疾病的方法。
文檔編號C07K16/00GK101855241SQ200780051105
公開日2010年10月6日 申請日期2007年12月6日 優(yōu)先權日2006年12月8日
發(fā)明者烏爾維·德賽, 馮曉, 戴維·鮑威爾, 李宜疆, 格雷戈里·蘭德斯, 洪錫柱 申請人:萊克康制藥公司