專利名稱：鱘科魚類卵黃磷蛋白的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鱘科魚類卵黃磷蛋白的制備方法及通過使用卵黃磷蛋白鑒別鱘科魚類雌雄的方法。
背景技術(shù)：
鱘魚的“魚籽醬”是營養(yǎng)價(jià)值非常高的食品，號(hào)稱“黑色黃金”，市場價(jià)格高達(dá)2000～4000美元/公斤。但是，鱘魚生命周期長，性成熟晚(9年以上)，即使是成熟鱘魚的性別也很難從外觀上識(shí)別。為了生產(chǎn)鱘魚籽醬，人們不得不將鱘魚養(yǎng)殖到性成熟后，才能鑒別出雌雄。在長達(dá)9年多的培育時(shí)間里，由于其中有近一半的雄魚，生產(chǎn)成本需增加一倍，浪費(fèi)了大量的資金和生產(chǎn)能力(面積)。因此，探索鱘魚性別鑒別方法，成為“魚籽醬”生產(chǎn)者的一致呼聲。
卵黃蛋白原是特異性地存在于卵生雌性動(dòng)物血液中的一種蛋白質(zhì)，由肝臟分泌的卵黃蛋白原入卵以后，在酶的作用下降解為卵黃蛋白。卵黃磷蛋白作為魚類卵黃蛋白原的降解產(chǎn)物，是卵母細(xì)胞的主要蛋白成分和魚類胚胎發(fā)育的重要營養(yǎng)和能量來源，其積累對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育是十分重要的。卵黃蛋白原與卵黃磷蛋白在結(jié)構(gòu)上具有相似性，可以通過免疫學(xué)的方法進(jìn)行檢測。而在正常環(huán)境下生活的雄魚血液中不存在卵黃蛋白原，在本發(fā)明中只要測定出鱘科魚類血液中有無卵黃蛋白原，便可知其性別。
目前，國內(nèi)還沒有使用魚類卵黃磷蛋白建立魚類及鱘科魚類卵黃蛋白原的檢測方法，國外也只建立少數(shù)鱘科魚類的酶聯(lián)檢測法，而且都是應(yīng)用基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和環(huán)境類荷爾蒙激素的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于對(duì)國內(nèi)還沒有使用魚類卵黃磷蛋白建立魚類及鱘科魚類卵黃蛋白原的檢測方法，國外只建立少數(shù)鱘科魚類的酶聯(lián)檢測法，而且都不是應(yīng)用于鱘科魚類的雌雄鑒別，本發(fā)明旨在提供一種鱘科魚類卵黃磷蛋白的制備方法及應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行鱘科魚類性別鑒別。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案制備鱘科魚類卵黃磷蛋白
一、鱘科魚卵黃磷蛋白提取液的制備①稱取鱘科魚卵5g加入15mL預(yù)先預(yù)冷的0.02mol/l、pH＝8.0的Tris-HCl緩沖液，高速勻漿，離心分離，棄沉淀，留上清液；②上清液通過凝膠色譜柱洗脫sphadex G-150；③收集含卵黃磷蛋白的洗脫液，透析除鹽，得到卵黃磷蛋白提取液；二、鱘科魚卵黃磷蛋白多克隆抗體的制備①將魚卵黃磷蛋白提取液冷凍干燥為凍干粉，稱取1mg的卵黃磷蛋白凍干粉溶于1ml生理鹽水中，加入1ml弗氏完全佐劑，低溫下乳化，動(dòng)物皮下多點(diǎn)注射，進(jìn)行初次免疫；②第28、38、48天各背部皮下多點(diǎn)加強(qiáng)免疫一次，免疫劑量同第一次，采用弗氏不完全佐劑乳化抗原溶液；③55天后，動(dòng)物耳緣抽取少量血液測定抗體效價(jià)；④心臟采血制備鱘科魚卵黃磷蛋白抗血清。
本發(fā)明直接從魚卵中提取卵黃磷蛋白，替代通過雌激素誘導(dǎo)魚類肝臟合成卵黃蛋白原，進(jìn)而從血液中提取的方法。本方法制備的鱘科魚卵黃磷蛋白可以用于檢測鱘科魚類的性別；基于免疫學(xué)原理，可分別采用雙向免疫擴(kuò)散法、酶聯(lián)免疫法和免疫膠體金法進(jìn)行檢測，三種檢測方法的原理為(1)雙向免疫擴(kuò)散原理，即抗原、抗體在一定的介質(zhì)中擴(kuò)散相遇后可生成免疫沉淀復(fù)合物，在介質(zhì)內(nèi)形成肉眼可見的免疫沉淀線。
(2)酶聯(lián)免疫吸附檢測原理，即標(biāo)準(zhǔn)抗原非特異性吸附于酶標(biāo)板上后，封閉多余的結(jié)合位點(diǎn)，加入待檢血清和酶標(biāo)抗體，除去多余的待檢樣品和酶標(biāo)抗體后，加入底物開始酶促反應(yīng)，并測定溶液的吸光度，吸光度與待檢樣品中的卵黃蛋白原濃度成負(fù)相關(guān)。雄性魚類有100％顯色反應(yīng)，而雌魚的顯色則較弱。
(3)免疫膠體金快速檢測試紙條的原理是將特異性的抗體以條帶狀固定于硝酸纖維膜上，將膠體金標(biāo)記試劑吸附在結(jié)合墊上。當(dāng)待測樣品血清加到試紙條一端的樣品墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解固化的結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動(dòng)至固定抗體的區(qū)域時(shí)，待測物和金標(biāo)試劑的復(fù)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，通過可目測的膠體金標(biāo)記物得到直觀的顯色結(jié)果。
在本發(fā)明提供的方法中，有使用方便、簡易、價(jià)格低廉的雙向免疫擴(kuò)散法；有檢測準(zhǔn)確、操作較復(fù)雜的酶聯(lián)免疫法；還有使用方便、檢測快速、價(jià)格適中的免疫膠體金快速檢測法。上述方法不僅可以定性鑒別鱘科魚類的性別，還可定量的檢測多種鱘科魚類血液中和組織中卵黃蛋白原的含量。
本發(fā)明可靈敏、準(zhǔn)確地檢測鱘科魚類血清中卵黃蛋白原的有無，來鑒別鱘科魚類的性別。與激素檢測技術(shù)、解剖學(xué)方法、超聲波檢測等傳統(tǒng)的魚類性別鑒定方法相比，本方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷、成本低等優(yōu)點(diǎn)，而且對(duì)受檢魚損傷小，是進(jìn)行鱘魚類雌雄鑒別的理想方法。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式按照下述方法制備鱘科魚類卵黃磷蛋白一、鱘科魚卵黃磷蛋白提取液的制備①稱取鱘科魚卵5g加入15ml預(yù)先預(yù)冷的0.02mol/l、pH＝8.0的Tris-HCl緩沖液，高速勻漿，離心分離，棄沉淀，留上清液；②上清液通過凝膠色譜柱洗脫；③收集含卵黃磷蛋白的洗脫液，透析除鹽，得到卵黃磷蛋白提取液；二、鱘科魚卵黃磷蛋白多克隆抗體的制備①將魚卵黃磷蛋白提取液冷凍干燥為凍干粉，稱取1mg的卵黃磷蛋白凍干粉溶于1ml生理鹽水中，加入1ml弗氏完全佐劑，低溫下乳化，動(dòng)物背部皮下多點(diǎn)注射，進(jìn)行初次免疫；②第28、38、48天各背部皮下多點(diǎn)加強(qiáng)免疫一次，免疫劑量同第一次，采用弗氏不完全佐劑乳化抗原溶液；③55天后，動(dòng)物耳緣抽取少量血液測定抗體效價(jià)；④心臟采血制備鱘科魚卵黃磷蛋白抗血清。
具體實(shí)施例方式
二本實(shí)施方式以雙向免疫擴(kuò)散法鑒別鱘科魚類雌雄為例，它包括如下步驟A、卵黃磷蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的分離純化①卵黃蛋白提取液的制備稱取魚卵5g加入預(yù)先預(yù)冷的0.02mol/l、pH＝8.0的Tris-HCl緩沖液15ml，10000rpm/min高速勻漿，4℃、12000rpm/min離心20min，棄沉淀，留上清；
②上清通過凝膠色譜柱，填料為sephadex G-100，層析柱用0.02mol/l、pH＝8.0的Tris-HCl緩沖液(含2％NaCl和0.015％疊氮鈉)平衡，加入1mL上清液用0.02mol/l、pH＝8.0的Tris-HCl緩沖液(含2％NaCl和0.015％疊氮鈉)洗脫；③收集含卵黃磷蛋白的洗脫液，透析除鹽后，冷凍干燥為凍干粉。
B、卵黃磷蛋白多克隆抗體的制備①稱取1mg卵黃磷蛋白凍干粉，溶于1ml生理鹽水中，加入1ml的弗氏完全佐劑，低溫下乳化，大白兔背部皮下多點(diǎn)注射，進(jìn)行初次免疫；②第28、38、48天各背部皮下多點(diǎn)加強(qiáng)免疫一次，免疫劑量同第一次，采用弗氏不完全佐劑乳化抗原溶液；③55天后，兔耳緣抽取少量血液測定抗體效價(jià)；④心臟采血制備卵黃磷蛋白抗血清。
C、雙向免疫擴(kuò)散法檢測①取瓊脂糖1g溶于0.02mol/l、pH＝8.0的Tris-HCl緩沖液(含2％NaCl和0.015％疊氮鈉)100ml中，無菌倒入培養(yǎng)皿中，冷卻后，打孔器打孔；②中間空加入抗血清，周圍孔加待檢血清，37℃孵育5小時(shí)，檢查結(jié)果；③結(jié)果判斷待檢血清孔與抗血清孔出現(xiàn)白色沉淀線的即為雌性，不出現(xiàn)沉淀線的為雄性。
具體實(shí)施例方式
三本實(shí)施方式以酶聯(lián)免疫法鑒別鱘科魚類雌雄為例，它包括如下步驟A、卵黃磷蛋白的分離純化同雙向免疫擴(kuò)散法。
B、卵黃磷蛋白多克隆抗體的制備同雙向免疫擴(kuò)散法。
C、酶標(biāo)抗體的制備①稱取HRP(辣根過氧化物酶)25mg溶于體積濃度為1.25％的戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜；②反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)SephadexG-25層析柱，用生理鹽水洗脫，流速控制在1ml/1分鐘，收集棕色流出液，如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml；放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌；③將待標(biāo)記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中；
④用1mol/l、pH＝9.5的碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3小時(shí)；⑤加0.2mol/l賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時(shí)；⑥在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時(shí)；⑦混合液在3000rpm/min離心分離半小時(shí)，棄上清液，沉淀物用半飽和硫酸銨洗滌兩次，最后沉淀物溶于0.15mol/l、pH＝7.4的磷酸-磷酸鹽緩沖液中；⑧將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15mol/l、pH＝7.4的磷酸-磷酸鹽緩沖液透析，去除銨離子后，在10000rpm/min離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。
D、酶聯(lián)免疫法鑒別鱘科魚類雌雄①在96孔酶標(biāo)板每孔中加入卵黃磷蛋白標(biāo)準(zhǔn)品包被酶標(biāo)板，4℃冰箱包被過夜24h；②棄去酶標(biāo)板中的液體，每孔加入360μl封閉液，置于4℃冰箱中封閉過夜24h；③棄去封閉液，每孔加入300μl洗滌液，輕微震蕩1min后，棄去洗滌液，重復(fù)3次；④每孔加入待檢血清和酶標(biāo)抗體，室溫孵育1h后，棄去酶標(biāo)抗體，洗滌4次；⑤每孔加入100μl顯色底物，室溫暗處反應(yīng)20分鐘，加入50μl反應(yīng)終止液，終止反應(yīng)；⑥依據(jù)有無顯色反應(yīng)判斷鱘科魚類的雌雄與白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果，反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，為雌性鱘魚；陰性反應(yīng)為無色或極淺，為雄魚。
本實(shí)施方式所設(shè)計(jì)的直接競爭法試劑盒組成如下包被好標(biāo)準(zhǔn)抗原的96孔酶標(biāo)板(1塊)；陰性對(duì)照一支(200μl/支)；酶標(biāo)卵黃磷蛋白抗體50μl，使用前稀釋1000倍；顯色液、稀釋液和洗滌緩沖液各一支；終止液(0.5mol/L H2SO4)8ml。
注稀釋液PBS緩沖液，PH7.4；洗滌液含0.05％Tween20的稀釋液；封閉液含1％牛血清白蛋白的的稀釋液；顯色液鄰苯二胺溶液(OPD)。
具體實(shí)施例方式
四本實(shí)施方式以免疫膠體金快速檢測試紙條法鑒別鱘科魚類雌雄為例，它包括如下步驟A、卵黃磷蛋白的分離純化同雙向免疫擴(kuò)散法。
B、卵黃磷蛋白多克隆抗體的制備同雙向免疫擴(kuò)散法。
C、免疫膠體金的制備①膠體金顆粒的制備用檸檬酸三鈉—鞣酸混合還原劑可以得到比較滿意的金溶膠，操作方法如下取4ml質(zhì)量濃度為1％的檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H2O)，加入5ml體積濃度為1％的鞣酸、5ml、25mmo/L K2CO2(體積與鞣酸加入量相等)，以雙蒸餾水補(bǔ)至溶液最終體積為20ml，加熱至60℃取1ml體積濃度1％的HAuCl4加于79ml雙蒸餾水中，水浴加熱至60℃，然后迅速將上述檸檬酸—鞣酸溶液加入，于此溫度下保持一定時(shí)間，待溶液顏色變成深紅色(約需1小時(shí))后，將溶液加熱至沸騰，保持沸騰5分鐘即可。
②蛋白質(zhì)的處理由于鹽類成分能影響金溶膠對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應(yīng)先對(duì)低離子強(qiáng)度的水透析。必須注意，蛋白質(zhì)溶液應(yīng)絕對(duì)澄清無細(xì)小微粒，否則應(yīng)先用微孔濾膜或超速離心除去。一般情況下應(yīng)避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在，因?yàn)樗鼈兌伎晌接陬w粒表面而減弱膠體金對(duì)蛋白質(zhì)的吸附。
③蛋白質(zhì)最適用量的選擇將待標(biāo)記的抗體稀釋儲(chǔ)存液作系列稀釋后，分別取0.1ml(含蛋白質(zhì)30μg)加到1ml膠體金溶液中，另設(shè)一管不加蛋白質(zhì)的對(duì)照管，5分鐘后加入0.1ml質(zhì)量濃度為10％的NaCl溶液，混勻后靜置2小時(shí)，不穩(wěn)定的金溶膠將發(fā)生聚沉，能使膠體金穩(wěn)定的最適蛋白量再加入10％蛋白質(zhì)即為最佳標(biāo)記蛋白量。
④標(biāo)記用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)膠體金溶液pH＝6.5；于100ml膠體金溶液中加入最佳標(biāo)記量的抗體溶液(體積為3ml)，攪拌2～3分鐘；加入5ml體積濃度為1％的PEG20000溶液；于12000rpm/min離心40分鐘，吸去上清液(切忌傾倒)；將沉淀懸浮于一定體積含0.2～0.5mg/ml PEG20000的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復(fù)，濃度以Alcm/540nm＝1.5左右為宜，以0.5mg/ml疊氮鈉防腐，置4℃保存。
⑤裝配方法膜的噴點(diǎn)Test線和Control線；膜的封閉；結(jié)合墊的處理；金標(biāo)試劑的噴點(diǎn)；在塑料底板上分別將吸血清用玻璃纖維、凍干金標(biāo)記抗卵黃磷蛋白玻璃纖維、已固定有抗卵黃磷蛋白抗體的NC膜及硬質(zhì)吸水濾紙按圖裝配，配件與塑料底板的結(jié)合可用雙面膠或其它粘性材料粘接。裝配好的紙板按縱向剪切，裁成寬度為4mm的條狀，將試紙條密封入鋁箔袋或裝入塑料外殼后再密封，即為檢測雌雄用紙條。
⑥結(jié)果判斷出現(xiàn)兩條粉紅色條C和T帶的為雌魚，出現(xiàn)一條C帶的為雄魚。
權(quán)利要求
1.鱘科魚類卵黃磷蛋白的制備方法，其特征在于所述鱘科魚類卵黃磷蛋白檢測方法的建立按照下述步驟進(jìn)行制備一、鱘科魚卵黃磷蛋白提取液的制備①稱取鱘科魚卵5g加入15ml預(yù)先預(yù)冷的0.02mol/l、pH＝8.0的Tris-HCl緩沖液，高速勻漿，離心分離，棄沉淀，留上清液；②上清液通過凝膠色譜柱洗脫；③收集含卵黃磷蛋白的洗脫液，透析除鹽，得到卵黃磷蛋白提取液；二、鱘科魚卵黃磷蛋白多克隆抗體的制備①將鱘魚卵黃磷蛋白提取液冷凍干燥為凍干粉，稱取1mg的卵黃磷蛋白凍干粉溶于1ml生理鹽水中，加入1ml弗氏完全佐劑，低溫下乳化，動(dòng)物皮下多點(diǎn)注射，進(jìn)行初次免疫；②第28、38、48天各背部皮下多點(diǎn)加強(qiáng)免疫一次，免疫劑量同第一次，采用弗氏不完全佐劑乳化抗原溶液；③55天后，動(dòng)物耳緣抽取少量血液測定抗體效價(jià)；④心臟采血制備鱘科魚卵黃磷蛋白抗血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述鱘科魚類卵黃磷蛋白的制備方法，其特征在于凝膠色譜柱的填料為sephadex G-100。
3.權(quán)利要求1所述鱘科魚類卵黃磷蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述鱘科魚類卵黃磷蛋白用于鑒別鱘科魚類雌雄。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述鱘科魚類卵黃磷蛋白的應(yīng)用，其特征在于鑒別鱘科魚類雌雄的方法為雙向免疫擴(kuò)散法、酶聯(lián)免疫法和免疫膠體金快速檢測法。
全文摘要
鱘科魚類卵黃磷蛋白的制備方法及其應(yīng)用，它涉及用于鑒別鱘科魚類雌雄的卵黃磷蛋白的制備方法及通過使用卵黃磷蛋白鑒別鱘科魚類雌雄的方法。鑒于國內(nèi)還沒有建立使用鱘科魚類卵黃磷蛋白來檢測鱘科魚類卵黃蛋白原的免疫學(xué)方法，國外只建立少數(shù)鱘科魚類的酶聯(lián)免疫法，本發(fā)明按照下述步驟進(jìn)行制備一、取鱘科魚類的卵，低溫高速勻漿和低溫離心后，經(jīng)飽和硫酸銨沉淀，凝膠柱分離純化，透析除鹽后，制備卵黃磷蛋白凍干粉；二、稱取凍干粉，溶于生理鹽水中，加入弗氏佐劑乳化，免疫大白兔，制備多克隆抗體，它可以用于鑒別鱘科魚類雌雄。本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷、成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1763090SQ20051001042
公開日2006年4月26日 申請日期2005年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日
發(fā)明者張穎, 孫大江, 曲秋芝, 劉海金 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所