專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗(yàn)方法，尤指一組用以檢測(cè)各亞型的禽流感病毒的特異性核苷酸序列、含有這些序列的試劑盒、以及用該組序列與試劑盒檢測(cè)禽流感病毒的方法，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禽流感是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病，是由A型流感病毒引起的一種禽類(lèi)的感染和/或疾病綜合征。根據(jù)血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)，可將A型流感病毒分為不同亞型，已報(bào)道的有15種血凝素HA亞型(H1～H15)和9種神經(jīng)氨酸酶NA亞型(N1～N9)。禽流感病毒呈世界分布，絕大多數(shù)禽流感病毒呈隱性感染，不表現(xiàn)任何臨床癥狀，只有少數(shù)禽流感病毒具有迅速傳播和高致死性的特性，稱(chēng)之為高致病力禽流感病毒(HPAI)。高致病力禽流感通常是由H5和H7亞型禽流感病毒引起的，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重大傳染病之一，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類(lèi)傳染病，我國(guó)也將其列為一類(lèi)檢疫對(duì)象。1994年，墨西哥在其中部地區(qū)發(fā)病的商品雞群中分離出H5N2禽流感病毒；1995年，美國(guó)猶他州發(fā)生由H7N3引起的禽流感，在方圓800公里的暴發(fā)地區(qū)內(nèi)，比較集中的火雞群相互之間都受到了感染；1997年香港的養(yǎng)雞場(chǎng)和禽類(lèi)市場(chǎng)爆發(fā)了由H5N1引起的禽流感，并導(dǎo)致人的嚴(yán)重疾病，在全世界引起極大恐慌；1999年，意大利發(fā)生了由H7N1引起的禽流感，火雞的死亡率很高；2001年，香港再度受到禽流感病毒H5N1的困擾。自韓國(guó)2001年從上海出口的鴨肉中檢測(cè)出禽流感病毒H5亞型后，日本、歐盟等對(duì)我出口禽肉采取嚴(yán)厲檢疫措施，日本聲稱(chēng)從我出口的禽肉中多次檢出高致病力禽流感病毒H9亞型，2003年4月，在我國(guó)受“非典”影響出口滑坡的情況下，日本從我出口鴨肉中三次檢出禽流感病毒H5亞型，導(dǎo)致封關(guān)。在國(guó)內(nèi)疫情復(fù)雜、國(guó)外頻頻對(duì)我出口禽肉檢出問(wèn)題的嚴(yán)峻形勢(shì)下，如果我們不采取嚴(yán)格的檢驗(yàn)檢疫措施，勢(shì)必影響禽肉的出口。
禽流感主要依靠實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確切診斷，診斷方法主包括血清學(xué)檢測(cè)及病原的分離和鑒定兩方面。血清學(xué)檢測(cè)的對(duì)象是從禽類(lèi)體內(nèi)采集血液析出血清后，檢測(cè)血清中抗體的有無(wú)和滴度變化。病原學(xué)檢測(cè)方法的對(duì)象是病毒，因?yàn)椴《就ǔＴ诤粑篮?或)腸道復(fù)制，所以一般從活禽或死禽的器官和(或)泄殖腔能分離到病毒，常用棉拭子從活禽氣管或泄殖腔取樣來(lái)分離病毒，也可以直接采集病料組織，棉拭子或病料均可以放入滅菌的保存液，然后送往專(zhuān)門(mén)的流感診斷實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行診斷。
國(guó)家質(zhì)檢總局在2001年下發(fā)文件，要求對(duì)禽肉出口企業(yè)進(jìn)行每?jī)蓚€(gè)月一次的定期監(jiān)測(cè)，該規(guī)定要求用雞胚病毒分離方法。雞胚病毒分離是一種敏感、特異的方法，但是耗時(shí)長(zhǎng)，約需3周左右，操作煩瑣，只能起到監(jiān)測(cè)作用，不能作快速檢測(cè)用，不利于快速通關(guān)和控制禽肉攜帶病毒。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一組特異性強(qiáng)、靈敏度高的用于檢測(cè)各型禽流感病毒的核苷酸序列。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一組特異性強(qiáng)、靈敏度高的用于檢測(cè)H5亞型禽流感病毒的核苷酸序列。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確的用與檢測(cè)禽流感病毒的試劑盒。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種快捷、準(zhǔn)確、方便的檢測(cè)禽流感病毒的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案禽流感病毒通用引物、探針序列上游引物CGTCAGGCCCCCTCAAA下游引物AAGATCTGTGTTCTTTCCTGCAAA探針FAM-CGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGT-TAMRA作為探針的核苷酸序列在5’端和3’端分別連接熒光報(bào)告基團(tuán)(FAM)和熒光淬滅基團(tuán)(TAMRA)，委托美國(guó)Integrated DNA Technologies，inc合成。
選擇A型禽流感病毒的共有NP基因序列設(shè)計(jì)多對(duì)通用引物和探針，引物長(zhǎng)度一般為20個(gè)堿基左右，GC含量為50％-60％，引物內(nèi)無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)無(wú)互補(bǔ)序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5℃。探針的長(zhǎng)度在25個(gè)堿基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。進(jìn)行大量篩選試驗(yàn)得到以上序列，該通用引物和探針序列不僅能夠用來(lái)檢測(cè)禽流感病毒H5、H7、H9亞型，而且對(duì)其他禽流感病毒亞型也能檢出，用其檢測(cè)常見(jiàn)其他禽類(lèi)病毒，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。該通用引物可以在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出樣本是否感染了禽流感病毒，節(jié)約人力和物力和檢測(cè)時(shí)間。
禽流感病毒H5亞型引物、探針序列上游引物CAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGG
下游引物ATAAGCCATACCACATTTCTGAAAAAGG探針FAM-CCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCC-TAMRA由于H5亞型的禽流感病毒具有高致病性，且可傳染給人類(lèi)，危害極大，因此在檢測(cè)到樣本被禽流感病毒感染后需要進(jìn)一步確認(rèn)感染的病毒是否為H5亞型，做到及早發(fā)現(xiàn)，及早處理，防止禽流感蔓延。
一種檢測(cè)禽流感病毒的試劑盒，以上述禽流感病毒通用引物和探針或者禽流感病毒H5亞型特異引物和探針，其組成如下一、樣本處理試劑裂解液自INVITROGEN公司購(gòu)買(mǎi)，貨號(hào)10296二、核酸擴(kuò)增試劑1、RT-PCR反應(yīng)液，見(jiàn)下表表1

2、RT-PCR酶0.25顆/test，購(gòu)自安發(fā)瑪西亞公司公司購(gòu)買(mǎi)，貨號(hào)27-9259-01。
3、Taq酶5U/ul，自上海普洛麥格公司購(gòu)買(mǎi)。
4、DEPC水自來(lái)水兩次蒸餾，經(jīng)過(guò)Millipore MILLI-Q PF PLUS純水儀純化，電阻率≥18.0MΩ.cm三、對(duì)照品1、陰性對(duì)照滅活的陰性尿囊液(委托專(zhuān)業(yè)的SPF雞場(chǎng)孵育SPF雞胚至12日齡，無(wú)菌抽取雞胚尿囊液；60℃作用1小時(shí)滅活)2、陽(yáng)性對(duì)照體外轉(zhuǎn)錄的RNA一種檢測(cè)禽流感病毒的方法，使用禽流感病毒通用引物和探針或者禽流感病毒H5亞型特異引物和探針，滅活尿囊液為陰性對(duì)照，對(duì)樣本進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，并判斷結(jié)果，其中(一)RT-PCR反應(yīng)的循環(huán)條件為
42℃30min；92℃3min；92℃10sec，45℃30sec 72℃1min 5個(gè)循環(huán)92℃10sec，60℃30sec 40個(gè)循環(huán)，60℃時(shí)設(shè)置收集熒光；(二)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)(1)陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果為陰性；陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于等于28.0；否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效；(2)Ct值無(wú)數(shù)值的樣本為陰性樣本；Ct值≤30.0的樣本為陽(yáng)性；(3)Ct值大于30.0的樣本建議重做重做結(jié)果無(wú)數(shù)值者為陰性，否則為陽(yáng)性。
本發(fā)明的有益效果為1)快速?gòu)臉悠诽幚淼匠鼋Y(jié)果僅需4小時(shí)左右；2)敏感檢測(cè)組織臟器和拭子的靈敏度與雞胚病毒分離基本一致；3)特異與常見(jiàn)禽類(lèi)其他病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，而且不僅采用了特異性的引物，還采用了特異性的探針，使該方法的特異性高于傳統(tǒng)PCR方法，大大杜絕了非特異性擴(kuò)增造成的假陰性結(jié)果；4)靈敏由于采用了特異性的熒光探針和高靈敏度的熒光PCR儀，使該方法比傳統(tǒng)的PCR方法靈敏度高100～1000倍。對(duì)于禽流感病毒尿囊液，稀釋至10-7仍可檢出，接近雞胚病毒分離；5)操作簡(jiǎn)單試劑盒給檢測(cè)者提供了質(zhì)量?jī)?yōu)異的試劑及優(yōu)化的操作程序，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的培訓(xùn)，檢測(cè)者就可勝任該項(xiàng)工作。
下面結(jié)合較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，可以幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員更全面的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明，凡依照本發(fā)明的內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.篩選通用引物和探針序列一.材料涉及的毒種由北京出入境檢驗(yàn)檢疫局分離保存二.方法(一)設(shè)計(jì)合成引物和探針序列A型流感病毒的基因組由8個(gè)單獨(dú)的單鏈RNA片段組成，本試劑盒選擇禽流感病毒RNA作為靶區(qū)域。選擇A型禽流感病毒的共有NP基因序列設(shè)計(jì)多對(duì)通用引物和探針，引物長(zhǎng)度一般為20個(gè)堿基左右，GC含量為50％-60％，引物內(nèi)無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)無(wú)互補(bǔ)序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5℃。探針的長(zhǎng)度在25個(gè)堿基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。
引物和探針從不同廠家合成，如上海生工、大連寶生物、國(guó)外公司如GIBCO/BRL、IDT等等，要求PAGE純或HPLC純，到貨時(shí)同時(shí)提供廠家對(duì)該產(chǎn)品的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜。收到引物后做HPLC分析，應(yīng)該得到單吸收峰圖譜、用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之間，則視為合格引物。
(二)篩選和配對(duì)1.通過(guò)引物、探針的篩選實(shí)驗(yàn)將上述上游引物和下游引物結(jié)合探針位置進(jìn)行配對(duì)，PCR反應(yīng)體系如表2所示表2 PCR反應(yīng)體系

RT-PCR beads為Amersham Pharmacia Biotech Inc的Ready-To-GoTM RT-PCR Beads(Cat.No.27-9259-01)2.PCR循環(huán)參數(shù)如下42℃30min；92℃3min；92℃10sec，45℃30sec 72℃1min 5個(gè)循環(huán)92℃10sec，60℃30sec 40個(gè)循環(huán)，60℃時(shí)設(shè)置收集熒光；3.采用上述條件對(duì)禽流感病毒的毒株尿囊液105倍稀釋提取RNA，選取合適的引物搭配進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)陽(yáng)性模板10-4、10-5、10-6、10-7、10-8進(jìn)行擴(kuò)增，得到效率和升幅較高的引物及與之配對(duì)的探針序列。
三.結(jié)果上游引物CGTCAGGCCCCCTCAAA下游引物AAGATCTGTGTTCTTTCCTGCAAA探針FAM-CGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGT-TAMRA探針的5’端和3’端分別連接熒光報(bào)告基團(tuán)(FAM)和熒光淬滅基團(tuán)(TAMRA)，委托美國(guó)Integrated DNA Technologies，inc合成。該組通用引物和探針序列可用于檢測(cè)各型禽流感病毒。
四.陽(yáng)性對(duì)照品的制備1.擴(kuò)增目的核酸片段按表1配方配成RT-PCR反應(yīng)液，加入陽(yáng)性H5-1 RNA模板，用PE2400擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件見(jiàn)表2，以期得到大量的目的片段。PCR完畢，用1.8％瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，紫外燈下見(jiàn)到一條分子量大小正確的特異性亮帶、無(wú)非特異性擴(kuò)增帶，則證明擴(kuò)增成功，保留PCR產(chǎn)物備用。
RT-PCR酶安發(fā)瑪西亞公司的Ready-To-GoTM RT-PCR Beads(Cat.No.27-9259-01)RT-PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)42℃30min94℃5min95℃5sec，55℃30sec，72℃60sec，40個(gè)循環(huán)2.純化目的核酸片段采用Promega公司的Wizard PCR Preps DNA Purification System(Cat#A7170、Lot#11356102)試劑盒純化上述PCR產(chǎn)物中的目的核酸片段。再用1.8％瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行粗略定量。
3.連接反應(yīng)用Promega公司的PGEM-T Easy Vertor System II(Cat#A1380、Lot#86893)試劑盒將目的片段與T載體相連接。
表3連接反應(yīng)體系

連接反應(yīng)中將PCR產(chǎn)物與T載體的數(shù)量的比值控制在1∶3-3∶1之間，因?yàn)榇藭r(shí)連接效率最高。連接反應(yīng)的條件為4℃過(guò)夜，如不立即進(jìn)行后續(xù)步驟，連接產(chǎn)物保存在4℃。
4.轉(zhuǎn)化按照Promega公司的PGEM-T Easy Vertor System II的說(shuō)明書(shū)要求，將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂于含有X-Gal和IPTG的瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。
5.克隆菌落鑒定從平板上長(zhǎng)出的藍(lán)色、白色菌落中隨機(jī)挑取3-4個(gè)白色菌落，提取質(zhì)粒，用PCR反應(yīng)液檢測(cè)，擴(kuò)增陽(yáng)性的為合格的克隆菌落。
6.質(zhì)粒擴(kuò)增挑取經(jīng)鑒定為陽(yáng)性的菌落，用3-5ml液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃搖床振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)。
7.質(zhì)粒純化用Promega公司的Wizard Plus Minipreps DNA Purification System(Cat#A7100、Lot#10454011)試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的提純，用1.0％瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)提純的質(zhì)粒進(jìn)行純度檢測(cè)。
8.體外轉(zhuǎn)錄以純化的質(zhì)粒為模板，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA ProductionSystem-T7(Cat#P1300、Lot#125575)試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase除去其中的DNA模板后，即得到制備AIV陽(yáng)性對(duì)照品所需的RNA陽(yáng)性對(duì)照品母液。
體外轉(zhuǎn)錄體系見(jiàn)表4。反應(yīng)條件為37℃溫浴2-4小時(shí)。
表4 T7體外轉(zhuǎn)錄體系

9.陽(yáng)性對(duì)照品的檢驗(yàn)(1)陽(yáng)性對(duì)照品母液的檢驗(yàn)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260nm/OD280nm的比值應(yīng)在1.8-2.0之間，用合格的試劑進(jìn)行檢定應(yīng)為陽(yáng)性。
(2)陽(yáng)性對(duì)照品的檢驗(yàn)將陽(yáng)性對(duì)照品母液用1×TE進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)玫蕉鄠€(gè)梯度稀釋液。各個(gè)梯度稀釋液用合格禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒(適用于H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13亞型)進(jìn)行Ct值標(biāo)定，取Ct值在22.0～28.0之間的稀釋液作為試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照，分裝后-70℃保存。
實(shí)施例2.篩選禽流感病毒H5亞型引物和探針序列一.材料涉及的毒種由北京出入境檢驗(yàn)檢疫局分離保存，如下禽流感病毒H5-1株禽流感病毒H5亞型禽流感病毒H5-2株禽流感病毒H5亞型禽流感病毒H5-3株禽流感病毒H5亞型禽流感病毒H5-4株禽流感病毒H5亞型禽流感病毒H5-5株禽流感病毒H5亞型二.方法(一)設(shè)計(jì)合成引物和探針序列禽流感病毒H5亞型(AIV H5)的基因組由8個(gè)單獨(dú)的單鏈RNA片段組成，選擇HA基因作為靶區(qū)域。分兩個(gè)區(qū)域選擇其中缺乏二級(jí)結(jié)構(gòu)且保守的基因區(qū)設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針。引物長(zhǎng)度一般為20個(gè)堿基左右，GC含量為50％-60％，引物內(nèi)無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)無(wú)互補(bǔ)序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5℃。探針的長(zhǎng)度在25個(gè)堿基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。
引物和探針從不同廠家合成，如上海生工、大連寶生物、國(guó)外公司如GIBCO/BRL、IDT等等，要求PAGE純或HPLC純，到貨時(shí)同時(shí)提供廠家對(duì)該產(chǎn)品的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜。收到引物后做HPLC分析，應(yīng)該得到單吸收峰圖譜、用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之間，則視為合格引物。
(二)篩選和配對(duì)1.通過(guò)引物、探針的篩選實(shí)驗(yàn)將上述上游引物和下游引物結(jié)合探針位置進(jìn)行配對(duì)，PCR反應(yīng)體系同表2。
2.PCR循環(huán)參數(shù)如下42℃30min；92℃3min；92℃10sec，45℃30sec 72℃1min 5個(gè)循環(huán)
92℃10sec，60℃30sec 40個(gè)循環(huán)，60℃時(shí)設(shè)置收集熒光；3.采用上述條件對(duì)禽流感病毒的毒株尿囊液105倍稀釋提取RNA，選取合適的引物搭配進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)陽(yáng)性模板(用禽流感病毒H5-1株尿囊液，PBS稀釋10-1至10-9，采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取RNA備用)10-4、10-5、10-6、10-7、10-8進(jìn)行擴(kuò)增，得到效率和升幅較高的引物及與之配對(duì)的探針序列。
三.結(jié)果上游引物CAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGG下游引物ATAAGCCATACCACATTTCTGAAAAAGG探針FAM-CCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCC-TAMRA探針的5’端和3’端分別連接熒光報(bào)告基團(tuán)(FAM)和熒光淬滅基團(tuán)(TAMRA)，委托美國(guó)Integrated DNA Technologies，inc合成。該組引物和探針序列用于特異性地檢測(cè)H5亞型禽流感病毒。
實(shí)施例3.禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒一.熒光RT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化(一)方法將實(shí)施例1最終得到的引物濃度從0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L遞增，探針濃度從0.025umol/L至0.2umol/L以0.025umol/L遞增。對(duì)引物和探針不同濃度的配比進(jìn)行了比較，其他條件均同表2。
采用上述配比對(duì)毒株BJCIQ-H9(北京出入境檢驗(yàn)檢疫局保存)尿囊液10-6稀釋所提取的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，循環(huán)條件同表3，每組均采用復(fù)管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
(二)結(jié)果從多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同濃度的引物、探針對(duì)于該陽(yáng)性模板，CT值基本穩(wěn)定在27.6-28.2，但引物濃度為0.2umol/L，探針濃度為0.1umol/L時(shí)熒光增幅較高，所以選定引物濃度為0.2umol/L，探針濃度為0.1umol/L作為禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒(適用于H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13亞型)引物和探針濃度。
二.試劑盒的組成(一)樣本處理試劑裂解液(購(gòu)自INVITROGEN公司，貨號(hào)10296)(二)核酸擴(kuò)增試劑1.RT-PCR反應(yīng)液同表1。
2.RT-PCR酶含量12顆，0.25顆/test(購(gòu)自安發(fā)瑪西亞公司公司，貨號(hào)27-9259-01)
3.Taq酶5U/ul(購(gòu)自上海普洛麥格公司)4.DEPC水自來(lái)水兩次蒸餾，經(jīng)過(guò)Millipore MILLI-Q PF PLUS純水儀純化，電阻率≥18.0MΩ.cm(三)對(duì)照品1.陰性對(duì)照滅活尿囊液2.陽(yáng)性對(duì)照體外轉(zhuǎn)錄的RNA(用禽流感病毒H5-1株尿囊液，PBS稀釋10-1至10-9，采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取RNA備用。)RT-PCR反應(yīng)液中的引物I、引物II和探針序列為禽流感病毒通用引物、探針序列上游引物CGTCAGGCCCCCTCAAA下游引物AAGATCTGTGTTCTTTCCTGCAAA探針FAM-CGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGT-TAMRA本試劑盒適用于檢測(cè)A型禽流感病毒H1、H2、H3、H5、H7、H9和H13亞型。
實(shí)施例4.禽流感病毒H5亞型熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒RT-PCR反應(yīng)液中的引物I、引物II和探針序列為禽流感病毒H5亞型特異引物、探針序列上游引物CAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGG下游引物ATAAGCCATACCACATTTCTGAAAAAGG探針FAM-CCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCC-TAMRA陽(yáng)性對(duì)照體外轉(zhuǎn)錄的RNA(用禽流感病毒H5-N1尿囊液，PBS稀釋10-1至10-9，采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取RNA備用。)其余同實(shí)施例3。本試劑盒用于檢測(cè)禽流感病毒H5亞型。
實(shí)施例5.檢測(cè)禽流感病毒的方法一.樣本采集、存放及運(yùn)輸(一)樣本采集所用取樣器材必須經(jīng)高壓或干熱滅菌。
若樣品為活禽，建議取咽喉拭子和泄殖腔拭子取咽喉拭子時(shí)將拭子深入喉頭口及上顎裂來(lái)回刮幾次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子時(shí)將拭子深入瀉殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便。然后將拭子一起放入盛有2ml PBS(含抗菌素)的試管，充分洗滌拭子，然后在管壁擠干液體，轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中備用。
若樣品為新鮮肌肉或臟器，取待檢樣品2g于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加10ml PBS混勻，取上清轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中備用。為使樣品的代表性更強(qiáng)，也可取50克肉樣，加入50ml無(wú)菌的PBS液，用Bagmixer均質(zhì)器處理后，取上清備用。
若樣品為血清、血漿或冷凍組織滲出液，則直接取用。
(二)存放分離后的樣本在2℃-8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24hr；-70℃以下可長(zhǎng)期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
(三)運(yùn)輸采用冰壺或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。
二.樣本處理(一)取n個(gè)1.5ml滅菌離心管(n＝樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，作好標(biāo)記。
(二)首先加入600ul裂解液，然后分別加入待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各200ul；再加入200ul氯仿，混勻器上振蕩混勻5sec。
(三)于12,000r/min離心15min(如有條件，于4℃進(jìn)行離心)。
(四)取與步驟(一)中相同數(shù)量的1.5ml滅菌離心管，加入400ul異丙醇(-20℃預(yù)冷)，作好標(biāo)記。
(五)吸取步驟(三)各管中的上清液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中(上清液應(yīng)至少吸取500ul，注意不要吸出中間層)，顛倒混勻。
(六)12,000r/min離心15min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體；加入600ul 75％乙醇(-20℃預(yù)冷)，顛倒洗滌。
(七)12,000r/min離心10min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。
(八)4,000r/min離心10sec，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干，室溫干燥3min。
(九)每管加入11ul DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2,000r/min離心5sec，冰上保存?zhèn)溆谩?br> 三.RT-PCR擴(kuò)增(一)擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備從試劑盒中取出RT-PCR反應(yīng)液、Taq酶，在室溫下融化后，2,000r/min離心5sec。設(shè)所需PCR管數(shù)為n(n＝樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表表5

計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積試管中，向其中加入n/4顆RT-PCR酶顆粒，充分混合均勻，向每個(gè)PCR管中各分裝15ul。
(二)加樣在各設(shè)定的PCR管中分別加入上述樣本處理步驟中制備的RNA溶液各10ul，蓋緊管蓋，于400r/min離心5sec。將PCR管排好放入熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。
(三)RT-PCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置42℃30min；92℃3min；92℃10sec，45℃30sec 72℃1min 5個(gè)循環(huán)92℃10sec，60℃30sec 40個(gè)循環(huán)，60℃時(shí)設(shè)置收集熒光。
四.結(jié)果判定(一)結(jié)果分析條件設(shè)定讀取檢測(cè)結(jié)果，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn)。或可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。
(二)結(jié)果判定1.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果為陰性。
陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于等于28.0。否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
2.結(jié)果判斷Ct值無(wú)數(shù)值的樣本為陰性樣本。Ct值≤30.0的樣本為陽(yáng)性。
Ct值大于30.0的樣本建議重做。重做結(jié)果無(wú)數(shù)值者為陰性，否則為陽(yáng)性。
實(shí)施例6.禽流感病毒通用引物和探針的特異性和靈敏性試驗(yàn)將建立的檢測(cè)禽流感病毒的熒光RT-PCR方法檢測(cè)不同稀釋度的雞胚感染尿囊液，并與雞胚分離方法比較，評(píng)估該方法的靈敏度；檢測(cè)不同亞型的禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原，評(píng)估該方法的敏感性；用該方法檢測(cè)常見(jiàn)禽類(lèi)病毒，以評(píng)估該方法的特異性。
一.材料與方法(一)材料1.病毒株由北京出入境檢驗(yàn)檢疫局分離保存，所有毒種均經(jīng)相應(yīng)部門(mén)鑒定禽流感病毒H5N1-AC1株禽流感病毒H5亞型禽流感病毒H5N1-AC2株禽流感病毒H5亞型禽流感病毒H5N1-AC3株禽流感病毒H5亞型禽流感病毒H5N1-AD1株禽流感病毒H5亞型禽流感病毒H5N1-AD2株禽流感病毒H5亞型禽流感病毒H5N1-AD3株禽流感病毒H5亞型BJCIQ-H7-BJV1禽流感病毒H7亞型BJCIQ-H7-BJV2禽流感病毒H7亞型BJCIQ-H7-GDV1禽流感病毒H7亞型BJCIQ-H7-SDV1禽流感病毒H7亞型BJCIQ-H9三株禽流感病毒H9亞型新城疫F48E9、新城疫I系苗、新城疫II系苗、新城疫IV系苗、IBDV、IBV疫苗(H120、H52)、KIBV、CAAV、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒。(來(lái)源于北京出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室)2.SPF雞胚購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
3.禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒(實(shí)施例2)(二)方法1.靈敏度試驗(yàn)將10株禽流感病毒(6株禽流感病毒H5亞型、2株禽流感病毒H7亞型、2株禽流感病毒H9亞型)的感染尿囊液作10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10倍稀釋?zhuān)殖蓛煞?，一份做熒光RT-PCR，一份接種10日齡SPF雞胚，每個(gè)稀釋度接種5枚，每天觀察兩次。
2.對(duì)不同亞型的禽流感病毒檢測(cè)用建立的禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒(適用于H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13亞型)檢測(cè)禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13(H1、H2、H3、H13來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，H5、H7、H9來(lái)源于北京出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室)，以驗(yàn)證該方法是否對(duì)所有禽流感病毒均可檢測(cè)。
3.特異性試驗(yàn)用禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)收集到的常見(jiàn)禽類(lèi)病毒新城疫F48E9、新城疫I系苗、新城疫II系苗、新城疫IV系苗、IBDV、IBV疫苗(H120、H52)、KIBV、CAAV、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒。觀察是否出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。
二.結(jié)果和討論1.檢測(cè)10株禽流感病毒感染尿囊液的敏感性以及與雞胚病毒分離比較見(jiàn)下表
表6禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒的靈敏度

從表6中可以看出，在檢測(cè)禽流感病毒感染雞胚尿囊液時(shí)，雞胚病毒分離較熒光RT-PCR敏感。熒光RT-PCR檢測(cè)雞胚感染尿囊液的最高稀釋度為10-7，最低為10-6。
2.檢測(cè)禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13，結(jié)果對(duì)于所有抗原該試劑盒均可檢出陽(yáng)性，Ct值基本一致。由此可見(jiàn)本試劑盒能夠檢測(cè)到可以購(gòu)買(mǎi)到的禽流感病毒所有的亞型，說(shuō)明禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒的探針、引物具有通用性。
3.檢測(cè)常見(jiàn)禽類(lèi)病毒結(jié)果，見(jiàn)下表表7禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒的特異性


從表7中可以看出，建立的禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒(適用于H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13亞型)檢測(cè)禽流感病毒方法與常見(jiàn)的禽類(lèi)病毒無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物、探針特異性良好。
實(shí)施例7.禽流感病毒H5亞型熒光RT-PCR方法的靈敏度、敏感性和特異性實(shí)驗(yàn)將建立的檢測(cè)禽流感病毒H5亞型的熒光RT-PCR方法檢測(cè)不同稀釋度的雞胚感染尿囊液，并與雞胚分離方法比較，評(píng)估該方法的靈敏度；用該方法檢測(cè)其余禽類(lèi)病毒，以評(píng)估該方法的特異性。
一.材料與方法1.材料病毒株該試驗(yàn)涉及的毒種由北京出入境檢驗(yàn)檢疫局分離保存，具體如下禽流感病毒H5-1株禽流感病毒H5亞型禽流感病毒H5-2株禽流感病毒H5亞型禽流感病毒H5-3株禽流感病毒H5亞型禽流感病毒H5-4株禽流感病毒H5亞型禽流感病毒H5-5株禽流感病毒H5亞型所有毒種均經(jīng)相應(yīng)部門(mén)鑒定。
SPF雞胚購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
2.方法(1)禽流感H5亞型熒光RT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)將5株禽流感病毒H5亞型的感染尿囊液作10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10倍稀釋?zhuān)殖蓛煞?，一份做熒光RT-PCR，一份接種10日齡SPF雞胚，每個(gè)稀釋度接種5枚，每天觀察兩次。
(2)禽流感病毒H5亞型熒光RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)不同亞型的禽流感病毒檢測(cè)用建立的禽流感病毒H5亞型熒光RT-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原Y1、Y2、Y3、Y4、Y5，以驗(yàn)證該方法是否對(duì)所有禽流感病毒H5亞型均可檢測(cè)。
(3)禽流感病毒H5亞型熒光RT-PCR檢測(cè)方法的特異性用禽流感病毒H5亞型熒光RT-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)收集到的常見(jiàn)禽類(lèi)病毒禽流感H7亞型、禽流感H9亞型、新城疫F48E9、新城疫I系苗、新城疫II系苗、新城疫IV系苗、IBDV、IBV疫苗(H120、H52)、KIBV、CAAV、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒。觀察是否出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。
二.結(jié)果1.禽流感病毒H5亞型熒光RT-PCR檢測(cè)5株禽流感病毒H5亞型感染尿囊液的敏感性以及與雞胚病毒分離比較見(jiàn)表8表8 H5亞型熒光RT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度

從表8中可以看出，在檢測(cè)禽流感病毒H5亞型感染雞胚尿囊液時(shí)，雞胚病毒分離較熒光RT-PCR敏感。熒光RT-PCR檢測(cè)雞胚感染尿囊液的最高稀釋度為10-8，最低為10-7。
2.禽流感病毒H5亞型熒光RT-PCR檢測(cè)常見(jiàn)禽類(lèi)病毒結(jié)果，見(jiàn)表9表9禽流感病毒H5亞型熒光RT-PCR的特異性


從表9中可以看出，建立的H5亞型熒光RT-PCR檢測(cè)禽流感病毒方法與常見(jiàn)的禽類(lèi)病毒無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物、探針特異性良好。
序列表<110>中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局深圳市匹基生物工程股份有限公司<120>檢測(cè)禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗(yàn)方法<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>17<212>DNA<213>禽流感病毒(avian influenza virus)<220>
<223>禽流感病毒通用引物序列<400>1cgtcaggccc cctcaaa 17<210>2<211>24<212>DNA<213>禽流感病毒(avian influenza virus)<220>
<223>禽流感病毒通用引物序列
<400>2aagatctgtg ttctttcctg caaa24<210>3<211>27<212>DNA<213>禽流感病毒(avian influenza virus)<220>
<223>禽流感病毒通用探針序列<400>3cgagatcgcg cagagacttg aagatgt 27<210>4<211>24<212>DNA<213>禽流感病毒(avian influenza virus)<220>
<223>禽流感病毒H5亞型引物序列<400>4cagatcatcc ccaaaagttc ttgg 24<210>5<211>28
<212>DNA<213>禽流感病毒(avian influenza virus)<220>
<223>禽流感病毒H5亞型引物序列<400>5ataagccata ccacatttct gaaaaagg28<210>6<211>28<212>DNA<213>禽流感病毒(avian influenza virus)<220>
<223>禽流感病毒H5亞型探針序列<400>6cctcatcagg ggtgagctca gcatgtcc28
權(quán)利要求
1.一組用于檢測(cè)各型禽流感病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.1-No.3所示的堿基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一組用于檢測(cè)各型禽流感病毒的核苷酸序列，其特征在于所述序列表SEQ ID No.3的核苷酸序列在5’端和3’端分別連接熒光報(bào)告基團(tuán)FAM和熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
3.一組用于檢測(cè)H5亞型禽流感病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.4-SEQ ID No.6所示的堿基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一組用于檢測(cè)H5亞型禽流感病毒的核苷酸序列，其特征在于所述序列表SEQ ID No.6的核苷酸序列在5’端和3’端分別連接熒光報(bào)告基團(tuán)FAM和熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
5.一種檢測(cè)禽流感病毒的試劑盒，其特征在于采用權(quán)利要求1-4所述的核苷酸序列作為檢測(cè)禽流感病毒的引物I、引物II或探針序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測(cè)禽流感病毒的試劑盒，其特征在于其組成如下1)裂解液；2)RT-PCR反應(yīng)液，終濃度配制成10×PCR緩沖液；1u TaqE；0.2umol/L引物I；0.2umol/L引物II；0.1umol/L探針；0.1umol/L DNTP；3)RT-PCR酶0.25顆/test；4)Taq酶5U/ul；5)DEPC水；6)陰性對(duì)照滅活陰性尿囊液；7)陽(yáng)性對(duì)照體外轉(zhuǎn)錄的RNA。
7.一種檢測(cè)禽流感病毒的方法，使用權(quán)利要求1或2所述的禽流感病毒通用引物和探針或者權(quán)利要求3或4所述的禽流感病毒H5亞型特異引物和探針，滅活尿囊液為陰性對(duì)照，對(duì)樣本進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，并判斷結(jié)果，其中(一)RT-PCR反應(yīng)的循環(huán)條件為42℃30min；92℃3min；92℃10sec，45℃30sec 72℃1min 5個(gè)循環(huán)92℃10sec，60℃30sec 40個(gè)循環(huán)，60℃時(shí)設(shè)置收集熒光；(二)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)(1)陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果為陰性；陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于等于28.0；否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效；(2)Ct值無(wú)數(shù)值的樣本為陰性樣本；Ct值≤30.0的樣本為陽(yáng)性；(3)Ct值大于30.0的樣本建議重做重做結(jié)果無(wú)數(shù)值者為陰性，否則為陽(yáng)性。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗(yàn)方法，尤指一組用以檢測(cè)各亞型的禽流感病毒的特異性核苷酸序列、含有這些序列的試劑盒、以及用該組序列與試劑盒檢測(cè)禽流感病毒的方法，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。一組用于檢測(cè)各型禽流感病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.1－No.3所示的堿基序列。本發(fā)明的有益效果為快速、敏感、特異、靈敏、操作簡(jiǎn)單；試劑盒給檢測(cè)者提供了質(zhì)量?jī)?yōu)異的試劑及優(yōu)化的操作程序，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的培訓(xùn)，檢測(cè)者就可勝任該項(xiàng)工作。
文檔編號(hào)G01N33/533GK1828299SQ20051000899
公開(kāi)日2006年9月6日 申請(qǐng)日期2005年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月28日
發(fā)明者魏傳忠, 張鶴曉, 賴(lài)平安, 楊偉, 高志強(qiáng), 張利鋒, 劉環(huán), 劉繼紅, 郭晉優(yōu), 李寧, 谷強(qiáng), 汪琳, 吳丹, 段生濤, 張向東 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局, 深圳市匹基生物工程股份有限公司