專利名稱：膽紅素標準液及其制備方法和保存方法
技術領域：
本發(fā)明涉及天然膽紅素或人工合成膽紅素與載體活性蛋白的結合機理、利用白蛋白上的膽紅素結合位點，膽紅素與白蛋白形成復合物的反應；從而增強了膽紅素標準液的抗氧化性和水溶性。以及規(guī)模生產工藝及保存方法。
背景技術：
膽紅素是臨床醫(yī)學實驗中常規(guī)檢驗項目之一，對肝膽疾病及溶血性疾病的診斷有著重要的意義。血中的膽紅素分為結合膽紅素和非結合膽紅素。測定膽紅素的常用方法有重氮法、酶法和直接氧化比色法；根據(jù)膽紅素與重氮試劑的反應特點，將其分為直接膽紅素和間接膽紅素。臨床醫(yī)學實驗測定膽紅素時，一般測定總膽紅素和直接膽紅素。膽紅素測定試劑盒種類繁多，方法各異，與之配套的標準品也不盡相同。不管采用那種方法來測定膽紅素，膽紅素標準品為臨床醫(yī)學檢驗必備。
天然膽紅素或人工合成膽紅素本身不穩(wěn)定，見光容易分解，不易保存。由于國內目前沒有統(tǒng)一的標準品供應，造成膽紅素標準品的標準化問題得不到解決；目前市場上銷售的膽紅素標準品多為各種膽紅素的混合物(或異構體)，不適于作為直接膽紅素測定的標準物。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗氧化性和水溶性的膽紅素標準液及其制備技術和保存方法。
本發(fā)明采用模擬人體膽紅素代謝途徑中與蛋白質結合的反應；從而有效地利用白蛋白上的膽紅素結合位點，膽紅素與白蛋白形成復合物后，將膽紅素包裹其中，增強了膽紅素的水溶液，使凍干后的膽紅素標準液復溶非常容易。白蛋白結合膽紅素體積變大，并將膽紅素完全包裹，從而阻隔氧氣與膽紅素接觸，防止其被氧化；與凍干技術相結合有效地實現(xiàn)了膽紅素標準液能較長期保存。本膽紅素標準液是將天然膽紅素或人工合成膽紅素與牛血清白蛋白在堿性緩沖劑條件下相結合，再緩慢加入一定濃度的穩(wěn)定劑，低溫保存12小時，使膽紅素與牛血清白蛋白充分作用并有效結合，形成較為穩(wěn)定的膽紅素-白蛋白結合物。待膽紅素與牛血清白蛋白結合后，調整PH值至接近人體生理狀態(tài)(7.15～7.35)；然后，按一定規(guī)格分裝凍干、真空或沖氮、壓蓋密封保存。
本發(fā)明膽紅素標準液配方組成原料為分析純，每升濃度范圍分別為碳酸鈉0.053+-0.5g、0.1N氫氧化鈉2.0-4.0ml、0.1鹽酸0.5--2ml、蔗糖40--60g、乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA-2Na)0.625-1.0g、碳酸氫銨4.94-5.5g、小牛血清8-12.0g、膽紅素(Bilirubin)45--60.0mg、Proclin300 0.1-0.25u。
上述基礎試劑配制方法如下①試劑I1.06％Na2CO3配制精稱Na2CO3 1.06g置100ml容量瓶中，加蒸餾水至100ml刻度；②試劑II0.1N NaOH配制精稱NaOH 0.4g置100ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度即成；③試劑III0.1N HCl配制量取12N濃鹽酸45ml，加蒸餾水至500ml即為0.1N HCl，④試劑IV10％蔗糖配制取Sucrose200g+EDTA-2Na 2.0g用DW溶解至2L加熱溶解；⑤試劑VNH4HCO3配制稱取19.75g NH4HCO3加蒸餾水至200ml，用HAC調PH至7.0±0.05；⑥試劑VI5.0％牛血清白蛋白配制稱取40g BSA，用200ml試劑V溶解，加蒸餾水至400ml，最后用蒸餾水定容至800ml。
本發(fā)明膽紅素標準液配制方法由以下工藝制成，(1)取試劑I，1.06％Na2CO3，5.0ml加入試劑II0.1N NaOH3.0ml，混勻加酚酞作指示劑，用試劑0.1N HCl滴定至紅色消失；(2)取膽紅素200mg～220mg置100ml燒瓶中，加入試劑I 20.0ml、試劑II 12.0ml迅速混勻，10分鐘內使其充分溶解，轉入5L容器中，(3)慢加入試劑試劑IV10％蔗糖，600ml～720ml，邊加邊搖勻并用其清洗2～3次燒瓶，(4)慢加入試劑III0.1N HCl，邊加邊搖勻，再加試劑VI及蒸餾水定容至2000ml，4℃過夜避光保存，PH＝8.22；(5)裝凍干前加入等體積的試劑IV(2000ml)混勻至總體積為4000ml加冰醋酸2.0ml，調PH＝7.12。
本發(fā)明膽紅素標準液保存方法與成品鑒定1.保存方法①將配制好的膽紅素標準液，充分混勻后每瓶2.0ml分裝，25℃速凍，低溫真空干燥10～12小時后，逐步升溫至5～18℃繼續(xù)真空干燥4～8小時便可自動真空壓蓋。
②如真空凍干設備無自動壓蓋裝置，必須將凍干好的膽紅素標準液沖入96％以上的氮氣后壓蓋。
③真空干燥的膽紅素標準液2～8℃保存有限期2年，-20℃保存有效期為4年。
2.成品鑒定①將凍干的膽紅素標準液成品隨機抽取30瓶，每瓶用2.0ml DW復溶凍干品，用T.Bil測定方法，在生化分析儀上測定λ＝492nm，其OD值為0.3±0.05，②膽紅素標準液成品以測定膽紅素的方法測定其值，“B”管OD值應小于0.01。
具體實施例實施例1本發(fā)明膽紅素標準液配方組成原料為分析純，每升濃度范圍分別為碳酸鈉0.055g、0.1N氫氧化鈉2.40ml、0.1鹽酸0.9ml、蔗糖50g、乙二胺四乙酸二鈉鹽EDTA-2Na 0.75g、碳酸氫銨5.0g、小牛血清11.0g、膽紅素(Bilirubin)56.0mg、Proclin300 0.2u。
上述的膽紅素標準液由以下工藝制成，(1)取試劑I，1.06％Na2CO3，5.0ml加入試劑II0.1N NaOH 3.0ml，混勻加酚酞作指示劑，用試劑0.1N HCl滴定至紅色消失，記錄用量為x ml；(2)取膽紅素200mg～220mg置100ml燒瓶中，加入試劑I 20.0ml、試劑II 12.0ml迅速混勻，10分鐘內使其充分溶解，轉入5L容器中，(3)慢加入試劑試劑IV10％蔗糖，600ml～720ml，邊加邊搖勻并用其清洗2～3次燒瓶，(4)慢加入試劑III0.1N HCl，4x ml，邊加邊搖勻，再加試劑VI及蒸餾水定容至2000ml，4℃過夜避光保存，PH＝8.22；(5)裝凍干前加入等體積的試劑IV(2000ml)混勻至總體積為4000ml加冰醋酸2.0ml，調PH＝7.12。
上述的膽紅素標準液的保存方法為(1)配制好的膽紅素標準液，充分混勻后每瓶2.0ml分裝，25℃速凍，低溫真空干燥10～12小時后，逐步升溫至5～18℃繼續(xù)真空干燥4～8小時便可自動真空壓蓋；(2)空干燥的膽紅素標準液2～8℃保存有限期2年，-20℃保存有效期為4年。
權利要求
1.一種膽紅素標準液，其特征在于按以下組分和濃度范圍制成，膽紅素標準液配方組成原料為分析純，每升濃度范圍分別為碳酸鈉0.043--0.62g、0.1N氫氧化鈉2.0-4.0ml、0.1N鹽酸0.5-2.0ml、蔗糖40--60g、乙二胺四乙酸二鈉鹽0.625-1.0g、碳酸氫銨4.94-5.5g、小牛血清8-12.0g、膽紅素45--60.0mg、Proclin3000.1-0.25u。
2.一種如權利要求1所述的膽紅素標準液的制法，其特征在于由以下工藝制成，(1)取試劑I，1.06％Na2CO3，5.0ml加入試劑II0.1NNaOH3.0ml，混勻加酚酞作指示劑，用試劑0.1N HCl滴定至紅色消失，記錄用量為xml；(2)取膽紅素200mg～220mg置100ml燒瓶中，加入試劑I20.0ml、試劑II 12.0ml迅速混勻，10分鐘內使其充分溶解，轉入5L容器中，(3)慢加入試劑試劑IV10％蔗糖，600ml～720ml，邊加邊搖勻并用其清洗2～3次燒瓶，(4)慢加入試劑III0.1N HCl，4x ml，邊加邊搖勻，再加試劑VI及蒸餾水定容至2000ml，4℃過夜避光保存，PH＝8.22；(5)裝凍干前加入等體積的試劑IV(2000ml)混勻至總體積為4000ml加冰醋酸2.0ml，調PH＝7.12。
3.一種如權利要求1所述的膽紅素標準液的保存方法，其特征在于(1)配制好的膽紅素標準液，充分混勻后每瓶2.0ml分裝，25℃速凍，低溫真空干燥10～12小時后，逐步升溫至5～18℃繼續(xù)真空干燥4～8小時便可自動真空壓蓋；或將凍干好的膽紅素標準液沖入96％以上的氮氣后壓蓋；(2)空干燥的膽紅素標準液2～8℃保存有限期2年，-20℃保存有效期為4年。
全文摘要
本發(fā)明為一種膽紅素標準液及其制備方法和保存方法，膽紅素標準液配方組成原料為分析純，每升濃度范圍分別為碳酸鈉0.043－0.62g、0.1N氫氧化鈉2.0－4.0ml、0.1N鹽酸0.5－2.0ml、蔗糖40－60g、乙二胺四乙酸二鈉鹽0.625－1.0g、碳酸氫銨4.94－5.5g、小牛血清8－12.0g、膽紅素45－60.0mg、Proclin3000.1－0.25u。本發(fā)明為一種具有抗氧化性和水溶性的膽紅素標準液。
文檔編號G01N33/50GK1664588SQ200510018340
公開日2005年9月7日 申請日期2005年3月4日 優(yōu)先權日2005年3月4日
發(fā)明者顏簫, 周洪華 申請人:江西特康科技有限公司