專利名稱：一種腫瘤標(biāo)志物－血清蛋白指紋圖譜的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種腫瘤標(biāo)志物-血清蛋白指紋圖譜的檢測(cè)方法。具體涉及血清蛋白質(zhì)的表面增強(qiáng)激光解析離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定和特異性蛋白峰比較識(shí)別的方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是一種多基因參與的復(fù)雜疾病。其基因表達(dá)分析涉及轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組學(xué)方法。由于蛋白質(zhì)的表達(dá)或功能從轉(zhuǎn)錄到翻譯間有多點(diǎn)調(diào)控，轉(zhuǎn)錄的mRNA豐度與翻譯的蛋白質(zhì)數(shù)量間相關(guān)不明顯，核酸的分析方法無法實(shí)時(shí)準(zhǔn)確地反映腫瘤發(fā)生過程中蛋白質(zhì)數(shù)量與種類地變化，因此用蛋白質(zhì)組學(xué)方法從整體上研究腫瘤地發(fā)病機(jī)制，尋找腫瘤診斷和預(yù)后的特異性標(biāo)記以及藥物治療的靶標(biāo)已成為近期研究的熱點(diǎn)(Srinivas PR，Kramer BS，Srivastava S.Trends in biomarkerresearch for cancer detection[J].Lancet Oncol，2001，2(11)698-704；Annika Lindblom，Snnelie lijegren.Tumor markers in malignancies.BMJ[J].2000，320424-427)。腫瘤標(biāo)志物的定義并不明確，它通常是指腫瘤組織自身特有的可反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的物質(zhì)，可在腫瘤患者組織、體液和排泄物中檢出。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物包括腫瘤特異性抗原及相關(guān)抗原、激素類受體、酶類、癌基因、抗癌基因及其產(chǎn)物等。理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)具備1)唯腫瘤細(xì)胞所特有，不存在于正?；蚍前┙M織中；2)與腫瘤的大小、分期及治療預(yù)后相關(guān)；3)采用高靈敏的方法可定性或定量地檢測(cè)。完全符合這些條件的腫瘤標(biāo)志物至今尚未發(fā)現(xiàn)。
肝癌已成為目前我國(guó)癌癥病人死亡第二位的原因，全世界45％的原發(fā)性肝癌發(fā)生在我國(guó)。目前仍以外科手術(shù)為首選和主要治療方案。術(shù)后總體5年生存率只有62.9％，大肝癌術(shù)后5年生存率僅為34.6％。HCC常表現(xiàn)為早期的血管侵犯，包膜侵犯和肝內(nèi)、肝外的轉(zhuǎn)移。盡管采取了免疫治療、預(yù)防性TAE、中藥治療等手段來預(yù)防肝癌切除術(shù)后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，但總體術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)61.5％，即使是小肝癌術(shù)后5年復(fù)發(fā)率也高達(dá)45.5％。目前臨床主要依靠定期復(fù)查AFP、異常凝血酶原、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和B超來發(fā)現(xiàn)術(shù)后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，但應(yīng)用于肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)和判斷仍有相當(dāng)?shù)睦щy。判斷腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性和早期診斷轉(zhuǎn)移的發(fā)生，并采取有效的手段預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，誘發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移休眠狀態(tài)或延遲轉(zhuǎn)移的發(fā)生，成為當(dāng)前肝癌研究的主要課題之一。肝細(xì)胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)極易侵犯門靜脈形成癌栓(portal vein tumor thrombus，PVTT)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的肝內(nèi)播散和轉(zhuǎn)移，因此PVTT是影響和決定肝癌患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)狀態(tài)的極重要的因素。
蛋白質(zhì)組學(xué)研究涉及蛋白質(zhì)表達(dá)模式研究和功能模式研究，目前以前者研究較為集中。蛋白質(zhì)表達(dá)模式研究的支撐技術(shù)主要有蛋白質(zhì)的分離、鑒定技術(shù)和生物信息學(xué)。蛋白質(zhì)的鑒定技術(shù)主要為質(zhì)譜法(MS)，即利用樣品離子化后，離子間的質(zhì)荷比(m/z)的差異來分析確定樣品的分子質(zhì)量?，F(xiàn)最常用的有兩種，即電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)。生物技術(shù)的發(fā)展對(duì)新的腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)起了非常的作用，2D電泳結(jié)合MS、高壓液相分析(HPLC)、表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)，LC-MS-MS等技術(shù)使人們可以從蛋白質(zhì)水平分析潛在的腫瘤標(biāo)志物，從而使新標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提升到一個(gè)更高的水平(Wei WZ.Tumor markersdiscovery topractice[J].DDT 2003，8(10)441-44316；Emanuel FP，Ali MA，Ben AH，etal.Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer[J].Lancet，2002，359(16)572-577；Julia DW，Kelley CM，Cloud PP，et al.Newapproaches to proteomic analysis of breast cancer[J].Proteomics，2001，1，1205-1215)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)目前肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)的不足，提供一種腫瘤標(biāo)志物-血清蛋白指紋圖譜的檢測(cè)方法。
本發(fā)明應(yīng)用血清蛋白質(zhì)組學(xué)的方法測(cè)定血清蛋白質(zhì)指紋圖譜的特異性，主要技術(shù)方案為表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)，包括血清樣本的采集標(biāo)準(zhǔn)，化學(xué)芯片的選擇、處理和閱讀，測(cè)定條件的優(yōu)化；PVTT判別模式及驗(yàn)證。
本方法經(jīng)血清樣品檢測(cè)的重復(fù)性分析；比較PVTT組和無PVTT組顯示有16個(gè)蛋白峰有顯著差異；獲得的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜中發(fā)現(xiàn)有判別意義的蛋白質(zhì)峰；通過建立的決策樹模型可以顯著地區(qū)分兩組患者，該模型的敏感性為75.8％(25/33)，特異性為82.3％(51/62)。本發(fā)明方法進(jìn)一步可用于無創(chuàng)鑒別和預(yù)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移。還可用于原發(fā)性肝癌病人術(shù)后肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)傾向的預(yù)測(cè)及篩選。


圖1，部分差異蛋白峰在HCC伴PVTT組和HCC不伴PVTT組中表達(dá)情況，其中m/z為3478(B)在HCC伴PVTT組上調(diào)，m/z為2745(A)、8773(C)、8901(D)在HCC伴PVTT組下調(diào)，橫坐標(biāo)為m/z(分子量)，縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)的豐度，PVTT(+)為HCC伴PVTT，PVTT(-)為HCC不伴PVTT圖2，區(qū)分肝癌轉(zhuǎn)移的血清蛋白質(zhì)圖譜的判別模式(PVTT決策樹模型)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1一、表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)實(shí)驗(yàn)1.血清樣本的采集標(biāo)準(zhǔn)患者均無藥物治療，空腹抽取5ml新鮮血，常溫下放置3小時(shí)，待自然凝固后，4℃3000rpm離心30min，取上層血清分裝后立刻置-70℃冰箱保存。
實(shí)驗(yàn)所用血清均僅一次凍融。表觀無融血、無雜質(zhì)，純清透明。
2.芯片選擇Ciphergen公司的WCX2芯片3.樣本處理取出-70℃下血清溶解后，4℃10000rpm離心2min，取3ul血清加入6ul U9(9M urea，2％CHAPS，50mM Tris-Hcl，1％DTT，pH 9.0)裂解液混合后，冰浴振蕩(MS1 Minishaker)30min，加入108ul WCX2緩沖液(50mMNaAc，pH 4.0)使血清稀釋約40倍；WCX2芯片插入生物處理器(Bioprocessor)后每孔加入200ul緩沖液室溫振蕩500rpm，5min×2預(yù)處理；棄緩沖液后每孔分別加入100ul不同稀釋后樣品，室溫振蕩500rpm，1h；棄樣品后芯片每孔加入200ul緩沖液室溫振蕩500prm，5min×2；棄緩沖液加入200ul去離子水(HPLC grade)即刻漂洗，取出芯片；待表面干燥后每孔滴加1ul SPA(Sinapinic Acid，50％ACN，0.5％TFA)，風(fēng)干后，PBS-II(CiphergenBiosystems)上機(jī)閱讀。
4.閱讀條件(1)選用激光能量(Intensity)為185，(2)敏感性(Sensitivity)為8。
(3)每孔都實(shí)行20次激光轟擊(4)測(cè)定范圍蛋白質(zhì)m/z(質(zhì)荷比)在1500~30000Da(5)all-in-1肽譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
5.分析條件(1)BioMarker Wizard軟件生成蛋白質(zhì)峰并進(jìn)行歸類比較，(2)由Biomarker Patterns Software(BPS)實(shí)現(xiàn)不同組間的差異的決策樹。
二.血清樣品檢測(cè)的重復(fù)性分析(SELDI-TOF-MS/WCX2蛋白芯片)利用同一份HCC血清樣品，選擇WCX2芯片的8個(gè)不在同一芯片的位點(diǎn)，進(jìn)行SELDI-TOF-MS檢測(cè)，得到的蛋白質(zhì)譜中隨機(jī)選擇8個(gè)蛋白質(zhì)峰，測(cè)得變異系數(shù)(CV)值為18.5％。
三，建立判別模式包含通過血清蛋白指紋譜比較區(qū)分肝癌轉(zhuǎn)移的、有意義的血清差異蛋白質(zhì)，和通過具有肝癌轉(zhuǎn)移判別意義的血清蛋白質(zhì)建立決策樹模型。
區(qū)分肝癌(HCC)轉(zhuǎn)移的、有意義的血清蛋白質(zhì)1.HCC轉(zhuǎn)移(以PVTT為基準(zhǔn))的血清蛋白指紋譜比較在m/z 1100～30000Da范圍內(nèi)，共檢測(cè)出100個(gè)蛋白峰，比較PVTT組和無PVTT組有16個(gè)蛋白峰有顯著差異(P＜0.01)(表1)，m/z為3478、1314、1744、1725、2022和3380在PVTT組中上調(diào)，而m/z為8901、9353、9415、8773、2766、2745、8697、7773、8569和1373在PVTT組下調(diào)(圖1)。
2.獲得的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜中有判別意義的蛋白質(zhì)峰表1是16個(gè)差異蛋白在PVTT(+)和PVTT(-)組中強(qiáng)度的比較。
表1

其中P＜0.01，*為參加建模型蛋白質(zhì)建立PVTT決策樹模型的判別方法采用Biomarker Patterns Software(BPS)完成PVTT的判斷模型。
95例HCC患者進(jìn)入模型，BPS處理數(shù)據(jù)，當(dāng)滿足0.439×(M2766)-0.101×(M3478)+0.605×(M8773)+0.657×(M8900)＜＝1.16232且M2745＜＝10.1457時(shí)進(jìn)入節(jié)點(diǎn)1，為23例伴PVTT的HCC和1例不伴PVTT的HCC；當(dāng)滿足0.439×(M2766)-0.101×(M3478)+0.605×(M8773)+0.657×(M8900)＜＝1.16232且M2745＞10.1457時(shí)進(jìn)入節(jié)點(diǎn)2，為3例不伴PVTT的HCC；當(dāng)滿足0.439×(M2766)-0.101×(M3478)+0.605×(M8773)+0.657×(M8900)＞1.16232且-0.0606×(M2745)+0.998×(M3478)＜＝0.795901進(jìn)入節(jié)點(diǎn)3，為46例不伴PVTT的HCC和3例伴PVTT的HCC；當(dāng)滿足0.439×(M2766)-0.101×(M3478)+0.605×(M8773)+0.657×(M8900)＞1.16232且-0.0606×(M2745)+0.998×(M3478)＞0.795901和-0.996×(M2022)-0.0908×(M9415)＜＝-0.307601時(shí)進(jìn)入節(jié)點(diǎn)4，為7例伴PVTT的HCC和1例不伴PVTT的HCC；當(dāng)滿足0.439×(M2766)-0.101×(M3478)+0.605×(M8773)+0.657×(M8900)＞1.16232且-0.0606×(M2745)+0.998×(M3478)＞0.795901和-0.996×(M2022)-0.0908×(M9415)＞-0.307601時(shí)，為11例不伴PVTT的HCC。
通過對(duì)原始圖譜的初步判斷，選擇m/z為3478、2022、8901、9415、8773、2766、和2745建立的決策樹模型，可以顯著地區(qū)分兩組患者(下圖)。該模型的敏感性為75.8％(25/33)，特異性為82.3％(51/62)。
權(quán)利要求
1.一種腫瘤標(biāo)志物-血清蛋白指紋圖譜的檢測(cè)方法，其特征是采用表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)，包括血清樣本的采集標(biāo)準(zhǔn)，化學(xué)芯片的選擇、處理和閱讀，測(cè)定條件的優(yōu)化；建立判別模式及驗(yàn)證步驟，所述的芯片閱讀步驟，其參數(shù)設(shè)置為，閱讀條件a.選用激光能量(Intensity)為185，b.敏感性(Sensitivity)為8，c.每孔都實(shí)行20次激光轟擊，d.測(cè)定范圍蛋白質(zhì)m/z(質(zhì)荷比)在1500~30000Da，e.all-in-1肽譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，所述的建立判別模式步驟包括通過血清蛋白指紋譜比較區(qū)分肝癌轉(zhuǎn)移的、有意義的血清差異蛋白質(zhì)，和通過具有肝癌轉(zhuǎn)移判別意義的血清蛋白質(zhì)建立決策樹模型。
2.按權(quán)利要求1所述的腫瘤標(biāo)志物-血清蛋白指紋圖譜的檢測(cè)方法，其特征是選擇的化學(xué)芯片是WCX2蛋白芯片。
3.按權(quán)利要求1所述的腫瘤標(biāo)志物-血清蛋白指紋圖譜的檢測(cè)方法，其特征是所述測(cè)定條件其中分析條件為a.BioMarker Wizard軟件生成蛋白質(zhì)峰并進(jìn)行歸類比較，b.由Biomarker Patterns Software(BPS)來實(shí)現(xiàn)不同組間的差異的決策樹。
4.按權(quán)利要求1所述的腫瘤標(biāo)志物-血清蛋白指紋圖譜的檢測(cè)方法，其中建立判別模式步驟所述通過血清蛋白指紋譜比較區(qū)分肝癌轉(zhuǎn)移的、有意義的血清差異蛋白質(zhì)為M/Z 9353、*9415、*8901、*8773、8697、8569、7773、*3478、3380、*2766、*2745、*2022、1744、1725、1374、1314。
5.按權(quán)利要求1所述的腫瘤標(biāo)志物-血清蛋白指紋圖譜的檢測(cè)方法，其中建立判別模式步驟的通過具有肝癌轉(zhuǎn)移判別意義的血清蛋白質(zhì)建立決策樹模型，所述的具有轉(zhuǎn)移判別意義的血清蛋白質(zhì)包括M/Z*9415、*8901、*8773、*3478、*2766、*2745和*2022。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種腫瘤標(biāo)志物－血清蛋白指紋圖譜的檢測(cè)方法。具體涉及血清蛋白質(zhì)的表面增強(qiáng)激光解析離子化－飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定和特異性蛋白峰比較識(shí)別的方法，包括血清樣本的采集標(biāo)準(zhǔn)，化學(xué)芯片的選擇、處理和閱讀，測(cè)定條件的優(yōu)化；PVTT判別模式及驗(yàn)證。經(jīng)血清樣品檢測(cè)重復(fù)性分析；比較PVTT和無PVTT組顯示有顯著差異蛋白峰；獲得的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜中發(fā)現(xiàn)有判別意義的蛋白質(zhì)峰；通過建立的決策樹模型能顯著地區(qū)分兩組患者，敏感性為75.8％(25/33)，特異性為82.3％(51/62)。本發(fā)明進(jìn)一步可用于無創(chuàng)鑒別和預(yù)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移。還可用于原發(fā)性肝癌病人術(shù)后肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)傾向的預(yù)測(cè)及篩選。
文檔編號(hào)G01N33/72GK1851455SQ20051002534
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2005年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月22日
發(fā)明者劉銀坤, 黃成 , 崔杰鋒, 樊嘉, 周儉, 湯釗猷 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院