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      血清腫瘤標(biāo)志物檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器的制作方法

      文檔序號:5959906閱讀:267來源:國知局
      專利名稱:血清腫瘤標(biāo)志物檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及生物傳感器,具體地,涉及一種血清腫瘤標(biāo)志物檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器,屬于醫(yī)學(xué)檢測方法與磁性傳感技術(shù)領(lǐng)域。
      背景技術(shù)
      惡性腫瘤是當(dāng)今威脅人類健康和生命的主要疾病之一,且發(fā)病率有逐年上升的趨勢。目前臨床主要的腫瘤檢測手段包括
      [I]實驗室檢查主要包括血、尿、大便的常規(guī)檢查、生化及免疫檢查、病理學(xué)檢查坐寸ο
      [2]放射學(xué)檢查主要包括X光透視、X光攝片、X光造影檢查、CT掃描、核磁共振成像等。
      [3]放射性核素檢查即同位素檢查,包括功能測定檢查、掃描及伽瑪照射檢查、 放射免疫分析等。
      [4]超聲波檢查包括A型、B型超聲波檢查。
      [5]內(nèi)窺鏡檢查包括各種硬性或光學(xué)纖維鏡。
      在腫瘤的研究和臨床實踐中,早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是關(guān)鍵。目前常規(guī)的影像方法如X線、CT、核磁共振、B超等僅能發(fā)現(xiàn)O. 5cm以上的腫塊,這時部分腫瘤已經(jīng)處于中晚期,有的腫瘤已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移,多數(shù)病人已經(jīng)喪失了最佳的治療時機。血清腫瘤標(biāo)志物在腫瘤普查、診斷、判斷預(yù)后和轉(zhuǎn)歸、評價治療療效等方面都具有較大的實用價值。血清腫瘤標(biāo)志物檢測已經(jīng)成為早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的方法之一,目前已經(jīng)發(fā)展了多種血清腫瘤標(biāo)志物檢測技術(shù)并不斷地應(yīng)用于臨床如免疫放射分析法、酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、熒光免疫分析法、液體芯片檢測技術(shù)等,這些方法各有其優(yōu)點,如液體芯片一次能檢查出多種腫瘤標(biāo)志物,和多次檢測相比降低了成本。但這些方法的不足之處在于缺乏靈活性, 單項指標(biāo)敏感性低、特異性較差。在檢測速度、準(zhǔn)確率和檢測費用方面均存在缺陷,因此利用多學(xué)科交叉的優(yōu)勢研制新型腫瘤標(biāo)志物檢測的生物傳感器技術(shù)顯得尤為重要。
      生物傳感器是利用生物活性材料(如酶、蛋白質(zhì)、DNA、抗體、抗原、生物膜等)與物理化學(xué)換能器(如電化學(xué)、光學(xué)、機械、電、磁等)有機結(jié)合構(gòu)成的一種生物信息檢測分析工具。由于生物傳感器在醫(yī)療保健、疾病診斷、食品安全檢測等具有廣泛的用途,受到了世界各國科學(xué)家的深入研究和大力研發(fā);然而仍存在一些因素限制了生物傳感器的大規(guī)模應(yīng)用和推廣,如傳統(tǒng)生物傳感器的分析操作步驟太多、分析周期長、價格昂貴、體積大、昂貴的光學(xué)檢測設(shè)備及需要訓(xùn)練有素的專業(yè)人員才能完成等。近年來,由于免疫磁珠技術(shù)的不斷進展和微傳感器技術(shù)的發(fā)展,科學(xué)家們提出了將微磁傳感器并結(jié)合磁性標(biāo)簽研制用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、毒物學(xué)等生物信息探測的新一代生物傳感器。利用微磁傳感器并結(jié)合磁性標(biāo)簽用于探測生物分子的理念最早是由美國海軍實驗室的Baselt等[Baselt D. R.,Lee G. U.,Natesan M.,Metzger S. W.,Sheehan P. E.,Colton R.,A biosensor based onmagnetoresistance technology, Biosens. Bioelectr. 17 (1998) 731.]于 1998 年提出的,由此開啟了磁生物傳感器研究的熱潮。目前已報道的用于磁性納米粒子(磁珠)檢測的微磁傳感器,主要有電磁感應(yīng)式傳感器、磁阻(AMR)傳感器、霍爾傳感器、巨磁電阻(GMR)傳感器和巨磁阻抗(GMI)傳感器等。巨磁阻抗(GMI)效應(yīng)傳感器是一種新型的磁場傳感器, 其原理是利用交流電流通過磁性材料時其阻抗(Z)隨外磁場(H)靈敏變化的這一特征,GMI 傳感器具有磁場靈敏度高(4 一 100% / 0e)、功耗少、響應(yīng)速度快,偏置磁場小等優(yōu)點,非常適合于磁性納米粒子的探測,其優(yōu)勢在于1)GMI傳感器具有較高的磁場靈敏度,適合于磁性納米粒子(或磁珠)的檢測;2)傳感器的制造技術(shù)可與大規(guī)模集成電路技術(shù)相兼容,易于批量化生產(chǎn),成本低、價格便宜;3)傳感器的信號測評電路可通過CMOS集成電路處理得到, 具有體積小、成本低等特點;4)GMI效應(yīng)的產(chǎn)生不需要很大的驅(qū)動磁場。由于GMI效應(yīng)是唯一的一種利用交流效應(yīng)做檢測的,并與傳統(tǒng)的設(shè)備和檢測手段相兼容,因此在磁場檢測與生物醫(yī)學(xué)檢測方面展示出廣闊的應(yīng)用前景。
      經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn),Kurlyandskaya等(Kurlyandskaya G. V. , SanchezM. L. , Hernando B.)在((Appl. Phys. Lett.))(美國應(yīng)用物理快報)((Vol. 82, pp. 3053,2003))首次提出使用GMI傳感器來探測磁性納米粒子,并利用CoFeMoSiB非晶帶材制備了探測裝直,成功實現(xiàn)了對商業(yè)Ferrofluid 液體中磁性納米粒子以及Dynabeads M-450 磁珠的探測。2007 年,Kurlyandskaya 等(A. Kumar, S. Mohapatra, V. F. Miyar, A. Cerdeira, J. A. Garcia, H. Srikanth, J. Gass and G. V. Kurlyandskaya) 在〈〈Appl. Phys. Lett.))(美國應(yīng)用物理快報)((Vol. 91,pp. 143902, 2007》報道了利用GMI傳感器對吞噬 Fe304納米粒子的人體胚腎細(xì)胞(HEK293)進行檢測,證明了 GMI效應(yīng)在生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域的可行性,但該研究工作只是得到了 GMI傳感器對Fe304磁性納米粒子的響應(yīng),沒有實現(xiàn)對細(xì)胞樣品的標(biāo)記和分型檢測。
      隨著微機電系統(tǒng)(MEMS)技術(shù)的發(fā)展,利用MEMS技術(shù)制備的微流控芯片已應(yīng)用于生物與醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域,而MEMS技術(shù)同樣可用來制造小型化、集成化的GMI傳感器。將生物信息的固定與小型化GMI傳感器相結(jié)合構(gòu)建新型血清腫瘤標(biāo)志物檢測系統(tǒng),利用磁性納米粒子標(biāo)簽對血清腫瘤標(biāo)志物進行檢測,具有重要的研究意義和臨床價值。通過文獻和專利檢索,沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于將GMI效應(yīng)傳感器用于血清腫瘤標(biāo)志物檢測的相關(guān)研究成果。發(fā)明內(nèi)容
      針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷,本發(fā)明的目的是提供一種血清腫瘤標(biāo)志物檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器。該生物傳感器采用MEMS加工工藝制作,能夠與配套的檢測電路制作在一起,實現(xiàn)整個系統(tǒng)的小型化、低成本,并使檢測系統(tǒng)具有高靈敏度和響應(yīng)速度,且易于大批量生產(chǎn)。該生物傳感器的檢測靈敏度可以檢測血清腫瘤標(biāo)志物高達lng/ml的抗原。
      為了實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明所述血清腫瘤標(biāo)志物檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器包括位于玻璃基片上的巨磁阻抗效應(yīng)傳感器、位于巨磁阻抗效應(yīng)傳感器上的絕緣層、位于絕緣層上的Au膜、位于Au膜上的生物敏感膜、位于生物敏感膜上的磁性標(biāo)簽,以及與巨磁阻抗效應(yīng)傳感器連接的信號采集系統(tǒng)。
      優(yōu)選地,上述的巨磁阻抗效應(yīng)傳感器由位于玻璃基片上的NiFe/Cu/NiFe多層膜構(gòu)成,傳感器外形呈曲折形結(jié)構(gòu),并采用MEMS工藝制作,NiFe薄膜厚度為2_6um,Cu膜厚度為l-6um,NiFe薄膜和Cu膜均采用電鍍工藝制作,具有批量生產(chǎn)的優(yōu)勢。CN 102928596 A書明說3/5頁
      優(yōu)選地,上述的絕緣層為三氧化二鋁,其厚度為小于lum,采用濺射工藝制作的。
      優(yōu)選地,上述的Au膜為濺射的Cr/Au薄膜,其厚度為100_500nm,用于修飾自組裝膜。
      優(yōu)選地,上述的生物敏感膜為一層納米級厚度的自組裝膜,自組裝膜為11-巰基十一烷酸,然后經(jīng)EDC+NHS活化形成,生物敏感膜可以連接各種單克隆抗體,單克隆抗體可以和被檢測的抗原結(jié)合。
      優(yōu)選地,上述的磁性標(biāo)簽為鏈酶親和素修飾的磁性納米粒子或由磁性納米粒子構(gòu)成的磁珠??梢院徒?jīng)生物素修飾的單克隆抗體或多克隆抗體相結(jié)合。生物素修飾的單克隆抗體或多克隆抗體可以和被檢測的抗原結(jié)合。
      本發(fā)明提供的生物傳感器,其檢測抗原的原理是采用雙抗夾心法。采用自組裝膜技術(shù)固定單克隆抗體,單克隆抗體與抗原結(jié)合,帶有鏈酶親和素的磁性標(biāo)簽與生物素化的多克隆抗體結(jié)合,由于抗原-抗體的免疫反應(yīng),磁性標(biāo)簽被標(biāo)記到傳感器的表面上。一旦有極微量的被檢測生物分子(抗原)存在時,在外磁場作用下,磁性標(biāo)簽產(chǎn)生的彌散磁場將導(dǎo)致傳感器的磁阻抗的變化,這種變化直接轉(zhuǎn)變?yōu)殡妷盒盘枺瑥亩鴮崿F(xiàn)對相 應(yīng)生物分子的高靈敏度檢測。
      與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下的有益效果
      (I)磁傳感器的制備技術(shù)可與半導(dǎo)體的CMOS技術(shù)兼容,從而可實現(xiàn)集成磁傳感器陣列,成本低、價格便宜,易于批量生產(chǎn);
      (2)磁阻抗變化的信號可通過集成的CMOS電路得到處理,直接將生物信息轉(zhuǎn)換為電信號,可實現(xiàn)即時分析,并具有很高的檢測靈敏度;
      (3)生物樣品本身不帶磁性,能提供一個很低噪聲的磁測量環(huán)境,相對于突光分子、放射性同位元素、酶等標(biāo)簽,磁性標(biāo)簽非常穩(wěn)定;
      (4)在單一化驗中,陣列傳感器可實現(xiàn)對多目標(biāo)分析物的同時檢測,具有快速、高靈敏探測的優(yōu)勢。
      (5)本發(fā)明中的血清腫瘤標(biāo)志物檢測系統(tǒng)具有檢測速度快、可重復(fù)使用、無特殊環(huán)境和存放要求、體積小、靈敏度高等優(yōu)點;不需要依賴于操作人員的生物學(xué)醫(yī)學(xué)經(jīng)驗以及龐雜、昂貴的熒光檢測設(shè)備,就可實現(xiàn)特定的生化分析或疾病診斷,這將有利于實現(xiàn)便攜式、 成本低廉、快速診斷的生物醫(yī)學(xué)疾病檢測系統(tǒng)。


      通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細(xì)描述,本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點將會變得更明顯
      圖I為本發(fā)明一實施例結(jié)構(gòu)示意圖2為圖I所示沿AB方向的截面圖3為本發(fā)明傳感器檢測原理圖。
      圖中NiFe薄膜I、玻璃基片2、Cu膜3、引腳4、巨磁阻抗效應(yīng)傳感器5、絕緣層6、 Au膜7、生物敏感膜8、單克隆抗體9、抗原10、單克隆抗體或多克隆抗體11、磁珠12、生物素 13、鏈酶親和素14。
      具體實施方式
      下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明,但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是,對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下,還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
      本實施例提供一種血清腫瘤標(biāo)志物檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器。該生物傳感器由位于玻璃基片上的巨磁阻抗效應(yīng)傳感器5、絕緣層6、Au膜7、生物敏感膜8、磁性標(biāo)簽及信號采集系統(tǒng)組成。
      本實施例中,所述巨磁阻抗效應(yīng)傳感器5由位于玻璃基片2上的NiFe薄膜I、Cu 膜3、NiFe薄膜I構(gòu)成的多層膜及引腳4構(gòu)成,其中Cu膜的寬度小于NiFe薄膜的寬度,并采用MEMS工藝制作,NiFe薄膜I厚度為2_6um,Cu膜3厚度為l-6um,NiFe薄膜和Cu膜均采用電鍍工藝制作,具有批量生產(chǎn)的優(yōu)勢。
      本實施例中,在巨磁阻抗效應(yīng)傳感器上面有絕緣層6,該絕緣層6為三氧化二鋁, 其厚度為小于lum,采用濺射工藝制作的,用來保護傳感器并與Au膜7絕緣。
      本實施例中,絕緣層6的上面為Au膜7,Au膜7為濺射的Cr/Au薄膜,其厚度為 100-500nm,用于修飾自組裝膜。
      本實施例中,Au膜7的上面為生物敏感膜8,生物敏感膜8為一層納米級厚度的自組裝膜,自組裝膜為11-巰基十一烷酸,然后經(jīng)EDC+NHS活化形成的,生物敏感膜可以連接各種單克隆抗體9,單克隆抗體可以和被檢測的抗原10結(jié)合。
      本實施例中,磁性標(biāo)簽為鏈酶親和素14修飾的磁性納米粒子或由磁性納米粒子構(gòu)成的磁珠12,可以和經(jīng)生物素13修飾的單克隆抗體或多克隆抗體11相結(jié)合,生物素修飾的單克隆抗體或多克隆抗體11可以和被檢測的抗原10結(jié)合。
      本實施例上述的生物傳感器制作流程如下
      (I)巨磁阻抗效應(yīng)傳感器由位于玻璃基片上的NiFe/Cu/NiFe多層膜構(gòu)成,制作方法采用現(xiàn)有技術(shù),比如專利號為200510026607. 8中國專利中記載的方法。
      (2)在GMI傳感器上面采用濺射工藝制作絕緣層三氧化二鋁。甩光刻膠、烘干、曝光、顯影、刻蝕三氧化二鋁、去膠,使傳感器引腳暴露在外面。
      (3 )濺射Cr/Au薄膜,甩光刻膠、烘干、曝光、顯影、刻蝕Cr/Au膜、去膠,使傳感器的引腳和傳感器敏感部分帶有Au膜,并暴露在外面。
      (4) Au膜上生物敏感膜的制備。生物敏感膜為一層納米級厚度的自組裝膜,自組裝膜為11巰基i^一烷酸,然后經(jīng)EDC+NHS活化形成的。
      (5)腫瘤標(biāo)志物單克隆抗體的固定。將適當(dāng)濃度的腫瘤標(biāo)志物單克隆抗體溶液滴入傳感器Au膜上面,放入冰箱4°C過夜;然后用PBS溶液清洗、BSA溶液封閉,最后用PBS溶液清洗、室溫干燥。
      (6)抗原點樣。將適當(dāng)濃度的抗原溶液滴入傳感器表面,室溫下22°C培育或在蒸汽浴37°C下培育,然后用PBS溶液清洗,室溫下干燥。
      (7)生物素化抗體的固定。將適當(dāng)濃度的生物素化抗體溶液滴入傳感器表面,室溫 22°C培育,然后用PBS溶液清洗,室溫下干燥。
      (8)磁性標(biāo)簽固定。磁性標(biāo)簽為鏈酶親和素修飾的磁性納米粒子或由磁性納米粒子構(gòu)成的磁珠。將適當(dāng)濃度的磁性標(biāo)簽滴入傳感器表面,室溫下培育,然后用PBS溶液清洗,室溫干燥。
      本實施例中,生物傳感器的信號采集系統(tǒng)為HP公司的4194A阻抗分析儀或 Agilent公司生產(chǎn)的4294A阻抗分析儀,通過在傳感器外部施加的磁場獲得檢測抗原的靈敏度。將巨磁阻抗效應(yīng)傳感器連接至HP4194阻抗分析儀,阻抗分析儀產(chǎn)生恒定交流電流幅值10mA、頻率O. 5-20MHZ的交流電流并通過傳感器構(gòu)成測試的閉合回路。沿著傳感器的長度方向施加大小為I-IOOOe的直流磁場,對抗原存在的傳感器進行巨磁阻抗變化測試。當(dāng)傳感器有磁性標(biāo)記的抗原存在時,磁性標(biāo)簽被標(biāo)記在傳感器上,由于巨磁阻抗效應(yīng)傳感器的高靈敏性,會觀測出磁性標(biāo)簽有無情況下的GMI效應(yīng),其GMI效應(yīng)的差異可表達抗原的存在,從而實現(xiàn)對待測血清腫瘤標(biāo)志物的檢測。
      以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是,本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改,這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。
      權(quán)利要求
      1.一種血清腫瘤標(biāo)志物檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器,其特征在于包括位于玻璃基片上的巨磁阻抗效應(yīng)傳感器、位于巨磁阻抗效應(yīng)傳感器上的絕緣層、位于絕緣層上的Au膜、位于Au膜上的生物敏感膜、位于生物敏感膜上的磁性標(biāo)簽,以及與巨磁阻抗效應(yīng)傳感器連接的信號采集系統(tǒng);其中所述巨磁阻抗效應(yīng)傳感器由位于玻璃基片上的NiFe/Cu/NiFe多層膜構(gòu)成;所述生物敏感膜為一層納米級厚度的自組裝膜。
      2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血清腫瘤標(biāo)志物檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器,其特征在于,所述巨磁阻抗效應(yīng)傳感器外形呈曲折形結(jié)構(gòu),并采用MEMS工藝制作,所述NiFe/Cu/NiFe多層膜中NiFe薄膜厚度為2_6um,Cu膜厚度為l_6um,NiFe薄膜和Cu膜均采用電鍍工藝制作。
      3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血清腫瘤標(biāo)志物檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器,其特征在于,所述絕緣層為三氧化二鋁,其厚度小于lum,采用濺射工藝制作的。
      4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血清腫瘤標(biāo)志物檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器,其特征在于,所述Au膜為派射的Cr/Au薄膜,其厚度為100-500nm,用于修飾自組裝膜。
      5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血清腫瘤標(biāo)志物檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器,其特征在于,所述生物敏感膜為11-巰基i^一烷酸,然后經(jīng)EDC+NHS活化形成的,生物敏感膜可以連接各種單克隆抗體,單克隆抗體可以和被檢測的抗原結(jié)合。
      6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的血清腫瘤標(biāo)志物檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器,其特征在于,所述的磁性標(biāo)簽為鏈霉親和素修飾的磁性納米粒子或由磁性納米粒子構(gòu)成的磁珠,可以和經(jīng)生物素修飾的單克隆抗體或多克隆抗體相結(jié)合,生物素修飾的單克隆抗體或多克隆抗體可以和被檢測的抗原結(jié)合。
      7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的血清腫瘤標(biāo)志物檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器,其特征在于,所述的生物傳感器,采用自組裝膜技術(shù)固定單克隆抗體,單克隆抗體與抗原結(jié)合,帶有鏈酶親和素的磁性標(biāo)簽與生物素化的多克隆抗體結(jié)合,由于抗原-抗體的免疫反應(yīng),磁性標(biāo)簽被標(biāo)記到傳感器的表面上,一旦有極微量的被檢測生物分子存在時,在外磁場作用下,磁性標(biāo)簽產(chǎn)生的彌散磁場將導(dǎo)致傳感器的磁阻抗的變化,這種變化直接轉(zhuǎn)變?yōu)殡妷盒盘?,從而實現(xiàn)對相應(yīng)生物分子的高靈敏度檢測。
      8.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的血清腫瘤標(biāo)志物檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器,其特征在于,所述的信號采集系統(tǒng)為HP公司的4194A阻抗分析儀或Agilent公司生產(chǎn)的4294A阻抗分析儀。
      全文摘要
      本發(fā)明提供一種血清腫瘤標(biāo)志物檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器。該生物傳感器由位于玻璃基片上的巨磁阻抗效應(yīng)傳感器、絕緣層、Au膜、生物敏感膜、磁性標(biāo)簽及信號采集系統(tǒng)組成。巨磁阻抗效應(yīng)傳感器由位于玻璃基片上的NiFe/Cu/NiFe多層膜構(gòu)成,并采用MEMS工藝制作。絕緣層為三氧化二鋁,Au膜為濺射的Cr/Au薄膜,生物敏感膜為納米級厚度的自組裝膜,生物敏感膜可以連接各種單克隆抗體。磁性標(biāo)簽為鏈霉親和素修飾的磁性納米粒子或由磁性納米粒子構(gòu)成的磁珠,可以和經(jīng)生物素修飾的單克隆抗體或多克隆抗體相結(jié)合。本發(fā)明傳感器檢測原理是采用雙抗夾心法,檢測靈敏度可以檢測血清腫瘤標(biāo)志物高達1ng/ml的抗原。
      文檔編號G01N33/531GK102928596SQ201210397979
      公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月18日
      發(fā)明者周勇, 陳翔, 雷沖, 王韜 申請人:上海交通大學(xué)
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